Summary
מתואר נוהל חדש ומפורט להדמיה תפקודית של חולדות ערות וקבועות ראש.
Abstract
חומרי הרדמה, המשמשים בדרך כלל במחקר מדעי פרה-קליני ובסיסי, משפיעים באופן דיכאוני על תפקודי חילוף החומרים, העצבים וכלי הדם במוח ויכולים להשפיע לרעה על התוצאות הנוירופיזיולוגיות. השימוש בבעלי חיים ערים למחקרים הוא יתרון, אך מציב את האתגר הגדול של שמירה על בעלי החיים רגועים ונייחים כדי למזער חפצי תנועה במהלך איסוף הנתונים. הדמיה ערה במכרסמים קטנים יותר (למשל עכברים) נפוצה מאוד, אך נשארת דלה בחולדות מכיוון שהחולדות גדולות יותר, חזקות יותר ויש להן נטייה גדולה יותר להתנגד לריסון תנועה וקיבוע ראש לאורך פרקי הזמן הארוכים הנדרשים להדמיה. מתואר מודל חדש של הדמיה מוחית של חולדות ערות ומקובעות ראש באמצעות קלעים מותאמים אישית שנתפרו ביד, שתלי ראש מודפסים בתלת-ממד, כובעי ראש ומסגרת ראש. התוצאות שהתקבלו לאחר ניסוי יחיד של גירוי שפם יחיד מצביעות על עלייה בעוצמת התגובה התפקודית המעוררת. רכישת התגובה התפקודית המעוררת מחולדות ערות ומקובעות ראש מהירה יותר מזו של חולדות מורדמות, אמינה, ניתנת לשחזור, וניתן להשתמש בה למחקרי אורך חוזרים.
Introduction
רוב חקירות הדימות המוחי המדעיות הבסיסיות, הפרה-קליניות והתרגומיות נרכשות מבעלי חיים מורדמים 1,2. חומרי הרדמה מקלים על הניסויים אך משפיעים ללא הרף על חילוף החומרים במוח ובגוף, לחץ הדם וקצב הלב3. סוג ההרדמה ומשך ומסלול מתן הנתונים מוסיפים משתנים מבלבלים לפרשנות הנתונים שיכולים לתרום לכשלים בשחזור ובתרגום4. צוואר בקבוק עיקרי של מחקרי דימות מוחי של חולדות ערות וקבועות ראש הוא הדרישה לשמור על החולדה נייחת ורגועה לאורך כל תהליכי ההכנה ורכישת הנתונים. תנועות קטנות מייצרות תוצרי תנועה לא מוצדקים, שיכולים להשפיע לרעה על ניתוח נתונים ופרשנויות.
פותח מודל חדש של דימות מוחי מחולדות ערות ומקובעות ראש באמצעות קלעים מותאמים אישית, שתלי ראש מודפסים בתלת ממד (3D), כובעי ראש ומסגרת ראש המציעה מספר יתרונות לניסויים קלים. שתל הראש התלת-ממדי קל ומכסה חלק קטן מהגולגולת הדרושה לטרנספיקציה. שתלי הראש והכובעים המודפסים בתלת-ממד מתוכננים באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). הפרוטוקולים של גירוי שפם, איסוף נתונים, ניתוח נתונים ותוצאות מחולדות מורדמות תוארו בפירוט בעבודה קודמת 5,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים היו תואמים להנחיות המכון הלאומי לבריאות ואושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, אירווין טיפול ושימוש בבעלי חיים. במחקר זה נעשה שימוש בשבעה זכרים וחולדה אחת (Sprague-Dawley, משקל: 185-350 גרם). לאחר סיום המחקר, החולדות הוקרבו באמצעות מנת יתר של פחמן דו חמצני.
