Summary
El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.
Abstract
Como ingrediente principal de las vacunas, los adyuvantes pueden inducir o mejorar directamente las respuestas inmunes potentes, generalizadas, innatas y adaptativas asociadas con los antígenos. Se ha encontrado que la ofiopogonina D (OP-D), un componente purificado extraído de la planta Ophiopogon japonicus, es útil como adyuvante de la vacuna. Los problemas de la baja solubilidad y toxicidad de OP-D se pueden superar eficazmente mediante el uso de un método de emulsificación de baja energía para preparar la nanoemulsión de ofiopogonina D (NOD). En este artículo, se examinan una serie de protocolos in vitro para la evaluación de la actividad celular. Los efectos citotóxicos de L929 se determinaron mediante un ensayo de kit de conteo celular-8. Luego, los niveles de citoquinas secretadas y el número de células inmunes correspondientes después de la estimulación y el cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados se detectaron mediante métodos ELISA y ELISpot. Además, la capacidad de absorción de antígenos en células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC), que se aislaron de ratones C57BL / 6 y maduraron después de la incubación con GM-CSF más IL-4, se observó mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Es importante destacar que la activación de los macrófagos se confirmó midiendo los niveles de IL-1β, IL-6 y citoquinas del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) mediante kits ELISA después de cocultivar macrófagos peritoneales (PM) de ratones en blanco con el adyuvante durante 24 h. Se espera que este protocolo proporcione a otros investigadores enfoques experimentales directos y efectivos para evaluar la eficacia de la respuesta celular de los nuevos adyuvantes de vacunas.
Introduction
Las vacunas son un medio importante para prevenir y tratar las enfermedades infecciosas y no transmisibles. La adición adecuada de adyuvantes y vehículos de administración a las formulaciones de vacunas es beneficiosa para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos y generar respuestas inmunes duraderas1. Además del alumbre adyuvante clásico (sal de aluminio), hay seis tipos de adyuvantes para vacunas que se comercializan actualmente: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 y Matrix-M5. Generalmente, cuando el cuerpo humano se encuentra con un ataque viral, la primera y segunda línea de defensa (piel, mucosa y macrófagos) toman la delantera en la eliminación del virus, y finalmente, se activa la tercera línea de defensa, que involucra los órganos inmunes y las células inmunes. El aluminio y las sales de aluminio han sido los adyuvantes más utilizados para las vacunas humanas desde principios de la década de 1920, provocando una respuesta inmune innata efectiva6. Sin embargo, se ha propuesto que la activación de las células presentadoras de antígeno (APC) por adyuvantes clásicos, que estimula a las células inmunes para generar conjuntos específicos de citoquinas y quimiocinas, es el mecanismo por el cual funcionan los adyuvantes y puede ser una de las razones por las cuales los adyuvantes ejercen solo efectos transitorios sobre respuestas inmunes específicas7. La presencia de adyuvantes autorizados limitados para uso humano es un factor restrictivo para el desarrollo de vacunas que provoquen respuestas inmunes efectivas8.
Actualmente, un número creciente de estudios adyuvantes están demostrando la capacidad de inducir una fuerte respuesta inmune celular en ratones. Se ha demostrado que QS-21 induce una respuesta inmune equilibrada de T-helper 1 (Th1) y T-helper 2 (Th2), produce niveles más altos de títulos de anticuerpos y prolonga la protección como adyuvante, pero su fuerte toxicidad y propiedades hemolíticas limitan su desarrollo como adyuvante clínico independiente 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopiranósido) es una de las saponinas esteroides aisladas de la raíz de la planta medicinal china Ophiopogon japonicas4. Además, es el principal componente farmacológicamente activo (Shen Mai San) que se encuentra en Radix Ophiopogonis y se sabe que tiene ciertas propiedades farmacológicas11. Además, es un miembro de la familia Liliaceae y es ampliamente utilizado por sus efectos inhibitorios y protectores en la inflamación celular y la lesión miocárdica. Por ejemplo, OP-D mejora las lesiones similares a la dermatitis atópica inducida por DNCB y las células inflamatorias HaCaT del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en ratones BALB/c12. Es importante destacar que OP-D promueve la protección antioxidante del sistema cardiovascular y protege el corazón contra la lesión autofágica inducida por doxorrubicina al reducir la generación de especies reactivas de oxígeno e interrumpir el daño de la membrana mitocondrial. Los experimentos han demostrado que tomar OP-D con monodesósido ayuda a mejorar la salud inmunológica, aumentar el recuento de glóbulos blancos y la síntesis de ADN, y hacer que los anticuerpos duren más13. Anteriormente se ha encontrado que la OP-D tiene un efecto adyuvante14.
