Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Konstruktion af cykliske peptider ved hjælp af et on-tether sulfoniumcenter

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64289
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 3, 1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Pingshan Translational Medicine Center, Shenzhen Bay Laboratory, 2Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School, 3Department of Radiation Oncology, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol præsenterer syntesen af cykliske peptider via bisalkylering mellem cystein og methionin og den letkøbte thiol-yne-reaktion udløst af propargylsulfoniumcentret.

Abstract

I de senere år har cykliske peptider tiltrukket stigende opmærksomhed inden for lægemiddelopdagelse på grund af deres fremragende biologiske aktiviteter, og som følge heraf anvendes de nu klinisk. Det er derfor afgørende at søge effektive strategier til syntetisering af cykliske peptider for at fremme deres anvendelse inden for lægemiddelopdagelse. Dette papir rapporterer en detaljeret protokol for effektiv syntese af cykliske peptider ved anvendelse af on-harpiks eller intramolekylær (intermolekylær) bisalkylering. Ved hjælp af denne protokol blev lineære peptider syntetiseret ved at drage fordel af fastfasepeptidsyntese med cystein (Cys) og methionin (Met) koblet samtidigt på harpiksen. Endvidere blev cykliske peptider syntetiseret via bisalkylering mellem Met og Cys ved hjælp af en indstillelig tether og et on-tether sulfoniumcenter. Hele den syntetiske rute kan opdeles i tre hovedprocesser: afbeskyttelse af Cys på harpiksen, koblingen af linkeren og cykliseringen mellem Cys og Met i en trifluoreddikesyre (TFA) spaltningsopløsning. Desuden, inspireret af sulfoniumcentrets reaktivitet, blev en propargylgruppe knyttet til Met for at udløse thiol-yne-tilsætning og danne et cyklisk peptid. Derefter blev de rå peptider tørret og opløst i acetonitril, adskilt og derefter renset ved højtydende væskekromatografi (HPLC). Molekylvægten af det cykliske peptid blev bekræftet af væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), og stabiliteten af den cykliske peptidkombination med reduktionsmidlet blev yderligere bekræftet ved anvendelse af HPLC. Derudover blev det kemiske skift i det cykliske peptid analyseret af 1 H kernemagnetisk resonans (1H NMR) spektre. Samlet set havde denne protokol til formål at etablere en effektiv strategi for syntetisering af cykliske peptider.

Introduction

Protein-protein-interaktioner (PPI'er)1 spiller en central rolle i forskning og udvikling af lægemidler. Konstruktion af stabiliserede peptider med en fast konformation ved kemiske midler er en af de vigtigste metoder til udvikling af mimetiske motiver af PPI'er2. Til dato er der udviklet flere cykliske peptider, der er målrettet mod PPI'er til klinisk brug3. De fleste peptider er begrænset til en α-helix-konformation for at mindske konformationsentropien og forbedre den metaboliske stabilitet, målbindende affinitet og cellepermeabilitet 4,5. I de sidste 2 årtier er sidekæderne af Cys 6,7, lysin8,9, tryptophan 10, arginin 11 og Met12,13 blevet indsat i unaturlige aminosyrer for at fiksere peptidet i en cyklisk konformation. Sådanne cykliske peptider kan målrette mod et unikt kemisk rum eller specielle steder og derved udløse en kovalent reaktion for at danne protein-peptidkovalent binding14,15,16,17. I en nylig rapport af Yu et al. blev et chloracetamid forankret på peptidligandernes domæne, hvilket sikrede en kovalent konjugationsreaktion med fremragende proteinspecificitet18. Desuden blev elektrofile sprænghoveder, såsom acrylamid og arylsulfonylfluorid (ArSO2F), yderligere inkorporeret i peptider af Walensky et al.19 for at danne stabiliserede peptidkovalente hæmmere og forbedre antitumoreffekten af peptidhæmmere. Derfor er det meget vigtigt at introducere en yderligere funktionel gruppe for kovalent at ændre protein-peptidligander20. Disse grupper reagerer ikke kun med proteiner på sidekæden, men stabiliserer også den sekundære struktur afpeptidet 21. Anvendelsen af kovalent modificerede proteiner induceret af peptidligander er imidlertid begrænset på grund af den komplicerede syntetiske vej og den ikke-specifikke binding af de kemiske grupper22,23. Der er derfor et presserende behov for effektive strategier til syntese af cykliske peptider.

