Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

On-Tether Sülfonyum Merkezi Kullanarak Döngüsel Peptitlerin Oluşturulması

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64289
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 3, 1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Pingshan Translational Medicine Center, Shenzhen Bay Laboratory, 2Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School, 3Department of Radiation Oncology, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, sistein ve metiyonin arasındaki bisalkilasyon yoluyla siklik peptitlerin sentezini ve propargil sülfonyum merkezi tarafından tetiklenen fakil tiol-yne reaksiyonunu sunar.

Abstract

Son yıllarda, siklik peptitler, mükemmel biyolojik aktiviteleri nedeniyle ilaç keşfi alanında giderek daha fazla dikkat çekmektedir ve sonuç olarak, şimdi klinik olarak kullanılmaktadırlar. Bu nedenle, ilaç keşfi alanındaki uygulamalarını teşvik etmek için siklik peptitleri sentezlemek için etkili stratejiler aramak çok önemlidir. Bu yazıda, on-reçine veya intramoleküler (moleküller arası) bisalkilasyon kullanılarak siklik peptitlerin etkin sentezi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol kullanılarak, lineer peptitler, reçine üzerinde aynı anda bağlanmış sistein (Cys) ve metiyonin (Met) ile katı faz peptid sentezinden yararlanılarak sentezlendi. Ayrıca, siklik peptitler, ayarlanabilir bir tether ve bir tether sülfonyum merkezi kullanılarak Met ve Cys arasında bisalkilasyon yoluyla sentezlendi. Tüm sentetik yol üç ana sürece ayrılabilir: reçine üzerindeki Cys'nin korunmasının azaltılması, bağlayıcının bağlanması ve bir trifloroasetik asit (TFA) bölünme çözeltisinde Cys ve Met arasındaki döngüselleşme. Ayrıca, sülfonyum merkezinin reaktivitesinden esinlenerek, tiol-yne ilavesini tetiklemek ve siklik bir peptit oluşturmak için Met'e bir propargil grubu bağlandı. Bundan sonra, ham peptitler kurutuldu ve asetonitril içinde çözüldü, ayrıldı ve daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırıldı. Siklik peptidin moleküler ağırlığı, sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile doğrulandı ve indirgeyici ile siklik peptid kombinasyonunun stabilitesi HPLC kullanılarak daha da doğrulandı. Ek olarak, siklik peptitteki kimyasal kayma, 1 H nükleer manyetik rezonans (1H NMR) spektrumu ile analiz edildi. Genel olarak, bu protokol siklik peptitlerin sentezlenmesi için etkili bir strateji oluşturmayı amaçlamıştır.

Introduction

Protein-protein etkileşimleri (PPI'lar)1, ilaç araştırma ve geliştirmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Stabilize peptitlerin kimyasal yollarla sabit bir konformasyonla oluşturulması, PPI'ların mimetik motiflerini geliştirmek için en önemli yöntemlerden biridir2. Bugüne kadar, ÜFE'leri hedef alan birkaç siklik peptit klinik kullanım için geliştirilmiştir3. Çoğu peptit, konformasyonel entropiyi azaltmak ve metabolik stabiliteyi, hedef bağlama afinitesini ve hücre geçirgenliğini iyileştirmek için bir α-sarmal konformasyonu ile sınırlıdır 4,5. Son 2 yılda, Cys6,7, lizin8,9, triptofan 10, arginin 11 ve Met12,13'ün yan zincirleri, peptidi siklik bir konformasyona sabitlemek için doğal olmayan amino asitlere yerleştirilmiştir. Bu tür siklik peptitler benzersiz bir kimyasal alanı veya özel bölgeleri hedefleyebilir, böylece protein-peptit kovalent bağlanması14,15,16,17 oluşturmak için kovalent bir reaksiyonu tetikleyebilir. Yu ve ark. tarafından yakın zamanda yayınlanan bir raporda, peptid ligandlarının alanına bir kloroasetamid tutturulmuş ve mükemmel protein özgüllüğü18 ile kovalent bir konjugasyon reaksiyonu sağlanmıştır. Ayrıca, akrilamid ve aril sülfonil florür (ArSO2F) gibi elektrofilik savaş başlıkları, stabilize peptid kovalent inhibitörleri oluşturmak ve peptid inhibitörlerinin anti-tümör etkisini iyileştirmek için Walensky ve ark.19 tarafından peptitlere daha fazla dahil edilmiştir. Bu nedenle, protein-peptid ligandlarını kovalent olarak modifiye etmek için ek bir fonksiyonel grup tanıtmak çok önemlidir20. Bu gruplar sadece yan zincirdeki proteinlerle reaksiyona girmekle kalmaz, aynı zamanda peptid21'in ikincil yapısını da stabilize eder. Bununla birlikte, peptid ligandları tarafından indüklenen kovalent modifiye proteinlerin uygulanması, karmaşık sentetik yol ve kimyasal grupların spesifik olmayan bağlanması nedeniyle sınırlıdır22,23. Bu nedenle, siklik peptitlerin sentezi için etkili stratejiler acilen gereklidir.