1. תכנון רכיבים שונים
- תכנון שתל הראש:
- צרו את הראש מושתל באמצעות תוכנת CAD (איור 1C) ותכננו אותו כך שיצלם את האזור האחורי לברגמה וצמוד לקו האמצע שבמרכזו קליפת המוח הסומטוסנסורית. ודא ששתל הראש מכסה שטח של 0.9 מ"מ עד 1.9 מ"מ בגולגולת הרחק מאזור ההדמיה.
- השתמש רק בשלושה ברגים כדי לעגן את שתל הראש על גולגולת החולדה. תכנן את כל חורי הבורג כך שיישארו בצד הנגדי של קו האמצע בחצי הכדור הנגדי של ההמיספרה המצולמת.
- הניחו מוט, חלול מבפנים, בחלק העליון של שתל הראש כדי לאפשר לחוטים לקבע את מכסה הראש לשתל הראש כפי שמוצג באיור 1D.
- עיצוב כובע הראש:
- ודא שכובע הראש מכסה את אזור ההדמיה לחלוטין ומגן עליו מפני כל סוג של טראומה כפי שמוצג באיור 1A, B. הוסיפו עקמומיות לכובע הראש כך שיתיישר לצורת הראש מבלי לגרום קושי לפעילות היומיומית של בעל החיים בכלובים המועשרים הסטנדרטיים.
- חתכו את הצד הפנימי של כובע הראש בצורה מלבנית רחבה יותר כך שהחלק העליון של שתל הראש יוכל להיכנס לתוכו כפי שמוצג באיור 1E. בניצב למלבן זה, חותכים שני אזורים מלבניים אחרים כדי לעגן את כובע הראש לשתל הראש.
- העבירו חוט אחד דרך המוט החלול העליון של שתל הראש לצורך קיבוע כובע הראש על ראש החולדה כפי שמוצג באיור 1E-G. מעבירים את החוט השני באותו אופן.
הערה: ניתן להסיר חוטים אלה בקלות באמצעות צבת או מלקחיים. קובצי ההדפסה בתלת-ממד מסופקים (תבנית קובץ: STL) כקובץ משלים 1 וכקובץ משלים 2.
- עיצוב מסגרת הראש:
- עצבו את מסגרת הראש כך שחלק חתוך אחד יכול לנוע דרך המוט העליון של שתל הראש ומקובע באמצעות מהדק.
- זווית את החלק החתוך השני כדי לספק חוזק נוסף לשמירה על ראש החולדה מקובע כדי להפוך את הצד הנגדי לנגיש לחלוטין להדמיה. לצורך המחקר הזה, חתכו את לוח הפלדה עם חתכי פח כדי לייצר את מסגרת הראש (איור 1H, I).
הערה: חלק זה יכול להיות מודפס בתלת-ממד גם כן.
2. אילוף חולדות ראשוני
- אפשרו לחולדות להתאקלם בסביבת הוויבריום בכלובים שלהן למשך 2-3 ימים.
- התחילו לטפל בחולדה בחדר שקט. פתחו את הכלוב ובקשו מהנסיין להכניס את ידו לתוך הכלוב ליד החולדה למשך 15-20 דקות כדי לאפשר לחולדה להתרגל.
- ברגע שהחולדה מפגינה רוגע בכך שאינה נבהלת או בורחת מידיו של הנסיין, הרימו אותה בעדינות לטיפול. טפלו בחולדה במשך 30-45 דקות בכל יום לפני אימון קלע.
3. אימון קלע
- לאמן את החולדות לפחות 2-3 ימים בקלעים לפני ההשתלה הכירורגית של שתל הראש וכובע הראש.
- סדרו את מערך המנשא כפי שמוצג באיור 2A. נקו את מערך המנשא באמצעות מגבוני אתנול.
הערה: כל הקלעים תפורים ביד ועשויים מחומר רשת בתחתית או בשני הצדדים כפי שמוצג באיור 2A, B. - לאימון קלע, הרדימו את החולדות באמצעות 4% איזופלורן לאינדוקציה ו-1% לתחזוקה עד שלא יהיה רפלקס צביטת כפות אחוריות.
