Summary
O presente protocolo descreve a indução de autofagia no corpo adiposo de larvas de Drosophila melanogaster via depleção de nutrientes e analisa as alterações na autofagia utilizando linhagens de moscas transgênicas.
Abstract
A autofagia é um processo de autodigestão celular. Ele entrega carga aos lisossomos para degradação em resposta a vários estresses, incluindo fome. O mau funcionamento da autofagia está associado ao envelhecimento e a múltiplas doenças humanas. A maquinaria de autofagia é altamente conservada - desde leveduras até humanos. O corpo adiposo larval de Drosophila melanogaster, um análogo para fígado e tecido adiposo de vertebrados, fornece um modelo único para o monitoramento da autofagia in vivo. A autofagia pode ser facilmente induzida pela falta de nutrientes no corpo adiposo das larvas. A maioria dos genes relacionados à autofagia é conservada em Drosophila. Muitas linhagens de moscas transgênicas expressando marcadores de autofagia marcados foram desenvolvidas, o que facilita o monitoramento de diferentes etapas do processo de autofagia. A análise clonal permite uma comparação próxima de marcadores de autofagia em células com genótipos diferentes no mesmo pedaço de tecido. O protocolo atual detalha procedimentos para (1) gerar clones somáticos no corpo adiposo larval, (2) induzir autofagia via inanição de aminoácidos e (3) dissecar o corpo adiposo larval, com o objetivo de criar um modelo para análise de diferenças na autofagia utilizando um marcador autofagossomal (GFP-Atg8a) e análise clonal.
Introduction
A autofagia é um processo de "autoalimentação" induzido por vários estresses, incluindo a inanição de aminoácidos1. A macroautofagia (doravante denominada autofagia) é o tipo de autofagia mais bem estudado e desempenha um papel insubstituível na manutenção da homeostase celular2. O mau funcionamento da autofagia está associado a diversas doençashumanas3. Além disso, alguns genes relacionados à autofagia são alvos potenciais para o tratamento de váriasdoenças4.
A autofagia é regulada de forma altamente sofisticada5. Após a inanição, as membranas de isolamento sequestram materiais citoplasmáticos para formar autofagossomos de membrana dupla6. Os autofagossomos então se fundem com endossomos e lisossomos para formar anfissomos e autolisossomos. Com a ajuda de enzimas hidrolíticas lisossômicas, o conteúdo citoplasmático engolido é degradado e os nutrientes são reciclados7.
A autofagia é um processo conservado evolutivamente8. Drosophila melanogaster é um ótimo modelo para o estudo do processo de autofagia in vivo. A inanição de aminoácidos induz facilmente autofagia no tecido adiposo das moscas, um análogo do fígado e do tecido adiposo humanos9. Defeitos na autofagia interrompem os distintos padrões puncta de várias proteínas relacionadas à autofagia, como Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1, p62, entre outras10. Portanto, a análise dos padrões desses marcadores de autofagia ajudará a discernir a ocorrência de defeitos de autofagia e a etapa de autofagia defeituosa. Por exemplo, a proteína semelhante à ubiquitina Atg8 é o marcador de autofagia mais comumente usado11. Em Drosophila melanogaster, cepas transgênicas com uma proteína fluorescente verde (GFP) marcada com Atg8a foram desenvolvidas com sucesso12. GFP-Atg8a é difundida no citosol e núcleos nas células alimentadas. Após a inanição, a GFP-Atg8a é processada e modificada pela fosfatidiletanolamina (PE) e forma puncta, que marcam as membranas de isolamento e os autofagossomos totalmente desenvolvidos13,14. Através da microscopia direta de fluorescência, a indução da autofagia pode ser facilmente observada como um aumento na formação de puncta GFP-Atg815. Atg8a puncta não se formaria em resposta à inanição na presença de um defeito de iniciação da autofagia. Como GFP-Atg8a pode ser extinta e digerida pelo pH baixo em autolisossomos, GFP-Atg8a puncta pode aumentar em número se a autofagia for bloqueada em estágios tardios16.
