Summary

In vitro Évaluation de l’activité cellulaire de l’adjuvant du vaccin à nanoémulsion ophiopogonine D

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Le protocole présente des méthodes détaillées pour évaluer si l’adjuvant de nanoémulsion ophiopogonine D favorise des réponses immunitaires cellulaires efficaces.

Abstract

En tant qu’ingrédient principal des vaccins, les adjuvants peuvent directement induire ou améliorer les réponses immunitaires puissantes, généralisées, innées et adaptatives associées aux antigènes. L’ophiopogonine D (OP-D), un composant purifié extrait de la plante Ophiopogon japonicus, s’est avérée utile comme adjuvant vaccinal. Les problèmes de faible solubilité et de toxicité de l’OP-D peuvent être efficacement surmontés en utilisant une méthode d’émulsification à faible énergie pour préparer la nanoémulsion d’ophiopogonine D (NOD). Dans cet article, une série de protocoles in vitro pour l’évaluation de l’activité cellulaire sont examinés. Les effets cytotoxiques de L929 ont été déterminés à l’aide d’un test de comptage cellulaire kit-8. Ensuite, les niveaux de cytokines sécrétées et le nombre de cellules immunitaires correspondantes après la stimulation et la culture de splénocytes de souris immunisées ont été détectés par les méthodes ELISA et ELISpot. De plus, la capacité d’absorption de l’antigène dans les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC), qui ont été isolées chez des souris C57BL/6 et mûries après incubation avec GM-CSF plus IL-4, a été observée par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Il est important de noter que l’activation des macrophages a été confirmée en mesurant les niveaux de cytokines IL-1β, IL-6 et du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) par des kits ELISA après coculture de macrophages péritonéaux (PM) de souris blanches avec l’adjuvant pendant 24 heures. On espère que ce protocole fournira à d’autres chercheurs des approches expérimentales directes et efficaces pour évaluer l’efficacité de la réponse cellulaire de nouveaux adjuvants vaccinaux.

Introduction

Les vaccins sont un moyen important de prévenir et de traiter les maladies infectieuses et non transmissibles. L’ajout approprié d’adjuvants et de véhicules d’administration aux formulations vaccinales est bénéfique pour renforcer l’immunogénicité des antigènes et générer des réponses immunitaires durables1. En plus de l’adjuvant classique alun (sel d’aluminium), il existe six types d’adjuvants pour les vaccins qui sont actuellement commercialisés: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG1018 4 et Matrix-M5. Généralement, lorsque le corps humain rencontre une attaque virale, les première et deuxième lignes de défense (peau, muqueuse et macrophages) prennent la tête de l’élimination du virus, et enfin, la troisième ligne de défense, impliquant les organes immunitaires et les cellules immunitaires, est activée. L’aluminium et les sels d’aluminium sont les adjuvants les plus utilisés pour les vaccins humains depuis le début des années 1920, provoquant une réponse immunitaire innée efficace6. Cependant, il a été proposé que l’activation des cellules présentatrices d’antigènes (APC) par les adjuvants classiques, qui stimule les cellules immunitaires à générer des ensembles spécifiques de cytokines et de chimiokines, est le mécanisme par lequel les adjuvants agissent et peut être l’une des raisons pour lesquelles les adjuvants n’exercent que des effets transitoires sur des réponses immunitaires spécifiques7. La présence d’adjuvants homologués limités à usage humain est un facteur restrictif pour la mise au point de vaccins qui provoquent des réponses immunitaires efficaces8.

Actuellement, un nombre croissant d’études adjuvantes démontrent la capacité d’induire une forte réponse immunitaire cellulaire chez la souris. Il a été démontré que le QS-21 induit une réponse immunitaire équilibrée T-helper 1 (Th1) et T-helper 2 (Th2), produit des niveaux plus élevés de titres d’anticorps et prolonge la protection en tant qu’adjuvant, mais sa forte toxicité et ses propriétés hémolytiques limitent son développement en tant qu’adjuvant clinique autonome 9,10. OP-D (ruscogénine-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) est l’une des saponines stéroïdiennes isolées de la racine de la plante médicinale chinoise Ophiopogon japonicas4. De plus, c’est le principal composant pharmacologiquement actif (Shen Mai San) trouvé dans Radix Ophiopogonis et est connu pour avoir certaines propriétés pharmacologiques11. De plus, il fait partie de la famille des Liliaceae et est largement utilisé pour ses effets inhibiteurs et protecteurs dans l’inflammation cellulaire et les lésions myocardiques. Par exemple, l’OP-D améliore les lésions de type dermatite atopique induites par la DNCB et les cellules HaCaT inflammatoires du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) chez les souris BALB / c12. Il est important de noter que l’OP-D favorise la protection antioxydante du système cardiovasculaire et protège le cœur contre les lésions autophages induites par la doxorubicine en réduisant à la fois la génération d’espèces réactives de l’oxygène et la perturbation des dommages à la membrane mitochondriale. Des expériences ont montré que la prise d’OP-D avec du mono-desmoside aide à stimuler la santé immunitaire, à augmenter le nombre de globules blancs et la synthèse de l’ADN, et à prolonger la durée de vie des anticorps13. Il a déjà été constaté que l’OP-D a un effet adjuvant14.

Les nanoémulsions sont des nanoformulations huile-dans-eau composées d’une combinaison de tensioactifs, d’huile, de cotensioactifs et d’eau12,15. Ces conceptions de nanovaccins permettent d’encapsuler les antigènes et les adjuvants ensemble pour améliorer la stimulation immunitaire, protéger les antigènes et favoriser la maturation des cellules dendritiques (DC)16. Pour le développement de ces nouveaux adjuvants obtenus par dépistage, il est important de trouver des méthodes appropriées pour évaluer leurs capacités de réponse cellulaire.

Le but de ce protocole est d’évaluer systématiquement si les adjuvants peuvent améliorer la phagocytose et l’expression des cellules immunitaires en culture cellulaire in vitro et d’élaborer les principales méthodes expérimentales. L’expérience est divisée en quatre sous-sections : (1) la toxicité des cellules OP-D et NOD pour les cellules L929 est déterminée par le test du kit de comptage cellulaire 8 (CCK-8); (2) les taux de cytokines de l’IFN-γ endocrinienne et de l’IL-17A et le nombre de cellules correspondant chez les souris immunisées sont détectés par stimulation splénocytaire et tests ELISpot; (3) la capacité de présentation de l’antigène des CD après stimulation adjuvante est observée par microscopie confocale; et (4) les trois types de cytokines, IL-1β, IL-6 et TNF-α, dans les surnageants obtenus à partir de macrophages péritonéaux (PM) chez des souris normales cocultivées avec des adjuvants sont détectés.

Protocol

Toutes les expériences cellulaires ont été réalisées dans un laboratoire d’ingénierie cellulaire équipé de salles d’opération de base, de salles tampons, de salles de culture stérile et de salles d’identification et d’analyse. L’environnement et les conditions de travail étaient exempts de contamination microbienne et d’autres facteurs nocifs. Les expériences sur les animaux ont été menées sur la base des Directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuv…

Representative Results

L’évaluation de l’activité cellulaire des adjuvants OP-D et NOD a été réalisée in vitro conformément au protocole. Les fibroblastes L929 sont un modèle de dépistage utile pour les essais de toxicité in vitro du NOD (Figure 1). La quantification des taux de cytokines inflammatoires dans la rate peut aider les chercheurs à mieux comprendre la réponse immunitaire (Figure 2). La surveillance des LTC avec ELISpot est l’étalon-or p…

Discussion

Les vaccins sous-unitaires offrent une excellente innocuité, mais une faible immunogénicité. La principale stratégie pour améliorer l’immunogénicité consiste à adsorber physiquement ou à coupler les antigènes avec des adjuvants et à les incorporer dans les systèmes d’administration des médicaments afin de favoriser l’adoption et la présentation par les pays en développement. Les saponines végétales naturelles telles que la saponine de quillaia et ses dérivés sont hautement toxiques et ne convienn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par la subvention n ° 2021YFC2302603 du Programme national de recherche et de développement clé de la Chine, les subventions n ° 31670938, 32070924, 82041045 et 32000651 du programme de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, les subventions n ° 2014jcyjA0107 et n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing, la subvention n ° CYS21519 du projet de recherche et d’innovation de troisième cycle de Chongqing, subvention n ° 2020XBK24 de l’Université médicale de l’armée Projets spéciaux et subvention n ° 202090031021 du Programme national d’innovation et d’entrepreneuriat pour les étudiants collégiaux.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x) GIBCO, USA 25200056
96-well filter plates Millipore. Billerica, MA CLS3922
AlPO4 General Chemical Company, USA null
Automated Cell Counter Countstar, China IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd null
caprylic/capric triglyceride (GTCC) Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China null
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Cell Counting Plate Costar, Corning, USA CO010101
Cell Sieve biosharp, China BS-70-CS
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
DMEM basic(1x) medium GIBCO, USA C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35) Mumbai, India null
ELISpot classic AID, Germany ELR06
Fetal Bovine Serum GIBCO, USA 10099141C
Full-function Microplate Reader Thermo Fisher Scientific, USA VL0000D2
GFP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P42212
Glutamax Invitrogen, USA 35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor GM-CSF, R&D Systems, USA 315-03
HEPES Invitrogen, USA 15630106
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland null
IL-4 PeproTech, USA 042149
L929 cell line FENGHUISHENGWU, China  NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss, Germany LSM 980
MONTANE 85 PPI SEPPIC, France L12910
MONTANOX 80 PPI SEPPIC, France 36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit Dakewe, China 1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit Dakewe, China DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit Dakewe, China 1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit ebiosciences, USA 3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit Dakewe, China 1210122
Mouse IL-6 ELISA kit Dakewe, China 1210602
Mouse TNF-α ELISA kit Dakewe, China 1217202
Non-essential amino acids(100x) Invitrogen, USA 11140050
Ophiopogonin-D Chengdu Purui Technology Co. Ltd 945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution Invitrogen, USA 15070063
Phalloidin Solarbio, China CA1620
Phosphate Buffered Saline ZSGB-BIO, China ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer Solarbio, China R1010
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology), USA SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM) Invitrogen, USA 11360070
Squalene Sigma, USA S3626
β- Mercaptoethanol Invitrogen, USA 21985023

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Luo, X., Tong, Y., Zeng, X., Ye, Y., Yang, Y., Song, Z., Zhang, Z., Li, H., Gao, J., Mao, X., Zeng, H., Zou, Q., Sun, H. In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D. J. Vis. Exp. (190), e64291, doi:10.3791/64291 (2022).

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