Summary
Protokollen præsenterer detaljerede metoder til evaluering af, om nanoemulsionen ophiopogonin D-adjuvans fremmer effektive cellulære immunresponser.
Abstract
Som en hovedbestanddel i vacciner kan adjuvanser direkte fremkalde eller forbedre de kraftfulde, udbredte, medfødte og adaptive immunresponser forbundet med antigener. Ophiopogonin D (OP-D), en renset komponent ekstraheret fra planten Ophiopogon japonicus, har vist sig at være nyttig som vaccineadjuvans. Problemerne med OP-D's lave opløselighed og toksicitet kan effektivt overvindes ved at anvende en lavenergiemulgeringsmetode til fremstilling af nanoemulsion ophiopogonin D (NOD). I denne artikel undersøges en række in vitro-protokoller til evaluering af cellulær aktivitet. De cytotoksiske virkninger af L929 blev bestemt ved anvendelse af et celletællingssæt-8-assay. Derefter blev de udskillede cytokinniveauer og tilsvarende immuncellenumre efter stimulering og dyrkning af splenocytter fra immuniserede mus detekteret ved ELISA- og ELISpot-metoder. Derudover blev antigenoptagelsesevnen i knoglemarvsafledte dendritiske celler (BMDC'er), som blev isoleret fra C57BL/6-mus og modnet efter inkubation med GM-CSF plus IL-4, observeret ved laserscanningskonfokalmikroskopi (CLSM). Det er vigtigt, at makrofagaktivering blev bekræftet ved at måle niveauerne af IL-1β, IL-6 og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) cytokiner af ELISA-sæt efter coculturing af peritoneale makrofager (PM'er) fra tomme mus med adjuvansen i 24 timer. Det er håbet, at denne protokol vil give andre forskere direkte og effektive eksperimentelle tilgange til at evaluere den cellulære responseffektivitet af nye vaccineadjuvanser.
Introduction
Vacciner er et vigtigt middel til forebyggelse og behandling af infektiøse og ikkeoverførbare sygdomme. Passende tilsætning af adjuvanser og leveringsmidler til vaccineformuleringer er gavnlig for at forbedre antigenernes immunogenicitet og generere langvarige immunresponser1. Ud over den klassiske adjuvans alun (aluminiumsalt) er der seks slags adjuvanser til vacciner, der i øjeblikket markedsføres: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 og Matrix-M5. Generelt, når menneskekroppen støder på et viralt angreb, tager den første og anden forsvarslinje (hud, slimhinde og makrofager) føringen i at rydde virussen, og endelig aktiveres den tredje forsvarslinje, der involverer immunorganerne og immuncellerne. Aluminiums- og aluminiumsalte har været de mest anvendte hjælpestoffer til humane vacciner siden begyndelsen af 1920'erne, hvilket fremkalder et effektivt medfødt immunrespons6. Det er imidlertid blevet foreslået, at aktivering af antigenpræsenterende celler (APC'er) af klassiske adjuvanser, som stimulerer immuncellerne til at generere specifikke sæt cytokiner og kemokiner, er den mekanisme, hvormed adjuvanser virker og kan være en af grundene til, at adjuvanser kun udøver forbigående virkninger på specifikke immunresponser7. Tilstedeværelsen af begrænsede godkendte adjuvanser til human brug er en begrænsende faktor for udvikling af vacciner, der fremkalder effektive immunresponser8.
I øjeblikket viser et stigende antal adjuverende undersøgelser evnen til at inducere et stærkt cellulært immunrespons hos mus. QS-21 har vist sig at inducere et afbalanceret T-hjælper 1 (Th1) og T-hjælper 2 (Th2) immunrespons, producere højere niveauer af antistoftitere og forlænge beskyttelsen som adjuvans, men dets stærke toksicitet og hæmolytiske egenskaber begrænser dets udvikling som en selvstændig klinisk adjuvans 9,10. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranosid) er et af de steroide saponiner isoleret fra roden af den kinesiske lægeplante Ophiopogon japonicas4. Derudover er det den vigtigste farmakologisk aktive komponent (Shen Mai San), der findes i Radix Ophiopogonis og vides at have visse farmakologiske egenskaber11. Desuden er det medlem af familien Liliaceae og bruges i vid udstrækning til dets hæmmende og beskyttende virkninger i cellulær inflammation og myokardieskade. For eksempel forbedrer OP-D DNCB-inducerede atopiske dermatitislignende læsioner og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) inflammatoriske HaCaT-celler i BALB / c-mus12. Det er vigtigt, at OP-D fremmer den antioxidative beskyttelse af det kardiovaskulære system og beskytter hjertet mod doxorubicin-induceret autofagisk skade ved at reducere både generering af reaktive iltarter og forstyrre mitokondriemembranskader. Eksperimenter har vist, at indtagelse af OP-D med monodesmosid hjælper med at øge immunforsvaret, øge antallet af hvide blodlegemer og DNA-syntese og få antistoffer til at vare længere13. Det har tidligere vist sig, at OP-D har en adjuvanseffekt14.