Inspireret af de mangfoldige strategier for cykliske peptider 2,24,25,26 forsøger denne protokol at udvikle en enkel og effektiv metode til stabilisering af peptider. Derudover bemærkede vi, at sidekædegruppen af et stabilt peptid kunne reagere kovalent med et målprotein, når det var rumligt tæt på peptidliganderne. Manglen på kemisk modificeret Met blev udfyldt af Deming-gruppen i 2013 ved at udvikle en ny metode til fremstilling af selektivt modificeret peptid methionin27. Baseret på denne baggrund fokuserede Shi et al. på udviklingen af ringlukningen af sidekæder for at danne et sulfoniumsaltcenter. Når peptidliganden kombineres med målproteinet, reagerer sulfoniumsaltgruppen kovalent med det rumligt tætte Cys-protein. I de senere år har Shi et al. designet en ny metode til stabilisering af cyklisk peptid28. Sulfoniumsaltet på det cykliske peptid blev reduceret med et reduktionsmiddel med en sulfhydrylgruppe, der blev reversibelt reduceret til Met. Reaktionen havde imidlertid lav effektivitet, hvilket var skadeligt for efterfølgende biologiske applikationsundersøgelser. I den nuværende undersøgelse blev der designet en Met-Cys og propargylbromid-Cys ringlukningsreaktion, hvor et enkelt sulfoniumsalt forblev på sidekæden af det cykliske peptid. Sulfoniumsaltet fungerede som et nyt sprænghoved, der reagerede kovalent med proteinet Cys under rumlig nærhed. Kort fortalt blev et Cys og Met muteret peptid cycliseret ved intramolekylær alkylering, hvilket resulterede i dannelsen af et on-tether sulfoniumcenter. I denne proces var dannelsen af en sidekædebro kritisk for cykliske peptider. Samlet set beskriver denne protokol en detaljeret sulfoniumbaseret peptidcyklisering, der opnås ved hjælp af enkle reaktionsbetingelser og operationer. Målet er at udvikle en potentiel metode til yderligere brede biologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af udstyr

FORSIGTIG: Morfolin, N, N-dimethylformamid (DMF), dichlormethan (DCM), N, N-diisopropylethylamin (DIPEA), TFA, morfolin, piperidin, diethylether og methanol er giftige, flygtige og ætsende. Disse reagenser kan skade menneskekroppen gennem indånding, indtagelse eller hudkontakt. Til alle kemiske eksperimenter skal du bruge beskyttelsesudstyr, herunder engangshandsker, eksperimentelle frakker og beskyttelsesbriller.