Las nanoemulsiones son nanoformulaciones de aceite en agua compuestas por una combinación de tensioactivos, aceite, cosurfactantes y agua12,15. Estos diseños de nanovacunas permiten encapsular antígenos y adyuvantes juntos para mejorar la estimulación inmune, proteger los antígenos y promover la maduración de las células dendríticas (DC)16. Para el desarrollo de estos nuevos adyuvantes obtenidos del cribado, es importante encontrar métodos apropiados para evaluar sus capacidades de respuesta celular.
El propósito de este protocolo es evaluar sistemáticamente si los adyuvantes pueden mejorar la fagocitosis y la expresión de células inmunes en cultivo celular in vitro y elaborar los principales métodos experimentales. El experimento se divide en cuatro subsecciones: (1) la toxicidad de OP-D y NOD para las células L929 se determina mediante el ensayo del kit de conteo de células-8 (CCK-8); (2) los niveles de citoquinas de IFN-γ endocrino e IL-17A y el número de células correspondiente en ratones inmunizados se detectan mediante estimulación de esplenocitos y ensayos ELISpot; (3) la capacidad de presentación de antígenos de las CD después de la estimulación adyuvante se observa mediante microscopía confocal; y (4) se detectan los tres tipos de citocinas, IL-1β, IL-6 y TNF-α, en los sobrenadantes obtenidos de macrófagos peritoneales (PM) en ratones normales cocultivados con adyuvantes.
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Protocol
Todos los experimentos celulares se realizaron en un laboratorio de ingeniería celular equipado con quirófanos básicos, salas de amortiguación, salas de cultivo estéril y salas de identificación y análisis. El entorno y las condiciones de trabajo estaban libres de contaminación microbiana y otros factores nocivos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo con base en las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar.
1. Autoclave y preparación de materiales
- Preparar los reactivos y consumibles, como solución salina tamponada con fosfato (PBS), tijeras, pinzas y malla abrasiva, mediante esterilización por calor húmedo en autoclave a 121 °C durante 20 min.
- Para conocer los reactivos y equipos necesarios, consulte la Tabla de materiales. Para la fórmula de la nanoemulsión en blanco (BNE), consulte la Tabla 1.
2. Ensayo de citotoxicidad L929
- Encienda el baño maría y ajuste la temperatura a 37 °C. Recoger un tubo de células L929 congeladas de nitrógeno líquido y descongelar rápidamente en un baño de agua a 37 °C.
- Pipetear las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml rápidamente después de la descongelación, agregar 2 ml de DMEM y mezclar bien.
- Centrifugar las muestras a 129 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Luego, agregue 2 ml de DMEM para resuspender las células y centrifugar las muestras nuevamente a 129 x g durante 5 minutos.
- Desechar el sobrenadante, añadir 6 ml de medio completo DMEM (que contenga un 10% de FBS) para su resuspensión, y transferir a un matraz de cultivo T25 en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 para cultivar durante 48 h.
- Desechar el medio de cultivo en el matraz de cultivo y lavar las células dos veces con 2 ml de PBS. Luego, agregue 1 ml de tripsina al 0,25% para digerir las células durante 1-2 minutos a 37 ° C.
- Cuando se observa el redondeo de las células, agregue 4 ml de medio completo DMEM para terminar la digestión inmediatamente y mezclar bien. Luego, aspire las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrifugar a 129 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de medio completo DMEM. Utilice una suspensión de células de 20 μL para el recuento de células utilizando placas de recuento de células y diluya las células restantes a 1 x 105 células/ml con medio completo DMEM.
- Agregue 100 μL de agua ultrapura a la periferia de una placa de 96 pocillos y agregue 100 μL de diluyente celular solo a los pocillos internos. Colocar la placa en la incubadora para el cultivo adherente durante 4 h a 37 °C.
- Después de que las células se adhieran, agregue OP-D y NOD por separado en medio completo DMEM a un volumen final de 200 μL / pocillo (las concentraciones finales de cada fármaco son 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml y 30 μg / ml). Para cada concentración, use tres pocillos como réplicas. Luego, coloque las células nuevamente en la incubadora y cultive durante otras 24 h.
- Diluir CCK-8 al 10% con medio completo DMEM y añadir diluciones de 100 μL/pocillo que contengan las soluciones adyuvantes y celulares a la placa de 96 pocillos. Coloque la placa de nuevo en la incubadora e incube durante otras 2-3 h.