2,24,25,26 siklik peptitlerin çok yönlü stratejilerinden esinlenen bu protokol, peptitleri stabilize etmek için basit ve etkili bir yöntem geliştirmeye çalışır. Ek olarak, kararlı bir peptidin yan zincir grubunun, peptid ligandlarına mekansal olarak yakın olduğunda bir hedef protein ile kovalent olarak reaksiyona girebileceğini belirttik. Kimyasal olarak modifiye edilmiş Met'in eksikliği, 2013 yılında Deming grubu tarafından, seçici olarak modifiye edilmiş peptid metiyonin27 üretmek için yeni bir yöntem geliştirilerek dolduruldu. Bu arka plana dayanarak, Shi ve ark. bir sülfonyum tuz merkezi oluşturmak için yan zincirlerin halka kapanmasının geliştirilmesine odaklandı. Peptit ligandı hedef protein ile birleştiğinde, sülfonyum tuzu grubu, mekansal olarak yakın Cys proteini ile kovalent olarak reaksiyona girer. Son yıllarda, Shi ve ark. siklik peptid28'i stabilize etmek için yeni bir yöntem tasarladılar. Siklik peptit üzerindeki sülfonyum tuzu, geri dönüşümlü olarak Met'e indirgenmiş bir sülfhidril grubuna sahip bir indirgeyici ajan tarafından indirgenmiştir. Bununla birlikte, reaksiyon düşük verimliliğe sahipti ve bu da sonraki biyolojik uygulama çalışmalarına zararlıydı. Bu çalışmada, siklik peptidin yan zincirinde kalan tek bir sülfonyum tuzu ile bir Met-Cys ve propargil bromür-Cys halka kapatma reaksiyonu tasarlanmıştır. Sülfonyum tuzu, uzaysal yakınlık altında Cys proteini ile kovalent olarak reaksiyona giren yeni bir savaş başlığı görevi gördü. Kısaca, bir Cys ve Met mutasyona uğramış peptid, molekül içi alkilasyon ile siklize edildi ve bu da bir on-tether sülfonyum merkezinin üretilmesiyle sonuçlandı. Bu süreçte, bir yan zincir köprüsünün oluşumu siklik peptitler için kritik öneme sahipti. Genel olarak, bu protokol, basit reaksiyon koşulları ve işlemleri kullanılarak elde edilen ayrıntılı bir sülfonyum bazlı peptid siklizasyonunu tanımlar. Amaç, daha geniş biyolojik uygulamalar için potansiyel bir yöntem geliştirmektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ekipman hazırlığı

DİKKAT: Morfolin, N, N-dimetilformamid (DMF), diklorometan (DCM), N, N-diizopropilelamin (DIPEA), TFA, morfolin, piperidin, dietil eter ve metanol toksik, uçucu ve aşındırıcıdır. Bu reaktifler insan vücuduna soluma, yutma veya cilt teması yoluyla zarar verebilir. Tüm kimyasal deneyler için, tek kullanımlık eldivenler, deneysel paltolar ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere koruyucu ekipman kullanın.

  1. Rink-amid 4-metilbenzhidrilamin (MBHA) reçinesi üzerindeki tüm peptid substratlarını, Şekil 1'de gösterildiği gibi standart manuel Fmoc bazlı katı faz peptid sentezi (SPPS)29 ile oluşturun.
  2. Lineer peptitler oluşturmak için iki seçenekten birini kullanın: birincisi, yoğuşma ajanı 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N, N',N'-tetrametiluronyum hekzaflorofosfat (HATU) ve bir PIPEA reaktifi kullanarak peptidi sentezleyin; veya iki, amid yoğuşma reaktifi olarak 1-hidroksibenzotriazol (HOBT) ve N, N'-diizopropilkarbodiimid (DIC) kullanarak sentezleyin. Peptitin sırasına göre peptid sentezi için uygun bir protokol seçin.
  3. Manuel bir peptit sentez cihazı kurmak için, bir duman davlumbazına modifiye edilmiş vakum katı faz ekstraksiyon ekipmanı kurun ve üç yönlü bir stopcock ile bağlayın. Ardından, azot (N2) gazına bağlıyken ekipmanın üzerine bir polipropilen filtre kartuşu veya cam reaktör yerleştirin.
    NOT: Vakumlu katı faz ekstraksiyon ekipmanını değiştirmek için, ekstraksiyon tüpünü çıkarın ve vakumla kapatılmış sistemi saklayın.
  4. MBHA reçinesini reçine dolu sütunlara yükleyin ve DMF'de çözün. Üç tıpaların anahtarınıN2 köpürmesi için ayarlayın ve ardından bir vakum sistemine bağlı çalışan bir pompa kullanarak kolondaki çözücüyü çıkarın. Aşağıdaki formülü kullanarak gerekli amino asit veya yoğuşma maddesi miktarını hesaplayın:
    Amino asit (g) ve yoğuşma maddesi (g) = reçine ölçeği (g) × reçine yükleme kapasitesi (mM/g) × eşdeğeri (5 eq) × moleküler ağırlık (g/M)
    NOT: Kaplin peptidinin uzunluğuna göre yüklenen reçine miktarını seçin. Daha tam reaksiyona girmek için amino asitlerin çoklu eşdeğerleri (eq) kullanılır. Sıvı çözücülerin yoğunluğa göre hacme dönüştürülmesi gerekir. 5 eq, hesaplanan bileşiğin giriş miktarının beş kat arttığını gösterir.