- תחת הרדמה איזופלורנית, הניחו את החולדות על יריעת פלסטיק גמישה בגודל 20 ס"מ x 8 ס"מ (אורך x רוחב), כאשר 10 ס"מ x 8 ס"מ מיריעת הפלסטיק מכוסה במלואה בחלק הרך יותר של הסקוטש.
הערה: הרדמת החולדות לצורך אילוף קלע היא צעד אופציונלי, המשמש בעיקר להפחתת מתח וחרדה. - במשך היומיים הראשונים של האימון, הכניסו את החולדה בצורה נוחה לתוך גרב תינוק (מידה 0-3 חודשים) עם הראש החוצה דרך חור קטן חתך בקצה הגרב.
- עטפו חתיכה קטנה של פד סופג סביב חלק פלג הגוף התחתון כדי לשמור על החולדה יבשה ולאסוף צואה.
- עטפו את החולדה בבד כותנה נושם (גודל: 25X25 ס"מ). הניחו את החולדה על יריעת פלסטיק שאליה מודבקות רצועות סקוטש.
- הצמידו את החולדה ליריעת הפלסטיק באמצעות רצועות סקוטש ברוחב 0.5 ס"מ במרחק של 3-6 מ"מ זו מזו.
- אבטחו את החולדה בקלע. הסר את הרדמת הגז. אפשרו לחולדה להתאושש מהרדמת גז בקלע.
- כאשר החולדה מתחילה להקציף, הציעו כמה טיפות של תמיסת 10% סוכרוז כפרס כל 10-15 דקות.
- הציגו לחולדה באופן אקראי את הגירויים החושיים שישמשו אותה במהלך ההדמיה (כאן גירוי שפם, כל 15-25 דקות) כדי להרגיל אותה לגירויים חושיים. גירוי ידני של השפם במרווחי זמן אקראיים.
- אילפו את החולדה בקלע במשך שעה אחת ביום 1, שעתיים ביום 2 ו-3 שעות ביום 3 כפי שמוצג באיור 2C.
4. הכנה טרום ניתוחית
- הדפס את שתל הראש ואת מכסה הראש באמצעות מדפסת התלת-ממד (איור 1).
- לעקר את כל כלי הניתוח ואת כיסויי הראש (שתלים וכובעים) על ידי טבילת הציוד ב Metricide28 germicide במשך 10 שעות. יש לשטוף היטב את הכלים במים סטריליים ממש לפני הניתוח.
- חשוף את החולדה ל 4% איזופלורן ולאחר מכן שמור על 1%-2% איזופלורן עד שאין רפלקס צביטת כפות אחוריות. ניתוח זה יכול להתבצע תחת סוגים רבים של הרדמה, כגון isoflurane, pentobarbital נתרן, ו ketamine-xylazine.
- הזריקו אטרופין (0.05 מ"ג/ק"ג) תוך שרירית כדי להפחית הפרשות ריריות כדי לסייע בנשימה.
- יש לגלח את ראש החולדה בקוטר 5 מ"מ במרכז קו האמצע באמצעות גוזם שיער החל מבין העיניים ועד לחלק האחורי של האוזניים.
- נטרו את ריווי החמצן החלקי ואת קצב הלב באמצעות מד דופק אוקסימטר ובדיקת מד דופק המאובטחת לרגל האחורית של החולדה.
- נגבו את ראשה של החולדה ואת סביבתה שלוש פעמים בסיבובים מתחלפים של בטדין ומגבונים של 70% אלכוהול.
- תקן את החולדה במערכת סטריאוטקסית.
- הכניסו בדיקה רקטלית משומנת בג'ל פטרולאום כדי למדוד את טמפרטורת הגוף של החולדה ולתחזק אותה באמצעות מערכת המשוב של שמיכת החימום כדי למנוע היפותרמיה לאחר מתן הרדמה.
- מתן לידוקאין הידרוכלוריד בהרדמה מקומית בריכוז של 20 מ"ג/מ"ל, 0.07 מ"ג/ק"ג +/-0.2 משקל גוף תת עורי באתר הניתוח.
- יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
- מתן 2% הרדמה מקומית תת עורית על פני אתר הניתוח.
- יש להזריק 3 מ"ל של תמיסת רינגר הנקה בטמפרטורת החדר באופן תת עורי כדי למנוע התייבשות ולספק הזנה במהלך הניתוח.
5. ניתוח
- הסר את חלק העור מעל אתר הניתוח (קוטר 4 מ"מ ממורכז סביב קו האמצע ומרכז הראש) באמצעות מספריים כירורגיים חדים. נתחו והסירו חלק מהעור (~ 2 מ"מ קוטר, מעל קליפת המוח הסומטוסנסורית השמאלית) בין האוזן לעין בחלק הרקתי של הראש.
- הסר, באמצעות אזמל, את רקמת העור הבסיסית (pericranium) כדי לחשוף את הגולגולת. נקו את הגולגולת באמצעות גזה כותנה מעוקרת.
- יש למשוך/לכוון שריר רקתי כדי לחשוף את הגודל הרצוי לאזור ההדמיה [7.5 מ"מ על 7.5 מ"מ במחקר זה].
- חשוף את הגולגולת על חצי הכדור הנגדי עבור שתל הראש. הניחו את שתל הראש על הגולגולת כדי לוודא את מיקום ברגי העיגון של השתל כפי שמוצג באיור 2D-F.
- סמן את הגולגולת לקידוח הברגים באמצעות דיו הודו עם מקדח 1. קדח את חורי הבור עבור הברגים באמצעות מקדחה דנטלית 3. הברג את שתל הראש למקומו.
- יבש את הגולגולת באמצעות גזה סטרילית. יש למרוח שכבה דקה של דבק רקמה מסביב ומתחת לשתל הראש כדי להדביק אותו לגולגולת. מרחו שכבה של מלט דנטלי כדי לתמוך עוד יותר בשתל הראש במקומו ותנו למלט להתייבש במשך 2-3 דקות.
הערה: השימוש בדבק רקמות בנוסף לצמנט דנטלי מבטיח אחיזה חזקה8. - באמצעות מקדחה דנטלית 3, דק שטח 7.5 מ"מ x 7.5 מ"מ בצד שמאל של הגולגולת רק אחורי לברגמה ולטרלי לקו האמצע. דק את הגולגולת ל~50 מיקרומטר כפי שמוצג באיור 3A.
- מרחו משחה אנטיביוטית מקומית על אתר הניתוח ולאחר מכן כסו אותה בשכבה דקה של גומי סיליקון כדי להגן על הגולגולת הדקה כפי שמוצג באיור 3B. כסו את אזור הניתוח באמצעות כובע הראש כפי שמוצג באיור 3C. תקנו אותו במקומו עם שתי חתיכות קטנות של חוטים שעוברות דרך שתל הראש וכובע הראש כפי שמוצג באיור 3D, E. מרחו גומי סיליקון כדי לכסות את כובע הראש והגולגולת כדי לייצב את כובע הראש עוד יותר על ראש החולדה, כפי שמוצג באיור 3F.
הערה: גומי סיליקון מספק הגנה נוספת לגולגולת דלילה. - הזריקו לחולדה פלוניקסין מגלום (2.5 מ"ג/ק"ג) תת עורית לטיפול בכאב ובדלקת. כדי למנוע זיהום, יש להזריק אנרופלוקסצין אנטיביוטי Enrosite (22.7mg/ml, 10mg/kg +/-.01), תוך צפקית.
- העבירו את החולדה לתא ההתאוששות כדי לסייע בשמירה על חום גופה בעזרת שמיכה מחממת ומנורת חום. עקבו אחר החולדה ברציפות עד שהיא חוזרת להכרה ויכולה לשמור על שכיבת עצם החזה.
- החזירו את החולדה לכלוב הנפרד שלה ברגע שהיא תתאושש לחלוטין.
- במשך 3 הימים הבאים, לנהל flunixin ו buprenorphine כדי להקל על דלקת וכאב enrosite כדי למנוע זיהום פעמיים ביום.
6. הדמיה ערה
- מרדימים את החולדה עם 4% איזופלורן לאינדוקציה ו-1% לתחזוקה כאשר אין רפלקס צביטת כפה אחורית. להזריק acepromazine (0.3-0.5 מ"ג / ק"ג) תת עורית.
הערה: ריכוז זה של אצפרומזין הוא מתחת לרמות הרגעה קלות ורק עוזר לשמור על החולדות רגועות לאורך כל תהליך ההדמיה. - באמצעות רצועות סקוטש מותאמות אישית, תקן את החולדה על יריעת הפלסטיק המשמשת במהלך הליכי האימון. עטפו את חלק פלג הגוף התחתון באמצעות כרית ספיגה והניחו את החולדה בנוחות במנשא.
- הסירו את גומי הסיליקון. הסר את מכסה הראש על ידי הסרת חוטי הקיבוע. קבע את מסגרת הראש בשתל הראש כפי שמוצג באיור 2G.
- נעלו את מסגרת הראש במלחציים כפי שמוצג באיור 2H, I.
- יש להסיר את ההרדמה הגזית. יש לשטוף את אזור ההדמיה במי מלח 3x ולנקות עם גזה רטובה. יבש את אזור ההדמיה ועשה באר, באמצעות ג'ל נפט, סביב אזור ההדמיה. מלאו את הבאר במי מלח מעוקרים וכסו בשקופית זכוכית (איור 2E).
- עיין בנוהלי הרכישה של הדמיה אופטית של אותות פנימיים, פרוטוקול גירוי שפם וניתוח והצגת נתונים, שנדונו בפירוט בעבר 6,7.
- במהלך הניסוי, עקוב אחר החולדות עבור סימנים של תסיסה וחוסר מנוחה, אשר ניתן להפחית עוד יותר על ידי כיסוי העיניים של החולדות עם מטלית רכה או גזה (אופציונלי).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אותות הדימות האופטי המייצגים מניסוי יחיד של חולדה מורדמת והתגובה המסוכמת (מתוך 40 ניסויים שנאספו) של חולדה ערה מוצגים (איור 4). ניתן לדמיין את עוצמת האות לגירוי שפם יחיד של חולדה ערה בסף גבוה יותר מאשר אצל חולדה מורדמת, ולהראות אות חזק יותר מהחיה הערה. שפם C2 של חולדות מגורה ב-5 הרץ למשך שנייה אחת, והתגובה התפקודית מוצגת כשינוי חלקי בהשוואה לקו הבסיס. האזורים הכהים יותר (מתחת לסף השלילי) הם האזורים העיקריים של הפעילות העצבית, והאזורים הלבנים הבהירים (מעל הסף החיובי) מראים את תגובת הדם המחומצן לגירוי9. התמונות מיושרות כך שמשמאל לימין הוא מרוסטרל לקאודלי (C) ומלמעלה למטה הוא הכיוון המדיאלי לרוחבי (L), כפי שמוצג על ידי החיצים.
איור 1: כובע ראש, שתל ראש ומסגרת ראש. (A) כובע הראש (מבט מלמעלה): הצד של התצוגה העליונה מראה את העקמומיות שיש ליישר לאורך עקמומיות הראש כדי להגן על הראש; שני החלקים המלבניים החלולים מיועדים לחוטי המתכת לעבור דרך מכסה הראש. (B) כובע ראש (מבט תחתון) מראה את החתך המלבני הרחב יותר כך שיתאים למוט העליון של שתל הראש ואת שני החתכים הניצבים כדי שהחוטים ינועו דרך השתל ואת כובע הראש כדי לשמור אותם במקומם. (C) שתל ראש עם שלושת חורי החיתוך של ברגי העגינה. ניתן להתאים את מיקום ברגי העיגון על שתל הראש בהתאם לראש החולדה. (D) כובע ראש ושתל ראש (מבט מהצד); מבט מהצד על שתל הראש מראה את המוט המלבני חלול מבפנים כדי לאפשר לחוט לעבור דרכו כדי לעגן את כובע הראש לשתל הראש. (ה-ג) מבט על שתל הראש המעוגן בכובע הראש דרך חתיכת חוט אחת; מבט תחתון, מבט צדדי ומבט מלמעלה כדי להראות כיצד שתל הראש מותאם בתוך כובע הראש. (H) מסגרת ראש, (I) שתל ראש המעוגן במסגרת הראש. המרחק בין שני קווים בסולם (כפי שמוצג על ידי המלבן הכחול) הוא 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קלע, שתל ראש וקיבוע מסגרת הראש לצורך הדמיה ערה וקבועה של הראש. (א,ב) קלע מותאם אישית עם חומר רשת לאחד הצדדים התחתונים בלבד או לשני הצדדים; (ג) חולדה שהונחה על יריעת הפלסטיק, קבועה ברצועות סקוטש, במהלך אימון קלע; (D-F) מבט מלמעלה ומהצד על שתל הראש על גולגולת חולדה מעל ההמיספרה הנגדית. קווים מקווקוים מציגים את אזור ההדמיה. התצוגות העליונות והצידיות מראות בבירור את שלושת החורים לקיבוע שתל הראש לגולגולת באמצעות בורג העגינה. (E) מבט מהצד מראה את המוט החלול שדרכו עובר החוט כדי לעגן את כובע הראש לשתל הראש כאשר החולדות אינן מצולמות. רגל אחת של מסגרת הראש עברה דרך החלק החלול של שתל הראש לצורך הדמיה של קליפת המוח של החולדה. (G) מסגרת ראש דרך שתל הראש עבור חולדות ערות וקבועות ראש. (H) מסגרת הראש דרך שתל הראש כששתי רגליו מהודקות לצורך הדמיה ערה וקבועה בראש (I) של חולדות ערות ומקובעות ראש במהלך מפגשי ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקום שתל ראש. (A) הכנת הגולגולת הדקה לצורך הדמיה ערה וקבועה בראש. (B) שתל ראש המקובע על גולגולת החולדה ואזור הדמיה של גולגולת דקה מכוסה בסיליקון הגומי. (C) כובע ראש המונח על שתל הראש. (ד,ה) כובע ראש המעוגן לשתל הראש באמצעות חוטי מתכת מצופים. (F) כובע הראש והאזור שמסביבו מכוסה בסיליקון גומי לתמיכה נוספת בקיבוע והגנה על הגולגולת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תגובות תפקודיות של גירויי שפם C2. (A) תגובה פונקציונלית מייצגת של ניסוי יחיד של גירוי שפם C2 של 5 הרץ עבור שנייה אחת של הדמיית חולדה ערה וקבועה בראש, כאשר כל ניסוי נמשך 7 שניות עם מרווח בין ניסויים של 3 שניות ± 2 שניות. סף הייצוג בגווני אפור של שינוי שבר מקו הבסיס (-3.5 × 10-3 ל-3.5 × 10-3). (B) תגובה פונקציונלית מייצגת של ניסוי יחיד של גירוי שפם C2 של 5 הרץ עבור שנייה אחת של חולדה מורדמת (נתרן פנטוברביטל). סף הייצוג בגווני אפור של שינוי שברים מקו הבסיס (-2.5 × 10-4 ל-2.5 × 10-4). התגובה התפקודית של החולדה הערה, בעלת הראש הקבוע, חזקה פי 140 מזו של החולדה המורדמת. כל מסגרת היא מסגרת של 0.5 שניות. התמונות מיושרות כך שמשמאל לימין הוא מרוסטרלי לקאודלי ומלמעלה למטה הוא מהכיוון המדיאלי לרוחבי כפי שמוצג על ידי החיצים. האזורים הכהים יותר (מתחת לסף השלילי) הם האזורים העיקריים של הפעילות העצבית, והאזורים הלבנים הבהירים (מעל הסף החיובי) מראים את תגובת הדם המחומצן לגירוי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. קיצורים: C = קאודלי; L = לרוחב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: קובץ הדפסה תלת מימדית לשתל הראש. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: קובץ הדפסה תלת מימדית עבור כובע הראש. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש בהדמיית חולדות ערה וקבועה ראש מציע יתרונות רבים מבחינת קלות והתאמה אישית. הקלעים שתוכננו בהתאמה אישית מאפשרים לעטוף את החולדות באמצעות חומר רשת נושם, ומבטלים את הצורך לעטוף בעלי חיים בתאי ריסון סגורים מפלסטיק לפרקי זמן ממושכים10,11. חולדות נשמרות רגועות ונטולות מתח לאורך פרקי הזמן הארוכים של מפגשי הדמיה רצופים באמצעות מינון נמוך מאוד של אצפרומזין מתחת לרמות של הרגעה קלה בחולדות (1.0-2.5 מ"ג/ק"ג)12. כדי לשמור על יציבות החולדה ולחסל עוד יותר את חפצי התנועה במהלך מפגשי ההדמיה, נעשה שימוש ברצועות סקוטש. רצועות הסקוטש ממוקמות במרחק של 3-6 מ"מ זו מזו כדי למנוע התכווצות גוף מיותרת למשך שעות ארוכות. החולדות מאומנות ומורגלות עם קלעים בגיל צעיר כדי להבטיח שהן נשארות רגועות ונוחות לנוח בקלעים שלהן במהלך ההכנה ואיסוף הנתונים. בהתבסס על התוצאות הראשוניות, קל ומהיר יותר לאלף חולדות צעירות השוקלות כ-150-175 גרם מאשר חולדות מבוגרות יותר.
שתל הראש על ראש החולדה שוקל רק 0.174 גרם, וכובע הראש הנשלף שוקל 1.483 גרם. שתל הראש מכסה שטח של 0.5 ס"מ עד 1.5 ס"מ בחצי כדור אחד, ומאפשר נגישות מלאה של ההמיספרה השנייה לדימות מוחי. גודל כובע הראש מבטיח כיסוי מלא של אתר הניתוח. נראה כי המשקולות של שתל הראש וכובע הראש אינן מפריעות לניידות ולפעילויות היומיומיות, וניתן לשכן את החולדות יחד בכלובים סטנדרטיים. באמצעות שיטה זו לריסון הראש והגוף, ניתן לדמיין את החולדות במשך 2-3 שעות בכל פעם בימים שונים לצורך מחקרי אורך. ניתן לבצע מספר מפגשי הדמיה על חולדה בודדת למשך עד 3 חודשים לפחות באמצעות מערך זה. לוקח בסך הכל 25 דקות להדפיס בתלת-ממד את שתל הראש ואת כובע הראש. החלקים ניתנים להתאמה אישית בקלות בהתאם לגודל המכרסם וניתן גם להתאים אותם אישית לשימוש בעכברים. עבור מחקרים הדורשים התמיינות של החולדות, צבעים וחומרים שונים יכולים לספק זיהוי קל. בנוסף, ניתן להתאים אישית את החלק העליון של הכובע כדי להוסיף סמלים, מספרים או אותיות לזיהוי קל.
ישנם מספר שלבים חשובים להשתלה והדמיה מוצלחת, החשוב שבהם הוא אילוף והרגלה של החולדות. החולדות מוצגות באופן אקראי עם גירויים חושיים כדי למזער את הפוטנציאל ללמידה אסוציאטיבית, אשר יכולה להשפיע על תוצאות ההדמיה. הניתוח וכל כלי הניתוח צריכים להיות סטריליים כדי למנוע זיהום, והשימוש באנטיביוטיקה מקומית הוא הכרחי. השימוש באצפרומזין בתחילת ההדמיה חשוב לשמירה על בעלי החיים רגועים ושקטים כדי למנוע תנועות מיותרות במהלך מפגשי ההדמיה. הגולגולת של החולדה צריכה להיות יבשה לצורך קיבוע נכון, ושכבת המלט הדנטלי שהושקעה צריכה להיות דקה מספיק כדי שכובע הראש יתאים לשתל הראש.
במחקר הנוכחי, אזור הדימות התמקד בקליפת המוח הסומטוסנסורית. מידותיו של השטח הדליל הן כ-7.5 מ"מ על 7.5 מ"מ, שהוא היקף השטח שניתן לדמיין במחקר הנוכחי. עם זאת, ניתן להגדיל את השטח המצולם ל- 11 מ"מ x 11 מ"מ במידת הצורך. יתרון נוסף של עיצוב זה הוא שהוא מאפשר הדמיה של כל האזור המדולל למרות העקמומיות של קליפת המוח.
שתלי ראש שדווחו בעבר דורשים כמעט 7-12 ברגי עיגון כדי לקבע את שתל הראש על ראש החולדה13,14. זה מונע הדמיה של שטח גדול יותר באמצעות הכנת גולגולת מדוללת. שיטת קיבוע נוספת דורשת קיבוע של חומר שרף על פני שטח גדול באמצעות ברגי ראש, מה שהופך את הגולגולת לבלתי נגישה להדמיה14. הדמיה ערה של חולדות באמצעות MRI דורשת אימוביליזציה של בעלי חיים בצינורות גליליים, מה שהופך את חוויות ההדמיה למלחיצות עבור בעלי החיים11,15. בחלק מהמערכים האחרים, שתל הראש בולט מהראש ועלול להסתבך בכלובים סטנדרטיים16,17. שתל הראש וכובע הראש מבטלים את השימוש בקיבוע מגלשות זכוכית והשטחת הגולגולת הדקה לצורך הדמיה כרונית18,19. גודל שתל הראש והשימוש בעקמומיות על כובע הראש מבטלים את הצורך בביצוע שינויים בכלובים הסטנדרטיים כמו בפרוצדורות כרוניות אחרות18,19. שתלי הראש בעכברים קלים יותר מכיוון שמשתמשים רק בתצורת אגוז ובורג אחד, דבר שאינו אפשרי בחולדות, מכיוון שחולדות הרבה יותר חזקות וקשה לשמור עליהן יציבות20.
המגבלה של שתל ראש היא שלמרות גודלו הקטן, הוא דורש עיגון של השתל לגולגולת באמצעות ברגים. שתל הראש נחוץ כדי לשמור על ראשו של בעל החיים יציב, אך מגביל את ההדמיה של מוח החולדה כולו. עם זאת, יתרון בשימוש בשתל ראש זה הוא שניתן להשתמש בו כדי לדמיין אזור רחב יותר לגירוי חושי מעורר באמצעות שיטות דימות מוחי שונות כגון דימות אופטי של אות פנימי, טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית דופלר והדמיית כתמי לייזר.
הייצוגים התפקודיים של קליפת המוח המבוססים על אותות פנימיים של חולדות ערות ומקובעות ראש נוטים להיות חזקים יותר בעוצמתם מאשר בחולדות מורדמות המשתמשות באותו פרוטוקול גירוי שפם. עלייה דומה בעוצמת תגובת האות הפנימית המעוררת דווחה בקופים ערים21,22. העבודה הנוכחית נמשכת לשיפור עיצוב שתל הראש וכובע הראש לסביבות מאתגרות יותר כגון בית הגידול הנטורליסטי23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לקלרה ג'ונס, ג'יימס סטירוואלט, לין הואנג, ג'ון הא הצעיר ואמירסוהיל זארה על עזרתם במהלך אימון החולדות והכנת הקלעים. המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH, מספר מענק: NS119852) וקרן לדוק (מספר מענק: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