Como a autofagia é altamente sensível à disponibilidade nutricional17, pequenas diferenças nas condições de cultura frequentemente levam a variações nos fenótipos. Portanto, a análise clonal, método que analisa células mutantes versus células controle selvagens de um mesmo tecido, tem grande vantagem na dissecção de defeitos autofágicos18. Aproveitando a recombinação sítio-específica mediada por flippase/flippase (FLP/FRT) entre cromossomos homólogos, moscas portadoras de tecidos em mosaico são prontamente confeccionadas19,20. As células selvagens que circundam as células mutantes formam um controle interno perfeito para evitar diferenças individuais21.
O presente estudo descreve como induzir autofagia por inanição de aminoácidos e gerar tecidos corporais de gordura em mosaico que expressam GFP-Atg8a. Esses protocolos podem ser utilizados para analisar diferenças na autofagia entre clones mutantes.
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Protocol
1. Cruzamento de Drosophila e postura de ovos
- Introduzir 3 moscas adultas machos (genótipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) e 15 fêmeas (genótipo y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) (ver Tabela de Materiais) num frasco para injetáveis de cultura (com meio padrão de fubá/melaço/ágar Drosophila a 25 °C) para acasalamento.
NOTA: Devem ser criados vários frascos de cultura da mesma cruz para garantir larvas suficientes para experiências posteriores. A linhagem de mosca macho com genótipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a carrega um sítio de FRT no cromossomo X próximo ao centrômero (FRT19A). Também expressa FLP após choque térmico a 37 °C. Um transgene com expressão ubíqua de RFP é inserido no cromossomo X. GFP-Atg8a é expressa sob o controle de cgGal4 no corpo adiposo de larvas22. A linhagem fêmea da mosca com genótipo y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP carrega uma mutação letal (Mu) e FRT19A no cromossomo X. O esquema detalhado de cruzamento é mostrado na Figura 1. - Para a postura de ovos, transfira as moscas para um novo frasco de cultura. Às 48 h após a introdução, toque no frasco para injetáveis de "acasalamento" até que as moscas fiquem atordoadas e caiam na mídia na base do frasco.
- Desligue o frasco para injetáveis de "acasalamento" e cubra a boca com um frasco para injetáveis invertido sem plugue com meios frescos (frasco para injetáveis de cultura fresca). Em seguida, transfira as moscas para o frasco de cultura fresco virando e tocando os frascos.
- Ligue o frasco para injetáveis de cultura frescos (com as moscas transferidas) e elimine o frasco de cultura antigo. Coloque este frasco para injetáveis de cultura fresca numa incubadora a 25 °C para a postura de ovos no meio fresco.
NOTA: Pré-aquecer os frascos de cultura fresca a 25 °C durante 15 minutos antes do processo de transferência de moscas ajudará as moscas a adaptarem-se rapidamente ao novo ambiente e a acelerar a postura de ovos.
- Retire as moscas após 6 h de postura dos ovos. Se as experiências tiverem de ser repetidas, transfira essas moscas para outro frasco para injetáveis de cultura (conforme descrito no passo 1.2). Caso contrário, descarte as moscas despejando-as em um frasco contendo etanol 75%).
- Incubar o frasco para injetáveis com embriões em banho-maria a 37 °C durante 1 h para induzir a expressão de FLP. Posteriormente, coloque-os numa incubadora a 25 °C e permita que os embriões continuem a desenvolver-se.
NOTA: A formação bem-sucedida de clones mutantes pode ser confirmada posteriormente através de imagens. A ausência de sinais de RFP marca os clones mutantes.
- Incubar o frasco para injetáveis com embriões em banho-maria a 37 °C durante 1 h para induzir a expressão de FLP. Posteriormente, coloque-os numa incubadora a 25 °C e permita que os embriões continuem a desenvolver-se.
