In vitro Cellulær aktivitet evaluering av nanoemulsjonsvaksinen adjuvans ophiopogonin D

Summary

Protokollen presenterer detaljerte metoder for å vurdere om nanoemulsjonsophiopogonin D-adjuvansen fremmer effektive cellulære immunresponser.

Abstract

Som en hovedingrediens i vaksiner kan adjuvanser direkte indusere eller forbedre de kraftige, utbredte, medfødte og adaptive immunresponsene forbundet med antigener. Ophiopogonin D (OP-D), en renset komponent ekstrahert fra planten Ophiopogon japonicus, har vist seg å være nyttig som vaksineadjuvans. Problemene med lav oppløselighet og toksisitet av OP-D kan effektivt overvinnes ved å bruke en lav-energi emulgering metode for å forberede nanoemulsjon ophiopogonin D (NOD). I denne artikkelen undersøkes en rekke in vitro-protokoller for evaluering av cellulær aktivitet. De cytotoksiske effektene av L929 ble bestemt ved hjelp av en celletellingssett-8-analyse. Deretter ble de utskilte cytokinnivåene og tilsvarende immuncelletall etter stimulering og kultur av splenocytter fra immuniserte mus oppdaget ved ELISA- og ELISpot-metoder. I tillegg ble antigenopptaksevnen i benmargsavledede dendrittiske celler (BMDC), som ble isolert fra C57BL / 6-mus og modnet etter inkubering med GM-CSF pluss IL-4, observert ved laserskanning konfokalmikroskopi (CLSM). Det er viktig at makrofagaktivering ble bekreftet ved å måle nivåene av IL-1β, IL-6 og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) cytokiner ved ELISA-sett etter coculturing peritoneal makrofager (PM) fra blanke mus med adjuvansen i 24 timer. Det er håpet at denne protokollen vil gi andre forskere direkte og effektive eksperimentelle tilnærminger for å evaluere de cellulære responseffektene av nye vaksineadjuvanser.

Introduction

Vaksiner er et viktig middel for å forebygge og behandle smittsomme og ikke-smittsomme sykdommer. Riktig tilsetning av adjuvanser og leveringsmidler til vaksineformuleringer er gunstig for å øke immunogeniteten til antigener og generere langvarige immunresponser¹. I tillegg til klassisk adjuvant alun (aluminiumsalt) er det seks typer adjuvanser for vaksiner som for tiden markedsføres: MF59^2,3, AS04 3, AS03 3, AS01 ^3, CpG1018 ⁴ og Matrix-M⁵. Vanligvis, når menneskekroppen møter et virusangrep, tar den første og andre forsvarslinjen (hud, slimhinner og makrofager) ledelsen i å rydde viruset, og til slutt aktiveres den tredje forsvarslinjen, som involverer immunorganer og immunceller. Aluminium- og aluminiumsalter har vært de mest brukte hjelpestoffene for humane vaksiner siden tidlig på 1920-tallet, noe som fremkaller en effektiv medfødt immunrespons⁶. Det har imidlertid blitt foreslått at aktiveringen av antigenpresenterende celler (APC) av klassiske adjuvanser, som stimulerer immuncellene til å generere spesifikke sett med cytokiner og kjemokiner, er mekanismen som adjuvanser virker på og kan være en av grunnene til at adjuvanser bare utøver forbigående effekter på spesifikke immunresponser⁷. Tilstedeværelsen av begrensede lisensierte adjuvanser til menneskelig bruk er en restriktiv faktor for å utvikle vaksiner som fremkaller effektive immunresponser⁸.

For tiden demonstrerer et økende antall adjuvante studier evnen til å indusere en sterk cellulær immunrespons hos mus. QS-21 har vist seg å indusere en balansert T-hjelper 1 (Th1) og T-hjelper 2 (Th2) immunrespons, produsere høyere nivåer av antistofftitere og forlenge beskyttelsen som adjuvans, men dens sterke toksisitet og hemolytiske egenskaper begrenser utviklingen som en frittstående klinisk adjuvans ^9,10. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) er en av de steroide saponinene isolert fra roten til den kinesiske medisinske planten Ophiopogon japonicas⁴. I tillegg er det den viktigste farmakologisk aktive komponenten (Shen Mai San) som finnes i Radix Ophiopogonis og er kjent for å ha visse farmakologiske egenskaper¹¹. Videre er det medlem av Liliaceae-familien og er mye brukt for sine hemmende og beskyttende effekter i cellulær betennelse og myokardskade. For eksempel forbedrer OP-D DNCB-induserte atopiske dermatittlignende lesjoner og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) inflammatoriske HaCaT-celler i BALB / c mus¹². Det er viktig at OP-D fremmer den antioksidative beskyttelsen av kardiovaskulærsystemet og beskytter hjertet mot doksorubicinindusert autofagisk skade ved å redusere både reaktiv oksygenartgenerering og forstyrre mitokondriell membranskade. Eksperimenter har vist at å ta OP-D med mono-desmosid bidrar til å øke immunforsvaret, øke antall hvite blodlegemer og DNA-syntese, og få antistoffer til å vare lenger¹³. Det er tidligere funnet at OP-D har en adjuvant effekt¹⁴.

