Summary

In vitro Cellulær aktivitet evaluering av nanoemulsjonsvaksinen adjuvans ophiopogonin D

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Protokollen presenterer detaljerte metoder for å vurdere om nanoemulsjonsophiopogonin D-adjuvansen fremmer effektive cellulære immunresponser.

Abstract

Som en hovedingrediens i vaksiner kan adjuvanser direkte indusere eller forbedre de kraftige, utbredte, medfødte og adaptive immunresponsene forbundet med antigener. Ophiopogonin D (OP-D), en renset komponent ekstrahert fra planten Ophiopogon japonicus, har vist seg å være nyttig som vaksineadjuvans. Problemene med lav oppløselighet og toksisitet av OP-D kan effektivt overvinnes ved å bruke en lav-energi emulgering metode for å forberede nanoemulsjon ophiopogonin D (NOD). I denne artikkelen undersøkes en rekke in vitro-protokoller for evaluering av cellulær aktivitet. De cytotoksiske effektene av L929 ble bestemt ved hjelp av en celletellingssett-8-analyse. Deretter ble de utskilte cytokinnivåene og tilsvarende immuncelletall etter stimulering og kultur av splenocytter fra immuniserte mus oppdaget ved ELISA- og ELISpot-metoder. I tillegg ble antigenopptaksevnen i benmargsavledede dendrittiske celler (BMDC), som ble isolert fra C57BL / 6-mus og modnet etter inkubering med GM-CSF pluss IL-4, observert ved laserskanning konfokalmikroskopi (CLSM). Det er viktig at makrofagaktivering ble bekreftet ved å måle nivåene av IL-1β, IL-6 og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) cytokiner ved ELISA-sett etter coculturing peritoneal makrofager (PM) fra blanke mus med adjuvansen i 24 timer. Det er håpet at denne protokollen vil gi andre forskere direkte og effektive eksperimentelle tilnærminger for å evaluere de cellulære responseffektene av nye vaksineadjuvanser.

Introduction

Vaksiner er et viktig middel for å forebygge og behandle smittsomme og ikke-smittsomme sykdommer. Riktig tilsetning av adjuvanser og leveringsmidler til vaksineformuleringer er gunstig for å øke immunogeniteten til antigener og generere langvarige immunresponser1. I tillegg til klassisk adjuvant alun (aluminiumsalt) er det seks typer adjuvanser for vaksiner som for tiden markedsføres: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG1018 4 og Matrix-M5. Vanligvis, når menneskekroppen møter et virusangrep, tar den første og andre forsvarslinjen (hud, slimhinner og makrofager) ledelsen i å rydde viruset, og til slutt aktiveres den tredje forsvarslinjen, som involverer immunorganer og immunceller. Aluminium- og aluminiumsalter har vært de mest brukte hjelpestoffene for humane vaksiner siden tidlig på 1920-tallet, noe som fremkaller en effektiv medfødt immunrespons6. Det har imidlertid blitt foreslått at aktiveringen av antigenpresenterende celler (APC) av klassiske adjuvanser, som stimulerer immuncellene til å generere spesifikke sett med cytokiner og kjemokiner, er mekanismen som adjuvanser virker på og kan være en av grunnene til at adjuvanser bare utøver forbigående effekter på spesifikke immunresponser7. Tilstedeværelsen av begrensede lisensierte adjuvanser til menneskelig bruk er en restriktiv faktor for å utvikle vaksiner som fremkaller effektive immunresponser8.

For tiden demonstrerer et økende antall adjuvante studier evnen til å indusere en sterk cellulær immunrespons hos mus. QS-21 har vist seg å indusere en balansert T-hjelper 1 (Th1) og T-hjelper 2 (Th2) immunrespons, produsere høyere nivåer av antistofftitere og forlenge beskyttelsen som adjuvans, men dens sterke toksisitet og hemolytiske egenskaper begrenser utviklingen som en frittstående klinisk adjuvans 9,10. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) er en av de steroide saponinene isolert fra roten til den kinesiske medisinske planten Ophiopogon japonicas4. I tillegg er det den viktigste farmakologisk aktive komponenten (Shen Mai San) som finnes i Radix Ophiopogonis og er kjent for å ha visse farmakologiske egenskaper11. Videre er det medlem av Liliaceae-familien og er mye brukt for sine hemmende og beskyttende effekter i cellulær betennelse og myokardskade. For eksempel forbedrer OP-D DNCB-induserte atopiske dermatittlignende lesjoner og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) inflammatoriske HaCaT-celler i BALB / c mus12. Det er viktig at OP-D fremmer den antioksidative beskyttelsen av kardiovaskulærsystemet og beskytter hjertet mot doksorubicinindusert autofagisk skade ved å redusere både reaktiv oksygenartgenerering og forstyrre mitokondriell membranskade. Eksperimenter har vist at å ta OP-D med mono-desmosid bidrar til å øke immunforsvaret, øke antall hvite blodlegemer og DNA-syntese, og få antistoffer til å vare lenger13. Det er tidligere funnet at OP-D har en adjuvant effekt14.

Nanoemulsjoner er olje-i-vann nanoformuleringer sammensatt av en kombinasjon av overflateaktive stoffer, olje, cosurfactants, og vann12,15. Disse nanovaccine designene tillater antigener og adjuvanser å bli innkapslet sammen for å forbedre immunstimulering, beskytte antigenene og fremme dendritisk celle (DC) modning16. For utvikling av disse nye adjuvansene hentet fra screening, er det viktig å finne passende metoder for å evaluere deres cellulære responsevner.

