Isolamento dei vettori di terapia genica di prossima generazione attraverso l'ingegneria, il codice a barre e lo screening delle varianti del capside del virus adeno-associato (AAV)

Summary

Generazione della libreria di visualizzazione dei peptidi AAV e successiva validazione attraverso il codice a barre di candidati con nuove proprietà per la creazione di AAV di nuova generazione.

Abstract

I vettori di rilascio genico derivati dal virus adeno-associato (AAV) sono uno degli strumenti più promettenti per il trattamento delle malattie genetiche, evidenziato da dati clinici incoraggianti e dall'approvazione di diverse terapie geniche AAV. Due ragioni principali per il successo dei vettori AAV sono (i) il precedente isolamento di vari sierotipi virali naturali con proprietà distinte e (ii) la successiva creazione di potenti tecnologie per la loro ingegneria molecolare e il loro riutilizzo ad alto rendimento. A rafforzare ulteriormente il potenziale di queste tecniche sono state recentemente implementate strategie per la codifica a barre di capsidi AAV selezionati a livello di DNA e RNA, consentendo la loro stratificazione completa e parallela in vivo in tutti i principali organi e tipi di cellule in un singolo animale. Qui, presentiamo una pipeline di base che comprende questo insieme di strade complementari, utilizzando la visualizzazione del peptide AAV per rappresentare il variegato arsenale di tecnologie di ingegneria del capside disponibili. Di conseguenza, descriviamo prima i passaggi cruciali per la generazione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV per la selezione in vivo di candidati con proprietà desiderate, seguita da una dimostrazione di come codificare a barre le varianti di capside più interessanti per lo screening secondario in vivo. Successivamente, esemplificamo la metodologia per la creazione di librerie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS), tra cui l'amplificazione dei codici a barre e la legatura degli adattatori, prima di concludere con una panoramica dei passaggi più critici durante l'analisi dei dati NGS. Poiché i protocolli qui riportati sono versatili e adattabili, i ricercatori possono facilmente sfruttarli per arricchire le varianti ottimali di capside AAV nel loro modello di malattia preferito e per applicazioni di terapia genica.

Introduction

La terapia di trasferimento genico è l'introduzione di materiale genetico nelle cellule per riparare, sostituire o alterare il materiale genetico cellulare per prevenire, trattare, curare o migliorare la malattia. Il trasferimento genico, sia in vivo che ex vivo, si basa su diversi sistemi di veicola, non virali e virali. I virus si sono evoluti naturalmente per trasdurre in modo efficiente le loro cellule bersaglio e possono essere utilizzati come vettori di consegna. Tra i diversi tipi di vettori virali impiegati nella terapia genica, i virus adeno-associati sono stati sempre più utilizzati, a causa della loro mancanza di patogenicità, sicurezza, bassa immunogenicità e, soprattutto, la loro capacità di sostenere l'espressione a lungo termine e non integrante ^1,2,3. La terapia genica AAV ha prodotto risultati considerevoli negli ultimi dieci anni; tre terapie sono state approvate dall'Agenzia europea per i medicinali e dalla Food and Drug Administration statunitense per l'uso nell'uomo ^3,4. Diversi studi clinici sono anche in corso per trattare una varietà di malattie, come l'emofilia, le malattie muscolari, cardiache e neurologiche, come esaminato altrove³. Nonostante decenni di progressi, il campo della terapia genica ha subito una serie di battute d'arresto negli ultimi anni⁴, soprattutto decessi negli studi clinici⁵ che sono stati sospesi a causa di tossicità dose-limitanti, in particolare per i tessuti che sono massicci, come i muscoli, o difficili da raggiungere, come il cervello⁶.

I vettori AAV attualmente utilizzati negli studi clinici appartengono ai sierotipi naturali con poche eccezioni¹. L'ingegneria AAV offre l'opportunità di sviluppare vettori con specificità ed efficienza superiori per organi o cellule. Negli ultimi due decenni, diversi approcci sono stati applicati con successo, come la visualizzazione del peptide, il loop-swap, il rimescolamento del DNA del capside, la PCR soggetta a errori e la progettazione mirata, per generare singole varianti AAV o librerie di esse con proprietà diverse⁷. Questi sono poi sottoposti a più cicli di evoluzione diretta per selezionare le varianti al loro interno con le proprietà desiderate, come esaminato altrove ^1,3. Di tutte le strategie di evoluzione del capside, le librerie AAV di visualizzazione dei peptidi sono state le più utilizzate, a causa di alcune proprietà uniche: sono relativamente facili da generare e possono raggiungere un'elevata diversità e un sequenziamento ad alto rendimento, che consente di seguire la loro evoluzione.

Le prime librerie AAV di successo per l'inserimento di peptidi sono state descritte quasi 20 anni fa. In uno dei primi, Perabo et ^al.8 hanno costruito una libreria di capsidi AAV2 modificati, in cui un pool di oligonucleotidi generati casualmente è stato inserito in un plasmide in una posizione corrispondente all'amminoacido 587 della proteina del capside VP1, nel triplice asse che sporge dal capside. Utilizzando la co-infezione da adenovirus, la libreria AAV è stata evoluta attraverso più cicli di selezione e le varianti finali re-mirate hanno dimostrato di essere in grado di trasdurre linee cellulari refrattarie all'AAV2 8 parentale^. Poco dopo, Müller et ^al.9 introdussero il sistema in due fasi per la produzione di biblioteche, un miglioramento significativo del protocollo. Inizialmente, la libreria plasmidica, insieme a un plasmide aiutante adenovirale, viene utilizzata per produrre una libreria AAV che contiene capsidi chimerici. Questa libreria navetta AAV viene utilizzata per infettare le cellule a bassa molteplicità di infezione (MOI), con l'obiettivo di introdurre un genoma virale per cellula. La co-infezione con adenovirus garantisce la produzione di AAV con un genoma e un capside 9^{corrispondenti.} Circa un decennio dopo, Dalkara¹⁰ ha utilizzato l'evoluzione diretta in vivo per creare la variante 7m8. Questa variante ha un'inserzione di 10 aminoacidi (LALGETTRPA), tre dei quali agiscono come linker, e colpisce efficacemente la retina esterna dopo l'iniezione intravitreale¹⁰. Questo capside ingegnerizzato è una storia di successo eccezionale, in quanto è uno dei pochi capsidi ingegnerizzati ad arrivare alla clinica finora¹¹.

Il campo ha registrato un secondo impulso con l'introduzione di tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Due pubblicazioni di Adachi et al.12 nel 2014 e di Marsic et ^al.13 nel 2015, hanno mostrato la potenza di NGS per tracciare la distribuzione di librerie di capsidi AAV con codice a barre con elevata precisione. Alcuni anni dopo, l'NGS delle regioni con codice a barre è stato adattato alla regione di inserzione del peptide per seguire l'evoluzione del capside. Körbelin et ^al.14 hanno eseguito uno screening guidato da NGS per identificare un capside basato su AAV2 mirato ai polmoni. L'analisi NGS ha aiutato a calcolare tre punteggi di valutazione: il punteggio di arricchimento tra i turni di selezione, il punteggio di specificità generale per determinare la specificità del tessuto e infine il punteggio combinato¹⁴. Il laboratorio Gradinaru¹⁵ ha pubblicato nello stesso anno il sistema di evoluzione mirata AAV basato sulla ricombinazione Cre, che facilita una selezione specifica del tipo di cellula. In questo sistema, la libreria capside trasporta uno switch Cre-invertibile, poiché il segnale polyA è affiancato da due siti loxP. La libreria AAV viene quindi iniettata nei topi Cre, dove il segnale polyA viene invertito solo nelle cellule Cre+, fornendo il modello per il legame di un primer PCR inverso con il primer forward all'interno del gene del capside. Questo salvataggio PCR altamente specifico ha permesso l'identificazione dell'AAV-PHP. Variante B che può attraversare la barriera emato-encefalica¹⁵. Questo sistema è stato ulteriormente evoluto in M-CREATE (Multiplexed-CREATE), in cui NGS e generazione di librerie sintetiche sono stati integrati nella pipeline¹⁶.

Una versione migliorata basata sull'RNA di questo sistema dal laboratorio Maguire¹⁷, iTransduce, consente la selezione a livello del DNA dei capsidi che trasducono funzionalmente le cellule ed esprimono i loro genomi. Il genoma virale della libreria di visualizzazione del peptide comprende un gene Cre sotto il controllo di un promotore ubiquitario e il gene del capside sotto il controllo del promotore p41. La libreria viene iniettata in topi che hanno una cassetta loxP-STOP-loxP a monte di tdTomato. Le cellule trasdotte con varianti AAV che esprimono il genoma virale e quindi Cre esprimono tdTomato e, in combinazione con marcatori cellulari, possono essere selezionate^{e selezionate 17}. Allo stesso modo, Nonnenmacher et al.18 e Tabebordbar et ^al.19 hanno posto la libreria genica del capside sotto il controllo di promotori tessuto-specifici. Dopo l'iniezione in diversi modelli animali, l'RNA virale è stato utilizzato per isolare le varianti del capside.

Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare il codice a barre per contrassegnare le librerie di capside. Il laboratorio Björklund²⁰ ha utilizzato questo approccio alle librerie di capsidi di inserzione di peptidi con codice a barre e ha sviluppato l'evoluzione razionale del vettore AAV con codice a barre (BRAVE). In un plasmide, la cassetta Rep2Cap viene clonata accanto a un transgene con codice a barre che esprime una proteina fluorescente gialla (YFP) con ripetizioni terminali invertite (ITR). Utilizzando siti loxP tra la fine del tappo e l'inizio del codice a barre, una ricombinazione Cre in vitro genera un frammento abbastanza piccolo per NGS, consentendo così l'associazione dell'inserimento del peptide con il codice a barre univoco (look-up table, LUT). La produzione di AAV viene eseguita utilizzando la libreria plasmidica e i codici a barre espressi nell'mRNA vengono sottoposti a screening dopo l'applicazione in vivo , sempre con NGS²⁰. Quando le librerie del capside comprendono varianti dell'intero gene del capside (cioè librerie mescolate), è necessario utilizzare il sequenziamento a lunga lettura. Diversi gruppi hanno utilizzato codici a barre per etichettare queste diverse librerie, il che consente a NGS una maggiore profondità di lettura. Il laboratorio Kay²¹ ha etichettato librerie mescolate di capside molto diverse con codici a barre a valle del segnale polyA del cappuccio . In una prima fase, è stata generata una libreria di plasmidi con codice a barre e la libreria del gene del capside mescolato è stata clonata in essa. Quindi è stata utilizzata una combinazione di MiSeq (lettura breve, profondità di lettura più elevata) e PacBio (lettura lunga, profondità di lettura inferiore) NGS e sequenziamento Sanger per generare la loro LUT²¹. Nel 2019, Ogden e colleghi del laboratorio Church²² hanno delineato l'idoneità del capside AAV2 per più funzioni utilizzando librerie che avevano mutazioni a singolo punto, inserzioni e delezioni in ogni posizione, che alla fine hanno permesso la progettazione guidata dalla macchina. Per la generazione della libreria, frammenti più piccoli del gene del capside sono stati sintetizzati, etichettati con un codice a barre, sequenziati di nuova generazione e quindi clonati nel gene del capside completo. I dati NGS sono stati utilizzati per generare una LUT. La libreria è stata quindi vagliata utilizzando solo i codici a barre e il sequenziamento a lettura breve, che a sua volta consente una profondità di lettura più elevata²².

Le librerie con codice a barre sono state utilizzate prevalentemente per vagliare un pool di varianti note, naturali e ingegnerizzate a seguito di diversi cicli di selezione delle librerie di capsidi o indipendentemente da uno studio sull'evoluzione del capside. Il vantaggio di tali librerie è l'opportunità di esaminare più capsidi, riducendo al contempo il numero di animali e minimizzando le variazioni tra gli animali. I primi studi che hanno introdotto questa tecnologia nel campo AAV sono stati pubblicati quasi un decennio fa. Il laboratorio Nakai 12 ha etichettato 191 mutanti doppi dell'alanina che coprono gli amminoacidi da 356 a 736 sul VP1 da AAV9 con una coppia di codici a barre a¹² nucleotidi. Utilizzando NGS, la libreria è stata esaminata in vivo per il legame con il galattosio e altre propriet๲. Marsic e colleghi hanno delineato la biodistribuzione delle varianti AAV utilizzando anche un'analisi a doppia barra 1 anno dopo¹³. Uno studio più recente su primati non umani ha confrontato la biodistribuzione nel sistema nervoso centrale di 29 capsidi utilizzando diverse vie di consegna²³. Il nostro laboratorio ha recentemente pubblicato schermi di librerie AAV con codice a barre di 183 varianti che includevano AAV naturali e ingegnerizzati. Questi screening a livello di DNA e RNA hanno portato all'identificazione di una variante AAV altamente miotropica²⁴ nei topi e in altri che mostrano un'elevata specificità di tipo cellulare nel cervello del topo²⁵.

Qui, descriviamo la metodologia utilizzata in questo lavoro e la espandiamo per includere lo screening delle librerie di visualizzazione dei peptidi AAV. Ciò comprende la generazione di librerie di visualizzazione dei peptidi AAV2, un metodo di PCR digitale a goccia (dd-PCR) per la quantificazione e, infine, una pipeline NGS per analizzare le varianti AAV, basata in parte sul lavoro di Weinmann e colleghi²⁴. Infine, viene fornita una descrizione della generazione di librerie AAV con codice a barre e della pipeline NGS utilizzata nella stessa pubblicazione.

Protocol

1. Preparazione della libreria di visualizzazione del peptide casuale 7-mer AAV2

NOTA: Per la preparazione di una libreria di visualizzazione di peptidi casuali AAV2, sintetizzare gli oligonucleotidi degenerati come DNA a singolo filamento, convertirlo in DNA a doppio filamento, digerire, ligate al plasmide accettore ed elettromerato.

1. Progettazione di oligonucleotidi degenerati
   1. Ordinare gli oligonucleotidi degeneri ed evitare la distorsione del codone. Nell'oligonucleotide 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 corrisponde a 20 codoni, ciascuno dei quali codifica per uno dei 20 amminoacidi. Il W può essere A o T, producendo i codoni AGA o AGT, che codificano gli amminoacidi arginina (R) o serina (S).
   2. Ordinare il primer di amplificazione: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (vedere la Figura 1 per i dettagli). Questo produce il seguente inserto proteico: R/S G X₇. La diversità teorica è calcolata come segue: 1 x 2 x 20⁷ = 2,56 x 10⁹ varianti uniche.
      NOTA: Va notato che questa diversità potrebbe essere limitata dall'efficienza della trasformazione.
2. Sintesi del secondo filamento
   1. Risospendere entrambi gli oligonucleotidi (oligonucleotidi degenerati e primer di amplificazione) ad una concentrazione finale di 100 μM con tampone TE.
      1. Per la reazione PCR, impostare una reazione da 50 μL con 1 μL di ciascun primer, 10 μL del tampone, 1,5 μL di DMSO, 0,5 μL di dNTPs (10 mM), 0,5 μL di polimerasi II ad alta fedeltà e 35,5 μL di acqua priva di nucleasi.
      2. Trasferire la reazione su un termociclatore ed eseguire una fase di pre-incubazione per 10 s a 98 °C, seguita da tre cicli di 10 s a 98 °C, 30 s a 59 °C e 10 s a 72 °C, quindi 5 minuti a 72 °C e una fase di raffreddamento finale.
   2. Purificare la reazione utilizzando un kit di rimozione dei nucleotidi ed eluire in 100 μL di acqua priva di nucleasi.
   3. Confermare l'efficienza della sintesi del secondo filamento mediante analisi su un bioanalizzatore (vedere Figura 2). Analizzare le dimensioni e la purezza dell'inserto a doppio filamento caricando 1 μL della reazione a un chip microfluidico da un kit di reagenti DNA 1000 secondo le istruzioni del produttore. Questo kit è ottimizzato per misurare le dimensioni e la concentrazione di frammenti di DNA a doppio filamento da 25-1.000 bps.
3. Digestione dell'inserto e del vettore plasmidico
   1. Digerire 85 μL dell'inserto purificato con 10 μL di tampone 10x e 5 μL di enzima BglI in un volume finale di reazione di 100 μL (vedere Figura 1 per i dettagli). Incubare a 37 °C durante la notte. Purificare utilizzando un kit di rimozione dei nucleotidi, eluire in 50 μL di acqua priva di nucleasi e quantificare utilizzando il tipo "Oligo DNA" in uno spettrofotometro.
   2. Digerire 10 μg di un plasmide AAV (pRep2Cap2_PIS)²⁶ competente per la replicazione (genoma virale affiancato da ITR) con 20 μL di tampone 10x e 10 μL di enzima SfiI in un volume di reazione finale di 200 μL (vedere Figura 1 per i dettagli). Incubare a 50 °C durante la notte. Purificare il vettore su un gel di agarosio all'1% utilizzando il kit di estrazione del gel seguito da un'ulteriore fase di purificazione utilizzando un kit di purificazione del DNA. Quantificare la concentrazione in uno spettrofotometro.
4. Legatura dell'inserto al vettore
   1. Ligate 955 ng di vettore plasmidico con 45 ng di inserto con 2 μL di tampone e 2 μL di ligasi in una reazione di legatura da 20 μL. Incubare a 16 °C durante la notte, seguito da 10 minuti a 70 °C per inattivare termicamente la ligasi.
5. Trasformazione, calcolo della complessità e preparazione della libreria di plasmidi
   1. Purificare la reazione con un kit di purificazione del DNA seguendo le istruzioni del produttore. Eluire la reazione in circa l'80% del volume iniziale di acqua priva di nucleasi e immagazzinarla sul ghiaccio per la successiva trasformazione.
   2. Trasformare le cellule elettrocompetenti: scongelare una fiala di cellule elettrocompetenti sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi aggiungere 1-2 μL della reazione di legatura purificata a 30 μL (un flaconcino) di cellule elettrocompetenti e mescolare picchiettando delicatamente. Quindi, pipettare accuratamente la miscela cellula/DNA in una cuvetta di elettroporazione a gap da 1 mm pre-raffreddata senza introdurre bolle d'aria.
   3. Elettropore utilizzando le seguenti impostazioni: 1800 V, 600 Ω e 10 μF. Entro 10 s dall'impulso di elettroporazione, aggiungere 970 μL di mezzi di recupero preriscaldati (forniti con le celle elettrocompetenti) alla cuvetta e miscelare mediante pipettaggio. Infine, trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga e incubare per 1 ora a 37 °C a 250 giri/min. Per ottenere la diversità desiderata, eseguire 10-100 reazioni e, dopo l'incubazione, raggruppare tutte le reazioni in un provetto.
   4. Calcolare la diversità diluendo 10 μL delle trasformazioni aggregate 10-, 100- o 1.000 volte in PBS e distribuire 100 μL su piastre di agar nutrienti contenenti l'antibiotico appropriato (75 mg / ml di ampicillina). Incubare le piastre di agar per una notte a 37 °C e poi contare le colonie sulle piastre di agar.
   5. Calcola la diversità teorica come segue:
      Diversità massima teorica = 10 x fattore di diluizione x numero di colonie x numero di reazioni di elettroporazione.
      NOTA: Per confermare la qualità della libreria, sequenziare almeno 20 colonie mediante sequenziamento Sanger. La maggior parte dei cloni dovrebbe contenere un inserto e tutti dovrebbero essere unici.
   6. Inoculare 400-1.000 mL di terreno LB contenente l'antibiotico appropriato con il resto delle trasformazioni aggregate e incubare per una notte a 37 °C, 180 giri/min.
6. Preparazione della libreria di plasmidi
   1. Dalla coltura notturna, preparare uno stock di glicerolo (mescolare volumi uguali di coltura batterica e soluzione di glicerolo al 50% in acqua priva di nucleasi e congelare a -80 °C) e purificare la libreria plasmidica utilizzando un maxi kit plasmide.
7. Produzione di libreria virale AAV
   1. Preparare la libreria virale come descritto in precedenza²⁷. Transfettare la libreria plasmidica (pRep2Cap2_PI, inserto peptidico) insieme a un plasmide adeno-helper alle cellule HEK293T utilizzando un reagente di trasfezione come la polietilenimina (PEI).
   2. Raccogliere le cellule dopo 3 giorni e sottoporle a tre cicli di congelamento-disgelo. Purificare il lisato virale utilizzando l'ultracentrifugazione a gradiente di cloruro di cesio, seguita dallo scambio tampone a PBS e infine concentrare le particelle virali.
8. Titolazione vettoriale AAV mediante dd-PCR
   1. Diluire in serie 2 μL del materiale madre vettoriale AAV in 198 μL di acqua priva di nucleasi per ottenere una diluizione finale 1:10⁶ . Miscelare accuratamente ogni volta utilizzando una pipetta da 200 μL. Aggiungere un controllo senza modello (NTC) come controllo negativo.
      NOTA: Ulteriori diluizioni inferiori o superiori possono essere analizzate (1:10^5-1:10⁷).
   2. Preparare un mix 20x primer-sonda. Aggiungere 3,6 μL di ciascuno dei primer da 100 μM (avanti e indietro, Rep2 e ITR), 1 μL ciascuna delle sonde dd-PCR da 100 μM (Rep2 e ITR) e 3,6 μL di acqua priva di nucleasi a una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
      NOTA: La libreria AAV viene misurata utilizzando un set di sonda primer mirato al transgene (Rep2) rilevato con una sonda marcata con FAM e un set di sonda primer mirato a ITR rilevato con una sonda marcata HEX.
   3. Preparare una reazione PCR da 22 μL aggiungendo 5,5 μL di campione, 1,1 μL di miscela primer-sonda 20x, 11 μL di supermiscela dd-PCR per sonde (senza dUTP) e 4,4 μL di acqua priva di nucleasi. Ciò produce concentrazioni di 900 nM e 250 nM rispettivamente per i primer e la sonda.
   4. Generare le goccioline utilizzando un generatore di gocce, trasferire la reazione su una piastra a 96 pozzetti, posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire una fase di denaturazione per 10 minuti a 94 °C, seguita da 40 cicli di 30 s a 94 °C e 1 min a 58 °C. Quindi, inattivare a caldo la polimerasi per 10 minuti a 98 °C e aggiungere una fase di raffreddamento finale. Leggere le reazioni in un lettore di gocce e procedere all'analisi²⁸.
   5. Aprire il file di lastra dd-PCR salvato utilizzando il software di analisi. Utilizzare lo strumento soglia nella scheda Ampiezza 1D (ampiezza della fluorescenza rispetto al numero dell'evento) per separare le goccioline negative e positive per ciascun canale, utilizzando l'NTC come guida ed esportare i dati in un file CSV.
   6. Per calcolare la concentrazione del vettore, calcolare prima il fattore di correzione CF usando la formula:
      
      La CF determina la proporzione di goccioline positive per il transgene [Positives] che sono positive sia per il transgene che per l'ITR [Ch1+ Ch2⁺], per garantire la rilevazione di particelle vettoriali funzionali. La concentrazione vettoriale finale c può ora essere calcolata usando la seguente equazione:
      
      DF è il fattore di diluizione (1:10^5-1:10⁷ come determinato in precedenza). Le copie per reazione a 20 μL/pozzetto corrispondono a 5 μL del campione diluito. Il fattore 1.000 corregge la scala in VG/mL (genoma virale/mL). Un risultato esemplare della titolazione è dimostrato nella Tabella 1 e nella Figura 3.
9. Analisi della libreria virale AAV mediante NGS
   1. Amplificare il frammento di inserzione del peptide a 96 nucleotidi impostando una reazione PCR da 20 μL utilizzando un kit di correzione di bozze della polimerasi (2x; vedere Figura 4). Aggiungere 1 μL di AAV contenente 1 x 10⁸ vg, 0,5 μL di ciascuno dei 100 μM di primer (NGS_forward e NGS_reverse) e 10 μL della miscela enzimatica alla reazione. Regolare il volume finale a 20 μL con acqua priva di nucleasi.
   2. Trasferire la reazione a un termociclatore ed eseguire una fase di denaturazione per 3 minuti a 98 °C, seguita da 30-35 cicli di 10 s a 98 °C, 10 s a 59 °C e 20 s a 72 °C, seguiti da 5 minuti a 72 °C e una fase di raffreddamento finale.
   3. Purificare i campioni utilizzando un kit di purificazione PCR. Quantificare la concentrazione in uno spettrofotometro ed eseguire un gel di agarosio al 3% per verificare la purezza e la dimensione del frammento.
   4. Elaborare i frammenti PCR utilizzando il sistema di librerie per il kit di campioni a bassa complessità secondo le istruzioni del produttore per la preparazione di una libreria NGS. Eseguire la reazione di riparazione finale con 30 ng di frammento di PCR, seguita da legatura dell'adattatore e amplificazione PCR per 10 cicli. Utilizzare il kit di purificazione PCR per la purificazione delle reazioni.
   5. Elaborare i prodotti finali su un Bioanalyzer per verificarne le dimensioni e la purezza, utilizzando un kit di reagenti del DNA secondo le istruzioni del produttore.
   6. Quantificare gli ampliconi utilizzando un fluorometro e raggrupparli. Quantificare nuovamente la libreria NGS aggregata finale su un fluorometro (secondo le istruzioni del produttore) e verificare la qualità su un bioanalizzatore.
   7. Sequenziare le librerie NGS in modalità single-end (SE), utilizzando un kit ad alto output di 75 cicli, con una lunghezza di lettura di 84 e un indice 1 di 8.
      NOTA: La sequenza degli esempi in questo articolo è stata eseguita presso la struttura GeneCore di EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
   8. Analizza i dati di sequenziamento NGS con Python 3 e biopython. I file sono disponibili all'indirizzo https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (in alternativa su https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). L'analisi NGS è composta da due fasi.
      1. Nella prima fase, cercare nei file di sequenza le sequenze che soddisfano determinati criteri (presenza di sequenze di riconoscimento che fiancheggiano il sito di inserimento) (vedere Figura 4, passaggio 1.9.8.5.). Questo viene fatto utilizzando uno script (Script # 1) e un file di configurazione che fornisce le informazioni necessarie. Una volta identificata la sequenza corretta, il programma estrae e memorizza la sequenza nel file di output, che è un file txt con lo stesso nome del file di sequenziamento.
      2. Il secondo passo è l'analisi dei file di output. Le sequenze nella libreria iniziano con uno qualsiasi dei sei nucleotidi (AGWggc, W = A / T) nell'inserto di nove aminoacidi. Sulla base di questa sequenza iniziale, il peptide viene tradotto. Questo genera i file di output che contengono le varianti peptidiche (PV).
      3. Preparare due cartelle: Script e Dati. Nella cartella Dati, copiare i file compressi gzip risultanti dalla sequenziazione. Nella cartella Script, copiare i seguenti file, file Python: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; File Python: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; File di configurazione: Barcode_Script_JoVE.conf; e file della tabella di ricerca (LUT): Zuordnung.txt.
      4. Prima di eseguire gli script, modificare i seguenti file nella cartella script. Apri il file "Zuordnung.txt" e aggiungi due colonne separate da tabulazioni, i nomi dei file gzip (colonna 1) e il nome finale desiderato (colonna 2; valori separati da tabulazioni).
         Nota : i file txt di esempio si trovano nella cartella GitHub "PV_analysis_script". I file forniti nella cartella GitHub vengono preparati per l'analisi di tre dati di esempio dalla libreria precedente: xaa.txt.gz, xab.txt.gz e xac.txt.gz. Vengono forniti anche i file di output.
      5. Modificare le seguenti variabili nel file di configurazione "Barcode_Script_JoVE.conf":
         my_dir = "~/Data/"
         filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
         Le variabili specifiche della sequenza: BCV_size = 27, BCV_left = TCCAGGGCCAG, BCV_right = GCCCAGG, BCV_loc = 30, BCV_margin = 8, BCV_{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC e BCV_{loc_revcomp} = 41 (vedere la Figura 4 per i dettagli).
      6. Utilizzare il comando seguente per chiamare il rilevamento e l'estrazione della sequenza di varianti:
         >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
         NOTA: L'output sono file txt con le sequenze di DNA estratte e il loro numero di letture. L'intestazione di questo file contiene dati statistici (cioè il numero totale di letture e le letture estratte). Questi dati vengono trasferiti ai file successivi. Questi dati txt sono i file di input per Script#2, in cui le sequenze di DNA vengono tradotte, classificate e analizzate.
      7. Eseguire l'estrazione e l'analisi FV utilizzando il seguente comando:
         >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analizza i file di output di testo di Script # 2. I file di output di Script#2 sono denominati utilizzando la seconda colonna della LUT in "Zuordnung.txt" con estensioni basate sul tipo di analisi.
         NOTA: assicurarsi che i tre file di output contengano dati statistici nelle prime righe ("# di letture PV valide", "# di letture PV non valide" e "# di letture PV univoche"), una prima colonna con l'indice di ogni sequenza di DNA dai file txt di input (output di Script # 1) e le seguenti colonne: (1) "... analyzed_all.csv": "Campione:" (sequenza del DNA), "#" (numero di letture), "Frw o Rev" (lettura diretta o inversa) e "PVs" (sequenza peptidica tradotta). Le sequenze non valide hanno "NA" e "not valid" nelle ultime due colonne. (2) "... analyzed_validSeq.csv": uguale al file precedente, filtrato per sequenze valide. (3) "... analyzed_PV.csv": "PVs" (sequenza peptidica tradotta), "#" (numero di letture) e "count" (i conteggi frw e rev nei file precedenti vengono uniti e il conteggio viene dato 1 o 2).
      9. Visualizza i file di output utilizzando il software disponibile in base alle esigenze dell'utente.

2. Selezione della libreria di visualizzazione del peptide casuale 7-mer AAV2

1. Utilizzare la libreria AAV dopo la quantificazione e il controllo di qualità (sezione 1) per l'evoluzione diretta in un modello di scelta per selezionare iterativamente i candidati con le proprietà desiderate (vedi Figura 5)^16,18,21.
   NOTA: Questi candidati vengono quindi utilizzati per la generazione di una libreria di codici a barre come descritto di seguito nella sezione 3.

3. Preparazione e analisi della libreria di capsidi AAV con codice a barre

NOTA: A seguito dell'identificazione di una serie di capsidi AAV potenzialmente specifici ed efficienti nella schermata di visualizzazione del peptide, verificare la funzionalità delle sequenze peptidiche identificate e confrontarle con una serie di varianti di capside AAV di riferimento comunemente usate o ben descritte. A tale scopo, la sequenza capside viene inserita in un costrutto helper Rep/Cap senza ITR.

1. Produzione di librerie AAV con codice a barre
   1. Eseguire la produzione di AAV ricombinante per ciascuna variante di capside utilizzando il sistema a tre plasmidi, come descritto in precedenza²⁴.
      NOTA: Per distinguere le diverse varianti di capside, il plasmide transgene reporter affiancato da ITR contiene un codice a barre univoco di 15 nucleotidi di lunghezza. Il codice a barre si trova al 3' UTR (regione non tradotta) tra la proteina fluorescente gialla potenziata (EYFP) e il segnale polyA (vedi Figura 6A). L'espressione di EYFP è guidata da un forte promotore ubiquitario del citomegalovirus (CMV) che fornisce livelli sufficienti di trascritti di RNA.
   2. Progettare codici a barre di 15 nucleotidi di lunghezza con omopolimeri di meno di tre nucleotidi, contenuto di GC di <65%²⁹ e una distanza di Hamming superiore a quattro nucleotidi²⁴.
   3. Produrre ciascun capside separatamente in combinazione con un plasmide transgene che trasporta un codice a barre univoco. In questo modo, ogni variante di capside è contrassegnata con un codice a barre distinto che ne consente il tracciamento specifico (vedere la Figura 6B).
2. Titolazione vettoriale AAV mediante dd-PCR
   1. Eseguire la titolazione AAV come descritto in precedenza nella sezione 1.8, sostituendo la coppia di primer Rep2 con la coppia di primer YFP.
   2. Quantificare le singole produzioni AAV e raggruppare quantità uguali di ciascuna produzione per generare la libreria finale di codici a barre.
   3. Quantificare nuovamente la libreria finale per verificare la concentrazione e la qualità finali (vedere Figura 7).
3. Libreria AAV con codice a barre in vivo applicazione
   1. Applicare sistematicamente la libreria AAV con codice a barre al sistema modello scelto (ad esempio sistematicamente nei topi²⁴).
   2. Raccogliere tessuti ON- e OFF-target (cioè fegato, polmone, cuore, diaframma, muscolatura liscia, duodeno, pancreas, colon, bicipiti, ovaie, stomaco, orecchio interno, rene, aorta addominale, aorta toracica, cervello, grasso bruno e bianco e milza) o tipi di cellule in base all'esperimento. Congelarli a -80 °C, estrarre il DNA/RNA e applicare l'analisi di quantificazione NGS, come descritto nella sezione successiva.
4. Estrazione DNA/RNA
   1. Estrarre il DNA e l'RNA dai tessuti di interesse utilizzando il Mini Kit DNA/RNA.
   2. Posizionare un piccolo pezzo del tessuto di interesse (1 mm³, circa 5 mg) in una provetta di reazione da 2 ml.
   3. Aggiungere 350 μL di tampone di lisi miscelato con β-mercaptoetanolo (1%) e sfere di acciaio da 5 mm al tessuto (maneggiare campioni con β-mercaptoetanolo sotto una cappa aspirante).
   4. Omogeneizzare il tessuto in un tissueLyser per 45 s a 40 Hz.
   5. Aggiungere 10 μL di proteinasi K (10 mg/ml) e incubare per 15 minuti a 55 °C agitando a 400 giri/min.
   6. Centrifugare a 20.000 x g per 3 minuti a temperatura ambiente, raccogliere il surnatante e procedere con il protocollo del produttore del Kit DNA/RNA.
   7. Dividere la fase di lavaggio in due fasi con 350 μL di tampone di lavaggio in ogni fase. Tra queste fasi di lavaggio, digerire il DNA residuo sulla colonna con DNasi I. Aggiungere 80 μL della soluzione di DNasi I, preparata secondo le istruzioni del produttore, sulla colonna e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
   8. Eluire RNA/DNA dalla colonna con acqua priva di nucleasi. Conservare l'RNA isolato a -80 °C e il gDNA a -20 °C.
5. Sintesi del cDNA
   1. Sottoporre i campioni di RNA ad un altro ciclo di trattamento con DNasi I di 15-30 minuti (per la completa rimozione del DNA contaminante dai campioni di RNA) prima della reazione di trascrizione inversa. Aggiungere 1 μL della soluzione di DNasi I, 4 μL di tampone (fornito con il kit) e acqua priva di nucleasi ad un volume finale di 40 μL a 212 ng di RNA. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e inattivare a 70 °C per 10 min.
   2. Sintetizzare il cDNA, utilizzando 150 ng di RNA utilizzando un kit secondo le istruzioni del produttore. Includere controlli senza trascrittasi inversa, per garantire l'assenza di DNA virale contaminante dal campione. Il cDNA è immagazzinato a -20 °C.
      NOTA: La quantità di RNA di input per una trascrizione inversa ottimale può variare a seconda del tipo di tessuto e dell'efficienza di trasduzione attesa nel rispettivo tessuto.
6. Analisi della libreria virale AAV (in-vivo) di NGS
   1. Per ottenere un'elevata profondità di sequenziamento a basso costo, eseguire NGS tramite sequenziamento Illumina come descritto in precedenza (sezione 1.9). Amplificare la sequenza di codici a barre, quindi collegare gli adattatori di sequenziamento all'amplicone.
   2. A causa della lunghezza di lettura ridotta e della legatura degli adattatori di sequenziamento su entrambi i lati dell'amplicone, durante la progettazione, verificare che l'amplicone sia sufficientemente piccolo da garantire la presenza della sequenza di codici a barre all'interno della lettura NGS. Per il sequenziamento dei codici a barre all'interno dei genomi virali e delle trascrizioni virali, l'amplicone PCR è progettato per essere lungo 113 bp (vedi Figura 8).
   3. Amplifica la regione con codice a barre con i primer BC-seq in avanti e BC-seq al contrario. Preparare la seguente reazione PCR: 0,5 μL di DNA polimerasi ad alta fedeltà, 10 μL di tampone 5x, 0,25 μL di ciascun primer da 100 μM (BC-seq fw/BC-seq rv) e 1 μl di 10 mM dNTPs. Utilizzare 25 ng di cDNA o DNA/reazione come modello e regolare il volume finale a 50 μL con acqua priva di nucleasi.
   4. Preparare il master-mix PCR sotto un cappuccio PCR pulito per evitare la contaminazione. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclismo: 30 s a 98 °C, seguiti da 40 cicli a 98 °C per 10 s e 72 °C per 20 s e un ultimo passo di 5 minuti a 72 °C.
   5. Includere controlli PCR per confermare l'assenza di DNA contaminante nel master-mix PCR. Per i campioni di cDNA, includere i controlli senza trascrittasi inversa. Infine, includere un esempio con la libreria di input AAV. Queste informazioni verranno utilizzate per generare il file Normalization_Variant.txt utilizzato nell'analisi.
   6. Verificare la dimensione del frammento PCR di ciascun campione mediante elettroforesi su gel prima della purificazione PCR. Quest'ultimo è ottenuto utilizzando perle magnetiche disponibili in commercio o sistemi di purificazione del DNA basati su colonne (vedi Tabella dei materiali).
   7. Preparare la libreria NGS utilizzando il sistema di librerie per campioni a bassa complessità secondo le istruzioni del produttore, come descritto in precedenza nella sezione 1.9.
   8. Determinare la concentrazione di DNA tramite il kit HS dsDNA e analizzare la qualità della libreria come descritto in precedenza (sezione 1.9.6), seguito dal pooling. Quantificare la libreria aggregata su un fluorometro e valutare la qualità su un bioanalizzatore.
   9. Eseguire il sequenziamento NGS come discusso nella sezione 1.9.7.
   10. Quantificare mediante qPCR il numero di copie del transgene (genomi virali) e del gene housekeeping per valutare la distribuzione della libreria aggregata tra tessuti o organi sul DNA.
   11. Impostare una reazione qPCR da 30 μL come segue, per determinare il numero di copie di EYFP (transgene) e GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, gene housekeeping):
       1. Preparare una miscela primer/sonda 60x per EYFP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv e 0,6 μM YFP_probe; vedere Tabella dei materiali). Utilizzare la miscela primer/sonda GAPDH (vedere la tabella dei materiali) per determinare il numero di copie del gene della governante. Imposta la reazione sul ghiaccio.
       2. Preparare una miscela master PCR (15 μL, vedere Tabella dei materiali) e aggiungere 60x miscela primer/sonda (0,5 μL) per tutti i campioni e gli standard (per calcolare il numero di copie per gli standard, utilizzare il seguente link: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Imposta la reazione sul ghiaccio.
       3. Trasferire 15,5 μL della miscela principale in una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 14,5 μL di campione (75 ng di concentrazione totale di DNA) o standard al rispettivo pozzetto. Sigillare brevemente la piastra a 96 pozzetti con un foglio, un vortice e una rotazione.
       4. Trasferire 10 μL di ciascun campione in una piastra da 384 pozzetti in duplicati. Sigillare la piastra con un foglio e centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C.
       5. Incubare la miscela di reazione in un termociclatore utilizzando una temperatura iniziale di 50 °C per 2 minuti, seguita da una fase iniziale di attivazione di 10 minuti a 95 °C. Eseguire 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 s e ricottura/estensione a 60 °C per 1 min²⁴.
       6. Per ottenere il numero di genomi diploidi (dg), utilizzare il numero di copia GAPDH e dividere per due. Quindi, prendi il valore del numero di copia dell'EYFP e dividi per il numero di dg, ottenendo genomi vettoriali per genoma diploide (vg / dg). Utilizzare questo valore per generare il file di Normalization_Organ.txt per l'analisi bioinformatica.
   12. Eseguire l'analisi dei dati di sequenziamento NGS come Weinmann et al.²⁴, usando codice personalizzato in Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Il flusso di lavoro comprende il rilevamento di sequenze di codici a barre guidate da sequenze di fiancheggiamento, la loro lunghezza e posizione (Script # 1_BarcodeDetection.py), nonché l'analisi dell'arricchimento e della distribuzione del codice a barre sul set di tessuti (Script # 2_BarcodeAnalysis.py).
       1. Rileva i codici a barre e assegnali alle varianti AAV. Posizionare i dati di sequenziamento come file fastq archiviati in una directory (ad esempio, "Data_to_analyze"). Il file di dati di sequenziazione per la libreria di input è incluso in questa directory e utilizzato solo per calcolare le proporzioni del capside nella libreria di input.
       2. Prima di eseguire lo script, creare due file di testo delimitati da tabulazioni: il file delle varianti del capside (vedere il file di esempio "Varianti.txt") con le sequenze di codici a barre assegnate ai nomi delle varianti del capside AAV e il file di contaminazione (vedere "Contaminazioni.txt") con sequenze di codici a barre che provengono da una possibile contaminazione (altri codici a barre disponibili in laboratorio, che contribuiscono alla contaminazione).
       3. Infine, modificare il file di configurazione "Barcode_Script.conf" per includere le seguenti informazioni: percorso della cartella con i dati di sequenziamento (ad esempio, "Data_to_analyze"), sequenza delle regioni laterali dei codici a barre, loro posizione e dimensione della finestra per il rilevamento dei codici a barre (simile a 1.9.8.5, vedere Figura 8).
       4. Utilizzare il seguente comando per chiamare il rilevamento dei codici a barre con i percorsi forniti a Script#1_BarcodeDetection.py e ai file di configurazione:
          >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
          NOTA: l'output dell'esecuzione di Script#1_BarcodeDetection.py è costituito da file di testo con conteggi di lettura per variante di capside e dal numero totale di letture recuperate dai dati non elaborati.
       5. Valutare la distribuzione dei capsidi AAV con codice a barre tra tessuti o organi, eseguendo Script#2_BarcodeAnalysis.py insieme ai seguenti file txt:
          1. Nel file "Zuordnung.txt", assegnare il nome a ciascun file txt ottenuto dall'esecuzione di rilevamento del codice a barre a un nome di tessuto/organo: nomi di file txt nella prima colonna e nomi di tessuti/organi corrispondenti in assegnazione delimitata da tabulazioni.
             NOTA: per un esempio, controllare nella cartella "Esempio" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Da notare che il nome del tessuto/organo può includere caratteri che definiscono la misurazione del cDNA o del gDNA e il numero di replica biologica (M1, M2, ecc.).
          2. Creare un file di testo "organi.txt" con l'elenco dei nomi per gli organi ON e OFF-target, che corrispondono ai nomi indicati nel file di assegnazione "Zuordnung.txt" (vedere la cartella "Esempio": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Creare file di testo delimitati da tabulazioni "Normalization_Organ.txt" e "Normalization_Variant.txt" con valori normalizzati per tutte le varianti di capside e tutti gli organi/tessuti. Nella prima colonna del file "Normalization_Organ.txt", scrivere i nomi indicati per ciascun organo (come nel file di assegnazione "Zuordnung.txt") e nella seconda colonna i valori di normalizzazione per i tessuti corrispondenti, generati nella sezione 3.6.11.
          4. Riempire la prima colonna del file "Normalization_Variant.txt" con l'elenco dei nomi dei capside e la seconda colonna con i valori normalizzati dei conteggi di lettura per ogni capside nella libreria in pool (la normalizzazione può essere calcolata in base al file di output txt per la libreria di input risultante dal primo script).
          5. Modificare il file di configurazione specificando i percorsi completi di tutti i file aggiuntivi sopra menzionati. Execute Script#2_BarcodeAnalysis.py come:
             >python3 /script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
             NOTA: lo script di analisi dei codici a barre produce diversi file: file di testo con valori di concentrazione relativa (RC) della distribuzione del capside all'interno di diversi tessuti in base a più passaggi di normalizzazione descritti in precedenza e il file di foglio di calcolo che combina i dati del file di testo nei dati della matrice uniti. Quest'ultimo può essere utilizzato per l'analisi e la visualizzazione dei cluster.
          6. Visualizza i dati ed esegui l'analisi dei cluster dei dati della matrice al fine di distinguere le proprietà del capside e valutare le loro somiglianze in base ai profili RC tra i tessuti. Utilizzare lo script aggiuntivo PCA_heatmap_plot. R inserito nel repository:
             >Rscript --vanilla ~/PCA. R ~/concentrazione relativa.xls
             NOTA: lo script accetta i file relativeconcentration.xls come input e genera due grafici di mappa di calore del cluster gerarchico e analisi dei componenti principali (PCA).
          7. Per modificare i grafici (assi della mappa di calore, componenti principali della PCA) o i parametri png (colore, dimensione, etichettatura), aprire lo script R e seguire le istruzioni fornite nelle sezioni commentate.

Representative Results

Generazione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV2. Come primo passo verso la selezione di AAV ingegnerizzati, viene descritta la generazione di una libreria di plasmidi. L'inserto peptidico viene prodotto utilizzando primer degenerati. Ridurre la combinazione di codoni in quelli da 64 a 20 ha il vantaggio di eliminare i codoni di stop e facilitare l'analisi NGS, riducendo la diversità della libreria sul DNA ma non il livello proteico. L'inserto oligonucleotidico viene acquistato come DNA a singolo filamento (Figura 1), che viene convertito in DNA a doppio filamento utilizzando una reazione PCR. La qualità di questa reazione è controllata in un bioanalizzatore. Come mostrato nella Figura 2, tre cicli hanno prodotto una banda più forte, rispetto a 10 o 30 cicli. L'inserto viene quindi digerito con BglI per generare sporgenze a tre nucleotidi. Il nucleotide vicino alla sequenza di sporgenza dell'inserto a doppio filamento può essere un A o un T (W è il codice di ambiguità per A o T), che si trova nella terza posizione di un codone che codifica arginina (R) o serina (S). Il vettore (pRep2Cap2_PIS) ha una mutazione frameshift nel sito di inserimento del peptide che impedisce la produzione del capside in assenza di un inserto, a causa della creazione di un codone di arresto poco dopo il sito di inserimento. La digestione SfiI di questo plasmide genera sporgenze a tre nucleotidi che corrispondono alle sporgenze generate nell'inserto oligonucleotidico codificante peptide. La legatura deve essere eseguita in condizioni ottimali per massimizzare la complessità della libreria di plasmidi. A tal fine, per la trasformazione, è stata eseguita l'elettroporazione utilizzando batteri disponibili in commercio con alta efficienza.

La diversità della libreria plasmidica è calcolata in base al conteggio delle colonie, che è tipicamente intorno a 1 x 10⁸ per questo tipo di libreria. Il numero totale di colonie corrisponde alla massima diversità potenziale della libreria all'analisi NGS, come discusso più avanti. La libreria dei plasmidi viene quindi utilizzata per generare la libreria AAV, che non è descritta in dettaglio qui ma altrove²⁷.

La quantificazione di questa libreria è stata eseguita utilizzando dd-PCR. Tipicamente, vengono quantificate due regioni, il gene AAV2 rep all'interno del genoma virale e l'ITR (vedi Figura 3 e Tabella 1). Come mostrato nella Tabella 1, dalle goccioline positive per il genoma virale, il 99,2% è positivo anche per ITR (Ch1 + Ch2 ⁺), che è un controllo di qualità per la libreria AAV e suggerisce che i capsidi AAV contengono genomi virali completi. Per ottenere una concentrazione in vg/mL, la proporzione di goccioline doppie positive rispetto ai positivi viene calcolata e utilizzata per ottenere il numero corretto di copie prima dell'amplificazione da parte del fattore di diluizione.

La qualità della libreria AAV viene quindi valutata mediante analisi NGS, iniziando con una PCR utilizzando primer appropriati. Successivamente, il prodotto PCR viene elaborato utilizzando un kit disponibile in commercio, che aggiunge adattatori contenenti indice al prodotto PCR. I prodotti NGS vengono sequenziati e i file vengono analizzati utilizzando Python. Vengono forniti tre dati campione da una libreria di visualizzazione del peptide AAV2. Ogni sequenza nel file di input Script#1 (elenco delle sequenze di tutte le copie PCR del segmento di DNA amplificato nel campione) viene ricercata bioinformaticamente per le sequenze BCV_sinistra e BCV_destra, o le sequenze BCV_{left_comp} e BCV_{right_comp}. Se viene identificata una delle due combinazioni, la sequenza contenuta viene estratta e aggiunta al file di output (vedere la Figura 4). L'output di entrambi gli script fornisce dati statistici relativi alla preparazione della libreria NGS. In tutti e tre i set, le letture estratte, basate su sequenze di firma specifiche della libreria, rappresentavano circa il 94% delle letture totali, il che suggerisce una buona qualità. L'output di Script#2 fornisce ulteriori dati statistici e la traduzione della sequenza di DNA estratta produce ulteriori dati di controllo della qualità. Il "# of Invalid PV reads" (cioè sequenze che mancano dei sei nucleotidi utilizzati per avviare la traduzione in silico e codificare i residui RG o SG) è inferiore all'1% delle letture recuperate, il che conferma una buona qualità di sequenziamento. Gli output del secondo script (cioè la traduzione e la classificazione delle sequenze di DNA estratte) forniscono informazioni aggiuntive, come il numero di letture per variante peptidica o il numero di sequenze di DNA che danno origine a ciascuna variante peptidica. Dei file, quelli che terminano con "analyzed_PVs" contengono solo letture valide del DNA e l'analisi viene eseguita a livello di sequenza peptidica. Delle letture valide, oltre il 99% sono uniche, il che suggerisce che la biblioteca è equilibrata e la diversità interna è elevata.

Selezione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV2. Questa libreria può quindi essere utilizzata per la selezione in vivo o in vitro . Questo non è incluso in questo protocollo, ma una struttura è fornita nella Figura 5. In breve, per la selezione in vivo , i tessuti vengono raccolti 1 settimana dopo l'iniezione sistemica di 1 x 10¹² vg/topo e il DNA viene isolato. Viene eseguita una PCR di salvataggio su un frammento più grande del gene cap e il prodotto viene clonato nel vettore plasmidico utilizzando diversi siti di restrizione ma un protocollo simile a quello descritto qui e vengono preparate librerie AAV round-1. Per l'analisi NGS, la PCR viene eseguita sul DNA isolato o sulle librerie AAV. Dopo la selezione, la percentuale di PV univoci nella libreria diminuisce in genere in base alla pressione della selezione. A seconda del progetto, la selezione può essere conclusa una volta che NGS identifica un numero sufficiente di PV dominanti.

Selezione e analisi della libreria con codice a barre. I dati di una libreria AAV con codice a barre comprendente 82 capsidi sono stati descritti in precedenza²⁴. La quantificazione dd-PCR delle particelle AAV (vedi Figura 7 e Tabella 1) mostra che il 94% dei capsidi positivi per il transgene contengono anche un ITR, indicativo di un genoma completo. Questo è inferiore alla libreria wild-type descritta sopra, ma suggerisce comunque una buona qualità per gli AAV ricombinanti, considerando che di solito si impacchettano in modo meno efficiente. Dopo l'iniezione della libreria aggregata negli animali, i tessuti vengono raccolti e il DNA e l'RNA vengono isolati. La PCR per NGS e la preparazione e il sequenziamento della libreria NGS vengono quindi eseguiti come descritto sopra e precedentemente²⁴. Per calcolare vg/dg, viene eseguita la qPCR e, nei dati campione forniti, i valori vanno da 0,1 a 4. Come è tipico per la somministrazione sistemica di AAV, il fegato ha oltre 10 vg / dg.

Come parte della pipeline di analisi, i passaggi di normalizzazione vengono eseguiti su diversi livelli. Nella libreria in pool di input, le varianti del capside non sono in genere rappresentate allo stesso modo. Pertanto, l'analisi NGS della libreria di input viene utilizzata per generare un file di normalizzazione, che corregge l'abbondanza di ciascuna variante di capside nel tessuto / organo finale in base all'abbondanza di questa variante di capside nella libreria di input. La biodistribuzione dei membri della libreria aggregati da parte di NGS viene eseguita a livello di DNA e RNA. Questa normalizzazione per la libreria di input produce il quoziente (P*_αβ) della proporzione all'interno del tessuto/organo (P_αβ) rispetto alla proporzione nella libreria di input (L_a). Questi calcoli possono essere trovati nel file "variant_comparison.txt". Questo quoziente viene quindi moltiplicato per i valori vg/dg del file "Normalization_organ.txt" per ottenere il valore Β αβ, e le proporzioni dei valori di Β_αβ sono calcolate per un singolo tessuto o per tutti. La proporzione del valore Β αβ per ciascuna variante all'interno di un tessuto (V_αβ) riflette la diffusione di questa variante all'interno di questo tessuto ("organ_comparison.txt"). Al contrario, la proporzione del valore Β αβ per ciascuna variante in tutti i tessuti (T_αβ) indica la diffusione di questa variante all'interno dell'intero corpo ("concetrazioni relative.xls"). Queste due proporzioni riflettono la biodistribuzione intra e intertissutale di ciascuna variante. Tutti questi file possono essere utilizzati per diverse visualizzazioni di efficienza e specificità del capside²⁴. Ad esempio, utilizzando la tabella finale (che si trova in "concetrazioni relative.xls"), l'analisi delle componenti principali e il clustering gerarchico sono presentati nella Figura 9.

La normalizzazione della libreria aggregata dal sequenziamento NGS mostra che ogni capside ha una proporzione media di 0,012, che corrisponde anche alla proporzione teorica di ciascuno degli 82 capsidi e suggerisce una libreria in pool ben bilanciata di 0,012 (1/82). Il file "concentrazione relativa.xls" generato dalla pipeline bioinformatica riflette la biodistribuzione intertissutale del capside, come illustrato nella Figura 9. La mappa di calore mostra i valori di concentrazione relativa su una scala log2 per ciascun capside della libreria aggregata raggruppata gerarchicamente in base al profilo di biodistribuzione tissutale. L'analisi delle componenti principali consente di distinguere gruppi di varianti di capside AAV con proprietà di biodistribuzione simili e mette in evidenza anche i capsidi periferici con modelli unici di biodistribuzione intertissutale. I due rami principali della gerarchia della mappa di calore riflettono la differenza nell'efficienza di trasduzione delle varianti del capside. Il ramo sinistro con la maggior parte delle varianti del capside comprende tutti i capsidi, che mostrano un alto valore di concentrazione relativa nella maggior parte dei tessuti. Oltre alla specificità epatica sorprendentemente elevata, altri tre capsidi (Var60, Var13 e Var63) hanno mostrato specificità nel diaframma (Di), nel muscolo scheletrico (SM), nei bicipiti (BlC) e nel cervello (B). Il ramo destro del raggruppamento gerarchico comprende le varianti del capside con un'efficienza di trasduzione complessivamente inferiore, che è pronunciata nel duodeno (Du) e nel pancreas (P). La PCA per il sottogruppo originale forma il cluster di varianti del capside con elevata specificità epatica (Var 64, 78, 65, 55, 56) e delinea il capside Var60 con eccezionale trofismo muscolare.

Figura 1: Panoramica della strategia di clonazione per la libreria di visualizzazione del peptide 7-mer casuale AAV2.
L'oligonucleotide con la sequenza di inserimento casuale del peptide 7-mer è affiancato da sequenze che contengono il sito di digestione BglI e un sito di legame per la reazione di amplificazione. Il pRep2Cap2_PIS vettoriale contiene siti SfiI. Gli sbalzi generati dalla digestione BglI e SflI sono complementari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Controllo della qualità del bioanalizzatore della sintesi del secondo filamento di oligonucleotidi.
La sintesi del secondo filamento di oligonucleotidi degenerati è confermata dall'analisi su un bioanalizzatore. Vengono confrontate le reazioni PCR con tre, 10 e 30 cicli di amplificazione, dimostrando che il più efficiente sono i tre cicli di amplificazione. (A) Dati del bioanalizzatore rappresentati come immagine gel. (B-D) Lunghezze dei frammenti tracciate (in bp, asse x) rispetto alle unità di fluorescenza (asse FU, y), rispetto ai picchi standard, visibili a 15 e 1500 bp. Le frecce rosse indicano oligonucleotidi a doppio filamento. Si noti che il più alto valore di FU, che rappresenta la più alta concentrazione di DNA, di oligonucleotidi a doppio filamento si osserva dopo tre cicli di amplificazione (frecce rosse). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Titolazione di una libreria di visualizzazione peptidica AAV2 mediante dd-PCR.
(A) Rilevazione di goccioline rep2-positive nel canale 1 (FAM, Canale 1) per un controllo dell'acqua non modello e un campione di virus diluito 1:10⁶ . (B) Rilevamento di goccioline ITR-positive nel canale 2 (HEX, canale 2). (C) Rilevamento di goccioline positive sia per rep2 che per ITR (evidenziate in arancione). Le linee viola indicano le soglie per il rilevamento di goccioline positive rispetto a quelle negative. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Panoramica del frammento di DNA utilizzato per NGS e impostazioni per l'analisi python.
La NGS PCR amplifica una regione di 96 nucleotidi. Il frammento PCR viene utilizzato per generare la libreria NGS. Per l'analisi bioinformatica, è necessario fornire sequenze di riconoscimento a destra e a sinistra del sito di inserimento per entrambi i filamenti, nonché la distanza dall'inizio del frammento di DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Selezione iterativa delle librerie AAV in vivo.
I topi vengono iniettati con la libreria AAV. I tessuti target ON e OFF vengono raccolti 1 settimana dopo e sottoposti a NGS e analisi. Il tessuto ON-target viene utilizzato per salvare il gene del capside, che viene clonato nel vettore genitore. La libreria AAV selezionata viene prodotta e utilizzata per ripetere il ciclo di selezione di cui sopra. Questa figura è stata creata con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Panoramica della generazione di librerie AAV con codice a barre.
(A) Rappresentazione grafica di un genoma AAV autocomplementare portatore di un transgene eyfp guidato dal promotore del CMV affiancato da ITR. Il 3' UTR contiene un codice a barre lungo 15 nucleotidi (BC) situato al 3' UTR tra l'eyfp e il segnale di poliadenilazione dell'ormone della crescita bovino (BGH). Il BC consente il tracciamento del capside a livello di DNA e mRNA. (B) Durante la produzione di AAV, un genoma unico con codice a barre viene impacchettato da un'unica variante del gene cap , facilitando l'identificazione del capside. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Titolazione di una libreria AAV con codice a barre mediante dd-PCR.
(A) Rilevazione di goccioline YFP-positive nel canale 1 (FAM, Canale 1) per un controllo dell'acqua non modello e un campione di vettore diluito 1:10⁶ . (B) Rilevamento di goccioline ITR-positive nel canale 2 (HEX, canale 2). (C) Rilevamento di goccioline positive sia per rep2 che per ITR (evidenziate in arancione). Le linee viola indicano le soglie per il rilevamento di goccioline positive rispetto a quelle negative. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Panoramica del frammento di DNA utilizzato per NGS e impostazioni per l'analisi Python.
La NGS PCR amplifica una regione di 113 nucleotidi. Per l'analisi bioinformatica, è necessario fornire sequenze di riconoscimento a destra e a sinistra del codice a barre per entrambi i filamenti, nonché la distanza dall'inizio del frammento di DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Analisi delle componenti principali (PCA) e analisi dei cluster gerarchici.
(A) La PCA dei valori di concentrazione relativa per 82 capsidi in tutti i tessuti consente di definire gruppi di varianti di capside con proprietà simili e varianti con modelli di trasduzione unici. (B) Per separare meglio il cluster altamente popolato, le registrazioni delle varianti uniche periferiche sono state escluse dalla matrice e l'analisi PCA è stata ripetuta. (C) L'analisi gerarchica dei cluster consente di valutare visivamente i profili di trasduzione delle varianti attraverso i tessuti come un grafico della mappa di calore (Li = fegato, Lu = polmone, FatB = grasso bruno, H = cuore, Di = diaframma, SM = muscolatura liscia, Du = duodeno, P = pancreas, C = colon, BIC = bicipiti, O = ovaie, St = stomaco, I = orecchio interno, K = rene, Aa = aorta addominale, At = aorta toracica, B = cervello, FatW = grasso bianco e S = milza). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Campione	Bersaglio	Copie/pozzetto da 20 μL	Positivi	Ch1+ Ch2+	CFR	copie corrette	DF	VG/mL
H2O	rep2	28	2	0	0	0	1,00E+06	5,60E+09
AAV2lib	rep2	90600	16396	16266	0.99	89882	1,00E+06	1,80E+13
H2O	YFP	4	3	2	0.67	3	1,00E+06	8,00E+08
BCAAVlib	YFP	34680	13229	12452	0.94	32643	1,00E+06	6,53E+12

Tabella 1: Risultati della titolazione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV2 ("AAV2lib") e della libreria vettoriale EYFP con codice a barre ("BCAAVlib").

Discussion

In questo protocollo, vengono delineati i passaggi necessari per l'ingegneria del capside AAV di visualizzazione del peptide e per lo screening della libreria AAV con codice a barre, nonché per l'analisi bioinformatica della composizione della libreria e delle prestazioni del capside. Questo protocollo si concentra sui passaggi che facilitano l'analisi bioinformatica di questi tipi di librerie, perché la maggior parte dei laboratori di virologia sono in ritardo nelle capacità di programmazione per abbinare la loro competenza nelle tecniche di biologia molecolare. Entrambi i tipi di biblioteche sono stati ampiamente descritti in letteratura, come delineato nell'introduzione, e possono essere riprodotti con relativa facilità.

Come primo passo, viene delineato il progetto di una libreria di visualizzazione dei peptidi in posizione 588 nella regione variabile VIII di AAV2. Questo disegno (AAV2_Peptide(ii) nella precedente pubblicazione 26) e il metodo di clonazione descritto possono essere facilmente adattati ad altri sierotipi sulla base delle informazioni fornite in una recente pubblicazione²⁶. Un passo critico nella pipeline di clonazione è l'efficienza di legatura/trasformazione (utilizzando il cut-off di ~1 x 10⁸ colonie). Si consiglia di aggiungere una reazione di legatura con solo vettore. Questo aiuta a identificare la percentuale di colonie batteriche con inserto, che dovrebbe essere superiore all'80%. Un'efficienza inferiore al previsto, cioè un numero di colonie batteriche (calcolando la percentuale con inserto) inferiore alla diversità teorica degli inserti oligonucleotidici, avrebbe un impatto negativo sulle varianti a bassa abbondanza. Diversi miglioramenti includono tempi di digestione più lunghi e passaggi di pulizia per la reazione del vettore o della legatura, utilizzando kit commerciali.

Il passo successivo è il controllo di qualità della libreria di varianti utilizzando NGS di un frammento PCR che comprende il sito di inserimento dell'oligonucleotide. L'NGS viene eseguito utilizzando un sistema di sequenziamento Illumina. Esistono diverse alternative, in cui i prodotti PCR possono essere inviati direttamente senza previa preparazione della libreria NGS. Questo è più adatto per esperimenti su piccola scala o quando non è richiesta un'elevata profondità di lettura. Il protocollo qui riportato comprende la preparazione della libreria NGS, compresa l'aggiunta di adattatori con indici Illumina ai prodotti PCR, utilizzando un kit disponibile in commercio. Una limitazione comune rispetto a NGS è che questi frammenti PCR hanno una bassa diversità, perché le sequenze che fiancheggiano il sito di inserimento ad alta diversità sono identiche in tutte le varianti, il che a sua volta riduce l'efficienza del sequenziamento. Per risolvere questo problema, questo kit aggiunge un numero qualsiasi da due a otto nucleotidi casuali tra il frammento PCR e l'adattatore. In alternativa, il campione deve essere arricchito con PhiX. La pipeline Python dettagliata è descritta per analizzare le librerie di visualizzazione dei peptidi AAV2. Come modello, vengono forniti file di esempio estratti dal file NGS originale della libreria di visualizzazione del peptide AAV2. Questo può essere adattato ad altri sierotipi con le istruzioni fornite. I file di output di questa analisi possono essere utilizzati nell'analisi a valle, come il confronto tra plasmide e libreria AAV 30, la composizione aminoacidica in ogni posizione³⁰, il calcolo del punteggio di arricchimento tra le librerie dopo i turni di selezione 14 o la generazione di loghi o grafici di sequenza ¹⁹. Per quanto riguarda la libreria di input, si desidera la presenza di un'alta percentuale di varianti uniche. Tuttavia, alcune varianti non producono bene come altre, il che potrebbe portare a distribuzioni distorte dopo la produzione. Una bassa diversità di varianti, o in altre parole la presenza di varianti dominanti, potrebbe essere attribuita a una bassa qualità dell'inserto oligonucleotidico o ad un elevato numero di cicli di sintesi del secondo filamento (fase 1.2). Inoltre, la composizione aminoacidica potrebbe essere influenzata dalla produzione. Ogni amminoacido dovrebbe avere una frequenza del 5,00%. Se la distribuzione varia notevolmente da questo valore, si suggerisce di eseguire la stessa analisi sulla libreria plasmidica per identificare potenziali distorsioni³⁰.

Poiché i protocolli per la generazione di librerie AAV e i successivi cicli di selezione in diversi modelli animali e in vitro sono stati ampiamente descritti in più pubblicazioni e protocolli 27,30,31,32^, qui viene descritta solo l'analisi delle librerie di codici a barre di varianti ingegnerizzate selezionate e benchmark. Da notare che la clonazione della libreria dopo ogni ciclo di selezione può essere eseguita mediante isolamento PCR del gene cap, come menzionato nelle sezioni protocollo e risultati. Ampi cicli di selezione e amplificazione della PCR possono portare all'accumulo di mutazioni o codoni di stop, che possono essere osservati da NGS. In alternativa, le varianti arricchite possono essere selezionate dai dati NGS e gli oligonucleotidi ordinati e clonati nel modo in cui è stato descritto per la generazione di una libreria di visualizzazione peptidica^16,18. Infine, il protocollo contiene una breve descrizione per la selezione delle librerie a livello del DNA, 1 settimana dopo l'iniezione sistemica. Le selezioni basate sull'RNA sono più rigorose, in quanto selezionano anche le varianti che transitano attraverso percorsi di ingresso infettivi, sebbene siano tecnicamente più impegnative. Va notato che le selezioni basate su RNA o transgeni (cioè Cre) richiedono una durata in vivo più lunga di circa 3-4 settimane 15,16,17,18,19,33. Soprattutto per le selezioni basate sul DNA, è fondamentale convalidare le varianti selezionate rispetto a sierotipi naturali e ingegnerizzati noti sia a livello di DNA che di RNA utilizzando una libreria AAV con codice a barre.

La seconda parte del protocollo descrive la generazione e lo screening di librerie AAV con codici a barre utilizzando la pipeline precedentemente sviluppata²⁴. Ogni capside AAV nel pool contiene lo stesso transgene (eyfp sotto il controllo di un promotore CMV) con un codice a barre distinto tra eyfp e il segnale polyA. I codici a barre utilizzati in questa biblioteca si trovano nella pubblicazione precedente²⁴. Il progetto si basava sul principio di base della distanza di Hamming (cioè, le sequenze di codici a barre devono essere adeguatamente diverse), in modo che gli errori di sequenziamento non portino a assegnazioni errate dei codici a barre. Come descritto in Lyons et al²⁶, la possibilità che si verifichino due errori in letture tra 25-100 nucleotidi è molto bassa. Una distanza di Hamming di 4 significa che sarebbero necessari due errori di sequenziamento per assegnare una lettura come codice a barre errato. Le letture con un errore verranno ignorate durante l'analisi e in questo caso classificate come "letture con varianti sconosciute". In una pubblicazione pertinente, vengono fornite linee guida e uno script Python per generare codici a barre²⁹ che possono essere utilizzati nella pipeline. Per l'identificazione di codici a barre utili, è possibile utilizzare un altro popolare codice di correzione degli errori come delineato nella pubblicazione di Buschmann e Bystrykh³⁴, vale a dire la distanza di Levenshtein. Questo gruppo fornisce anche un pacchetto software per il linguaggio di programmazione R³⁵.

Dopo la produzione di AAV, la libreria AAV con codice a barre in pool può essere utilizzata per studi di biodistribuzione in diversi modelli. Questo studio delinea la pipeline utilizzando la libreria di 82 varianti della precedente pubblicazione²⁴ e fornisce dati di esempio per la pratica. Questo protocollo può anche essere adattato in base alle esigenze di ciascun utente. L'analisi della biodistribuzione si basa sulla raccolta di diversi tessuti o cellule ON- e OFF-target, l'estrazione di DNA e RNA da essi, l'amplificazione PCR della regione del codice a barre per il sequenziamento NGS e la misurazione di vg / dg a livello di DNA. Per l'RNA, sarebbe meglio calcolare il rapporto con il numero di copie di mRNA di un gene di riferimento. Il gene di riferimento scelto deve essere espresso in modo simile in diversi tessuti 36, come RPP30 (Ribonucleasi P/MRP Subunit P30)³⁷ o Hprt (ipoxantina fosforibosiltransferasi 1)³⁶. Tuttavia, questo è arduo, quindi potrebbe essere necessario utilizzare diversi geni di riferimento contemporaneamente per normalizzare i dati dell'RNA. Per questo motivo, la normalizzazione a dg sul livello del DNA può essere completata, che correla approssimativamente con il numero di cellule. Ciò sottolinea anche l'uso della qPCR per questo calcolo, come descritto in precedenza²⁴, sebbene dd-PCR sia più preciso e quindi sia preferito per un uso futuro, soprattutto considerando i progressi in questo campo³⁷. Ultimo ma non meno importante, le ottimizzazioni di biologia molecolare di base sono estremamente critiche per la metodologia qui descritta. Le reazioni PCR devono essere ottimizzate per evitare di introdurre pregiudizi nella distribuzione delle librerie. Le sonde dd-PCR devono essere progettate per includere regioni introniche per il DNA e regioni interesoniche per l'RNA. Una buona pratica di laboratorio, come la compartimentazione fisica delle fasi, in particolare la produzione di DNA e AAV dalla preparazione della libreria, e una corretta disinfezione sono di fondamentale importanza per evitare l'amplificazione errata e le contaminazioni della libreria.

In particolare, l'uso di librerie di visualizzazione peptidica e codici a barre vettoriali DNA/RNA per selezionare capsidi ingegnerizzati con nuovi tropismi o altre proprietà clinicamente rilevanti rappresenta solo due esempi di tecnologie di evoluzione diretta del capside AAV. Tutti hanno in comune il fatto che hanno dei limiti e richiedono un'ulteriore ottimizzazione per realizzare il loro pieno potenziale. Ad esempio, il semplice inserimento di un peptide lascia invariata una grande percentuale (~ 99%) della sequenza del capside sottostante, le cui proprietà, inclusa l'interazione con anticorpi neutralizzanti anti-AAV, potrebbero dover essere ulteriormente modificate prima dell'applicazione umana³⁸. Inoltre, la diversità effettiva della visualizzazione dei peptidi o di altre librerie è tipicamente inferiore a quella teorica, a causa, ad esempio, di limitazioni tecniche durante la clonazione o la trasformazione batterica³¹. In generale, vi è anche un dibattito attivo sulla rilevanza traslazionale dell'evoluzione diretta in modelli animali o in vitro , favorito da una crescente evidenza di una possibile prestazione specie- o addirittura specifica del ceppo dei capsidi sintetici AAV³⁸. Tuttavia, c'è una sostanziale speranza che molti o tutti questi limiti saranno superati e che l'attuale arsenale di tecnologie sarà ampliato a una varietà ancora più ampia di modelli di malattia e diventerà ancora più accessibile alla maggior parte dei gruppi di ricerca. A questo proposito, uno sviluppo recente particolarmente incoraggiante è l'uso di librerie AAV con codici a barre come quelle qui riportate per convalidare capsidi selezionati non più solo sull'organo, ma ora anche a livello cellulare, che può essere raggiunto con nuove tecnologie come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (sc)³⁹. I protocolli qui presentati faciliteranno la più ampia istituzione di tecniche di evoluzione AAV e quindi accelereranno lo sviluppo di nuovi capsidi su misura per le esigenze di una pletora di gruppi di ricerca e pazienti umani.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification primer	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	80204	DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	NGS Library preparation
BC-seq fw:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	ATCACTCTCGGCATGGACGAGC	NGS Library preparation
BC-seq rv:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	GGCTGGCAACTAGAAGGCACA	NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	44-420-3250ML	DNA/RNA extraction
BglI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0143	Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1851196	dd-PCR cycler
dNTPS	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	N0447S	NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863024	dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863005	dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864008	dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863051	dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863009	dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	12001925	dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells	Lucigen (Middleton, WI, USA)	60081-1	Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm	Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)	748050	Electroporation
GAPDH primer/probe mix	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Mm00186825_cn	Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1652660	Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)	4368814	cDNA reverse transcription
ITR_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	SY-415-1001	NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*	Roche AG (Basel, Switzerland)	KK2600 07958919001	NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	V8151	Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	ND-2000	Digestion of double-stranded insert
NGS_frw	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC	NGS primer
NGS_rev	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	CGC CTT GTG TGT TGA CAT C	NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	FC-404-2005	NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit	NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)	9092-256	NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814000	dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814040	dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F530S	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)	24765-1G	AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	NG2002	Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F549L	NGS Library preparation
Proteinase K	Roche AG (Basel, Switzerland)	5963117103	DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS			ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864002	dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864003	dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28306	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28704	Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	12162	Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28104	Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer	Invitrogen (Waltham, MA, USA)	Q32857	NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Q32851	NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix	Qiagen (Venlo, Netherlands)	1044234	Taqman qPCR
rep_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC	dd-PCR primer
rep_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CAATCACGGCGCACATGT	dd-PCR primer
rep_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1	dd-PCR probe
RNase-free DNase	Qiagen (Venlo, Netherlands)	79254	DNA/RNA extraction
SfiI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0123	Digestion of vector
5 mm, steel Beads	Qiagen (Venlo, Netherlands)	69989	DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	M0202L	Plasmid library ligation
TissueLyserLT	Qiagen (Venlo, Netherlands)	85600	DNA/RNA extraction
YFP_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GAGCGCACCATCTTCTTCAAG	dd-PCR primer
YFP_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	TGTCGCCCTCGAACTTCAC	dd-PCR primer
YFP_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1	dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)	Zymo research (Irvine, CA, USA)	D4013	Vector and Ligation purification