2. Reçine hazırlama

NOT: Kaplin peptidinin uzunluğuna göre yüklenen reçine miktarını seçin.

  1. Bir kolona (20 mL rezervuar) 302 mg Rink-amid MBHA reçinesini (0,331 mM/g yüklü) tartın. Reçineyi 30 dakika boyunca köpüren N2 altında şişirmek için sütuna 5-10 mL DCM veya DMF ekleyin.
  2. Ardından, N2 anahtarını kapatın ve ardından çözücüyü çıkarmak için vakum pompası emme anahtarını açın. Daha sonra, reçineleri sırayla DCM (5-10 mL) ve DMF (5-10 mL) 5x ile yıkayın.

3. N-terminal Fmoc korumasından arındırma

NOT: Morfolin ile korumanın kaldırılması 30 dakika gerektirir ve piperidin ile korumanın kaldırılması 5 dakika sürer.

  1. N-terminal 9-floresilmetiloksikarbonil (Fmoc) deproteksiyon çözeltisini hazırlayın: Fmoc grubu deproteksiyonu için bir cam kapta DMF'de yeterli hacimde (500 mL) %20 (v/v) piperidin veya %50 (v/v) morfolin hazırlayın.
  2. Kolona 10 mL deproteksiyon çözeltisi ekleyin, kabarcık N2'yi çözeltiye 30 dakika veya 5 dakika 2x ekleyin ve deprotection prosedürlerini 2x tekrarlayın.
  3. Çözeltiyi bir vakum pompası ile boşaltın ve reçineyi sırayla DCM (5-10 mL) ve DMF (5-10 mL) 5x ile yıkayın.
  4. Kaplin adımından önce Fmoc grubunun yokluğunu doğrulamak için reçineyi her korumadan sonra% 5 ninhidrin (Kaiser testi) ile koyu sarı renkli bir çözelti olarak tespit edin. Ayrıntılı olarak, az miktarda reçineye 1 mL DMF ekleyin ve reçine rengindeki değişiklikleri değerlendirmek için 3 dakika boyunca 130 ° C'de ısıtılan bir cam tüpe 200 μL% 5 ninhidrin ekleyin.
  5. Çözeltiyi bir vakum pompası ile boşaltın ve reçineyi sırayla DCM (5-10 mL) ve DMF (5-10 mL) 5x ile yıkayın.

4. Lineer peptidin bağlanması (Şekil 2)

NOT: Sentetik peptit dizileri iki veya daha fazla tekrar eden birim içerdiğinde, bağlantı prosedürü doğrudan Fmoc-AA-OH veya Fmoc-AAA-OH gibi amino asit tipi seçilerek gerçekleştirilebilir. Sterik engele sahip bazı özel amino asitler ve daha uzun amino asit dizilerine sahip peptitler, bağlantı için reaksiyon süresini uygun şekilde uzatmak için gereklidir.