Formålet med denne protokollen er å systematisk vurdere om adjuvanser kan forsterke fagocytose og ekspresjon av immunceller i in vitro cellekultur og å utdype de viktigste eksperimentelle metodene. Forsøket er delt inn i fire underavsnitt: (1) toksisiteten til OP-D og NOD til L929-celler bestemmes av celletellingssett-8 (CCK-8) -analysen; (2) cytokinnivåene av endokrine IFN-γ og IL-17A og tilsvarende celletall hos immuniserte mus oppdages ved splenocyttstimulering og ELISpot-analyser; (3) antigenpresentasjonsevnen til DCs etter adjuvant stimulering observeres ved bruk av konfokal mikroskopi; og (4) de tre typene cytokiner, IL-1β, IL-6 og TNF-α, i supernatantene oppnådd fra peritoneale makrofager (PM) hos normale mus som er kokulturert med adjuvanser, oppdages.

Protocol

Alle celleforsøk ble utført i et celleteknisk laboratorium utstyrt med grunnleggende operasjonsrom, bufferrom, sterile kulturrom og identifikasjons- og analyserom. Arbeidsmiljøet og forholdene var fri for mikrobiell forurensning og andre skadelige faktorer. Dyreforsøkene ble utført basert på retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av laboratoriedyrevelferds- og etikkkomiteen ved det tredje militære medisinske universitetet. 1. Autoklavering og materialforb…

Representative Results

Den cellulære aktivitetsevalueringen av adjuvansene OP-D og NOD ble fullført in vitro i henhold til protokollen. L929 fibroblaster er en nyttig screeningmodell for in vitro toksisitetstesting av NOD (figur 1). Kvantifiseringen av inflammatoriske cytokinnivåer i milten kan hjelpe forskere bedre å forstå immunresponsen (figur 2). Monitorering av CTL med ELISpot er gullstandarden for vurdering av antigenspesifikk T-celleimmunitet i kliniske s…

Discussion

Subenhetsvaksiner gir utmerket sikkerhet, men dårlig immunogenisitet. Hovedstrategien for å forbedre immunogenisiteten er å fysisk adsorbere eller parere antigener med adjuvanser og innlemme dem i legemiddelleveringssystemene for å fremme opptak og presentasjon av DCs. Naturlige plante saponiner som quillaia saponin og dets derivater er svært giftige og er ikke egnet for utvikling av humane vaksiner17. Derfor er studiet av toksiske effekter av vaksiner eller adjuvanser på celler et nødvendi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av tilskudd nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, tilskudd nr. 31670938, 32070924, 82041045 og 32000651 av National Natural Science Foundation Program of China, tilskudd nr. 2014jcyjA0107 og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 av Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, tilskudd nr. CYS21519 av Postgraduate Research and Innovation Project of Chongqing, tilskudd nr. 2020XBK24 av Army Medical University Spesielle prosjekter, og tilskudd nr. 202090031021 av National Innovation and Entrepreneurship Program for studenter.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x) GIBCO, USA 25200056
96-well filter plates Millipore. Billerica, MA CLS3922
AlPO4 General Chemical Company, USA null
Automated Cell Counter Countstar, China IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd null
caprylic/capric triglyceride (GTCC) Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China null
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Cell Counting Plate Costar, Corning, USA CO010101
Cell Sieve biosharp, China BS-70-CS
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
DMEM basic(1x) medium GIBCO, USA C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35) Mumbai, India null
ELISpot classic AID, Germany ELR06
Fetal Bovine Serum GIBCO, USA 10099141C
Full-function Microplate Reader Thermo Fisher Scientific, USA VL0000D2
GFP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P42212
Glutamax Invitrogen, USA 35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor GM-CSF, R&D Systems, USA 315-03
HEPES Invitrogen, USA 15630106
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland null
IL-4 PeproTech, USA 042149
L929 cell line FENGHUISHENGWU, China  NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss, Germany LSM 980
MONTANE 85 PPI SEPPIC, France L12910
MONTANOX 80 PPI SEPPIC, France 36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit Dakewe, China 1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit Dakewe, China DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit Dakewe, China 1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit ebiosciences, USA 3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit Dakewe, China 1210122
Mouse IL-6 ELISA kit Dakewe, China 1210602
Mouse TNF-α ELISA kit Dakewe, China 1217202
Non-essential amino acids(100x) Invitrogen, USA 11140050
Ophiopogonin-D Chengdu Purui Technology Co. Ltd 945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution Invitrogen, USA 15070063
Phalloidin Solarbio, China CA1620
Phosphate Buffered Saline ZSGB-BIO, China ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer Solarbio, China R1010
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology), USA SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM) Invitrogen, USA 11360070
Squalene Sigma, USA S3626
β- Mercaptoethanol Invitrogen, USA 21985023

References

  1. Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
  2. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  3. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  4. Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
  5. Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years – United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
  6. Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
  7. Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
  8. Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
  9. Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
  10. Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
  12. An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
  13. Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
  14. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  15. Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
  16. Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D’ in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
  17. Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
  18. Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
  19. Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
  20. Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
  21. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  22. Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
  23. Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
  24. Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
  25. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  26. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  27. Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
  28. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
  29. Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).

Play Video

Cite This Article
Luo, X., Tong, Y., Zeng, X., Ye, Y., Yang, Y., Song, Z., Zhang, Z., Li, H., Gao, J., Mao, X., Zeng, H., Zou, Q., Sun, H. In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D. J. Vis. Exp. (190), e64291, doi:10.3791/64291 (2022).

View Video