Le protocole présente des méthodes détaillées pour évaluer si l’adjuvant de nanoémulsion ophiopogonine D favorise des réponses immunitaires cellulaires efficaces.
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Article de méthode
In vitro Évaluation de l’activité cellulaire de l’adjuvant du vaccin à nanoémulsion ophiopogonine D
Dans cet article
Résumé
Résumé
En tant qu’ingrédient principal des vaccins, les adjuvants peuvent directement induire ou améliorer les réponses immunitaires puissantes, généralisées, innées et adaptatives associées aux antigènes. L’ophiopogonine D (OP-D), un composant purifié extrait de la plante Ophiopogon japonicus, s’est avérée utile comme adjuvant vaccinal. Les problèmes de faible solubilité et de toxicité de l’OP-D peuvent être efficacement surmontés en utilisant une méthode d’émulsification à faible énergie pour préparer la nanoémulsion d’ophiopogonine D (NOD). Dans cet article, une série de protocoles in vitro pour l’évaluation de l’activité cellulaire sont examinés. Les effets cytotoxiques de L929 ont été déterminés à l’aide d’un test de comptage cellulaire kit-8. Ensuite, les niveaux de cytokines sécrétées et le nombre de cellules immunitaires correspondantes après la stimulation et la culture de splénocytes de souris immunisées ont été détectés par les méthodes ELISA et ELISpot. De plus, la capacité d’absorption de l’antigène dans les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC), qui ont été isolées chez des souris C57BL/6 et mûries après incubation avec GM-CSF plus IL-4, a été observée par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Il est important de noter que l’activation des macrophages a été confirmée en mesurant les niveaux de cytokines IL-1β, IL-6 et du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) par des kits ELISA après coculture de macrophages péritonéaux (PM) de souris blanches avec l’adjuvant pendant 24 heures. On espère que ce protocole fournira à d’autres chercheurs des approches expérimentales directes et efficaces pour évaluer l’efficacité de la réponse cellulaire de nouveaux adjuvants vaccinaux.
Introduction
Les vaccins sont un moyen important de prévenir et de traiter les maladies infectieuses et non transmissibles. L’ajout approprié d’adjuvants et de véhicules d’administration aux formulations vaccinales est bénéfique pour renforcer l’immunogénicité des antigènes et générer des réponses immunitaires durables1. En plus de l’adjuvant classique alun (sel d’aluminium), il existe six types d’adjuvants pour les vaccins qui sont actuellement commercialisés: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG1018 4 e....
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Protocole
Toutes les expériences cellulaires ont été réalisées dans un laboratoire d’ingénierie cellulaire équipé de salles d’opération de base, de salles tampons, de salles de culture stérile et de salles d’identification et d’analyse. L’environnement et les conditions de travail étaient exempts de contamination microbienne et d’autres facteurs nocifs. Les expériences sur les animaux ont été menées sur la base des Directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité de bien-être et d’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire.
1. Autoclavage et préparation....
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Résultats
L’évaluation de l’activité cellulaire des adjuvants OP-D et NOD a été réalisée in vitro conformément au protocole. Les fibroblastes L929 sont un modèle de dépistage utile pour les essais de toxicité in vitro du NOD (Figure 1). La quantification des taux de cytokines inflammatoires dans la rate peut aider les chercheurs à mieux comprendre la réponse immunitaire (Figure 2). La surveillance des LTC avec ELISpot est l’étalon-or pour évaluer l’immun.......
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Discussion
Les vaccins sous-unitaires offrent une excellente innocuité, mais une faible immunogénicité. La principale stratégie pour améliorer l’immunogénicité consiste à adsorber physiquement ou à coupler les antigènes avec des adjuvants et à les incorporer dans les systèmes d’administration des médicaments afin de favoriser l’adoption et la présentation par les pays en développement. Les saponines végétales naturelles telles que la saponine de quillaia et ses dérivés sont hautement toxiques et ne conviennent pas au développement .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers ou personnels concurrents qui auraient pu influencer le travail rapporté dans cet article.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par la subvention n ° 2021YFC2302603 du Programme national de recherche et de développement clé de la Chine, les subventions n ° 31670938, 32070924, 82041045 et 32000651 du programme de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, les subventions n ° 2014jcyjA0107 et n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing, la subvention n ° CYS21519 du projet de recherche et d’innovation de troisième cycle de Chongqing, subvention n ° 2020XBK24 de l’Université médicale de l’armée Projets spéciaux et subvention n ° 202090031021 du Programme national d’innovation et d’entrepreneuriat pou....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsine-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| plaques filtrantes à 96 puits | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, États-Unis | null | |
| Compteur de cellules automatisé | Countstar, Chine | IC1000 | |
| souris BALB/c et souris C57BL/6 | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglycéride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Pékin, Chine | null | |
| Kits CCK-8 | Dojindo, Japon | CK04 | |
| Plaque de comptage cellulaire | Costar, Corning, États-Unis | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, Chine | BS-70-CS | |
| Centrifugeuse 5810 R | Eppendorf, Allemagne ; | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, États-Unis | C11885500BT | |
| DSZ5000X Microscope inversé | Nikon, Japon | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, Inde | null | |
| ELISpot classic | AID, Allemagne | ELR06 | |
| Sérum fœtal bovin | GIBCO, États-Unis | 10099141C | |
| Lecteur de microplaques à fonction complète | Thermo Fisher Scientific, États-Unis | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, États-Unis | 35050061 | |
| Facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires | GM-CSF, R& D Systems, États-Unis | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, États-Unis | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubateur | Heal Force, Suisse | null | |
| IL-4 | PeproTech, États-Unis | 042149 | |
| L929 lignée cellulaire | FENGHUISHENGWU, Chine | . NCTC clone 929 (RRID :CVCL_0462) | |
| Microscopie confocale à balayage laser | Zeiss, Allemagne | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Souris IFN-&gamma ; Kit ELISA | Dakewe, Chine | 1210002 | |
| Souris IFN-&gamma ; kit ELISPOT pré-enduit | Dakewe, Chine | DKW22-2000-096 | |
| Souris IL-17A Kit ELISA | Dakewe, Chine | 1211702 | |
| Souris IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Souris IL-1&beta ; Kit ELISA | Dakewe, Chine | 1210122 | |
| Souris IL-6 Kit ELISA | Dakewe, Chine | 1210602 | |
| Souris TNF-&alpha ; Kit ELISA | Dakewe, Chine | 1217202 | |
| Acides aminés non essentiels (100x) | Invitrogen, États-Unis | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Pénicilline-Streptomycine Solution | Invitrogen, États-Unis | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, Chine | CA1620 | |
| Phosphate Saline tamponnée | ZSGB-BIO, Chine | ZLI-9062 | |
| Tampon de lyse des globules rouges | Solarbio, Chine | R1010 | |
| RPMI 1640 moyen | Hyclone (Life Technology), États-Unis | SH30809.01 | |
| Pyruvate de sodium(100 mM) | Invitrogen, États-Unis | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, États-Unis | S3626 | |
| &beta ;- Mercaptoethanol | Invitrogen, États-Unis | 21985023 |
Références
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeuti....
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Réimpressions et autorisations