  1. Tek bir bağlantı adımı için, örnek olarak Cys kalıntısının bağlanmasını alın (300 mg reçine ölçeklerini sentezleyin). Bir polipropilen tüp içinde Fmoc-Cys (Trt)-OH (5 eq, 292 mg) ve HATU (5 eq, 206 mg) veya Fmoc-Cys (Trt)-OH (5 eq, 292 mg) ve HOBT (5 eq, 106 mg) içeren bir karışım çözeltisi hazırlayın ve 3 mL DMF içinde çözün.
  2. Amino asidi aktive etmek için Cys çözeltisine 173 μL DIPEA (10 eq) veya 154 μL DIC (10 eq) ekleyin. Karışımın 1 dakika boyunca önceden aktive olmasına izin verin. Karışımı reçine ile sütuna ekleyin ve 2 saat boyunca N2 ile kabarcıklayın.
    NOT: Gereken spesifik reaksiyon süresi,% 5 ninhidrini tespit etmek için standartlaştırılmalıdır.
  3. Birleştirmeden sonra, az miktarda reçineye 1 mL DMF ekleyin ve 3 dakika boyunca 130 ° C'de ısıtılmış bir cam tüpe 200 μL% 5 ninhidrin ekleyin. Deprotection adımından önce serbest bir amino grubunun yokluğunu doğrulamak için reçinenin renksizliğe dönüşmesini gözlemleyin.
  4. Çözeltiyi bir vakum pompası kullanarak boşaltın ve reçineyi DCM (5-10 mL) ve DMF (5-10 mL) 5x ile sırayla yıkayın.
  5. Kolona 10 mL deproteksiyon çözeltisi ekleyin, 30 dakika veya 5 dakika 2x için N 2 ile kabarcık ekleyin, taze çözelti ekleyin ve korumasızlık prosedürlerini2x tekrarlayın.
  6. Aşağıdaki adımları tekrarlayın: Fmoc grubunun korumasını kaldırma; reçine korumasının azaltılmasını tespit etmek; reçineyi yıkamak; amino asidin bağlanması; bağlantı reaksiyonunu algılama. Tüm peptitler sentezlenene kadar bağlantı adımını tekrarlayın.
    NOT: Korumasızlaştırmanın her adımının tamamlanıp tamamlanmadığını veya amino asit bağlantısının her adımının eksiksiz olup olmadığını izlemek için Kaiser testini kullanın. Alternatif olarak, az miktarda peptit reçineden ayrılabilir ve başarılı bir bağlantı için LC-MS tarafından kontrol edilebilir.

5. Met ve Cys arasında bisalkilasyon (Şekil 3)

  1. 4.1-4.6 adımlarını tekrarlayarak Met ve Cys ile doğrusal bir peptit oluşturun. Dehidrasyon için reçineli kolona 10 mL susuz metanol ekleyin ve doğrusal peptit bağlantısından sonra bir sonraki kullanım içinN2 ile kurutun (tekrar 2x).
  2. Önceki adımda elde edilen reçinenin 100 mg'ını bir kolona (20 mL rezervuar) tartın ve reçineyi kaplin adımından önce DCM (5-10 mL) ve DMF (5-10 mL) ile yıkayın.
  3. Cys trt(trityl) koruma grubunu çıkarmak için bir çözelti hazırlayın. Koruyucu grubu çıkarmak için bir cam kapta yeterli miktarda (100 mL) TFA/TIS/DCM (3:5:92) karışımı hazırlayın.
  4. Koruma grubunu 10 dakika boyunca kaldırmak için sütuna 5-10 mL TFA/TIS/DCM (3:5:92) çözeltisi ekleyin. Sarı renk tamamen kaybolana kadarN2 köpürerek altı kez tekrarlayın.
  5. Çözeltiyi bir vakum pompası ile boşaltın ve reçineyi sırayla DCM (5-10 mL) ve DMF (5-10 mL) 5x ile yıkayın.
  6. Korumasız Cys ile reaksiyona girmek için bir çözelti hazırlayın. Korumasız Cys ile reaksiyona girmek için di-halojenli bağlayıcı (2 eq) ve DIPEA (4 eq) dahil olmak üzere yeterli miktarda (50 mL) karışım çözeltisi (DMF) hazırlayın.
  7. N2 köpürme ile en az 3 saat boyunca korumasız Cys ile reaksiyona girmek için kolona 5-10 mL reaksiyon çözeltisi ekleyin. Susuz metanol ile kurutun ve bir sonraki kullanım içinN2 ile kurutun.
  8. Çözeltiyi bir vakum pompası ile boşaltın ve reçineyi sırayla DCM (5-10 mL) ve DMF (5-10 mL) 5x ile yıkayın.
  9. Peptit siklizasyonu için bir çözelti hazırlayın: peptid siklizasyonu için duman davlumbazındaki bir cam kapta yeterli miktarda (20mL) TFA karışımı (TFA: TIS: H 2 O = 95: 2.5: 2.5) hazırlayın.
  10. Polipropilen tüpe 5-10 mL TFA karışım çözeltisi ekleyin ve reçineyi TFA kokteylinin altında 3 saat boyunca bölün.
    DİKKAT: TFA oldukça aşındırıcı ve tahriş edicidir; peptid bölünme işlemi bir duman davlumbazında yapılmalıdır.
  11. Ters faz sıvı faz saflaştırma (HPLC) ile doğrusal bir peptit çözeltisi elde etmek için 7.1-7.5 adımlarını uygulayın. Bir sonraki kullanım için çözeltiyi dondurarak kurutun.