2. A inanição de aminoácidos induz autofagia
- Usando uma espátula de laboratório, retire os meios contendo as larvas em desenvolvimento em uma placa de Petri 75 h após a postura dos ovos. Adicionar 3 mL de PBS 1x ao prato e separar suavemente o meio de cultura e as larvas usando pinça longa. Selecione 10 a 15 larvas de terceiro ínstar precoces.
NOTA: Larvas de terceiro ínstar precoce precisam ser escolhidas com cuidado. O estágio de desenvolvimento das larvas é crítico para o sucesso deste protocolo. Devido à duração restrita da postura de ovos, espera-se que a maioria das larvas no frasco de cultura esteja no estágio inicial de terceiro ínstar por 75 h de incubação. No entanto, diferentes receitas de meios de cultura podem levar a variações no tempo de desenvolvimento das larvas. Os critérios para distinguir larvas de terceiro estádio precoce são o comprimento do corpo, a presença de espiráculos anterior e posterior, bem como os ganchos mandibulares do aparelho bucal23. - Encha os poços de uma placa spot de depressão de vidro de 9 poços (consulte Tabela de Materiais) com 1x PBS. Coloque as larvas separadas do terceiro ínstar nos poços usando pinças longas e lave bem as larvas para remover todos os resíduos do meio.
- Tome 5 ml de solução de sacarose a 20% (em 1x PBS) num frasco para injetáveis vazio e coloque as larvas limpas de terceiro ínstar nesta solução utilizando pinças longas. Incubar este frasco para injetáveis numa incubadora a 25 °C durante 6 h antes de os colher para dissecção.
NOTA: A solução de sacarose a 20% (em 1x PBS) serve como meio de privação deficiente em aminoácidos.
3. Dissecção de larvas de terceiro ínstar e processamento de amostras de tecido
- Afie dois pares de pinças #5 (veja Tabela de Materiais) uniformemente em ambos os lados com uma pedra afiada.
- Adicione 400 μL de 1x PBS em cada poço da placa de ponto de depressão de vidro de 9 poços e transfira as larvas para os poços com pinças longas. Coloque uma larva em um poço com o lado dorsal (o lado com a traqueia) voltado para cima.
- Segure a cutícula da larva com duas pinças #5 no meio do tronco da larva e rasgue suavemente as cutículas. Os corpos gordurosos expostos, juntamente com outros tecidos internos da larva, ainda estarão aderidos à carcaça da larva. Puxe o suficiente para expor os órgãos internos tanto quanto possível. Repita este passo para todas as larvas.
NOTA: Cada larva tem dois grandes pedaços de corpo gorduroso ao longo do tronco do corpo. O tecido adiposo é uma monocamada branca, opaca e plana que pode ser facilmente distinguida ao microscópio dedissecção24.
- Segure a cutícula da larva com duas pinças #5 no meio do tronco da larva e rasgue suavemente as cutículas. Os corpos gordurosos expostos, juntamente com outros tecidos internos da larva, ainda estarão aderidos à carcaça da larva. Puxe o suficiente para expor os órgãos internos tanto quanto possível. Repita este passo para todas as larvas.
- Transferir a carcaça da larva para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de paraformaldeído (PFA) a 4%. Incubar durante 30 min a 25 °C sem agitar os tubos.
CUIDADO: 4% PFA é tóxico. Use luvas e máscaras para proteção.
Observação : recomenda-se preparar 4% PFA em 1x buffer PBS. O pó de PFA não se dissolve em 1x PBS instantaneamente. Assim, a mistura deve ser incubada a 65 °C numa incubadora durante a noite ou agitada intermitentemente durante 45 minutos a 25 °C. - Após 30 min de incubação da carcaça com PFA a 4%, pipetar a solução de PFA, adicionar 500 μL de 1x PBS no tubo e agitar suavemente o tubo em um rotador plano por 10 min antes de descartar a solução de 1x PBS (repetir 3x).