  1. Alle peptidsubstrater konstrueres på Rink-amid 4-methylbenzhydrylamin (MBHA)-harpiks ved hjælp af standard manuel Fmoc-baseret fastfasepeptidsyntese (SPPS)29, som vist i figur 1.
  2. Brug en af de to muligheder til konstruktion af lineære peptider: den ene, syntetisere peptidet ved hjælp af kondenseringsmiddel 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N, N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU) og et reagens af DIPEA; eller to, syntetisere ved anvendelse af 1-hydroxybenzotriazol (HOBT) og N,N'-diisopropylcarbodiimid (DIC) som amidkondensationsreagens. Vælg en passende protokol for peptidsyntese i henhold til peptidsekvensen.
  3. For at etablere en manuel peptidsynteseanordning skal du opsætte modificeret vakuumudsugningsudstyr til fast fase i en røghætte og forbinde det med en trevejs stophane. Placer derefter en polypropylenfilterpatron eller glasreaktor på udstyret, mens den er tilsluttet nitrogen (N2) gas.
    BEMÆRK: For at ændre vakuumudsugningsudstyret til fast fase skal du fjerne ekstraktionsrøret og beholde det vakuumforseglede system.
  4. Læg MBHA-harpiks i de harpiksfyldte kolonner og opløs den i DMF. Juster kontakten på trevejs stophanerne for N2 boblende, og fjern derefter opløsningsmidlet i søjlen ved hjælp af en arbejdspumpe, der er tilsluttet et vakuumsystem. Beregn mængden af aminosyre eller kondenseringsmiddel, der kræves ved hjælp af følgende formel:
    Aminosyre (g) og kondenseringsmiddel (g) = harpiksskala (g) × harpiksbelastningskapacitet (mM/g) × ækvivalent (5 ækvm) × molekylvægt (g/M)
    BEMÆRK: Vælg mængden af indlæst harpiks i henhold til koblingspeptidets længde. Flere ækvivalenter (eq) af aminosyrer bruges til at reagere mere fuldstændigt. Flydende opløsningsmidler skal omdannes til volumen efter densitet. De 5 eq viser, at inputmængden af den beregnede forbindelse forstærkes med en faktor på fem.

2. Fremstilling af harpiks

BEMÆRK: Vælg mængden af indlæst harpiks i henhold til koblingspeptidets længde.

  1. 302 mg Rink-amid MBHA-harpiks (0,331 mM/g fyldt) vejes i en søjle (20 ml reservoir). Tilsæt 5-10 ml DCM eller DMF i kolonnen for at svulme harpiksen under N2 boblende i 30 min.
  2. Luk derefter N2-kontakten , og tænd derefter vakuumpumpens sugekontakt for at fjerne opløsningsmidlet. Vask derefter harpikserne sekventielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.

3. N-terminal Fmoc debeskyttelse

BEMÆRK: Debeskyttelse ved morfolin kræver 30 min, og debeskyttelse med piperidin tager 5 min.

  1. Forbered N-terminal 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) afbeskyttelsesopløsning: Forbered et tilstrækkeligt volumen (500 ml) 20% (v / v) piperidin eller 50% (v / v) morfolin i DMF i en glasbeholder til Fmoc-gruppeafbeskyttelse.
  2. Tilsæt 10 ml afbeskyttelsesopløsning til kolonnen, boble N2 i opløsningen i 30 min eller 5 min 2x, og gentag afbeskyttelsesprocedurerne 2x.
  3. Tøm opløsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekventielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.
  4. Registrer harpiksen som en mørk gul farveopløsning med 5% ninhydrin (Kaiser-test) efter hver afbeskyttelse for at bekræfte fraværet af Fmoc-gruppen før koblingstrinnet. I detaljer tilsættes 1 ml DMF til en lille mængde harpiks og tilsættes 200 μL 5% ninhydrin til et glasrør opvarmet ved 130 ° C i 3 minutter for at vurdere ændringer i harpiksfarven.
  5. Tøm opløsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekventielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.

4. Kobling af det lineære peptid (figur 2)

BEMÆRK: Når de syntetiske peptidsekvenser indeholder to eller flere gentagne enheder, kan koblingsproceduren udføres direkte ved at vælge aminosyretypen, såsom Fmoc-AA-OH eller Fmoc-AAA-OH, og så videre. Nogle specielle aminosyrer med sterinhindring og peptider med længere aminosyresekvenser er nødvendige for korrekt at forlænge reaktionstiden for kobling.