6. Propargyl sülfonyum tuzu siklizasyonu (Şekil 4)

  1. 4.1-4.6 adımlarını tekrarlayarak Met ve Cys ile doğrusal bir peptit oluşturun. Dehidrasyon için reçine ile kolona 10 mL susuz metanol ekleyin ve doğrusal peptit bağlantısından sonra bir sonraki kullanım için N2 ile kurutun (iki kez tekrarlayın).
  2. Önceki adımda elde edilen reçinenin 100 mg'ını bir kolona (20 mL rezervuar) tartın ve reçineyi kaplin adımından önce DCM (5-10 mL) ve DMF (5-10 mL) ile yıkayın.
  3. HPLC ile doğrusal bir peptit çözeltisi elde etmek için 7.1-7.5 adımlarını uygulayın ve bir sonraki kullanım için numuneyi belirtildiği gibi dondurarak kurutun.
  4. % 1'lik bir HCOOH sulu çözelti (hacim olarak) ve 1.0 mM propargil bromür (5 eq) hazırlayın ve Met peptid çözeltisine ekleyin (0.2 mM, 1 eq; 0.2 mL MeCN / H2O [1: 1, v / v]).
  5. Daha sonra, Met ve propargil bromürün bağlantı reaksiyonunu oda sıcaklığında 12 saat boyunca sallayın.
  6. Reaksiyondan sonra, ürünü asetonitril içinde bir polipropilen tüp içinde çözün ve 0.22 μmfilter membrandan süzün. Daha sonra, çözeltiyi hemen ters fazlı HPLC ile saflaştırın ve bir sonraki kullanım için dondurarak toz haline getirin.
  7. Son adımda, propargil bromür içeren peptidi bir polipropilen tüpe ekleyin, (NH4)2CO3 çözeltisi ekleyerek reaksiyon çözeltisi pH'ını 8.0'da tutun ve reaksiyon karışımını 12 saat boyunca 37 ° C'de çalkalayın. Bu adım, propargil sülfonyum tuzunun siklik peptidini elde eder.
  8. Son reaksiyon karışımını toplayın: asetonitril içinde bir polipropilen tüp içinde çözün ve 0,22 μm'lik bir filtre zarından süzün. Daha sonra, çözeltiyi hemen ters fazlı HPLC ile saflaştırın ve bir sonraki kullanım için dondurarak toz haline getirin.

7. Siklik peptitlerin saflaştırılması

  1. 4.1-4.6 adımlarını tekrarlayarak Rink-amid MBHA reçinesi üzerinde doğrusal peptit substratları oluşturun. Dehidrasyon için reçineli kolona 10 mL susuz metanol ekleyin ve doğrusal peptit bağlantısından sonra bir sonraki kullanım için N2 ile kurutun (iki kez tekrarlayın).
  2. Duman davlumbazında yeterli miktarda bölünme kokteyli (TFA / H 2 O / TIS, v / v / v, 95: 2.5:2.5) hazırlayın. Polipropilen tüpe 1-5 mL TFA karışım çözeltisi ekleyin ve reçineyi TFA kokteylinin altında 3 saat boyunca bölün.
  3. Daha sonra, reçineyi sütundakiN2'lik bir buhar altında sırayla kurulayın. Alternatif olarak, reçineyi filtrelemek ve peptid çözeltisini toplamak için bir filtre cihazı kullanın. Daha sonra, peptidi çökeltmek için peptid çözeltisine 20 mL eter ekleyin, 5 dakika boyunca 3.500 x g'de santrifüj yapın ve iki kez tekrarlayın. Ham peptit çökeltiyi toplayın ve bir sonraki adım içinN2 akışı altında kurutun.
  4. 200 mg ham peptidi bir polipropilen tüp içinde 4 mL asetonitril su çözeltisi içinde çözün ve 0.22 μm'lik bir filtreden süzün. Peptiti bir HPLC şişe ekine aktarın. Kesici ucu, C18 5 μm, 4,6 mm x 250 mm sütun ve 1 mL enjeksiyon döngüsü ile donatılmış yarı hazırlıklı ters fazlı HPLC sisteminin otomatik numune alma cihazına yerleştirin.
  5. 254 nm'de UV kullanarak HPLC spektrumlarını izlerken, 30 dakika boyunca% 0.1 TFA ile% 5-95 asetonitril gradyan programı kullanarak peptidi saflaştırın ve izole edin. Peptit moleküler ağırlığını LC-MS ile onaylayın, peptidin çözeltisini toplayın ve bir sonraki kullanım için toz haline getirerek dondurarak kurutun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tüm lineer peptitler, standart manuel Fmoc katı faz sentezi ile Rink-amid MBHA reçinesi üzerinde sentezlendi. Şekil 5A'da açıklandığı gibi bir model siklik hekzapeptid (Ac (siklo-I)-WMAAAC-NH2) inşa edilmiştir. Özellikle, Met alkilasyonu ile yeni bir on-tether kiral merkezi üretildi ve siklik peptidin iki epimeri (Ia, Ib) ters faz HPLC tarafından doğrulandı. Ayrıca, epimerlerin dönüşümü ve oranı, ters faz HPLC'nin entegrasyonu kullanılarak belirlendi. Hekzapeptid Ac-WMAAAC-NH2'den üretilen siklik Ac-(siklo-I)-WMAAAC-NH2 peptidleri 1-Ia ve 1-Ib, farklı tutma süreleri ve aynı moleküler ağırlıklar sergiledi (Şekil 5B). Daha sonra, siklik peptidin farklı fonksiyonel gruplara toleransı, Şekil 5C'de gösterildiği gibi daha fazla test edilmiştir. 10 lineer peptidin döngü kapatma verimliliği, di-halojenli bir bağlayıcı kullanılarak değerlendirildi ve sonuçlar, tüm peptitlerin karşılık gelen siklik peptitleri verimli bir şekilde ürettiğini gösterdi. Diğer siklik peptitlerle karşılaştırıldığında, yüksek dönüşüm oranlarına sahip bir model hekzasiklik siklik peptid, epimerlerin 1: 1'lik bir diferansiyel oranını üretti ve HPLC ile ayrılabilir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, peptid epimerleri, muhtemelen epimerin sülfonyum kiral merkezinin çok kararlı olmaması ve yavaş yavaş epimer karışımlarına rasemize olması nedeniyle HPLC koşulları altında ayrılamamıştır. Epimerlerin (1-Ia) piridinrtioller (PyS) (10 mM) ile reaksiyon etkinliği daha sonra HPLC tarafından incelendi. Şekil 5D, siklik peptid (1 mM) ile konjuge ürünü arasındaki zamana bağlı dönüşümün HPLC izlerini göstermektedir. İzler, PBS'de (pH 7.4) PyS ile peptid 1-Ia'nın zamana bağlı azalmasını açıkça göstermektedir.