Nanoemulsioner er olie-i-vand nanoformuleringer sammensat af en kombination af overfladeaktive stoffer, olie, cosurfactants og vand12,15. Disse nanovaccinedesign gør det muligt at indkapsle antigener og adjuvanser sammen for at forbedre immunstimuleringen, beskytte antigenerne og fremme dendritisk cellemodning (DC)16. For udvikling af disse nye adjuvanser opnået ved screening er det vigtigt at finde passende metoder til at evaluere deres cellulære responsevner.
Formålet med denne protokol er systematisk at vurdere, om adjuvanser kan forbedre fagocytose og ekspression af immunceller i in vitro-cellekultur og at uddybe de vigtigste eksperimentelle metoder. Eksperimentet er opdelt i fire underafsnit: (1) toksiciteten af OP-D og NOD til L929-celler bestemmes af celletællingssæt-8 (CCK-8) assay; (2) cytokinniveauerne af endokrine IFN-γ og IL-17A og de tilsvarende cellenumre i immuniserede mus påvises ved splenocytstimulering og ELISpot-assays; 3) DC'ernes antigenpræsentationsevne efter adjuverende stimulering observeres ved anvendelse af konfokalmikroskopi og (4) de tre slags cytokiner, IL-1β, IL-6 og TNF-α, i supernatanterne opnået fra peritoneale makrofager (PM'er) i normale mus dyrket sammen med adjuvanser detekteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle celleeksperimenter blev udført i et celleteknisk laboratorium udstyret med grundlæggende operationsstuer, bufferrum, sterile dyrkningsrum og identifikations- og analyserum. Arbejdsmiljøet og forholdene var fri for mikrobiel kontaminering og andre skadelige faktorer. Dyreforsøgene blev udført på baggrund af retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af laboratoriedyrs velfærds- og etiske komité ved det tredje militære medicinske universitet.
1. Autoklavering og materialeforberedelse
- Reagenser og forbrugsvarer, såsom fosfatbufret saltvand (PBS), saks, pincet og slibenet, fremstilles ved fugtig varmesterilisering ved autoklavering ved 121 °C i 20 minutter.
- For de nødvendige reagenser og udstyr, se materialetabellen. For formlen for blind nanoemulsion (BNE), tjek tabel 1.
2. L929 cytotoksicitetsanalyse
- Tænd for vandbadet og juster temperaturen til 37 °C. Et rør frosne L929-celler opsamles fra flydende nitrogen og tøs hurtigt op i et 37 °C vandbad.
- Pipette cellerne ind i et 15 ml sterilt centrifugerør hurtigt efter optøning, tilsæt 2 ml DMEM, og bland godt.
- Prøverne centrifugeres ved 129 x g i 5 min. og supernatanten kasseres. Derefter tilsættes 2 ml DMEM for at resuspendere cellerne, og centrifugeres prøverne igen ved 129 x g i 5 minutter.
- Supernatanten kasseres, der tilsættes 6 ml DMEM-substrat (indeholdende 10 % FBS) til resuspension, og der overføres til en T25-dyrkningskolbe i en 37 °C-inkubator med 5 % CO2 til dyrkning i 48 timer.
- Dyrkningsmediet i dyrkningskolben kasseres, og cellerne vaskes to gange med 2 ml PBS. Derefter tilsættes 1 ml 0,25% trypsin for at fordøje cellerne i 1-2 minutter ved 37 °C.
- Når der observeres afrunding af cellerne, tilsættes 4 ml DMEM komplet medium for straks at afslutte fordøjelsen og blande godt. Derefter aspireres cellerne til et 15 ml sterilt centrifugerør og centrifugeres ved 129 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 1 ml DMEM-fuldsubstrat. Brug en 20 μL cellesuspension til celletælling ved hjælp af celletælleplader og fortynd de resterende celler til 1 x 105 celler / ml med DMEM komplet medium.
- Tilsæt 100 μL ultrarent vand til periferien af en plade med 96 brønde, og tilsæt kun 100 μL cellefortyndingsmiddel til de indre huller. Pladen anbringes i inkubatoren til vedhæftningskultur i 4 timer ved 37 °C.
- Når cellerne har klæbet, tilsættes OP-D og NOD separat i DMEM komplet medium til et endeligt volumen på 200 μL / brønd (de endelige koncentrationer af hvert lægemiddel er 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml og 30 μg / ml). For hver koncentration skal du bruge tre brønde som replikater. Placer derefter cellerne tilbage i inkubatoren og kulturen i yderligere 24 timer.
- CCK-8 fortyndes til 10 % med DMEM-komplet medium, og der tilsættes 100 μL/brøndfortyndinger indeholdende adjuvans- og celleopløsningerne til 96-brøndspladen. Placer pladen tilbage i inkubatoren og inkuber i yderligere 2-3 timer.
- Bland ofte, mens du pletterer celleopløsningen for at forhindre inhomogenitet på grund af celleudfældning. Ryst forsigtigt pladen flere gange før og efter tilsætning af CCK-8 for at blande mediet og CCK-8-opløsningen godt.
- Absorbansen måles ved 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser. Opsæt en nulstillingsbrønd med kun medium og CCK-8 for en baseline absorbansværdi. De nøjagtige absorbansværdier beregnes ved at trække absorbansværdien nulstillet fra den opnåede absorbansværdi ved afbildningen.
- Bekræft, at der ikke er bobler til stede i nogen brønde, før du tester med mikropladelæseren, fordi bobler vil forstyrre analysen.
3. Splenocytstimulering
- BALB/c-mus i alderen 6-8 uger immuniseres med 30 μg proteinantigen plus 30 μg adjuvans via en intramuskulær injektion (200 μL) på dag 0, dag 7 og dag 14 i henhold til følgende forsøgsgrupper: (1) PBS-gruppe, (2) antigen (Ag) gruppe, (3) antigen + OP-D (Ag/OP-D) gruppe, (4) antigen + BNE (Ag/BNE) gruppe, (5) antigen + NOD (Ag/NOD) gruppe og (6) antigen + AlPO4 (Ag/Al) gruppe.
- Forberedelsesrum: På dag 24 efter den primære immunisering fjernes musene fra dyrerummet og aflives ved en intraperitoneal injektion på 100 mg / kg 1% natriumpentobarbital. Læg musene i et glasfad og blød 75% alkohol i 5 min.
- Anbring centrifugeglassene på en centrifugerørsrist, nummerer engangspetriskålene, og tilsæt 5 ml PBS til hver petriskål med en 10 ml pipette.
- Lav et snit på 6-8 cm med en saks midt på musens venstre ventrale side, riv huden op, udsæt abdominalvæggen og find miltens lange røde strimmel.
- Løft peritoneum på miltens nedre side med tang, skær den åben og drej den opad for at udsætte milten. Løft milten med tang, adskil bindevævet under milten med oftalmisk saks, og fjern milten.
- Milten anbringes i en petriskål indeholdende 5 ml PBS og formales med en sigte (200 maske, 70 μm) og slibestang. Efter formaling overføres væsken til et 15 ml centrifugerør med en albuedråber i overensstemmelse med nummereringen.
- Centrifuger væsken ved 453 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, der tilsættes 3 ml natriumblodcellelysebuffer til hvert glas, cellerne resuspenderes og lyseres ved stuetemperatur i 10 min.
- Tilsæt 10-12 ml PBS til hvert glas, bland røret på hovedet og centrifuger ved 453 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, der tilsættes 10 ml PBS til hvert centrifugeglas, og cellerne genopslæmmes.
- Der udtages 20 μL af hver prøve i et hul på celletællepladen, og antallet af levende celler registreres ved hjælp af en automatiseret celletæller.
- Prøverne centrifugeres ved 453 x g i 5 min. og supernatanten kasseres. Resuspender cellerne, fortynd til 2,5 x 106 celler/ml med RF-10-medium (formuleringsoplysninger i tabel 2), og tilsæt til en 96-brønds plade ved 100 μL/hul.
- Antigenet fortyndes med RF-10-medium til 10 μg/ml, der tilsættes 100 μL til hvert hul, og der inkuberes i 3 dage ved 37 °C i 5 % CO2.
- Cellesuspensionen fra hver gruppe celler opsuges i 1,5 ml centrifugeglas, centrifugeres ved 453 x g i 20 minutter, og supernatanten suges til et rent centrifugeglas.
- Udfør IFN-γ og IL-17A indholdsdetektion strengt i henhold til ELISA-kitinstruktionerne. Metoderne og procedurerne er som følger.
- Forbered 1x vaskebufferarbejdsløsning (leveres med sættet), standardgradientkoncentrationsopløsning (fortyndet cytokinstandardopløsning til 500 pg / ml, 250 pg / ml, 125 pg / ml, 62,5 pg / ml, 31,3 pg / ml og 15,6 pg / ml i fortyndingsbufferen R [1x], der følger med sættet), biotinyleret antistofarbejdsopløsning (fortynd biotinyleret antistofopløsning til 1:100 ved hjælp af fortyndingsbufferen R [1x], der leveres med sættet, til dannelse af arbejdsløsningen), og streptavidin-HRP arbejdsløsning efter behov.
- Der tilsættes 100 μL/hul fortyndet cytokinstandardopløsning i standardhulet, 100 μL/hul prøve i prøvebrønden (fortyndingsbufferen R [1x], der leveres med sættet, anvendes til prøvefortyndingen) og 100 μL/hul fortyndingsbuffer R (1x) i blindprøvebrønden.
- Tilsæt biotinyleret antistofarbejdsopløsning ved 50 μL / brønd. Bland godt, dæk med en tætningsmembran og inkuber ved 37 °C i 90 minutter.
- Fjern væsken fra hullerne, og tilsæt 1x vaskebufferarbejdsløsning ved 300 μL/brønd. Kassér væsken fra brøndene efter 1 min. Gentag denne proces 4x, så væsken tørrer på filterpapir hver gang.
- Tilsæt 100 μL/hul streptavidin-HRP arbejdsløsning. Prøverne dækkes og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Prøverne centrifugeres ved 453 x g i 5 min. og supernatanten kasseres.
BEMÆRK: Den vaskeopløsning, der er tilbage i reaktionsbrønden under vaskeprocessen, skal klappes grundigt, indtil der ikke kan ses vandmærke på filterpapiret. - Der tilsættes TMB ved 100 μL/hul, pladerne inkuberes ved 37 °C i 5-30 minutter i mørke, og afslutningsreaktionen bedømmes i henhold til farvedybden i brønden (mørkeblå). Normalt kan 10-20 min til farveudvikling opnå gode resultater.
- Reaktionen afsluttes hurtigt ved at tilsætte stopopløsning ved 100 μL/hul. Absorbansværdien registreres ved 450 nm inden for 10 min efter afslutning.
BEMÆRK: Reagenset afbalanceres ved stuetemperatur i 30 minutter før brug.
4. ELISpot-analyse
- Udfør immunisering af musene og indsamling af splenocytter nøjagtigt som beskrevet i trin 3.1-3.10 ovenfor. Udfør analyserne for IFN-γ og IL-17A i nøje overensstemmelse med kitinstruktionerne. Metoderne og procedurerne er som følger.
- Fjern pladen fra den forseglede emballage, vask 4x med steril PBS (200 μL/hul), og tilsæt 1640 komplet dyrkningsmedium (200 μL/hul) for at afbalancere det ved stuetemperatur i 2 timer.
- Mediet fjernes og splenocytsuspensionen fortyndes med RF-10-medium til 2 x 105 celler/ml, idet der tilsættes 50 μL celler og antigen pr. hul (slutkoncentration: 10 μg/ml).
- Pladen anbringes i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer. Flyt ikke pladen i dette tidsrum, og tag forholdsregler for at undgå fordampning (f.eks. Pak pladen ind med aluminiumsfolie).
- Fortynd detektionsantistoffet (BVD6-24G2-biotin) til 1 μg/ml (1:1.000) i fosfatbufret saltvand (0,5 ml:100 ml) indeholdende 0,5% føtalt bovint serum (PBS-0,5% FBS). Der tilsættes 100 μL/hul til pladen, og den inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer efter filtrering gennem en 0,22 μm membran.
- Væsken dekanteres i hullerne, tilsættes 1x vaskebuffer ved 200 μL/hul, og vask 5x. Lad stå i 30-60 s hver gang, og lad det tørre for sidste gang på blottingpapir.
- Fortynd streptavidin-peberrodsperoxidasen (1:1.000) i PBS-0,5% FBS og tilsæt 100 μL/hul. Inkuber pladen i 1 time ved stuetemperatur. Pladen vaskes som i trin 4.6.
- Tilsæt 100 μL/hul TMB-substratopløsning, der er klar til brug, og udvikl, indtil der vises et klart sted. Stop farveudviklingen ved at vaske grundigt i deioniseret vand (skyl 5x-6x gentagne gange). Fjern om nødvendigt kulverten (den bløde plast under pladen), og skyl undersiden af membranen.
- Undersøg og tæl pletterne på en ELISpot-læser eller dissekermikroskop, efter at pladen er tørret.
5. Udviklingslandenes anvendelse
- Aflive normale BALB/c-mus ved en intraperitoneal injektion af 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital. Læg musene i blød i 75% alkohol i 5 min.
- Skær et snit på 6-8 cm under musens underliv med en saks, og klem de to ender af åbningen for at adskille den i forskellige retninger og udsætte musens ben. Adskil musens lårben fra musekroppen og skinnebenet fra leddet, og hold knoglerne intakte i begge ender.
- Fjern det resterende væv og brusk fra ledleddene i begge ender af lårbenet med saks og tang. Blødgør lårbenene i 75% alkohol i 5 minutter, og blød derefter i steril PBS-opløsning for at vaske overfladealkoholen af.
- Skær enderne af lårbenene af med en saks, og skyl knoglemarven i en steril petriskål med steril PBS-opløsning efterfulgt af aspiration med en 1 ml sprøjte. Gentag vasken 3x-5x.
- Der filtreres efter en cellesigte (200 mesh, 70 μm), og BMDC'erne samles i et 15 ml centrifugeglas. Prøverne centrifugeres ved 290 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, tilsættes 4 ml natriumblodcellelysebuffer, resuspenderes og lyseres ved stuetemperatur i 5 min.
- Der tilsættes 10 ml steril PBS-opløsning for at neutralisere lysatet, centrifugeres ved 290 x g i 5 min., og supernatanten kasseres.
- Resuspender cellerne i 1 ml DMEM indeholdende 1% penicillin-streptomycinopløsning og 10% FBS og tæller. Derefter tilsættes GM-CSF (20 ng / ml) plus IL-4 (10 ng / ml) til mediet, juster cellekoncentrationen til 5 x 105 / ml og pod cellerne på dæksedler.
- Cellesuspensionen tilsættes til en plade med 6 huller ved 2 ml/hul, og pladen anbringes i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer. Skift mediet helt efter 2 dage, og skift halvdelen af mediet efter 4 dage.
- Vælg fem brønde med celler i god stand (store og radiolucente celler med dendritiske fremspring på celleoverfladen) ved hjælp af et omvendt mikroskop ved 100x forstørrelse til eksperimentet på den syvende kulturdag. Supernatanten kasseres, tilsættes 2 ml GFP-, OP-D + GFP- og NOD + GFP-opløsninger fortyndet med DMEM-fuldsubstrat (GFP-slutkoncentration: 20 μg/ml; endelig adjuvanskoncentration: 10 μg/ml) til hvert hul, og pladerne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter i mørke.
- Pladerne vaskes 3x med PBS, tilsættes 1 ml 4% paraformaldehyd til hvert hul, og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. Paraformaldehydet fjernes efter fiksering, inkuberes cellerne med phalloidin og DAPI til en slutkoncentration på 10 μg/ml i 10 minutter til farvning, og vask derefter 3x med PBS.
- Der tilsættes 1 ml PBS til hvert hul, og antigenoptagelsen observeres ved hjælp af CLSM som beskrevet nedenfor.
- Åbn CLSM-softwaren, klik på ZEN System, og vent på, at hardwareinitialiseringen er afsluttet.
- Klik på GFP - og DAPI-genveje i fanen Find for at finde det område, der kan observeres. Sluk for lysstofrøret og det transmitterede lys.
- Klik på Smart opsætning i anskaffelsesmenuen for at åbne farvestofbiblioteket, og tilføj tre fluorescerende farvestoffer: EGFP, phalloidin og DAPI. Klik på Bedste signal > OK. Klik på EGFP-kanalen i fanen kanaler, og klik på Live for at vælge det korrekte synsfelt på den rigtige grænseflade.
- Vælg 1 AU som pinhole, drej finfokuseringsskruen for at justere brændvidden, og vælg det relevante brændplan. Klik på Range Indicator og juster kombinationen af laserkraft og masterforstærkning, så der kun vises sporadiske røde prikker på billedet.
- Juster phalloidin- og DAPI-kanalerne med de samme parametre uden at ændre lasereffekten.
- Vælg Stop Live , og klik på Acquisition Mode for at ændre optageparametrene: Rammestørrelse: 1024 pixels x 1024 pixels; Scan hastighed: 7; Gennemsnit: 2x. Klik på Snap , og vælg Opdel for at se alle de billeder, der er taget. Gem billederne.
6. Aktivering af makrofag
- Dyp C57BL/6 mus i 75% alkohol efter aktiv dødshjælp og læg dem med forsiden opad i et petrifad i nummereret rækkefølge.
- Før musene gennem transfervinduet ind i det sterile operationsrum og læg dem på operationsbordet i 5 min.
- Brug en sprøjte til at aspirere 10 ml saltvand, vip musene nedad ved ca. 45° og injicer i midten af bughulen. Træk ca. 5 ml cellesuspension i et 15 ml centrifugeglas for hver 10 ml og gentag injektionen 3x.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 129 x g i 5 minutter for at opnå peritoneale primære makrofager med mus. Resuspender cellerne, juster cellekoncentrationen til 2 x 106 celler/ml med RPMI 1640 komplet medium (indeholdende 10% FBS), og pod cellesuspensionen i en plade med 24 huller for at sikre et ensartet antal celler pr. hul (1 ml/hul).
- Dyrkning ved 37 °C i 5% CO 2 natten over (ca. 16-20 timer) efterfulgt af inkubation med PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD og Ag/Al (Ag slutkoncentration: 5 μg/ml; endelig adjuvanskoncentration: 10 μg/ml; samlet volumen:2 ml) i 24 timer. Niveauerne af IL-1β, IL-6 og TNF-α i kultursupernatanten med ELISA-sæt påvises ved hjælp af de metoder og procedurer, der er beskrevet i trin 3.12-3.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den cellulære aktivitetsevaluering af adjuvanserne OP-D og NOD blev afsluttet in vitro i henhold til protokollen. L929 fibroblaster er en nyttig screeningsmodel til in vitro toksicitetstest af NOD (figur 1). Kvantificeringen af inflammatoriske cytokinniveauer i milten kan hjælpe forskere med bedre at forstå immunresponset (figur 2). Overvågning af CTL'er med ELISpot er guldstandarden til vurdering af antigenspecifik T-celleimmunitet i kliniske forsøg og til screening af vaccinekandidater (figur 3). DC'ernes øgede optagelse af et antigen kan fremkalde forbedrede adaptive immunresponser (figur 4). Makrofager spiller en vigtig rolle i præsentationen af antigener til T-celler samt inducering af andre antigenpræsenterende celler til at udtrykke costimulatoriske molekyler og derved initiere adaptive immunresponser (figur 5). Ovenstående eksperimentelle resultater blev offentliggjort af Tong et al., og de forskellige antistofresponser in vivo og beskyttelseseffektivitet mod mus findes i den oprindelige artikel14.
Figur 1: In vitro cytotoksicitetstest af L929-celler. De cytotoksiske virkninger af forskellige gradientkoncentrationer af OP-D og NOD (30 μg/ml, 60 μg/ml, 120 μg/ml, 240 μg/ml og 480 μg/ml) ved inkubation med L929-celler vises. Et CCK-8-sæt blev brugt til detektion. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en statistisk analysesoftware. Forskelle mellem de to grupper blev analyseret ved hjælp af en uparret, tohalet elevs t-test. Alle værdier udtrykkes som gennemsnit ± SD (n = 3), og signifikante forskelle udtrykkes som følger: *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Niveauer af IFN-γ og IL-17A i splenocytter. Splenocytter fra vaccinerede mus blev stimuleret med antigenet i 3 dage, og niveauerne af cytokinerne (A) IFN-γ og (B) IL-17A i supernatanten blev målt med ELISA. Resultaterne viste, at IFN-γ- og IL-17A-produktionen blev signifikant øget i Ag/NOD-gruppen sammenlignet med Ag/OP-D-, Ag/BNE- og Ag/Al-grupperne (p < 0,01). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en statistisk analysesoftware. Forskelle mellem de flere grupper blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest. Alle værdier udtrykkes som gennemsnit ± SD (n = 8), og signifikante forskelle udtrykkes som følger: *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Antal IFN-γ- og IL-17A-udskillende celler i splenocytpopulationen. A) ELISpot-analyse af IFN-γ pletdannende antigenspecifikke T-celler blandt splenocytterne. B) ELISpot-analyse af IL-17A pletdannende antigenspecifikke T-celler blandt splenocytterne. I lighed med cytokinresultaterne viste Ag / OP-D og Ag / NOD-grupperne signifikant øgede forhold og antal IFN-γ- og IL-17A-dannende celler i miltlymfoide T-cellepopulationen. Ag / NOD-gruppen inducerede stærkere Th1 (p < 0,001) og Th17 (p < 0,01) immunresponser end de andre grupper. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en statistisk analysesoftware. Forskelle mellem de flere grupper blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest. Alle værdier udtrykkes som gennemsnit ± SD (n = 8), og signifikante forskelle udtrykkes som følger: *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: CLSM-billeder af BMDC'ernes antigenoptagelse. Phalloidin pletter cytoskelettet i rødt, DAPI pletter kernen i blåt, og GFP præsenterer grøn fluorescens. Som vist i figuren observeres grøn fluorescens i CLSM efter 30 minutters sammenkubation af GFP + OP-D og GFP + NOD-grupperne med BMDC'er, men GFP + NOD-partiklerne er omgivet af fagosomlignende vesikulære strukturer, mens GFP + OP-D-partiklerne ikke er. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Virkningen af adjuvansformuleret antigen på aktiveringen af PM'er. ELISA til påvisning af koncentrationerne af cytokinerne IL-1β, IL-6 og TNF-α i supernatanten af PM'er sammenfaldende med PBS, Ag, Ag / OP-D, Ag / NOD og Ag / Al. Sammenlignet med antigenstimulering øgede Ag / NOD, Ag / OP-D og Ag / Al-stimulering alle signifikant IL-1β, IL-6 og TNF-α sekretion fra PM'erne (p < 0,05). Aktiveringen af makrofager blev signifikant forbedret i NOD-gruppen sammenlignet med OP-D- og AlPO4-grupperne (p < 0,05). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en statistisk analysesoftware. Forskelle mellem de flere grupper blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest. Alle værdier udtrykkes som gennemsnit ± SD (n = 8), og signifikante forskelle udtrykkes som følger: *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Tæthed | Masse(pr. 10 g) |
| Cremophor EL-35 | Bulk | 1.92 |
| Glycerol | Bulk | 0.48 |
| GTCC | Bulk | 0.6 |
| Ultrarent vand | Bulk | Restbeløb |
Tabel 1: Formlen for BNE.
| Reagens | Tæthed | Lydstyrke |
| β- Mercaptoethanol | 50μM | 0,366μL |
| Føtalt bovin serum | 1X | 10 ml |
| Glutamax | 2mM | 1 ml |
| Glutamax RPMI 1640 | 1X | 85 ml |
| HEPES | 10mM | 1 ml |
| Ikke-essentielle aminosyrer(100x) | 1X | 1 ml |
| Penicillin-streptomycin opløsning | 100U/ml | 1 ml |
| Natriumpyruvat(100 mM) | 1mM | 1 ml |
Tabel 2: Oplysninger om forberedelse af RF-10 komplet medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Underenhedsvacciner giver fremragende sikkerhed, men dårlig immunogenicitet. Hovedstrategien til forbedring af immunogeniciteten er fysisk at adsorbere eller parre antigener med adjuvanser og inkorporere dem i lægemiddelafgivelsessystemerne for at fremme optagelse og præsentation af DC'er. Naturlige plantesaponiner såsom quillaia saponin og derivater heraf er meget giftige og er ikke egnede til udvikling af humane vacciner17. Derfor er undersøgelsen af de toksiske virkninger af vacciner eller adjuvanser på celler et nødvendigt første skridt i evalueringen af nye vacciner.
Protokollen præsenteret i denne undersøgelse udføres i henhold til ISO 10993-5: 200918, hvilket giver en vis fleksibilitet i prøvefremstillingen. Standard toksiske cellelinje, L929 fibroblaster og tandkødsfibroblaster har lignende niveauer af cytotoksicitet. L929-fibroblaster er imidlertid blevet en nyttig screeningsmodel for in vitro-toksicitetstest af nanomaterialer på grund af deres fremragende reproducerbarhed19. MTT og CCK-8 anvendes almindeligvis til cellelevedygtighed og cytotoksicitetsassays. Resultaterne af MTT- og CCK-8-assays modsiger hinanden og er ikke signifikant korrelerede, men cellelevedygtigheden af CCK-8-analysen er signifikant forskellig fra MTT-assay20. En mulig forklaring på MTT-resultaterne i den tidligere undersøgelse er, at accelererende celledød kan induceres ved højere MTT-koncentrationer21. De eksperimentelle resultater af CCK-8-metoden er generelt i overensstemmelse med resultaterne af dyretoksicitetstest22. Indtil nye cytotoksiske evalueringsmetoder er tilgængelige, er brugen af CCK-8-assayet til påvisning af OP-D's og NOD's toksicitet over for L929-celler sandsynligvis den bedste løsning på nuværende tidspunkt. Denne metode vil også fortsat blive anvendt inden for vaccinematerialer og adjuverende evaluering.
Milten er det største sekundære lymfoide organ i menneskekroppen, og kvantificeringen af inflammatoriske cytokinniveauer i milten kan hjælpe os med at forstå immunresponset23. Det antages, at der er nogle grundlæggende forskelle i strukturen og celletyperne mellem milten hos mus og mennesker 24, men den grundlæggende lighed mellem specifikke immuncelletyper og miltregionens funktion gør undersøgelser ved hjælp af musens milt-T-celler relevante24. I denne protokol målte vi sekretoriske niveauer af Th1 cytokin IFN-γ og Th17 cytokin IL-17A i milten ved hjælp af ELISA kits. Dette assay bruges normalt til kvantitative bestemmelser og har høj følsomhed, fordi det bruger antistoffer med høj affinitet til at vaske uspecifikke stoffer væk. De vigtigste begrænsninger ved denne undersøgelse er den lange måletid og det høje forbrug af reagenser. Cytokiner kan også detekteres med flowcytometri og Luminex-metoder, men disse metoder kræver komplekse instrumenter samt dyre råmaterialer og specialuddannelse. Derfor er dette enkle og økonomiske ELISA-kit et værdifuldt værktøj til måling af specifikke immunresponser. ELISpot er blevet en af de mest almindeligt anvendte teknikker til bestemmelse af immunresponserne af specifikke cytokinspotdannende celler. Det kan ikke kun bruges til at detektere CD8 + T-celleresponser fremkaldt af vaccinekandidater, men også til genkendelse af specifikke antigener efter immunisering25. Med screening med høj kapacitet og en følsom detektionsgrænse (1/100.000 celler) bruges ELISpot i vid udstrækning, da det også giver fordele ved direkte observation af celler og hurtig analyse. Dannelsen af hver plet angiver hyppigheden af aktivering af individuelle T-celler eller B-cellerEvalueringen af cellulær respons på vacciner og adjuvanser er af stor betydning, hvilket gør ELISpot uerstattelig på nuværende tidspunkt.
DC'ers præsentation af antigener er en forudsætning for at fremkalde immunresponser14. DC'er, der anvendes til antigenoptagelse, migration til lymfeknuder og aktivering af naive T-celler, er en af de væsentlige celletyper til udvikling af T-cellemedierede immunresponser14. I betragtning af at interaktionen mellem nanoemulsionspartikler og cellemembranen er en nøgledeterminant for partikeloptagelse, blev GFP-fagocytose inden for DC'er bestemt ved anvendelse af CLSM i denne eksperimentelle protokol. Det har vist sig, at DC'er effektivt kan transportere antigener til drænende lymfeknuder, hvilket kan være grunden til, at adjuvanser forbedrer antigenimmunogeniciteten in vivo. Derudover er CLSM den mest almindelige kommercielle implementering af teknikken og bruges i vid udstrækning i billeddannelseslaboratorier. Den optiske sektionskapacitet, klare opløsning og alsidighed af 3D-billeddannelse26 af CLSM gør det til det bedste værktøj til analyse af antigenoptagelse af DC'er, selvom det ikke kan bruges til indsamling af kvantitative data.
Det vigtigste histokompatibilitetskompleks (MHC I og II) er vigtigt for den specifikke genkendelse af antigener. MHC II funktionelle molekyler udtrykkes stærkt i APC'er og fungerer til at inducere CD4 + T-celleaktivering. APC'er inkluderer makrofager, DC'er og B-lymfocytter27, som stærkt modulerer adaptiv immunitet. Makrofager er bredt fordelt i værtsimmunsystemet og spiller en nøglerolle i forsvar og homeostase28. Aktivering af makrofager er afgørende for at indlede adaptive immunresponser29. I mellemtiden kan nanoemulsionsadjuvanser, der har samme størrelse som patogener, fremme antigengenkendelse og fagocytose, aktivere NALP3-inflammasomer og makrofager og modulere antigenpræsentation28. I denne protokol blev PM'er hovedsageligt anvendt som model til bestemmelse af sekretionen af de proinflammatoriske cytokiner IL-1β ogTh2, cytokiner IL-6 og TNF-α af ELISA, som kan bruges til kvalitativt at evaluere makrofagaktiveringsevnen hos vacciner og adjuvanser. Imidlertid skal aktiveringsgraden og mekanismen bestemmes af flere eksperimenter. For eksempel om EGF, IL-6 og andre faktorer, der er nødvendige for aktivering af immunceller, udskilles, og de relaterede signalveje (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt osv.) skal undersøges.
Sammenfattende er der etableret en række protokoller til bekræftelse af in vitro-cellulære reaktioner på nye adjuvanser, herunder cytotoksicitet, cytokinsekretion, DC-optagelse og makrofagaktivering. Disse protokoller viser ikke kun lav toksicitet og høj cellulær levering, men giver også detaljerede procedurer for CCK-8, ELISA og ELISpot. Cellulære responsvurderinger af den planteafledte immunpotentiator OP-D og dens modificerede kraftfulde nanoemulsionsadjuvans NOD blev afsluttet in vitro, og protokollen var effektiv. Selvom ELISA, ELISpot og konfokale laserscanningsteknikker klassisk er blevet brugt til at evaluere in vitro-immunkompetence hos adjuvanser til celler, har disse metoder mange ulemper, såsom lange måletider, tunge arbejdsbyrder, dyre materialer og behovet for professionelle teknikere. Mange nøjagtige metoder og avancerede teknologier, såsom genchips, enkeltcellesekventering og transkriptomteknologi, skal bruges i fremtidige undersøgelser for yderligere at udvide teknikkens omfang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende økonomiske eller personlige interesser, der kunne have påvirket det arbejde, der er rapporteret i dette papir.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, tilskud nr. 31670938, 32070924, 82041045 og 32000651 fra National Natural Science Foundation Program of China, tilskud nr. 2014jcyjA0107 og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 fra Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, bevilling nr. CYS21519 fra Postgraduate Research and Innovation Project of Chongqing, tilskud nr. 2020XBK24 fra Army Medical University Særlige projekter og tilskud nr. 202090031021 af National Innovation and Entrepreneurship Program for universitetsstuderende.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