  1. For et enkelt koblingstrin skal du tage koblingen af Cys-rest som et eksempel (syntetisere 300 mg harpiksskalaer). Der fremstilles en blandingsopløsning, herunder Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 ækv., 292 mg) og HATU (5 ækv., 206 mg) eller Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 ækv., 292 mg) og HOBT (5 eq, 106 mg) i et polypropylenrør og opløses i 3 ml DMF.
  2. Der tilsættes 173 μL DIPEA (10 eq) eller 154 μL DIC (10 eq) til opløsningen af Cys for at aktivere aminosyren. Lad blandingen foraktivere i 1 min. Tilsæt blandingen til søjlen med harpiks, og boble den medN2 i 2 timer.
    BEMÆRK: Den specifikke reaktionstid, der kræves, bør standardiseres til påvisning af 5% ninhydrin.
  3. Efter kobling tilsættes 1 ml DMF til en lille mængde harpiks og tilsættes 200 μL 5% ninhydrin til et glasrør opvarmet ved 130 °C i 3 min. Overhold harpiksændringen til farveløs for at bekræfte fraværet af en fri aminogruppe før afbeskyttelsestrinnet.
  4. Tøm opløsningen ved hjælp af en vakuumpumpe og vask harpiksen sekventielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.
  5. Tilsæt 10 ml afbeskyttelsesopløsning til kolonnen, boble med N2 i 30 min eller 5 min 2x, tilsæt frisk opløsning, og gentag afbeskyttelsesprocedurerne 2x.
  6. Gentag følgende trin: afbeskyttelse af Fmoc-gruppen; detektering af harpiks debeskyttelse; vask af harpiksen; kobling af aminosyren; detektering af koblingsreaktionen. Gentag koblingstrinnet, indtil alle peptider er syntetiseret.
    BEMÆRK: Brug Kaiser-testen til at overvåge, om hvert trin i afbeskyttelsen er fuldført, eller om hvert trin i aminosyrekoblingen er grundigt. Alternativt kan en lille mængde peptid spaltes fra harpiksen og kontrolleres af LC-MS for vellykket kobling.

5. Bisalkylering mellem Met og Cys (figur 3)

  1. Konstruer et lineært peptid med Met og Cys ved at gentage trin 4.1-4.6. Tilsæt 10 ml vandfri methanol til søjlen med harpiks til dehydrering og tør med N2 til næste brug (gentag 2x) efter lineær peptidkobling.
  2. Vej 100 mg af harpiksen opnået i det foregående trin i en søjle (20 ml reservoir) og vask harpiksen med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) før koblingstrinnet.
  3. Forbered en opløsning til fjernelse af Cys trt (trityl) beskyttelsesgruppen. Der fremstilles et tilstrækkeligt volumen (100 ml) TFA/TIS/DCM (3:5:92) i en glasbeholder til fjernelse af beskyttelsesgruppen.
  4. Der tilsættes 5-10 ml af opløsningen af TFA/TIS/DCM (3:5:92) til kolonnen for at fjerne beskyttelsesgruppen i 10 minutter. Gentag seks gange med N2 boblende, indtil den gule farve helt forsvinder.
  5. Tøm opløsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekventielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.
  6. Forbered en løsning til at reagere med debeskyttede Cys. Der fremstilles et tilstrækkeligt volumen (50 ml) blandingsopløsning (DMF), herunder di-halogeneret linker (2 ækv.) og DIPEA (4 ækv.) til at reagere med afbeskyttet Cys.
  7. Tilsæt 5-10 ml reaktionsopløsning til søjlen for at reagere med debeskyttede Cys i mindst 3 timer med N2 boblende. Dehydrere med vandfri methanol og tørre med N2 til næste brug.
  8. Tøm opløsningen med en vakuumpumpe og vask harpiksen sekventielt med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) 5x.
  9. Forbered en opløsning til peptidcyklisering: Forbered et tilstrækkeligt volumen (20 ml) TFA-blanding (TFA: TIS: H 2 O = 95: 2.5:2.5) i en glasbeholder i røghætten til peptidcyklisering.
  10. Tilsæt 5-10 ml TFA-blandingsopløsning til polypropylenrøret og spalte harpiksen under TFA-cocktailen i 3 timer.
    FORSIGTIG: TFA er meget ætsende og irriterende; Peptidspaltningsprocessen skal udføres i en røghætte.
  11. Trin 7.1-7.5 udføres for at opnå en lineær peptidopløsning ved omvendt fase væskefaserensning (HPLC). Frys-tør opløsningen til næste brug.