Peptit halkasının kapatılması için başka bir strateji, ilk olarak, bir propargil grubunun Met'e bağlanması ve daha sonra oluşan propargil sülfonyum merkezinin, siklik bir peptit üretmek için bir tiol-yne reaksiyonunu tetiklemesiydi. Bu stratejide, halka boyutu ve peptid dizisi siklizasyon reaksiyonunu etkilemedi, iki veya üç amino asit içeren peptid sadece döngüyü kapatmak için bir model olarak kullanıldı. İntramoleküler peptid siklizasyonunun sentetik yolu Şekil 6A'da açıklanmıştır. Ek olarak, Şekil 6B'de açıklandığı gibi basitleştirilmiş bir proparşilenmiş Met model peptid inşa edilmiştir. Sonuçlar, reaksiyon çözeltisi pH'ı 8.0'a ayarlandığında model peptid MC'nin veriminin% 80'e kadar çıkabileceğini göstermiştir (MC, bu yolla sentezlenen bir model siklik peptidi ifade eder; Şekil 6A). Ayrıca, model peptid MC, HPLC (Şekil 6D) tarafından izole edildi ve saflaştırıldı ve moleküler ağırlığı LC-MS (Şekil 6C) ile doğrulandı. Şekil 6E'de gösterildiği gibi, kimyasal kayma ayrıca 1H NMR ve heteronükleer tek kuantum tutarlılığı (HSQC) ile karakterize edildi. Ek olarak, MC'nin stabilitesini keşfetmek için sülfonyum halkasını açmaya çalışmak için dithiothreitol (DTT) eklenmiştir. Sonuçlar, 24 saat sonra hiçbir ekleme veya halka açma ürünü göstermedi (Şekil 6F).

