Analys av svältinducerad autofagi i Drosophila melanogaster Larval Fat Body
Summary
Detta protokoll beskriver induktionen av autofagi i Drosophila melanogaster larvfettkropp via näringsutarmning och analyserar förändringar i autofagi med hjälp av transgena flugstammar.
Abstract
Autofagi är en cellulär självförtunningsprocess. Det levererar last till lysosomerna för nedbrytning som svar på olika påfrestningar, inklusive svält. Fel på autofagi är förknippad med åldrande och flera mänskliga sjukdomar. Autofagi-maskineriet är mycket bevarat – från jäst till människor. Larvfettkroppen hos Drosophila melanogaster, en analog för lever och fettvävnad hos ryggradsdjur, ger en unik modell för övervakning av autofagi in vivo. Autofagi kan lätt induceras av näringshushållning i larvfettkroppen. De flesta autofagirelaterade gener bevaras i Drosophila. Många transgena flugstammar som uttrycker märkta autofagimarkörer har utvecklats, vilket underlättar övervakningen av olika steg i autofagiprocessen. Den klonala analysen möjliggör en nära jämförelse av autofagimarkörer i celler med olika genotyper i samma vävnadsbit. Det nuvarande protokollet beskriver procedurer för (1) generering av somatiska kloner i larvfettkroppen, (2) inducering av autofagi via aminosyrasvält och (3) dissekering av larvfettkroppen, som syftar till att skapa en modell för att analysera skillnader i autofagi med hjälp av en autofagosommarkör (GFP-Atg8a) och klonanalys.
Introduction
Autofagi är en “självätande” process inducerad av olika påfrestningar, inklusive aminosyrasvält1. Makroautofagi (nedan kallad autofagi) är den mest välstuderade typen av autofagi och spelar en oersättlig roll för att upprätthålla cellulär homeostas2. Fel på autofagi är förknippad med flera mänskliga sjukdomar3. Dessutom är vissa autofagirelaterade gener potentiella mål för behandling av olika sjukdomar4.
Autofagi regleras på ett mycket sofistikerat sätt5. Vid svält binder isoleringsmembranen cytoplasmatiska material för att bilda dubbelmembranerade autofagosomer6. Autofagosomer smälter sedan samman med endosomer och lysosomer för att bilda amfisomer och autolysosomer. Med hjälp av lysosomala hydrolytiska enzymer bryts det uppslukade cytoplasmatiska innehållet ned och näringsämnena återvinns7.
Autofagi är en evolutionärt bevarad process8. Drosophila melanogaster är en utmärkt modell för att studera autofagiprocessen in vivo. Aminosyrasvält inducerar lätt autofagi i flygfettkroppsvävnad, en analog av mänsklig lever och fettvävnad9. Defekter i autofagi stör de distinkta punctamönstren hos flera autofagirelaterade proteiner, såsom Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 och p62, bland annat10. Därför kommer analys av mönstren för dessa autofagimarkörer att hjälpa till att urskilja förekomsten av autofagidefekter och det defekta autofagisteget. Till exempel är det ubiquitinliknande proteinet Atg8 den vanligaste autofagimarkören11. I Drosophila melanogaster har transgena stammar med ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt Atg8a framgångsrikt utvecklats12. GFP-Atg8a diffunderas i cytosolen och kärnorna i de matade cellerna. Vid svält bearbetas och modifieras GFP-Atg8a av fosfatidyletanolamin (PE) och bildar puncta, som märker isoleringsmembranen och fullt utvecklade autofagosomer13,14. Genom direkt fluorescensmikroskopi kan autofagiinduktionen lätt observeras som en ökning av GFP-Atg8 puncta-bildning15. Atg8a puncta skulle inte bildas som svar på svält i närvaro av en autofagiinitieringsdefekt. Eftersom GFP-Atg8a kan släckas och smältas av det låga pH-värdet i autolysosomer kan GFP-Atg8a puncta öka i antal om autofagi blockeras i sena stadier16.
Eftersom autofagi är mycket känslig för näringstillgänglighet17, leder små skillnader i odlingsförhållanden ofta till variationer i fenotyper. Därför har klonanalys, en metod som analyserar mutanta celler kontra kontrollceller av vildtyp i samma vävnad, en stor fördel vid dissekering av autofagidefekter18. Genom att utnyttja flippas/flippase recognition target (FLP/FRT)-medierad platsspecifik rekombination mellan homologa kromosomer, görs flugor som bär mosaikvävnader lätt19,20. Vildtypscellerna som omger mutantcellerna bildar en perfekt intern kontroll för att undvika individuella skillnader21.
Den aktuella studien beskriver hur man inducerar autofagi genom aminosyrasvält och genererar GFP-Atg8a-uttryckande mosaikfettkroppsvävnader. Dessa protokoll kan användas för att analysera skillnader i autofagi mellan mutanta kloner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver metoderna för att (1) generera flugor som bär mutanta kloner i larvfettkropparna, (2) inducera autofagi genom aminosyrasvält och (3) dissekera larvfettkropparna. För att generera kloner framgångsrikt i larvfettkropparna måste följande kritiska steg utföras noggrant. (1) Timing av värmechocken exakt är avgörande eftersom mitotisk rekombination endast sker när vävnaden genomgår mitos, och (2) både värmechocktemperatur och varaktighet är avgörande för att inducera FLP-uttryck. Et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för att THFC och BDSC tillhandahåller flugstammarna. Dr. Tong Chao stöds av National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) och grundforskningsmedel för de centrala universiteten. Vi tackar core facility i Life Sciences Institute (LSI) för att tillhandahålla tjänster.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