6. Propargylsulfoniumsaltcyklisering (figur 4)

  1. Konstruer et lineært peptid med Met og Cys ved at gentage trin 4.1-4.6. Tilsæt 10 ml vandfri methanol til kolonnen med harpiksen til dehydrering og tør med N2 til næste brug (gentag to gange) efter lineær peptidkobling.
  2. Vej 100 mg af harpiksen opnået i det foregående trin i en søjle (20 ml reservoir) og vask harpiksen med DCM (5-10 ml) og DMF (5-10 ml) før koblingstrinnet.
  3. Trin 7.1-7.5 udføres for at opnå en lineær peptidopløsning ved HPLC, og prøven frysetørres som nævnt til næste brug.
  4. Der fremstilles en vandig opløsning på 1 % HCOOH (i volumen) og 1,0 mM propargylbromid (5 ækv.), og der tilsættes Met-peptidopløsningen (0,2 mM, 1 ækv.; 0,2 ml MeCN/H2O[1:1, v/v]).
  5. Ryst derefter koblingsreaktionen af Met og propargylbromid ved stuetemperatur i 12 timer.
  6. Efter reaktionen opløses produktet i et polypropylenrør i acetonitril og filtreres gennem en 0,22 μmfiltermembran. Rens derefter opløsningen med omvendt fase HPLC med det samme og frysetørrer den til pulver til næste brug.
  7. I det sidste trin tilsættes peptidet med propargylbromid til et polypropylenrør, reaktionsopløsningens pH-værdi holdes på 8,0 ved tilsætning af (NH4)2CO3-opløsning , og reaktionsblandingen rystes ved 37 °C i 12 timer. Dette trin opnår det cykliske peptid af propargylsulfoniumsalt.
  8. Opsamling den sidste reaktionsblanding: Opløs den i et polypropylenrør i acetonitril og filtrer den gennem en 0,22 μm filtermembran. Rens derefter opløsningen med omvendt fase HPLC med det samme og frysetørrer den til pulver til næste brug.

7. Oprensning af cykliske peptider

  1. Konstruer lineære peptidsubstrater på Rink-amid MBHA-harpiks ved at gentage trin 4.1-4.6. Tilsæt 10 ml vandfri methanol til kolonnen med harpiks til dehydrering og tør med N2 til næste brug (gentag to gange) efter lineær peptidkobling.
  2. Tilbered en tilstrækkelig mængde spaltningscocktail (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) i røgemhætten. Tilsæt 1-5 ml TFA-blandingsopløsning til polypropylenrøret og spalte harpiksen under TFA-cocktailen i 3 timer.
  3. Tør derefter harpiksen sekventielt under en damp afN2 i søjlen. Alternativt kan du bruge en filteranordning til at filtrere harpiksen og opsamle peptidopløsningen. Derefter tilsættes 20 ml ether til peptidopløsningen for at udfælde peptidet, centrifuge ved 3.500 x g i 5 minutter og gentages to gange. Saml råpeptidet bundfaldet og tør det under en strøm af N2 til næste trin.
  4. 200 mg råpeptid opløses i et polypropylenrør i 4 ml acetonitrilvandopløsning og filtreres gennem et 0,22 μm filter. Overfør peptidet til en HPLC hætteglasindsats. Anbring indsatsen i autosampleren af et semi-præparativt omvendt fase HPLC-system udstyret med en C18 5 μm, 4,6 mm x 250 mm søjle og en 1 ml injektionssløjfe.
  5. Rens og isoler peptidet ved hjælp af et gradientprogram på 5%-95% acetonitril i vand med 0,1% TFA over 30 minutter, mens HPLC-spektrene overvåges ved hjælp af UV ved 254 nm. Bekræft peptidmolekylvægten med LC-MS, opsamling opløsningen af peptidet og frys-tør det i pulver til næste brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle de lineære peptider blev syntetiseret på Rink-amid MBHA-harpiks ved standard manuel Fmoc fastfasesyntese. En model cyklisk hexapeptid (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) blev konstrueret som beskrevet i figur 5A. Især blev et nyt chiralt center genereret af Met-alkylering, med de to epimerer af cyklisk peptid (Ia, Ib) bekræftet af omvendt fase HPLC. Endvidere blev konverteringen og forholdet mellem epimerer bestemt ved hjælp af integrationen af omvendt fase HPLC. Cyklisk Ac-(cyclo-I)-WMAAAC-NH 2 peptider 1-Ia og 1-Ib, genereret fra hexapeptid Ac-WMAAAC-NH2, udviste forskellige retentionstider og identiske molekylvægte (figur 5B). Dernæst blev tolerancen for det cykliske peptid til forskellige funktionelle grupper yderligere testet, som vist i figur 5C. Looplukningseffektiviteten af de 10 lineære peptider blev evalueret ved hjælp af en di-halogeneret linker, hvor resultaterne viste, at alle peptiderne effektivt genererede de tilsvarende cykliske peptider. Sammenlignet med de andre cykliske peptider producerede et hexacyklisk cyklisk peptid med høje konverteringsfrekvenser et differentielt forhold på 1: 1 af epimererne og kunne adskilles af HPLC. I nogle tilfælde kunne peptidepimererne imidlertid ikke adskilles under HPLC-betingelser, sandsynligvis på grund af epimerens sulfoniumkirale centrum, der ikke var meget stabilt og langsomt blev racemiseret i epimerblandinger. Reaktionseffektiviteten af epimererne (1-Ia) med pyridinrthioler (PyS) (10 mM) blev derefter undersøgt af HPLC. Figur 5D viser HPLC-sporene af den tidsafhængige omdannelse mellem det cykliske peptid (1 mM) og dets konjugerede produkt. Sporene viser tydeligt den tidsafhængige reduktion af peptid 1-Ia med PyS i PBS (pH 7,4).