- Usando pinças longas, transfira a carcaça da larva fixa e lavada para um poço na placa spot de 9 depressões preenchida com 1x PBS. Usando pinças #5, remova todos os tecidos corporais não gordurosos.
- Use pinças #5 para montar os pedaços do corpo gordo em uma lâmina de microscópio usando glicerol 80% como meio de montagem e coloque uma lamínula por cima.
NOTA: Antes de montar, verifique o pH do glicerol a 80% (usando papéis de pH, pH = 7 é ideal) para proteger o sinal de GFP. O meio de montagem (ver Tabela de Materiais) com DAPI em glicerol a 80% ajudará na obtenção de imagens dos núcleos das células do corpo adiposo. Essas lâminas são estáveis por 1 semana quando armazenadas no escuro a 4 °C.
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Representative Results
Sob condições de alimentação, a proteína semelhante à ubiquitina marcada com GFP, GFP-Atg8a, é difundida dentro das células. Após a fome, forma puncta verde e rotula autofagossomos. Uma vez que os autofagossomos se fundem com os lisossomos, a GFP é extinta nos autolisossomos ácidos, e os puncta verdes desaparecem. Se a autofagia não for induzida ou a maturação do autofagossomo for acelerada, espera-se que o número de pontos de GFP seja baixo. No entanto, se a fusão entre autofagossomos e lisossomos for bloqueada ou o pH do autolisossomo se tornar básico, espera-se que o número e/ou tamanho da GFP puncta seja alto.
No protocolo aqui apresentado, o sistema FLP/FRT induz recombinação mitótica e gera tecidos com células selvagens e mutantes. Enquanto as células selvagens expressam RFP, as células mutantes não têm expressão de RFP. A expressão de RFP em todas as células do corpo adiposo indicaria que a recombinação mitótica mediada por FLP/FRT não foi induzida com sucesso ou que a mutação é letal celular. Neste último caso (ou seja, se a mutação for letal para células), espera-se que o corpo adiposo da larva tenha algumas células com sinais de RFP de nível mais alto do que as células circundantes.
Na Figura 2, GFP-Atg8a (verde) formou pontos em células selvagens (vermelho), implicando que a autofagia foi induzida com sucesso. Nos clones mutantes (RFP negativo), o padrão de GFP-Atg8a puncta foi diferente daquele nas células selvagens circundantes, sugerindo defeitos de autofagia. Pouquíssimos pontos de GFP-ATG8a foram detectados em clones mutantes de Mu1 (Figura 2B), indicando que a autofagia foi bloqueada nas etapas de iniciação ou acelerou a maturação do autolisossomo. O número e o tamanho de GFP-Atg8a puncta aumentaram consideravelmente nos clones mutantes Mu2 (Figura 2C), sugerindo fusão autofagossomo-lisossomo ou defeitos de acidificação autolisossomos. Mais experimentos são necessários para distinguir essas possibilidades. Além disso, os tamanhos e o número de pontos precisam ser quantificados para determinar se as diferenças observadas são estatisticamente significativas.
Figura 1: Representação esquemática dos procedimentos experimentais para monitoramento do marcador de autofagia GFP-Atg8a em um mosaico de corpo adiposo de larvas portadoras de clones mutantes. O esquema de cruzamento para gerar moscas que expressam GFP-Atg8a nos tecidos do corpo adiposo da larva e carregam clones mutantes é mostrado (uma cepa com uma mutação de ponto letal [Mu] no cromossomo X serve como exemplo). Após choque térmico a 37 °C por 1 h para ativar a expressão de FLP, as células mutantes homozigotas com expressão de GFP-Atg8a podem ser geradas no corpo adiposo de larvas y' w* Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / + corpo adiposo larval. A autofagia é induzida no corpo adiposo incubando-se as larvas em solução de sacarose a 20% por 6 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os padrões de GFP-Atg8a puncta nos clones Mu1 e Mu2 diferiram daqueles nos clones controle. Mu1 e Mu2 são dois mutantes letais independentes no cromossomo X. Isogenizadas y' w*, as moscas FRT19A servem como controle. Os padrões de GFP-Atg8a (verde) foram analisados nos corpos gordurosos de larvas de larvas controle, Mu1 ou Mu2. Os clones mutantes (ou controle) foram marcados negativamente por RFP (vermelho). (A) Nos clones controle (RFP negativo), os padrões de GFP-Atg8a puncta foram semelhantes aos das células RFP positivas circunvizinhas. (B) Nos clones mutantes Mu1 (RFP negativo), os puncta GFP-Atg8a foram bastante reduzidos. (C) Em clones mutantes Mu2 (RFP negativo), o número e o tamanho de GFP-Atg8a puncta foram aumentados. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo descreve os métodos para (1) gerar moscas portadoras de clones mutantes nos corpos gordurosos das larvas, (2) induzir autofagia através da inanição de aminoácidos e (3) dissecar os corpos gordurosos das larvas. A fim de gerar clones com sucesso nos corpos gordurosos das larvas, as seguintes etapas críticas precisam ser realizadas diligentemente. (1) Cronometrar o choque térmico com precisão é crucial, pois a recombinação mitótica só ocorre quando o tecido está sofrendo mitose, e (2) tanto a temperatura quanto a duração do choque térmico são críticas para induzir a expressão de FLP. Recomenda-se um banho de água padrão de 37 °C para 1 h de choque térmico. Considerando a maior possibilidade de morte embrionária/larval durante choque térmico e inanição, múltiplos cruzamentos devem ser estabelecidos para a geração de amostras de tecido suficientes para exames de imagem.
Além disso, algumas etapas podem precisar ser modificadas considerando as condições reais de cultivo. Por exemplo, as diferenças no ambiente e nos meios de cultura de Drosophila entre laboratórios podem afetar as taxas de crescimento das larvas. Portanto, o tempo de desenvolvimento necessário para que os embriões atinjam o estágio inicial de terceiro estádio e a duração da inanição larval (cultivo em 20% de sacarose para induzir autofagia) podem precisar ser padronizados em cada laboratório separadamente.
GFP-Atg8a é o marcador mais comumente usado para determinar a autofagia. No entanto, as alterações no padrão GFP-Atg8a puncta não conseguem identificar o defeito exato da autofagia ou o passo afetado diretamente. Portanto, múltiplos marcadores devem ser analisados para interpretar esses dados com precisão. O protocolo aqui apresentado pode ser adaptado para outras proteínas relacionadas à autofagia com suas respectivas cepas transgênicas25. Múltiplos marcadores marcados com diferentes proteínas fluorescentes (como a proteína de fluorescência azul [PBF]) podem ser analisados simultaneamente para elucidar os processos de iniciação ou fusão. A modificação controlada da autofagia, usando interferência química26 ou RNA de genes críticos27, pode ser combinada com a presente abordagem para elucidar melhor os mecanismos de autofagia. Além disso, a análise de marcadores proteicos endógenos de autofagia (por imunohistoquímica) em tecidos do mosaico é importante para confirmar os fenótipos28.
Embora a autofagia tenha sido originalmente reconhecida como um processo aleatório e não seletivo, evidências crescentes indicam que ela pode ser seletiva e degradar seletivamente organelas citoplasmáticas, como mitocôndrias, retículo endoplasmático, entre outras29. Além disso, o procedimento aqui descrito pode ser aplicado para explorar a autofagia seletiva. Por exemplo, a mitofagia pode ser monitorada em corpos gordurosos de moscas anexando proteínas fluorescentes (como Keima ou etiquetas em tandem GFP-RFP) a uma sequência de alvos mitocondriais30.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Somos gratos à THFC e à BDSC por fornecerem as cepas de mosca. O Dr. Tong Chao é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32030027, 91754103, 92157201) e fundos de pesquisa fundamental para as universidades centrais. Agradecemos à instalação central do Instituto de Ciências da Vida (LSI) pela prestação de serviços.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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