Figure 1
Şekil 1: Peptitleri sentezlemek için Fmoc tabanlı katı faz peptidi için deney düzeneğinin diyagramı. Peptit kolonu, peptid sentezi sırasında kolon boyunca köpüren azot veya argon ile üç stopcocklar aracılığıyla katı faz reaktörüne yerleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Reçine üzerine moleküller arası sentetik lineer CM peptitleri. Tüm lineer peptitler, standart manuel Fmoc katı faz sentezi ile Rink-amid MBHA reçinesi üzerinde sentezlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Cys ve Met bisalkilasyonu yoluyla peptid siklizasyonu için sentetik yollar. Met ve Cys içeren lineer peptitler stabilize siklik peptitler olarak inşa edildi. İlk olarak, trt korumalı Cys, DCM'de% 3 TFA ile korumasız hale getirildi. Daha sonra, 3 saat boyunca Cys ile reaksiyona girmek için di-halojenli bir bağlayıcı (2 eq) ve DIPEA (4 eq) eklendi. Son olarak, Cys ve Met arasındaki döngüselleşme, reçine bir TFA bölünme çözeltisinde bölündüğünde tamamlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Cys ve Met tiol-yne yoluyla peptid siklizasyonu için sentetik yollar. İlk olarak, lineer peptitler saflaştırıldı ve HPLC ve LC-MS ile karakterize edildi. Reaksiyon aşağıdaki koşullar altında meydana geldi: 0.2 mL MeCN/ H 2O (1: 1, v / v), % 1 HCOOH sulu çözelti (hacim olarak) ve propargil bromür (1.0 mM, 5.0 eq) içindeki bileşik (0.2 mM, 1.0 eq) içeren bir çözelti, oda sıcaklığında 8.0 pH'ta 12 saat boyunca çalkalandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Cys ve Met arasında bisalkilasyon kullanan siklik peptitlerin sentez şeması. (A) Cys ve Met tarafından peptid siklizasyonunun şematik gösterimi. (B) Epimerlerin HPLC ve LC-MS spektrumu (1-Ia ve 1-Ib). (C) Farklı peptitlerin fonksiyonel kalıntı toleransı test edildi. (D) Epimerler (1-Ia; 1 mM) ve bunların konjuge ürünleri arasındaki zamana bağlı dönüşümün HPLC izleri. Bu rakam, Wang ve ark.30 tarafından bildirilenin bir modifikasyonudur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Tiol-yne tipi reaksiyon kullanılarak siklik peptitlerin sentez şeması. (A) Tiol-yne reaksiyonu ile peptid siklizasyonunun kolay yapımı. MC, yol tarafından sentezlenen bir model siklik peptidi ifade eder. (B) Farklı lineer peptitlerin intramoleküler peptid siklizasyonu. a = 1 mL 1 M (NH4)2CO3 sulu çözelti. b = MeCN/H2O'nun 1 mL'sinde %1 Et3N (1:1). Kısaltmalar: Ahx = 6-aminokaproik asit. Verim, tartım ile belirlenen ürünün yüzdesi olarak hesaplanmıştır. Dönüşüm, HPLC tarafından reaksiyona giren başlangıç malzemesi miktarını temsil ediyordu. (C) MC siklizasyon peptidinin LC-MS spektrumu. (D) MC siklizasyon peptidinin HPLC spektrumu. (E) MC siklik peptitlerin 1H NMR ve HSQC spektrum karakterizasyonu. (F) MC siklik peptid ile DTT arasındaki zamana bağlı dönüşümün D2O'da 3 saat, 6 saat,12saat ve 24 saat boyunca 1 H NMR spektrumu. Bu rakam, Hou ve ark.31 tarafından bildirilenin bir modifikasyonudur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda açıklanan sentetik yaklaşım, temel lineer peptitlerin ortak katı faz peptid sentez teknikleri ile oluşturulduğu peptid dizisinde Cys ve Met kullanarak siklik peptidlerin sentezlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Cys ve Met arasındaki siklik peptitlerin bisalkilasyonu için, tüm sentetik yol üç ana sürece ayrılabilir: reçine üzerindeki Cys'nin korunmasının azaltılması, bağlayıcının bağlanması ve bir trifloroasetik asit bölünme çözeltisinde Cys ve Met arasındaki siklikleşme. Özellikle, koruyucu grup Cys'in çıkarılmasının, sonraki halka kapatma reaksiyonu için kritik bir adım olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, trt-Cys'in koruması kaldırıldı ve bu, çözeltinin belirgin sarı rengi kalmayana kadar yapıldı. Daha ileri çalışmalar, Cys ve Met metodolojisi arasındaki bisalkilasyon tarafından geliştirilen siklik peptitlerin, peptidin Cys ve Met amino asitlerini içermesi koşuluyla, çeşitli peptitlerde döngü kapanmasına genişletilebileceğini göstermiştir. Ek olarak, peptid dizisi ve bağlayıcı da deneysel tasarıma göre daha da ayarlanabilir (Şekil 5). Bu nedenle, sentezi LC-MS ile izlemek gerekliydi.

Tiol-yne tipi reaksiyondaki siklik peptitler için, ilk olarak, lineer peptitler, reçine üzerinde ortak katı fazlı peptid sentez teknikleri ile de inşa edildi ve aşağıdaki reaksiyonlar sıvı faz çözeltisinde gerçekleştirildi. Ham peptitler daha sonra reçineden ayrıldı ve ters fazlı HPLC ile saflaştırıldı. 0.2 mL MeCN / H 2 O (1: 1, v / v) ve% 1 HCOOH sulu çözeltisi ile birlikte12saat boyunca reaksiyona bir peptit ve propargil bromür çözeltisi eklendi ve ürünler daha sonra ters fazlı HPLC ile hemen saflaştırıldı. Şaşırtıcı bir şekilde, halka kapatma reaksiyonu, reaksiyon çözeltisinin pH'ı 8.0'a yükseltildiğinde meydana geldi. Bu çalışma, peptidi tiol-yne tipi reaksiyon yoluyla iyi stabiliteye sahip siklik bir konformasyon yapısına sınırlayan bir yöntem geliştirmiştir. Ayrıca, peptidlerin hidrofilisitesi ve hidrofobikliğinin farklı olması nedeniyle peptid döngü kapanışı için çözücünün ayarlanması gerekiyordu. Örneğin, hidrofilik peptidin pH'ı (NH4)2 CO 3 ile ayarlandı ve hidrofobik peptid daha sonra karışık bir çözücü (% 50 MeCN / H 2O'da% 1 Et3 N çözeltisi; Şekil 6).