En anden strategi for lukning af peptidring var, at først en propargylgruppe blev knyttet til Met, og derefter udløste det dannede propargylsulfoniumcenter en thiol-yne-reaktion for at generere et cyklisk peptid. I denne strategi påvirkede ringstørrelsen og peptidsekvensen ikke cykliseringsreaktionen, hvor peptidet indeholdende to eller tre aminosyrer bare blev brugt som model til at lukke sløjfen. Den syntetiske rute for intramolekylær peptidcyklisering er beskrevet i figur 6A. Derudover blev der konstrueret et forenklet propargyleret Met-modelpeptid som beskrevet i figur 6B. Resultaterne viste, at modelpeptidet MC's udbytte kunne være op til 80%, når reaktionsopløsningens pH blev indstillet til 8,0 (MC refererer til et modelcyklisk peptid syntetiseret ved denne rute; Figur 6A). Desuden blev modelpeptidet MC isoleret og oprenset af HPLC (figur 6D), og dets molekylvægt blev bekræftet af LC-MS (figur 6C). Som vist i figur 6E blev det kemiske skift yderligere karakteriseret ved 1H NMR og heteronuklear enkeltkvantekohærens (HSQC). Derudover blev dithiothreitol (DTT) tilføjet for at forsøge at åbne sulfoniumringen for at undersøge stabiliteten af MC. Resultaterne viste ingen tilsætnings- eller ringåbningsprodukter efter 24 timer (figur 6F).