- Mezcle con frecuencia mientras se coloca la solución celular para evitar la falta de homogeneidad debido a la precipitación celular. Agite suavemente la placa varias veces antes y después de agregar el CCK-8 para mezclar bien el medio y la solución de CCK-8.
- Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Configure un pozo de puesta a cero con solo medio y CCK-8 para un valor de absorbancia de referencia. Calcule valores de absorbancia precisos restando el valor de absorbancia a cero del valor de absorbancia obtenido al trazar.
- Confirme que no hay burbujas presentes en ningún pozo antes de realizar la prueba con el lector de microplacas, ya que las burbujas interferirán con el ensayo.
3. Estimulación de esplenocitos
- Inmunizar ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad con 30 μg de antígeno proteico más 30 μg de adyuvante mediante una inyección intramuscular (200 μL) el día 0, el día 7 y el día 14 de acuerdo con los siguientes grupos experimentales: (1) grupo PBS, (2) grupo antígeno (Ag), (3) antígeno + grupo OP-D (Ag/OP-D), (4) antígeno + grupo BNE (Ag/BNE), (5) grupo antígeno + NOD (Ag/NOD) y (6) antígeno + grupo AlPO4 (Ag/Al).
- Sala de preparación: El día 24 después de la inmunización primaria, retirar los ratones de la sala de animales y sacrificarlos mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1%. Coloque los ratones en un plato de vidrio y sumérjase en alcohol al 75% durante 5 minutos.
- Coloque los tubos de centrífuga en una rejilla de tubos de centrífuga, numere las placas de Petri desechables y agregue 5 ml de PBS a cada placa de Petri con una pipeta de 10 ml.
- Haga una incisión de 6-8 cm con tijeras en el medio del lado ventral izquierdo del ratón, abra la piel, exponga la pared abdominal y localice la larga franja roja del bazo.
- Levante el peritoneo en el lado inferior del bazo con fórceps, córtelo y gírelo hacia arriba para exponer el bazo. Levante el bazo con fórceps, separe el tejido conectivo debajo del bazo con tijeras oftálmicas y retire el bazo.
- Coloque el bazo en una placa de Petri que contenga 5 ml de PBS y molino con un tamiz (malla 200, 70 μm) y una barra de molienda. Después de moler, transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de 15 ml con un gotero de codo de acuerdo con la numeración.
- Centrifugar el líquido a 453 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, agregue 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos a cada tubo, resuspenda las células y lisar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Agregue 10-12 ml de PBS a cada tubo, mezcle el tubo boca abajo y centrifugar a 453 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, agregue 10 ml de PBS a cada tubo de centrífuga y vuelva a suspender las células.
- Tome 20 μL de cada muestra en un pocillo de la placa de conteo de células y registre el número de células vivas utilizando un contador de células automatizado.
- Centrifugar las muestras a 453 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Resuspender las células, diluir a 2,5 x 106 células/ml con medio RF-10 (información de formulación en la Tabla 2) y añadir a una placa de 96 pocillos a 100 μL/pocillo.
- Diluir el antígeno con RF-10 medio a 10 μg/ml, añadir 100 μL a cada pocillo e incubar durante 3 días a 37 °C enCO2 al 5%.
- Aspirar la suspensión celular obtenida de cada grupo de células en tubos de centrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 453 x g durante 20 min y aspirar el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio.
- Realice la detección de contenido IFN-γ e IL-17A estrictamente de acuerdo con las instrucciones del kit ELISA. Los métodos y procedimientos son los siguientes.
- Preparar 1x solución de trabajo tampón de lavado (suministrada con el kit), solución de concentración de gradiente estándar (solución patrón diluida de citoquinas a 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml y 15,6 pg/ml en el tampón de dilución R [1x] suministrado con el kit), solución de trabajo de anticuerpos biotinilados (solución diluida de anticuerpos biotinilados a 1:100 utilizando el tampón de dilución R [1x] suministrado con el kit para formar la solución de trabajo), y solución de trabajo de estreptavidina-HRP según sea necesario.
- Añadir 100 μL/pocillo de solución patrón de citoquinas diluidas en el pocillo patrón, 100 μL/pocillo de muestra en el pocillo de muestra (el tampón de dilución R [1x] suministrado con el kit se utiliza para la dilución de la muestra) y 100 μL/pocillo de tampón de dilución R (1x) en el pocillo de control en blanco.
- Añadir solución de trabajo de anticuerpos biotinilados a 50 μL/pocillo. Mezclar bien, cubrir con una membrana de sellado e incubar a 37 °C durante 90 min.
- Retire el líquido de los pocillos y agregue 1x solución de trabajo tampón de lavado a 300 μL / pocillo. Deseche el líquido de los pozos después de 1 min. Repita este proceso 4 veces dejando que el líquido se seque en papel de filtro cada vez.
- Añadir 100 μL/pocillo de solución de trabajo de estreptavidina-HRP. Cubrir e incubar las muestras a 37 °C durante 30 min. Centrifugar las muestras a 453 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
NOTA: La solución de lavado que queda en el pozo de reacción durante el proceso de lavado debe ser golpeada a fondo hasta que no se pueda ver ninguna marca de agua en el papel de filtro. - Añadir TMB a 100 μL/pocillo, incubar las placas a 37 °C durante 5-30 min en la oscuridad y juzgar la reacción de terminación según la profundidad de color en el pozo (azul oscuro). Por lo general, 10-20 minutos para el desarrollo del color puede lograr buenos resultados.
- Terminar la reacción rápidamente añadiendo solución de parada a 100 μL/pocillo. Detecte el valor de absorbancia a 450 nm dentro de los 10 minutos posteriores a la terminación.
NOTA: Equilibre el reactivo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlo.
4. Ensayo ELISpot
- Realice la inmunización de los ratones y la recolección de esplenocitos exactamente como se describe en los pasos 3.1-3.10 anteriores. Realice los ensayos para IFN-γ e IL-17A en estricta conformidad con las instrucciones del kit. Los métodos y procedimientos son los siguientes.
- Retire la placa del envase sellado, lave 4 veces con PBS estéril (200 μL/pocillo) y añada 1640 medios de cultivo completos (200 μL/pocillo) para equilibrarla a temperatura ambiente durante 2 h.
- Retirar el medio y diluir la suspensión de esplenocitos con medio RF-10 a 2 x 105 células/ml, añadiendo 50 μL de células y antígeno por pocillo (concentración final: 10 μg/ml).
- Colocar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2 durante 48 h. No mueva la placa durante este tiempo y tome medidas para evitar la evaporación (por ejemplo, envuelva la placa con papel de aluminio).
- Diluir el anticuerpo de detección (BVD6-24G2-biotina) a 1 μg/ml (1:1.000) en solución salina tamponada con fosfato (0,5 ml:100 ml) que contiene 0,5% de suero bovino fetal (PBS-0,5% FBS). Añadir 100 μL/pocillo a la placa, e incubar a temperatura ambiente durante 2 h después de la filtración a través de una membrana de 0,22 μm.
- Decantar el líquido en los pocillos, añadir 1x tampón de lavado a 200 μL/pocillo y lavar 5x. Dejar actuar durante 30-60 s cada vez, y por última vez, dejar secar en papel secante.
- Diluir la estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1:1.000) en PBS-0,5% FBS y añadir 100 μL/pocillo. Incubar el plato durante 1 h a temperatura ambiente. Lave el plato como en el paso 4.6.
- Añadir 100 μL/pocillo de solución de sustrato TMB lista para usar y desarrollar hasta que aparezca una mancha clara. Detenga el desarrollo del color lavando extensamente en agua desionizada (enjuague 5x-6x repetidamente). Si es necesario, retire la alcantarilla (el plástico blando debajo de la placa) y enjuague la parte inferior de la membrana.
- Examine y cuente las manchas en un lector ELISpot o microscopio de disección después de que la placa se haya secado.
5. Aceptación por los países en desarrollo
- Eutanasia en ratones BALB/c normales mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1%. Remoje los ratones en alcohol al 75% durante 5 minutos.
- Corte una incisión de 6-8 cm debajo del abdomen del ratón con tijeras, y sujete los dos extremos de la abertura para separarla en diferentes direcciones y exponer las patas del ratón. Separe el fémur del ratón del cuerpo del ratón y la tibia de la articulación, y mantenga los huesos intactos en ambos extremos.
- Retire el tejido residual y el cartílago de las articulaciones articulares en ambos extremos del fémur con tijeras y fórceps. Remoje los fémures en alcohol al 75% durante 5 minutos, y luego sumérjase en una solución estéril de PBS para lavar el alcohol de la superficie.
- Corte los extremos de los fémures con tijeras y enjuague la médula ósea en una placa de Petri estéril con solución estéril de PBS seguida de aspiración con una jeringa de 1 ml. Repita el lavado 3x-5x.
- Filtrar mediante un tamiz celular (malla 200, 70 μm) y recoger los BMDC en un tubo centrífugo de 15 ml. Centrifugar las muestras a 290 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, agregue 4 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos, resuspenda y lisar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir 10 ml de solución estéril de PBS para neutralizar el lisado, centrifugar a 290 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 1 ml de DMEM que contiene 1% de solución de penicilina-estreptomicina y 10% FBS y contar. Luego, agregue GM-CSF (20 ng / ml) más IL-4 (10 ng / ml) al medio, ajuste la concentración celular a 5 x 105 / ml e inocule las células en cubreobjetos.
- Añadir la suspensión celular a una placa de 6 pocillos a 2 mL/pocillo y colocar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2 durante 48 h. Cambie el medio completamente después de 2 días y cambie la mitad del medio después de 4 días.
- Seleccione cinco pocillos con células en buen estado (células grandes y radiotransparentes con protuberancias dendríticas en la superficie celular) utilizando un microscopio invertido con un aumento de 100x para el experimento en el séptimo día de cultivo. Deseche el sobrenadante, agregue 2 ml de soluciones de GFP, OP-D + GFP y NOD + GFP diluidas con medio completo DMEM (concentración final de GFP: 20 μg / ml; concentración final adyuvante: 10 μg / ml) a cada pocillo e incube las placas a 37 ° C durante 30 minutos en la oscuridad.
- Lave las placas 3 veces con PBS, agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Retire el paraformaldehído después de la fijación, incubar las células con faloidina y DAPI a una concentración final de 10 μg / ml durante 10 minutos para la tinción, y luego lavar 3 veces con PBS.
- Agregue 1 ml de PBS a cada pocillo y observe la captación de antígenos usando CLSM, como se describe a continuación.
- Abra el software CLSM, haga clic en Sistema ZEN y espere a que se complete la inicialización del hardware.
- Haga clic en los accesos directos GFP y DAPI en la pestaña localizar para encontrar el área que se puede observar. Apague la luz fluorescente y la luz transmitida.
- Haga clic en Configuración inteligente en el menú de adquisición para abrir la biblioteca de tintes y agregue tres tintes fluorescentes: EGFP, faloidina y DAPI. Haga clic en Mejor señal > Aceptar. Haga clic en el canal EGFP en la pestaña canales y haga clic en Live para seleccionar el campo de visión correcto en la interfaz derecha.
- Seleccione 1 UA para el agujero de alfiler, gire el tornillo de enfoque fino para ajustar la distancia focal y seleccione el plano focal adecuado. Haga clic en Indicador de rango y ajuste la combinación de potencia láser y ganancia maestra para que solo aparezcan puntos rojos esporádicos en la imagen.
- Ajuste los canales de faloidina y DAPI con los mismos parámetros sin cambiar la potencia del láser.
- Seleccione Detener en vivo y haga clic en Modo de adquisición para cambiar los parámetros de disparo: Tamaño de cuadro: 1024 píxeles x 1024 píxeles; Velocidad de escaneo: 7; Promedio: 2x. Haga clic en Ajustar y seleccione Dividir para ver todas las imágenes tomadas. Guarde las imágenes.
6. Activación de macrófagos
- Sumerja los ratones C57BL / 6 en alcohol al 75% después de la eutanasia y colóquelos boca arriba en una placa de Petri de vidrio en orden numerado.
- Pase los ratones a través de la ventana de transferencia a la sala de operaciones estéril y colóquelos en la mesa de operaciones durante 5 minutos.
- Usando una jeringa, aspire 10 ml de solución salina, incline los ratones hacia abajo a aproximadamente 45 ° e inyecte en el centro de la cavidad abdominal. Extraiga aproximadamente 5 ml de suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 ml por cada 10 ml y repita la inyección 3 veces.
- Centrifugar la suspensión celular a 129 x g durante 5 min para obtener macrófagos primarios peritoneales de ratón. Resuspender las células, ajustar la concentración celular a 2 x 106 células/ml con medio completo RPMI 1640 (que contiene 10% de FBS) e inocular la suspensión celular en una placa de 24 pocillos para asegurar un número constante de células por pocillo (1 ml/pocillo).
- Cultivo a 37 °C enCO2 al 5% durante la noche (aproximadamente 16-20 h), seguido de incubación con PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD y Ag/Al (concentración final de Ag: 5 μg/mL; concentración final adyuvante: 10 μg/mL; volumen total: 2 mL) durante 24 h. Detectar los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α en el sobrenadante de cultivo con kits ELISA utilizando los métodos y procedimientos descritos en los pasos 3.12-3.19.
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Representative Results
La evaluación de la actividad celular de los adyuvantes OP-D y NOD se completó in vitro de acuerdo con el protocolo. Los fibroblastos L929 son un modelo de cribado útil para los ensayos de toxicidad in vitro de la NOD (Figura 1). La cuantificación de los niveles de citoquinas inflamatorias en el bazo puede ayudar a los investigadores a comprender mejor la respuesta inmune (Figura 2). La monitorización de CTL con ELISpot es el estándar de oro para evaluar la inmunidad de células T específicas de antígeno en ensayos clínicos y para detectar vacunas candidatas (Figura 3). El aumento de la captación de un antígeno por las CD puede provocar respuestas inmunes adaptativas mejoradas (Figura 4). Los macrófagos desempeñan un papel importante en la presentación de antígenos a las células T, así como en la inducción de otras células presentadoras de antígenos para expresar moléculas coestimuladoras, iniciando así respuestas inmunes adaptativas (Figura 5). Los resultados experimentales anteriores fueron publicados por Tong et al., y las diferentes respuestas de anticuerpos in vivo y la eficiencia de protección contra ratones se pueden encontrar en el artículo14 original.
Figura 1: Prueba de citotoxicidad in vitro de células L929. Se muestran los efectos citotóxicos de diferentes concentraciones de gradiente de OP-D y NOD (30 μg/mL, 60 μg/mL, 120 μg/mL, 240 μg/mL y 480 μg/mL) cuando se incuban con células L929. Se utilizó un kit CCK-8 para la detección. El análisis estadístico se realizó utilizando un software de análisis estadístico. Las diferencias entre los dos grupos se analizaron utilizando una prueba t de Student no pareada y de dos colas. Todos los valores se expresan como media ± DE (n = 3), y las diferencias significativas se expresan de la siguiente manera: *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Esta cifra ha sido modificada de Tong et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Niveles de IFN-γ e IL-17A en esplenocitos. Los esplenocitos de ratones vacunados fueron estimulados con el antígeno durante 3 días, y los niveles de las citoquinas (A) IFN-γ y (B) IL-17A en el sobrenadante se midieron por ELISA. Los resultados mostraron que la producción de IFN-γ e IL-17A aumentó significativamente en el grupo Ag/NOD en comparación con los grupos Ag/OP-D, Ag/BNE y Ag/Al (p < 0,01). El análisis estadístico se realizó utilizando un software de análisis estadístico. Las diferencias entre los múltiples grupos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Todos los valores se expresan como media ± DE (n = 8), y las diferencias significativas se expresan de la siguiente manera: *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Esta cifra ha sido modificada de Tong et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Número de células secretoras de IFN-γ e IL-17A en la población de esplenocitos. (A) Análisis ELISpot de células T específicas de antígeno específico formador de IFN-γ entre los esplenocitos. (B) Análisis ELISpot de células T específicas de antígeno formador de manchas IL-17A entre los esplenocitos. Similar a los resultados de citoquinas, los grupos Ag / OP-D y Ag / NOD mostraron proporciones y números significativamente mayores de células formadoras de IFN-γ e IL-17A en la población de células T linfoides esplénicas. El grupo Ag/NOD indujo respuestas inmunes Th1 (p < 0,001) y Th17 (p < 0,01) más fuertes que los otros grupos. El análisis estadístico se realizó utilizando un software de análisis estadístico. Las diferencias entre los múltiples grupos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Todos los valores se expresan como media ± DE (n = 8), y las diferencias significativas se expresan de la siguiente manera: *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Esta cifra ha sido modificada de Tong et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes CLSM de la captación de antígenos por los BMDC. La faloidina tiñe el citoesqueleto en rojo, DAPI tiñe el núcleo en azul y GFP presenta fluorescencia verde. Como se muestra en la figura, la fluorescencia verde se observa en CLSM después de 30 min de coincubación de los grupos GFP + OP-D y GFP + NOD con BMDC, pero las partículas GFP + NOD están rodeadas por estructuras vesiculares similares a fagosomas, mientras que las partículas GFP + OP-D no lo están. Esta cifra ha sido modificada de Tong et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Impacto del antígeno formulado con adyuvante en la activación de PMs. ELISA para la detección de las concentraciones de las citoquinas IL-1β, IL-6 y TNF-α en el sobrenadante de PM coincubadas con PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD y Ag/Al. En comparación con la estimulación antigénica, la estimulación Ag/NOD, Ag/OP-D y Ag/Al aumentó significativamente la secreción de IL-1β, IL-6 y TNF-α de las PM (p < 0,05). La activación de macrófagos mejoró significativamente en el grupo NOD en comparación con los grupos OP-D y AlPO4 (p < 0,05). El análisis estadístico se realizó utilizando un software de análisis estadístico. Las diferencias entre los múltiples grupos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Todos los valores se expresan como media ± DE (n = 8), y las diferencias significativas se expresan de la siguiente manera: *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Esta cifra ha sido modificada de Tong et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Densidad | Masa (por 10g) |
| Cremophor EL-35 | bulto | 1.92 |
| glicerol | bulto | 0.48 |
| GTCC | bulto | 0.6 |
| Agua ultrapura | bulto | Importe residual |
Tabla 1: La fórmula de BNE.
| Reactivo | Densidad | Volumen |
| β- Mercaptoetanol | 50μM | 0.366μL |
| Suero bovino fetal | 1X | 10 ml |
| Glutamax | 2mM | 1 ml |
| Glutamax RPMI 1640 | 1X | 85mL |
| HEPES | 10mM | 1 ml |
| Aminoácidos no esenciales (100x) | 1X | 1 ml |
| Solución de penicilina-estreptomicina | 100U/mL | 1 ml |
| Piruvato de sodio (100 mM) | 1mM | 1 ml |
Tabla 2: Información de preparación para el medio completo RF-10.
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Discussion
Las vacunas de subunidades proporcionan una excelente seguridad pero una inmunogenicidad deficiente. La estrategia principal para mejorar la inmunogenicidad es adsorber físicamente o acoplar antígenos con adyuvantes e incorporarlos a los sistemas de administración de fármacos para promover la absorción y presentación por parte de las DC. Las saponinas vegetales naturales como la saponina quillaia y sus derivados son altamente tóxicas y no son adecuadas para el desarrollo de vacunas humanas17. Por lo tanto, el estudio de los efectos tóxicos de las vacunas o adyuvantes sobre las células es un primer paso necesario en la evaluación de nuevas vacunas.
El protocolo presentado en este estudio se realiza de acuerdo con la norma ISO 10993-5:200918, lo que permite cierta flexibilidad en la fabricación de muestras. La línea celular tóxica estándar, los fibroblastos L929 y los fibroblastos gingivales tienen niveles similares de citotoxicidad. Sin embargo, los fibroblastos L929 se han convertido en un modelo de cribado útil para ensayos de toxicidad in vitro de nanomateriales debido a su excelente reproducibilidad19. MTT y CCK-8 se utilizan comúnmente para ensayos de viabilidad celular y citotoxicidad. Los resultados de los ensayos MTT y CCK-8 se contradicen entre sí y no están significativamente correlacionados, pero la viabilidad celular del ensayo CCK-8 es significativamente diferente de la del ensayo MTT20. Una posible explicación para los resultados de MTT en el estudio anterior es que la aceleración de la muerte celular puede ser inducida a concentraciones más altas de MTT21. Los resultados experimentales del método CCK-8 son generalmente consistentes con los resultados de los ensayos de toxicidad en animales22. Por lo tanto, hasta que se disponga de nuevos métodos de evaluación de citotoxicidad, el uso del ensayo CCK-8 para detectar la toxicidad de OP-D y NOD para las células L929 es probablemente la mejor opción en la actualidad. Este método también se seguirá aplicando en el campo de los materiales de vacunas y la evaluación adyuvante.
El bazo es el órgano linfoide secundario más grande del cuerpo humano, y la cuantificación de los niveles de citoquinas inflamatorias en el bazo puede ayudarnos a comprender la respuesta inmune23. Se cree que existen algunas diferencias fundamentales en la estructura y los tipos de células entre el bazo de ratones y humanos 24, pero la similitud básica de tipos específicos de células inmunes y la función de la región del bazo hacen que los estudios con células T del bazo de ratones sean relevantes24. En este protocolo, medimos los niveles secretores de la citoquina Th1 IFN-γ y la citoquina Th17 IL-17A en el bazo utilizando kits ELISA. Este ensayo se utiliza generalmente para determinaciones cuantitativas y tiene una alta sensibilidad porque utiliza anticuerpos de alta afinidad para eliminar sustancias no específicas. Las principales limitaciones de este estudio son el largo tiempo de medición y el alto consumo de reactivos. Las citoquinas también se pueden detectar con citometría de flujo y métodos Luminex, pero estos métodos requieren instrumentos complejos, así como materias primas costosas y capacitación especializada. Por lo tanto, este kit ELISA simple y económico es una herramienta valiosa para medir respuestas inmunes específicas. ELISpot se ha convertido en una de las técnicas más utilizadas para determinar las respuestas inmunes de células formadoras de manchas de citoquinas específicas. Puede ser utilizado no sólo para detectar respuestas de linfocitos T CD8+ provocadas por vacunas candidatas, sino también para el reconocimiento de antígenos específicos después de la inmunización25. Con un cribado de alto rendimiento y un límite de detección sensible (1/100.000 células), ELISpot es ampliamente utilizado, ya que también ofrece ventajas de observación directa de células y análisis rápido. La formación de cada punto indica la frecuencia de activación de células T individuales o células BLa evaluación de la respuesta celular a las vacunas y adyuvantes es de gran importancia, lo que hace que ELISpot sea insustituible en la actualidad.
La presentación de antígenos por las CD es un requisito previo para provocar respuestas inmunes14. Las DC, que se utilizan para la captación de antígenos, la migración a los ganglios linfáticos y la activación de células T naïve, son uno de los tipos de células esenciales para el desarrollo de respuestas inmunes mediadas por células T14. Teniendo en cuenta que la interacción de las partículas de nanoemulsión con la membrana celular es un determinante clave de la absorción de partículas, la fagocitosis GFP dentro de las CD se determinó utilizando CLSM en este protocolo experimental. Se ha demostrado que las CD pueden transportar antígenos de manera eficiente a los ganglios linfáticos drenantes, lo que puede ser la razón por la cual los adyuvantes mejoran la inmunogenicidad del antígeno in vivo. Además, CLSM es la implementación comercial más común de la técnica y es ampliamente utilizada en laboratorios de imágenes. La capacidad de seccionamiento óptico, la resolución clara y la versatilidad de la imagen3D 26 de CLSM la convierten en la mejor herramienta para analizar la captación de antígenos por parte de las DC, incluso si no se puede utilizar para la recopilación de datos cuantitativos.
El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC I y II) es importante para el reconocimiento específico de antígenos. Las moléculas funcionales del MHC II están altamente expresadas en APC y funcionan para inducir la activación de células T CD4 +. Las APC incluyen macrófagos, DC y linfocitos B27, que modulan fuertemente la inmunidad adaptativa. Los macrófagos están ampliamente distribuidos en el sistema inmune del huésped y juegan un papel clave en la defensa y la homeostasis28. La activación de los macrófagos es esencial para iniciar respuestas inmunes adaptativas29. Mientras tanto, los adyuvantes de nanoemulsión que son del mismo tamaño que los patógenos pueden promover el reconocimiento de antígenos y fagocitosis, activar inflamasomas y macrófagos NALP3 y modular la presentación de antígenos28. En este protocolo, las PM se utilizaron principalmente como modelo para determinar la secreción de las citoquinas proinflamatorias IL-1β y Th2, citoquinas IL-6 y TNF-α por ELISA, que se pueden utilizar para evaluar cualitativamente la capacidad de activación de macrófagos de vacunas y adyuvantes. Sin embargo, el grado y el mecanismo de activación deben determinarse mediante más experimentos. Por ejemplo, si se secretan EGF, IL-6 y otros factores necesarios para la activación de las células inmunes y las vías de señalización relacionadas (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt, etc.) deben estudiarse.
En resumen, se han establecido una serie de protocolos para confirmar las respuestas celulares in vitro a nuevos adyuvantes, incluida la citotoxicidad, la secreción de citoquinas, la captación de CC y la activación de macrófagos. Estos protocolos no solo demuestran baja toxicidad y alta entrega celular, sino que también proporcionan procedimientos detallados para CCK-8, ELISA y ELISpot. Las evaluaciones de la respuesta celular del inmunopotenciador OP-D derivado de plantas y su potente adyuvante de la vacuna de nanoemulsión modificada NOD se completaron in vitro, y el protocolo fue efectivo. Aunque ELISA, ELISpot y las técnicas de escaneo láser confocal se han utilizado clásicamente para evaluar la inmunocompetencia in vitro de los adyuvantes a las células, estos métodos tienen muchas desventajas, como largos tiempos de medición, cargas de trabajo pesadas, materiales costosos y la necesidad de técnicos profesionales. Muchos métodos precisos y tecnologías avanzadas, como chips genéticos, secuenciación de células individuales y tecnología de transcriptomas, deben usarse en estudios futuros para ampliar aún más el alcance de la técnica.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros o personales en competencia que podrían haber influido en el trabajo reportado en este documento.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la subvención No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China, subvenciones No. 31670938, 32070924, 82041045 y 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, subvenciones No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, subvención No. CYS21519 del Proyecto de Investigación e Innovación de Postgrado de Chongqing, subvención No. 2020XBK24 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y subvención No. 202090031021 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiantes universitarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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