Analyse av sultindusert autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme
Summary
Denne protokollen beskriver induksjon av autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme via næringsutarming og analyserer endringer i autofagi ved bruk av transgene fluestammer.
Abstract
Autofagi er en cellulær selvfordøyelsesprosess. Det leverer last til lysosomene for nedbrytning som svar på ulike påkjenninger, inkludert sult. Funksjonsfeil i autofagi er forbundet med aldring og flere menneskelige sykdommer. Autofagimaskineriet er sterkt konservert – fra gjær til mennesker. Larvefettlegemet til Drosophila melanogaster, en analog for virveldyr lever og fettvev, gir en unik modell for overvåking av autofagi in vivo. Autofagi kan lett induseres av næringssult i larvefettkroppen. De fleste autofagirelaterte gener er bevart i Drosophila. Det er utviklet mange transgene fluestammer som uttrykker merkede autofagimarkører, noe som letter overvåkingen av ulike trinn i autofagiprosessen. Den klonale analysen muliggjør en nøye sammenligning av autofagimarkører i celler med forskjellige genotyper i samme vevsstykke. Den nåværende protokollen beskriver prosedyrer for (1) generering av somatiske kloner i larvefettlegemet, (2) indusering av autofagi via aminosyresult og (3) dissekering av larvefettlegemet, med sikte på å lage en modell for å analysere forskjeller i autofagi ved hjelp av en autofagosommarkør (GFP-Atg8a) og klonal analyse.
Introduction
Autofagi er en “selvspisende” prosess indusert av ulike påkjenninger, inkludert aminosyresult1. Makroautofagi (heretter kalt autofagi) er den mest studerte typen autofagi og spiller en uerstattelig rolle i å opprettholde cellulær homeostase2. Funksjonsfeil i autofagi er forbundet med flere menneskelige sykdommer3. I tillegg er noen autofagirelaterte gener potensielle mål for behandling av ulike sykdommer4.
Autofagi reguleres på en svært sofistikert måte5. Ved sult sekvestrerer isolasjonsmembranene cytoplasmatiske materialer for å danne dobbeltmembranerte autofagosomer6. Autofagosomer smelter deretter sammen med endosomer og lysosomer for å danne amfisomer og autolysosomer. Ved hjelp av lysosomale hydrolytiske enzymer nedbrytes det oppslukte cytoplasmatiske innholdet, og næringsstoffene resirkuleres7.
Autofagi er en evolusjonært bevart prosess8. Drosophila melanogaster er en flott modell for å studere autofagiprosessen in vivo. Aminosyresult induserer lett autofagi i fluefett kroppsvev, en analog av menneskelig lever og fettvev9. Defekter i autofagi forstyrrer de distinkte punctamønstrene til flere autofagirelaterte proteiner, som Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 og p62, blant andre10. Derfor vil en analyse av mønstrene til disse autofagimarkørene bidra til å skjelne forekomsten av autofagidefekter og det defekte autofagitrinnet. For eksempel er det ubiquitinlignende proteinet Atg8 den mest brukte autofagimarkøren11. I Drosophila melanogaster har transgene stammer med et grønt fluorescerende protein (GFP)-merket Atg8a blitt utviklet12. GFP-Atg8a diffunderes i cytosol og kjerner i matede celler. Ved sult blir GFP-Atg8a behandlet og modifisert av fosfatidyletanolamin (PE) og danner puncta, som merker isolasjonsmembranene og fullt utviklede autofagosomer13,14. Gjennom direkte fluorescensmikroskopi kan autofagiinduksjonen lett observeres som en økning i GFP-Atg8 punctadannelse15. Atg8a puncta ville ikke dannes som respons på sult i nærvær av en autofagi initieringsdefekt. Siden GFP-Atg8a kan slukkes og fordøyes av den lave pH-verdien i autolysosomer, kan GFP-Atg8a puncta øke i antall hvis autofagi blokkeres sent i trinn16.
Siden autofagi er svært følsom for ernæringstilgjengelighet17, fører små forskjeller i kulturforhold ofte til variasjoner i fenotyper. Derfor har klonal analyse, en metode som analyserer mutante celler versus villtype kontrollceller i samme vev, en stor fordel i å dissekere autofagidefekter18. Ved å dra nytte av flippase / flippase recognition target (FLP / FRT)-mediert stedsspesifikk rekombinasjon mellom homologe kromosomer, blir fluer som bærer mosaikkvev lett laget19,20. Villtypecellene som omgir mutantcellene danner en perfekt indre kontroll for å unngå individuelle forskjeller21.
Denne studien beskriver hvordan man induserer autofagi ved aminosyresult og genererer GFP-Atg8a-uttrykkende kroppsvev med mosaikkfett. Disse protokollene kan brukes til å analysere forskjeller i autofagi blant mutante kloner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver metodene for å (1) generere fluer som bærer mutante kloner i larvefettlegemene, (2) indusere autofagi gjennom aminosyresult og (3) dissekere larvefettlegemene. For å generere kloner vellykket i larvefettlegemene, må følgende kritiske trinn utføres flittig. (1) Timing av varmesjokket nøyaktig er avgjørende fordi mitotisk rekombinasjon bare skjer når vevet gjennomgår mitose, og (2) både varmesjokktemperatur og varighet er kritiske for å indusere FLP-uttrykk. Et standard vannbad på 3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for THFC og BDSC for å gi fluestammene. Dr. Tong Chao støttes av National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) og grunnleggende forskningsfond for de sentrale universitetene. Vi takker kjernefasiliteten i Life Sciences Institute (LSI) for å tilby tjenester.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