Nanoemulsjoner er olje-i-vann nanoformuleringer sammensatt av en kombinasjon av overflateaktive stoffer, olje, cosurfactants, og vann^12,15. Disse nanovaccine designene tillater antigener og adjuvanser å bli innkapslet sammen for å forbedre immunstimulering, beskytte antigenene og fremme dendritisk celle (DC) modning¹⁶. For utvikling av disse nye adjuvansene hentet fra screening, er det viktig å finne passende metoder for å evaluere deres cellulære responsevner.

Formålet med denne protokollen er å systematisk vurdere om adjuvanser kan forsterke fagocytose og ekspresjon av immunceller i in vitro cellekultur og å utdype de viktigste eksperimentelle metodene. Forsøket er delt inn i fire underavsnitt: (1) toksisiteten til OP-D og NOD til L929-celler bestemmes av celletellingssett-8 (CCK-8) -analysen; (2) cytokinnivåene av endokrine IFN-γ og IL-17A og tilsvarende celletall hos immuniserte mus oppdages ved splenocyttstimulering og ELISpot-analyser; (3) antigenpresentasjonsevnen til DCs etter adjuvant stimulering observeres ved bruk av konfokal mikroskopi; og (4) de tre typene cytokiner, IL-1β, IL-6 og TNF-α, i supernatantene oppnådd fra peritoneale makrofager (PM) hos normale mus som er kokulturert med adjuvanser, oppdages.

Protocol

Alle celleforsøk ble utført i et celleteknisk laboratorium utstyrt med grunnleggende operasjonsrom, bufferrom, sterile kulturrom og identifikasjons- og analyserom. Arbeidsmiljøet og forholdene var fri for mikrobiell forurensning og andre skadelige faktorer. Dyreforsøkene ble utført basert på retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av laboratoriedyrevelferds- og etikkkomiteen ved det tredje militære medisinske universitetet. 1. Autoklavering og materialforb…

Representative Results

Den cellulære aktivitetsevalueringen av adjuvansene OP-D og NOD ble fullført in vitro i henhold til protokollen. L929 fibroblaster er en nyttig screeningmodell for in vitro toksisitetstesting av NOD (figur 1). Kvantifiseringen av inflammatoriske cytokinnivåer i milten kan hjelpe forskere bedre å forstå immunresponsen (figur 2). Monitorering av CTL med ELISpot er gullstandarden for vurdering av antigenspesifikk T-celleimmunitet i kliniske s…

Discussion

Subenhetsvaksiner gir utmerket sikkerhet, men dårlig immunogenisitet. Hovedstrategien for å forbedre immunogenisiteten er å fysisk adsorbere eller parere antigener med adjuvanser og innlemme dem i legemiddelleveringssystemene for å fremme opptak og presentasjon av DCs. Naturlige plante saponiner som quillaia saponin og dets derivater er svært giftige og er ikke egnet for utvikling av humane vaksiner¹⁷. Derfor er studiet av toksiske effekter av vaksiner eller adjuvanser på celler et nødvendi…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x)	GIBCO, USA	25200056
96-well filter plates	Millipore. Billerica, MA	CLS3922
AlPO4	General Chemical Company, USA	null
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd	null
caprylic/capric triglyceride (GTCC)	Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China	null
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Cell Counting Plate	Costar, Corning, USA	CO010101
Cell Sieve	biosharp, China	BS-70-CS
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
DMEM basic(1x) medium	GIBCO, USA	C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)	Mumbai, India	null
ELISpot classic	AID, Germany	ELR06
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
GFP	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P42212
Glutamax	Invitrogen, USA	35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor	GM-CSF, R&D Systems, USA	315-03
HEPES	Invitrogen, USA	15630106
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	null
IL-4	PeproTech, USA	042149
L929 cell line	FENGHUISHENGWU, China	NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss, Germany	LSM 980
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit	Dakewe, China	1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit	Dakewe, China	DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit	Dakewe, China	1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit	ebiosciences, USA	3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit	Dakewe, China	1210122
Mouse IL-6 ELISA kit	Dakewe, China	1210602
Mouse TNF-α ELISA kit	Dakewe, China	1217202
Non-essential amino acids(100x)	Invitrogen, USA	11140050
Ophiopogonin-D	Chengdu Purui Technology Co. Ltd	945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution	Invitrogen, USA	15070063
Phalloidin	Solarbio, China	CA1620
Phosphate Buffered Saline	ZSGB-BIO, China	ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology), USA	SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)	Invitrogen, USA	11360070
Squalene	Sigma, USA	S3626
β- Mercaptoethanol	Invitrogen, USA	21985023