Son yıllarda, siklik peptitlerin sentezlenmesi için çeşitli ligasyon teknolojileri geliştirilmiştir, bu teknolojiler doğal peptit bağları ve doğal olmayan omurga bağlantıları üretmektedir32. Bununla birlikte, sentetik siklik peptit alanında zorluklar devam etmektedir. İlk olarak, peptidin amino asit dizisi sterik bir etkiye sahiptir ve siklizasyonun etkinliği, siklizasyon bölgesine yakın kalıntılardan etkilenebilir. İkincisi, peptitlerin mekansal yapısı çeşitlidir ve aynı bölgede halka kapatma sırasında bağlantı bölgesini dikkatlice seçmek gerekebilir. Son olarak, peptit dizileri hidrofilik veya hidrofobik amino asitler içerir ve bu nedenle reaksiyon çözücüsünün çözünürlüğünün dikkate alınması gerekir. Bu nedenle, farmasötik endüstrisinde siklik peptit uygulamalarını daha da geliştirmek için sahadaki siklleşmeyi, çözünürlüğü ve izomerleri tanımlamak için daha fazla çaba gösterilmelidir.

Bu araştırmada, Cys ve Met arasında bisalkilasyon kullanan veya tiol-yne tipi bir reaksiyon yoluyla bir dizi kolay makrosiklizasyon protokolü, siklik peptitlerin sentezlenmesinin zorluklarını çözmek için tasarlanmıştır. Neyse ki, bu reaksiyonlar kolay, yüksek verimli ve metal katalizörü içermiyordu. Geliştirilen yöntemlerin hem intermoleküler hem de intramoleküler olarak performans gösterdiği ve fonksiyonel grup toleransını tatmin edici olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bu yöntemler kısıt siklikleştirmeyi sağlamak, peptid zincirinin daha konformasyonel olarak stabilize edilmesini sağlamak, böylece hedef protein bağlanma afinitesini geliştirmek ve spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltmak için geliştirilmiştir. Ek olarak, makul tasarımlar kullanılarak, reaksiyon bölgesi seçiciliği, konformasyonel olarak stabilize edilmiş bir siklizasyon peptidi oluşturularak da arttırılabilir. Genel olarak, peptid zinciri siklizması, siklik peptitlerin umut verici ilaç adayları olduğunu gösteren biyolojik olarak aktif bileşikler üretti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı'nın (2021YFC2103900) finansal desteğini kabul ediyoruz; Çin Doğa Bilimleri Vakfı hibe (21778009 ve 21977010); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2022A1515010996 ve 2020A1515010521): Shenzhen Bilim ve Teknoloji İnovasyon Komitesi, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 ve JCYJ20200109140406047); ve Shenzhen-Hong Kong Beyin Bilimi Enstitüsü-Shenzhen Temel Araştırma Kurumları hibesi (2019SHIBS0004). Yazarlar, referans 30 için Chemical Science, The Royal Society of Chemistry ve referans 31 için The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society'den dergi desteğini kabul etmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen Energy D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid Energy A46873
1H NMR and HSQC Bruker  AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate Energy E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) Energy A1797
2-mercaptopyridine Energy Y31130
6-Aminocaproic acid Energy A010678
Acetic anhydride Energy A01021454
Acetonitrile Aldrich 9758
Ammonium carbonate Energy 12980
Dichloromethane (DCM) Energy W330229
Digital Heating Cooling Drybath  Thermo Scientific 88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA) Energy W320014
Dimethyl formamide (DMF) Energy B020051
Dithiothreitol Energy A10027
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU2020  LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30701
Fmoc-His(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R30902
Fmoc-Ile-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31201
Fmoc-Met-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31301
Fmoc-Pro-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R31901
Fmoc-Val-OH Nanjing Peptide Biotech Ltd R32001
Formic acid Energy W810042
High Performance Liquid
Chromatography		 SHIMADZU LC-2030
Methanol Aldrich 9758
Morpholine Aldrich M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide Energy B010023
Ninhydrin Reagent Energy N7285
Propargyl bromide Energy W320293
Rink Amide MBHA resin Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates  Thermo Scientific 60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium Energy T1350
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Triethylamine Energy B010737
Trifluoroacetic acid (TFA) J&K 101398
Triisopropylsilane (TIS) Energy T1533

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Tags

Kimya Sayı 187 Siklik peptitler bisalkilasyon/dealkilasyon propargil bromür stabilizasyon sistein metiyonin
On-Tether Sülfonyum Merkezi Kullanarak Döngüsel Peptitlerin Oluşturulması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu,… More

Song, C., Hou, Z., Jiao, Z., Liu, Z., Lian, C., Zhang, M., Liang, W., Yin, F., Li, Z. Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center. J. Vis. Exp. (187), e64289, doi:10.3791/64289 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter