In vitro Cellulær aktivitetsevaluering af nanoemulsionsvaccineadjuvansen ophiopogonin D

Summary

Protokollen præsenterer detaljerede metoder til evaluering af, om nanoemulsionen ophiopogonin D-adjuvans fremmer effektive cellulære immunresponser.

Abstract

Som en hovedbestanddel i vacciner kan adjuvanser direkte fremkalde eller forbedre de kraftfulde, udbredte, medfødte og adaptive immunresponser forbundet med antigener. Ophiopogonin D (OP-D), en renset komponent ekstraheret fra planten Ophiopogon japonicus, har vist sig at være nyttig som vaccineadjuvans. Problemerne med OP-D’s lave opløselighed og toksicitet kan effektivt overvindes ved at anvende en lavenergiemulgeringsmetode til fremstilling af nanoemulsion ophiopogonin D (NOD). I denne artikel undersøges en række in vitro-protokoller til evaluering af cellulær aktivitet. De cytotoksiske virkninger af L929 blev bestemt ved anvendelse af et celletællingssæt-8-assay. Derefter blev de udskillede cytokinniveauer og tilsvarende immuncellenumre efter stimulering og dyrkning af splenocytter fra immuniserede mus detekteret ved ELISA- og ELISpot-metoder. Derudover blev antigenoptagelsesevnen i knoglemarvsafledte dendritiske celler (BMDC’er), som blev isoleret fra C57BL/6-mus og modnet efter inkubation med GM-CSF plus IL-4, observeret ved laserscanningskonfokalmikroskopi (CLSM). Det er vigtigt, at makrofagaktivering blev bekræftet ved at måle niveauerne af IL-1β, IL-6 og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) cytokiner af ELISA-sæt efter coculturing af peritoneale makrofager (PM’er) fra tomme mus med adjuvansen i 24 timer. Det er håbet, at denne protokol vil give andre forskere direkte og effektive eksperimentelle tilgange til at evaluere den cellulære responseffektivitet af nye vaccineadjuvanser.

Introduction

Vacciner er et vigtigt middel til forebyggelse og behandling af infektiøse og ikkeoverførbare sygdomme. Passende tilsætning af adjuvanser og leveringsmidler til vaccineformuleringer er gavnlig for at forbedre antigenernes immunogenicitet og generere langvarige immunresponser¹. Ud over den klassiske adjuvans alun (aluminiumsalt) er der seks slags adjuvanser til vacciner, der i øjeblikket markedsføres: MF59^2,3, AS04 3, AS03 3, AS01 ³, CpG1018⁴ og Matrix-M⁵. Generelt, når menneskekroppen støder på et viralt angreb, tager den første og anden forsvarslinje (hud, slimhinde og makrofager) føringen i at rydde virussen, og endelig aktiveres den tredje forsvarslinje, der involverer immunorganerne og immuncellerne. Aluminiums- og aluminiumsalte har været de mest anvendte hjælpestoffer til humane vacciner siden begyndelsen af 1920’erne, hvilket fremkalder et effektivt medfødt immunrespons⁶. Det er imidlertid blevet foreslået, at aktivering af antigenpræsenterende celler (APC’er) af klassiske adjuvanser, som stimulerer immuncellerne til at generere specifikke sæt cytokiner og kemokiner, er den mekanisme, hvormed adjuvanser virker og kan være en af grundene til, at adjuvanser kun udøver forbigående virkninger på specifikke immunresponser⁷. Tilstedeværelsen af begrænsede godkendte adjuvanser til human brug er en begrænsende faktor for udvikling af vacciner, der fremkalder effektive immunresponser⁸.

I øjeblikket viser et stigende antal adjuverende undersøgelser evnen til at inducere et stærkt cellulært immunrespons hos mus. QS-21 har vist sig at inducere et afbalanceret T-hjælper 1 (Th1) og T-hjælper 2 (Th2) immunrespons, producere højere niveauer af antistoftitere og forlænge beskyttelsen som adjuvans, men dets stærke toksicitet og hæmolytiske egenskaber begrænser dets udvikling som en selvstændig klinisk adjuvans ^9,10. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranosid) er et af de steroide saponiner isoleret fra roden af den kinesiske lægeplante Ophiopogon japonicas⁴. Derudover er det den vigtigste farmakologisk aktive komponent (Shen Mai San), der findes i Radix Ophiopogonis og vides at have visse farmakologiske egenskaber¹¹. Desuden er det medlem af familien Liliaceae og bruges i vid udstrækning til dets hæmmende og beskyttende virkninger i cellulær inflammation og myokardieskade. For eksempel forbedrer OP-D DNCB-inducerede atopiske dermatitislignende læsioner og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) inflammatoriske HaCaT-celler i BALB / c-mus¹². Det er vigtigt, at OP-D fremmer den antioxidative beskyttelse af det kardiovaskulære system og beskytter hjertet mod doxorubicin-induceret autofagisk skade ved at reducere både generering af reaktive iltarter og forstyrre mitokondriemembranskader. Eksperimenter har vist, at indtagelse af OP-D med monodesmosid hjælper med at øge immunforsvaret, øge antallet af hvide blodlegemer og DNA-syntese og få antistoffer til at vare længere¹³. Det har tidligere vist sig, at OP-D har en adjuvanseffekt¹⁴.

Nanoemulsioner er olie-i-vand nanoformuleringer sammensat af en kombination af overfladeaktive stoffer, olie, cosurfactants og vand^12,15. Disse nanovaccinedesign gør det muligt at indkapsle antigener og adjuvanser sammen for at forbedre immunstimuleringen, beskytte antigenerne og fremme dendritisk cellemodning (DC)¹⁶. For udvikling af disse nye adjuvanser opnået ved screening er det vigtigt at finde passende metoder til at evaluere deres cellulære responsevner.

Formålet med denne protokol er systematisk at vurdere, om adjuvanser kan forbedre fagocytose og ekspression af immunceller i in vitro-cellekultur og at uddybe de vigtigste eksperimentelle metoder. Eksperimentet er opdelt i fire underafsnit: (1) toksiciteten af OP-D og NOD til L929-celler bestemmes af celletællingssæt-8 (CCK-8) assay; (2) cytokinniveauerne af endokrine IFN-γ og IL-17A og de tilsvarende cellenumre i immuniserede mus påvises ved splenocytstimulering og ELISpot-assays; 3) DC’ernes antigenpræsentationsevne efter adjuverende stimulering observeres ved anvendelse af konfokalmikroskopi og (4) de tre slags cytokiner, IL-1β, IL-6 og TNF-α, i supernatanterne opnået fra peritoneale makrofager (PM’er) i normale mus dyrket sammen med adjuvanser detekteres.

Protocol

Alle celleeksperimenter blev udført i et celleteknisk laboratorium udstyret med grundlæggende operationsstuer, bufferrum, sterile dyrkningsrum og identifikations- og analyserum. Arbejdsmiljøet og forholdene var fri for mikrobiel kontaminering og andre skadelige faktorer. Dyreforsøgene blev udført på baggrund af retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af laboratoriedyrs velfærds- og etiske komité ved det tredje militære medicinske universitet. 1. Autokl…

Representative Results

Den cellulære aktivitetsevaluering af adjuvanserne OP-D og NOD blev afsluttet in vitro i henhold til protokollen. L929 fibroblaster er en nyttig screeningsmodel til in vitro toksicitetstest af NOD (figur 1). Kvantificeringen af inflammatoriske cytokinniveauer i milten kan hjælpe forskere med bedre at forstå immunresponset (figur 2). Overvågning af CTL’er med ELISpot er guldstandarden til vurdering af antigenspecifik T-celleimmunitet i klini…

Discussion

Underenhedsvacciner giver fremragende sikkerhed, men dårlig immunogenicitet. Hovedstrategien til forbedring af immunogeniciteten er fysisk at adsorbere eller parre antigener med adjuvanser og inkorporere dem i lægemiddelafgivelsessystemerne for at fremme optagelse og præsentation af DC’er. Naturlige plantesaponiner såsom quillaia saponin og derivater heraf er meget giftige og er ikke egnede til udvikling af humane vacciner¹⁷. Derfor er undersøgelsen af de toksiske virkninger af vacciner eller…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x)	GIBCO, USA	25200056
96-well filter plates	Millipore. Billerica, MA	CLS3922
AlPO4	General Chemical Company, USA	null
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd	null
caprylic/capric triglyceride (GTCC)	Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China	null
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Cell Counting Plate	Costar, Corning, USA	CO010101
Cell Sieve	biosharp, China	BS-70-CS
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
DMEM basic(1x) medium	GIBCO, USA	C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)	Mumbai, India	null
ELISpot classic	AID, Germany	ELR06
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
GFP	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P42212
Glutamax	Invitrogen, USA	35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor	GM-CSF, R&D Systems, USA	315-03
HEPES	Invitrogen, USA	15630106
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	null
IL-4	PeproTech, USA	042149
L929 cell line	FENGHUISHENGWU, China	NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss, Germany	LSM 980
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit	Dakewe, China	1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit	Dakewe, China	DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit	Dakewe, China	1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit	ebiosciences, USA	3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit	Dakewe, China	1210122
Mouse IL-6 ELISA kit	Dakewe, China	1210602
Mouse TNF-α ELISA kit	Dakewe, China	1217202
Non-essential amino acids(100x)	Invitrogen, USA	11140050
Ophiopogonin-D	Chengdu Purui Technology Co. Ltd	945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution	Invitrogen, USA	15070063
Phalloidin	Solarbio, China	CA1620
Phosphate Buffered Saline	ZSGB-BIO, China	ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology), USA	SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)	Invitrogen, USA	11360070
Squalene	Sigma, USA	S3626
β- Mercaptoethanol	Invitrogen, USA	21985023