Figure 1
Figur 1: Diagram over den eksperimentelle opsætning for et Fmoc-baseret fastfasepeptid til syntetisering af peptider. Peptidkolonnen blev anbragt på fastfasereaktoren via trevejs stophaner med nitrogen eller argon, der boblede gennem søjlen under peptidsyntese. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Intermolekylære syntetiske CM-peptider på harpiks. Alle de lineære peptider blev syntetiseret på Rink-amid MBHA-harpiks ved standard manuel Fmoc fastfasesyntese. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Syntetiske ruter til peptidcyklisering via Cys og Met bisalkylering. De lineære peptider indeholdende Met og Cys blev konstrueret som stabiliserede cykliske peptider. For det første blev de trt-beskyttede Cys debeskyttet med 3% TFA i DCM. Derefter blev en di-halogeneret linker (2 eq) og DIPEA (4 eq) tilføjet for at reagere med Cys i 3 timer. Endelig blev cyklisering mellem Cys og Met afsluttet, da harpiksen blev spaltet i en TFA-spaltningsopløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Syntetiske ruter til peptidcyklisering via Cys og Met thiol-yne. For det første blev de lineære peptider oprenset og karakteriseret ved HPLC og LC-MS. Reaktionen forekom under følgende betingelser: En opløsning inklusive forbindelsen (0,2 mM, 1,0 eq) i 0,2 ml MeCN/H2 O (1:1, v/v), 1% vandig opløsning (i volumen) og propargylbromid (1,0 mM, 5,0 eq) blev rystet ved stuetemperatur i12timer ved en pH-værdi på 8,0. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Synteseskema for cykliske peptider ved anvendelse af bisalkylering mellem Cys og Met. (A) Skematisk illustration af peptidcyklisering af Cys og Met. (B) SYMERS HPLC- og LC-MS-spektrum (1-Ia og 1-Ib). (C) Den funktionelle resttolerance for de forskellige peptider blev testet. D) HPLC-spor af den tidsafhængige omdannelse mellem epimerer (1-Ia; 1 mM) og deres konjugerede produkter. Dette tal er en ændring af det, der er rapporteret af Wang et al.30. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Synteseskema for cykliske peptider ved anvendelse af en thiol-yne-type reaktion. (A) Letkøbt konstruktion af peptidcyklisering ved thiol-yne-reaktionen. MC refererer til et model cyklisk peptid syntetiseret af ruten. (B) Intramolekylær peptidcyklisering af forskellige lineære peptider. a = 1 ml vandig opløsning på 1 M (NH4)2CO3. b = 1% et3n i 1 ml MeCN/H2O (1:1). Forkortelser: Ahx = 6-aminocaproinsyre. Udbyttet blev beregnet som procentdelen af produktet bestemt ved vejning. Konvertering repræsenterede mængden af udgangsmateriale, der reagerede af HPLC. (C) LC-MS-spektret af MC-cykliseringspeptidet. (D) HPLC-spektret af MC-cykliseringspeptidet. (E) 1H NMR- og HSQC-spektrekarakterisering af MC-cykliske peptider. F) 1H NMR-spektre af den tidsafhængige omdannelse mellem MC-cyklisk peptid og DTT i D2 O i 3 timer, 6 timer,12timer og 24 timer. Dette tal er en ændring af det, der er rapporteret af Hou et al.31. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den syntetiske tilgang, der er beskrevet i dette papir, giver en metode til syntetisering af cykliske peptider ved hjælp af Cys og Met i peptidsekvensen, hvor de grundlæggende lineære peptider konstrueres ved almindelige fastfasepeptidsynteseteknikker. Til bisalkylering af cykliske peptider mellem Cys og Met kan hele den syntetiske rute opdeles i tre hovedprocesser: afbeskyttelse af Cys på harpiksen, koblingen af linkeren og cykliseringen mellem Cys og Met i en trifluoreddikesyrespaltningsopløsning. Især blev fjernelsen af den beskyttende gruppe af Cys fundet at være et kritisk skridt for den efterfølgende ringlukningsreaktion. Derfor blev trt-Cys afbeskyttet, og dette blev gjort, indtil opløsningen ikke havde nogen tilsyneladende gul farve. Yderligere undersøgelser viste, at cykliske peptider udviklet ved bisalkylering mellem Cys og Met-metoden kunne udvides til looplukning i en række peptider, idet betingelsen er, at peptidet indeholder aminosyrerne Cys og Met. Derudover kan peptidsekvensen og linkeren også justeres yderligere i henhold til det eksperimentelle design (figur 5). Det var derfor nødvendigt at overvåge LC-MS's syntese.

For cykliske peptider i thiol-yne-typereaktionen blev lineære peptider for det første også konstrueret ved almindelige fastfasepeptidsynteseteknikker på harpiks, med følgende reaktioner udført i væskefaseopløsningen. Rå peptider blev derefter spaltet fra harpiksen og renset ved omvendt fase HPLC. En opløsning af peptider og propargylbromid blev tilsat til reaktionen i 12 timer sammen med 0,2 ml MeCN/H2O(1:1, v/v) og 1% HCOOH vandig opløsning, og produkterne blev derefter straks renset ved omvendt fase HPLC. Overraskende nok opstod ringlukningsreaktionen, når pH i reaktionsopløsningen blev øget til 8,0. Denne undersøgelse har udviklet en metode, der begrænser peptidet til en cyklisk konformationsstruktur med god stabilitet via en thiol-yne type reaktion. Desuden var det nødvendigt at justere opløsningsmidlet til peptidsløjfelukningen på grund af peptidernes hydrofilicitet og hydrofobicitet var anderledes. For eksempel blev pH i det hydrofile peptid justeret med (NH4)2CO 3, og det hydrofobe peptid blev derefter justeret med et blandet opløsningsmiddel (1% Et3 N-opløsning i 50% MeCN/H2O; Figur 6).

I de senere år er der udviklet forskellige ligeringsteknologier til syntetisering af cykliske peptider, hvor disse teknologier genererer naturlige peptidbindinger og unaturlige rygradsforbindelser32. Der er dog stadig udfordringer inden for det syntetiske cykliske peptidfelt. For det første har aminosyresekvensen af peptidet en sterisk virkning, og effektiviteten af cyklisering kan påvirkes af resterne tæt på cycliseringsstedet. For det andet er peptidernes rumlige struktur forskelligartet, og det kan være nødvendigt at omhyggeligt vælge forbindelsesstedet under ringlukning på samme sted. Endelig indeholder peptidsekvenser hydrofile eller hydrofobe aminosyrer, og derfor skal opløseligheden af reaktionsopløsningsmidlet overvejes. Derfor bør der gøres en større indsats for at identificere cyklisering på stedet, opløselighed og isomerer for at videreudvikle cykliske peptidapplikationer i medicinalindustrien.

I denne forskning blev en række letkøbte makrocykliseringsprotokoller ved hjælp af bisalkylering mellem Cys og Met eller via en thiol-yne-type reaktion designet til at løse udfordringerne ved syntetisering af cykliske peptider. Heldigvis var disse reaktioner letkøbte, meget effektive og metalkatalysatorfrie. De udviklede metoder har vist sig at udføre både intermolekylært og intramolekylært og har tilfredsstillende funktionel gruppetolerance. Desuden blev disse metoder udviklet til at introducere begrænsningscyklisering, hvilket sikrer, at peptidkæden er mere konformationelt stabiliseret, hvilket forbedrer målproteinbindingsaffiniteten og reducerer uspecifik proteinbinding. Derudover kan reaktionsstedets selektivitet ved hjælp af rimelige designs også forbedres ved at danne et konformationsstabiliseret cyklisationspeptid. Samlet set genererede peptidkædecyklisering biologisk aktive forbindelser, hvilket indikerer, at cykliske peptider er lovende lægemiddelkandidater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender økonomisk støtte fra Kinas nationale centrale F &U-program (2021YFC2103900); Natural Science Foundation of China-tilskud (21778009 og 21977010); Naturvidenskabsfonden i Guangdong-provinsen (2022A1515010996 og 2020A1515010521): Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 og JCYJ20200109140406047); og Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions bevilling (2019SHIBS0004). Forfatterne anerkender tidsskriftsstøtte fra Chemical Science, The Royal Society of Chemistry til reference 30 og The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, til reference 31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography		 SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Tags

Kemi udgave 187 cykliske peptider bisalkylering / dealkylering propargylbromid stabilisering cystein methionin
Konstruktion af cykliske peptider ved hjælp af et on-tether sulfoniumcenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu,… More

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter