Выделение векторов генной терапии следующего поколения с помощью инженерии, штрих-кодирования и скрининга вариантов капсида аденоассоциированного вируса (AAV)

Summary

Генерация библиотеки пептидных дисплеев AAV и последующая проверка с помощью штрих-кодирования кандидатов с новыми свойствами для создания AAV следующего поколения.

Abstract

Векторы доставки генов, полученные из аденоассоциированного вируса (AAV), являются одним из наиболее перспективных инструментов для лечения генетических заболеваний, о чем свидетельствуют обнадеживающие клинические данные и одобрение нескольких генных терапий AAV. Двумя основными причинами успеха векторов AAV являются (i) предварительное выделение различных встречающихся в природе вирусных серотипов с различными свойствами и (ii) последующее создание мощных технологий для их молекулярной инженерии и перепрофилирования с высокой пропускной способностью. Дальнейшим повышением потенциала этих методов являются недавно реализованные стратегии штрих-кодирования выбранных капсидов AAV на уровне ДНК и РНК, что позволяет проводить их всестороннюю и параллельную стратификацию in vivo во всех основных органах и типах клеток одного животного. Здесь мы представляем базовый конвейер, охватывающий этот набор дополнительных возможностей, используя пептидный дисплей AAV для представления разнообразного арсенала доступных технологий инженерии капсида. Соответственно, сначала мы описываем ключевые шаги по созданию библиотеки пептидных дисплеев AAV для отбора кандидатов in vivo с желаемыми свойствами, а затем демонстрируем, как штрих-кодировать наиболее интересные варианты капсида для вторичного скрининга in vivo . Далее мы проиллюстрируем методологию создания библиотек для секвенирования следующего поколения (NGS), включая амплификацию штрих-кода и лигирование адаптеров, прежде чем завершить обзор наиболее важных шагов во время анализа данных NGS. Поскольку протоколы, представленные здесь, универсальны и адаптируемы, исследователи могут легко использовать их для обогащения оптимальных вариантов капсида AAV в своей любимой модели заболевания и для применения в генной терапии.

Introduction

Терапия переноса генов — это введение генетического материала в клетки для восстановления, замены или изменения клеточного генетического материала для предотвращения, лечения, лечения или улучшения заболевания. Перенос генов, как in vivo, так и ex vivo, зависит от различных систем доставки, невирусных и вирусных. Вирусы эволюционировали естественным образом, чтобы эффективно трансдуцировать свои клетки-мишени и могут использоваться в качестве векторов доставки. Среди различных типов вирусных векторов, используемых в генной терапии, все чаще используются аденоассоциированные вирусы из-за их недостаточной патогенности, безопасности, низкой иммуногенности и, что наиболее важно, их способности поддерживать долгосрочную, неинтегрирующую экспрессию ^1,2,3. За последнее десятилетие генная терапия AAV принесла значительные достижения; три метода лечения были одобрены Европейским агентством по лекарственным средствам и Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для использования у людей ^3,4. Также проводится несколько клинических испытаний для лечения различных заболеваний, таких как гемофилия, мышечные, сердечные и неврологические заболевания, как рассмотрено в другом месте³. Несмотря на десятилетия прогресса, в последние годы область генной терапии пережила ряд неудач⁴, наиболее важным из которых были смерти в клинических^{испытаниях 5}, которые были приостановлены из-за токсичности, ограничивающей дозу, особенно для тканей, которые являются массивными, такими как мышцы, или труднодоступными, такими как мозг⁶.

Векторы AAV, используемые в настоящее время в клинических испытаниях, относятся к естественным серотипам, за некоторыми исключениями:¹. Инженерия AAV дает возможность разрабатывать векторы с превосходной органной или клеточной специфичностью и эффективностью. За последние два десятилетия было успешно применено несколько подходов, таких как пептидный дисплей, замена петли, перетасовка капсидной ДНК, подверженная ошибкам ПЦР и целевой дизайн, для создания отдельных вариантов AAV или их библиотек с различными свойствами⁷. Затем они подвергаются нескольким раундам направленной эволюции для выбора вариантов внутри них с желаемыми свойствами, как рассмотрено в другом месте ^1,3. Из всех стратегий эволюции капсидов наиболее широко используются библиотеки AAV пептидных дисплеев благодаря некоторым уникальным свойствам: их относительно легко генерировать, и они могут достигать высокого разнообразия и высокой пропускной способности секвенирования, что позволяет отслеживать их эволюцию.

Первые успешные пептидные библиотеки AAV были описаны почти 20 лет назад. В одном из первых Perabo et ^al.8 построили библиотеку модифицированных капсидов AAV2, в которой пул случайно сгенерированных олигонуклеотидов был вставлен в плазмиду в положении, соответствующем аминокислоте 587 капсидного белка VP1, в тройной оси, выступающей из капсида. Используя коинфекцию аденовируса, библиотека AAV была разработана путем нескольких раундов отбора, и было показано, что окончательные ретаргетированные варианты способны трансдуцировать клеточные линии, рефрактерные к родительскому AAV2⁸. Вскоре после этого Мюллер и ^др.9 представили двухступенчатую систему библиотечного производства, что значительно улучшило протокол. Первоначально библиотека плазмид вместе с аденовирусной вспомогательной плазмидой используется для получения библиотеки AAV, содержащей химерные капсиды. Эта челночная библиотека AAV используется для заражения клеток с низкой кратностью инфекции (MOI) с целью введения одного вирусного генома на клетку. Коинфекция аденовирусом обеспечивает выработку AAV с совпадающим геномом и капсидом⁹. Примерно десять лет спустя Dalkara¹⁰ использовала направленную эволюцию in vivo для создания варианта 7m8. Этот вариант имеет вставку 10 аминокислот (LALGETTRPA), три из которых действуют как линкеры и эффективно нацелены на внешнюю сетчатку после интравитреальной инъекции¹⁰. Этот инженерный капсид является исключительной историей успеха, так как это один из немногих инженерных капсидов, попавших в клинику на данный момент¹¹.

Эта область пережила второй импульс с внедрением методов секвенирования следующего поколения (NGS). Две публикации от Adachi et al.12 в 2014 году и от Marsic et ^al.13 в 2015 году продемонстрировали возможности NGS для отслеживания распределения библиотек капсидов AAV со штрих-кодом с высокой точностью. Несколько лет спустя NGS областей со штрих-кодом был адаптирован к области введения пептидов, чтобы проследить эволюцию капсида. Körbelin et ^al.14 провели скрининг под контролем NGS для выявления капсида на основе AAV2, нацеленного на легкие. Анализ NGS помог рассчитать три рейтинговых балла: балл обогащения между отборочными раундами, общий балл специфичности для определения тканевой специфичности и, наконец, комбинированный балл¹⁴. В том же году лаборатория^{Gradinaru 15} опубликовала систему целевой эволюции AAV (CREATE) на основе Cre-рекомбинации, которая облегчает отбор по типу клеток. В этой системе капсидная библиотека несет Cre-инвертируемый переключатель, так как сигнал polyA окружен двумя сайтами loxP. Затем библиотеку AAV вводят мышам Cre, где сигнал polyA инвертируется только в клетках Cre+, обеспечивая матрицу для связывания праймера обратной ПЦР с прямым праймером в гене капсида. Это высокоспецифическое спасение ПЦР позволило идентифицировать AAV-PHP. Вариант B, который может пересекать гематоэнцефалический барьер¹⁵. Эта система получила дальнейшее развитие в M-CREATE (Multiplexed-CREATE), в которой NGS и генерация синтетических библиотек были интегрированы в конвейер¹⁶.

Улучшенная версия этой системы на основе РНК из лаборатории^{Магуайра 17}, iTransduce, позволяет отбирать на уровне ДНК капсиды, которые функционально трансдуцируют клетки и экспрессируют их геномы. Вирусный геном библиотеки пептидного дисплея включает ген Cre под контролем вездесущего промотора и ген капсида под контролем промотора p41. Библиотека вводится мышам, у которых есть кассета loxP-STOP-loxP перед tdTomato. Клетки, трансдуцированные вариантами AAV, которые экспрессируют вирусный геном и, следовательно, Cre экспрессируют tdTomato и в сочетании с клеточными маркерами могут быть отсортированы и отобраны¹⁷. Аналогичным образом, Nonnenmacher et al.18 и Tabebordbar et ^al.19 поместили библиотеку генов капсида под контроль тканеспецифических промоторов. После инъекции на разных животных моделях вирусная РНК использовалась для выделения вариантов капсида.

Альтернативным подходом является использование штрих-кодирования для маркировки библиотек капсидов. Лаборатория²⁰ Бьорклунда использовала этот подход к библиотекам капсидов для вставки пептидов штрих-кода и разработала рациональную эволюцию вектора AAV со штрих-кодом (BRAVE). В одной плазмиде кассета Rep2Cap клонируется рядом с трансгеном с инвертированным концевым повтором (ITR), экспрессирующим желтый флуоресцентный белок (YFP), помеченным штрих-кодом. Используя сайты loxP между концом колпачка и началом штрих-кода, рекомбинация Cre in vitro генерирует фрагмент, достаточно маленький для NGS, тем самым позволяя ассоциировать вставку пептида с уникальным штрих-кодом (справочная таблица, LUT). Производство AAV осуществляется с использованием библиотеки плазмид, а штрих-коды, экспрессированные в мРНК, проверяются после применения in vivo , опять же с помощью NGS²⁰. Когда библиотеки капсида содержат варианты всего гена капсида (т.е. перетасованные библиотеки), необходимо использовать секвенирование с длинным чтением. Несколько групп использовали штрих-коды для маркировки этих разнообразных библиотек, что позволяет NGS иметь более высокую глубину считывания. Лаборатория^{Кея 21} пометила очень разнообразные перетасованные капсидные библиотеки штрих-кодами после сигнала cap polyA. На первом этапе была сгенерирована библиотека плазмид со штрих-кодом, и в нее была клонирована перетасованная библиотека генов капсида. Затем для генерации LUT²¹ была использована комбинация MiSeq (короткое чтение, более высокая глубина чтения) и PacBio (длинное чтение, меньшая глубина чтения), а также секвенирование Сэнгера. В 2019 году Огден и его коллеги из лаборатории^{Черча 22} определили пригодность капсида AAV2 для нескольких функций, используя библиотеки, которые имели одноточечные мутации, вставки и делеции в каждой позиции, что в конечном итоге позволило использовать машинно-управляемое проектирование. Для генерации библиотеки были синтезированы меньшие фрагменты гена капсида, помечены штрих-кодом, секвенированы следующего поколения, а затем клонированы в ген полного капсида. Данные NGS были использованы для создания LUT. Затем библиотека была проверена с использованием только штрих-кодов и короткой последовательности считывания, что, в свою очередь, обеспечивает более высокую глубину считывания²².

Библиотеки со штрих-кодом в основном использовались для скрининга пула известных, естественных и инженерных вариантов после нескольких раундов отбора библиотек капсида или независимо от исследования эволюции капсида. Преимуществом таких библиотек является возможность скрининга нескольких капсидов, при этом сокращая количество животных и сводя к минимуму различия между животными. Первые исследования, которые представили эту технологию в области AAV, были опубликованы почти десять лет назад. Лаборатория Накаи 12 пометила 191 двойного аланинового мутанта, охватывающего аминокислоты с 356 по 736 на VP1 из AAV9 парой 12-нуклеотидных штрих-кодов. С помощью NGS библиотека была проверена in vivo на связывание галактозы и другие свойства¹². Марсик и его коллеги очертили биораспределение вариантов AAV, используя также анализ с двойным шнуром 1 год спустя¹³. В более позднем исследовании, проведенном на нечеловекообразных приматах, сравнивалось биораспределение в центральной нервной системе 29 капсидов с использованием различных путей доставки²³. Наша лаборатория недавно опубликовала библиотечные экраны AAV со штрих-кодом из 183 вариантов, которые включали натуральные и инженерные AAV. Эти скрининги на уровне ДНК и РНК привели к идентификации высокомиотропного варианта^{AAV 24} у мышей, а также других, демонстрирующих высокую специфичность клеточного типа в мозге^{мыши 25}.

Здесь мы описываем методологию, используемую в этой работе, и расширяем ее, включая скрининг библиотек пептидных дисплеев AAV. Это включает в себя создание библиотек пептидных дисплеев AAV2, метод цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) для количественной оценки и, наконец, конвейер NGS для анализа вариантов AAV, частично основанный на работе Вайнманна и его коллег²⁴. Наконец, приводится описание генерации библиотек AAV со штрих-кодом и конвейера NGS, используемых в той же публикации.

Protocol

1. Подготовка библиотеки случайных 7-мерных пептидных дисплеев AAV2

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения библиотеки дисплея случайных пептидов AAV2 синтезируйте вырожденные олигонуклеотиды в виде одноцепочечной ДНК, преобразуйте ее в двухцепочечную ДНК, расщепляйте, связывайте с акцепторной плазмидой и электропорат.

1. Конструирование вырожденных олигонуклеотидов
   1. Упорядочивайте вырожденные олигонуклеотиды и избегайте смещения кодонов. В олигонуклеотиде 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 соответствует 20 кодонам, каждый из которых кодирует одну из 20 аминокислот. W может быть A или T, продуцируя кодоны AGA или AGT, которые кодируют аминокислоты аргинин (R) или серин (S).
   2. Закажите праймер усиления: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (подробнее см. Рисунок 1 ). При этом образуется следующая белковая вставка: R / S G_{X 7}. Теоретическое разнообразие рассчитывается следующим образом: 1 х 2 х 20⁷ = 2,56 х 10⁹ уникальных вариантов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что это разнообразие может быть ограничено эффективностью трансформации.
2. Синтез второй цепи
   1. Ресуспендируют оба олигонуклеотида (вырожденные олигонуклеотиды и праймер амплификации) до конечной концентрации 100 мкМ с буфером TE.
      1. Для реакции ПЦР установите реакцию 50 мкл с 1 мкл каждого праймера, 10 мкл буфера, 1,5 мкл ДМСО, 0,5 мкл dNTP (10 мМ), 0,5 мкл высокоточной полимеразы горячего старта II и 35,5 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
      2. Перенесите реакцию в термоциклер и запустите стадию предварительной инкубации в течение 10 с при 98 °C, затем три цикла по 10 с при 98 °C, 30 с при 59 °C и 10 с при 72 °C, затем 5 мин при 72 °C и заключительную стадию охлаждения.
   2. Очистите реакцию с помощью набора для удаления нуклеотидов и разбавьте 100 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
   3. Подтвердите эффективность синтеза второй цепи анализом на биоанализаторе (см. рис. 2). Проанализируйте размер и чистоту двухцепочечной вставки, загрузив 1 мкл реакции в микрофлюидный чип из набора реагентов DNA 1000 в соответствии с инструкциями производителя. Этот набор оптимизирован для измерения размера и концентрации двухцепочечных фрагментов ДНК в диапазоне от 25 до 1000 бит в секунду.
3. Расщепление вставки и плазмидного вектора
   1. Расщепите 85 мкл очищенной вставки с 10 мкл 10-кратного буфера и 5 мкл фермента BglI в конечном реакционном объеме 100 мкл (подробнее см. Рисунок 1 ). Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи. Очистите с помощью набора для удаления нуклеотидов, растворите в 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и количественно определите с помощью типа «олиго-ДНК» в спектрофотометре.
   2. Расщепите 10 мкг репликационно-компетентной плазмиды AAV (pRep2Cap2_PIS)²⁶ (вирусный геном с фланкированным ITR) с 20 мкл 10-кратного буфера и 10 мкл фермента SfiI в конечном реакционном объеме 200 мкл (подробнее см. Рисунок 1 ). Инкубировать при температуре 50 °C в течение ночи. Очистите вектор на 1% агарозном геле с помощью набора для экстракции геля с последующим дополнительным этапом очистки с использованием набора для очистки ДНК. Количественно определите концентрацию в спектрофотометре.
4. Перевязка вставки в вектор
   1. Лигат 955 нг плазмидного вектора с 45 нг вставки с 2 мкл буфера и 2 мкл лигазы в реакции лигирования 20 мкл. Инкубировать при 16 ° C в течение ночи, а затем 10 минут при 70 ° C для инактивации лигазы при нагревании.
5. Преобразование, расчет сложности и подготовка библиотеки плазмид
   1. Очистите реакцию с помощью набора для очистки ДНК, следуя инструкциям производителя. Растворяют реакцию примерно в 80% исходного объема безнуклеазной воды и хранят на льду для последующего превращения.
   2. Трансформация электрокомпетентных ячеек: разморозьте один флакон электрокомпетентных ячеек на льду в течение 10 минут. Затем добавьте 1-2 мкл очищенной реакции лигирования в 30 мкл (один флакон) электрокомпетентных клеток и перемешайте, осторожно постукивая. Затем осторожно нанесите смесь клеток/ДНК пипеткой в предварительно охлажденную кювету для электропорации с зазором 1 мм без введения пузырьков воздуха.
   3. Электропорация с использованием следующих настроек: 1800 В, 600 Ω и 10 мкФ. В течение 10 с после импульса электропорации добавьте в кювету 970 мкл предварительно нагретой восстановительной среды (поставляемой с электрокомпетентными ячейками) и перемешайте пипеткой. Наконец, перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку и инкубируйте в течение 1 ч при 37 ° C при 250 об/мин. Чтобы добиться желаемого разнообразия, выполните 10-100 реакций, а после инкубации объедините все реакции в одну пробирку.
   4. Рассчитайте разнообразие, разбавив 10 мкл объединенных превращений в 10, 100 или 1000 раз в PBS и распределив 100 мкл на пластинах с питательным агаром, содержащих соответствующий антибиотик (75 мг/мл ампициллина). Инкубируйте агаровые пластины в течение ночи при 37 ° C, а затем подсчитайте колонии на агаровых пластинах.
   5. Рассчитайте теоретическое разнообразие следующим образом:
      Теоретическое максимальное разнообразие = 10 х коэффициент разбавления х количество колоний х число реакций электропорации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить качество библиотеки, секвенируйте не менее 20 колоний с помощью секвенирования Сэнгера. Большинство клонов должны содержать вставку, и все они должны быть уникальными.
   6. Инокулируют 400-1000 мл среды LB, содержащей соответствующий антибиотик, с остальными объединенными превращениями и инкубируют в течение ночи при 37 ° C, 180 об/мин.
6. Подготовка плазмидной библиотеки
   1. Из ночной культуры приготовьте глицериновый бульон (смешайте равные объемы бактериальной культуры и 50% раствора глицерина в воде без нуклеаз и заморозьте при -80 ° C) и очистите библиотеку плазмид с помощью набора плазмид макси.
7. Производство вирусной библиотеки AAV
   1. Подготовьте вирусную библиотеку, как описано^{ранее 27}. Трансфицируйте плазмидную библиотеку (pRep2Cap2_PI, пептидную вставку) вместе с аденохелперной плазмидой в клетки HEK293T с помощью трансфекционного реагента, такого как полиэтиленимин (PEI).
   2. Соберите клетки через 3 дня и подвергните их трем циклам замораживания-оттаивания. Очистите вирусный лизат с помощью ультрацентрифугирования с градиентом хлорида цезия с последующим буферным обменом на PBS и, наконец, сконцентрируйте вирусные частицы.
8. Векторное титрование AAV с использованием dd-PCR
   1. Последовательно разбавляют 2 мкл векторного запаса AAV в 198 мкл воды, не содержащей нуклеаз, для получения окончательного разбавления 1:10⁶ . Каждый раз тщательно перемешивайте с помощью пипетки объемом 200 мкл. Добавьте один элемент управления без шаблона (NTC) в качестве отрицательного элемента управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть проанализированы дополнительные более низкие или более высокие разведения (1:10^5-1:10⁷).
   2. Приготовьте 20-кратную смесь грунтовки и зонда. Добавьте по 3,6 мкл каждого из 100 мкМ праймеров (прямой и обратный, Rep2 и ITR), по 1 мкл каждого из 100 мкМ зондов dd-PCR (Rep2 и ITR) и 3,6 мкл безнуклеазной воды в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека AAV измеряется с использованием набора праймер-зондов, нацеленных на трансгены (Rep2), обнаруженного с помощью зонда, меченного FAM, и набора праймер-зондов, нацеленного на ITR, обнаруженного с помощью зонда, меченного HEX.
   3. Приготовьте реакцию ПЦР 22 мкл, добавив 5,5 мкл образца, 1,1 мкл 20-кратной смеси праймер-зонд, 11 мкл суперсмеси dd-PCR для зондов (без dUTP) и 4,4 мкл воды, не содержащей нуклеаз. Это дает концентрации 900 нМ и 250 нМ для праймеров и зонда соответственно.
   4. Сгенерируйте капли с помощью генератора капель, перенесите реакцию на 96-луночную пластину, поместите пластину в термоциклер и запустите стадию денатурации в течение 10 минут при 94 ° C, а затем 40 циклов по 30 с при 94 ° C и 1 минуту при 58 ° C. Затем термоинактивируйте полимеразу в течение 10 мин при 98 ° C и добавьте последнюю стадию охлаждения. Прочтите реакции в считывателе капель и приступайте к анализу²⁸.
   5. Откройте сохраненный файл планшета dd-PCR с помощью программного обеспечения для анализа. Используйте инструмент «Порог» на вкладке «Амплитуда 1D» (амплитуда флуоресценции в зависимости от номера события), чтобы разделить отрицательные и положительные капли для каждого канала, используя NTC в качестве ориентира, и экспортируйте данные в CSV-файл.
   6. Чтобы рассчитать векторную концентрацию, сначала рассчитайте поправочный коэффициент CF по формуле:
      
      CF определяет долю капель, положительных для трансгена [Positives], которые являются положительными как для трансгена, так и для ITR [Ch1+ Ch2⁺], чтобы обеспечить обнаружение функциональных векторных частиц. Конечная векторная концентрация c теперь может быть рассчитана с помощью следующего уравнения:
      
      DF - коэффициент разбавления (1:10^5-1:10⁷ , как определено ранее). Количество копий на реакцию 20 мкл соответствует 5 мкл разбавленного образца. Фактор 1,000 корректирует шкалу до VG / мл (вирусный геном / мл). Примерный результат титрования показан в таблице 1 и на рисунке 3.
9. Анализ вирусной библиотеки AAV методом NGS
   1. Амплифицируйте фрагмент вставки 96-нуклеотидного пептида, настроив ПЦР-реакцию 20 мкл с использованием набора полимеразы для корректуры (2x; см. рис. 4). Добавьте в реакцию 1 мкл запаса AAV, содержащего 1 x 10⁸ мкг, по 0,5 мкл каждого из 100 мкМ праймера (NGS_forward и NGS_reverse) и 10 мкл смеси ферментов. Отрегулируйте конечный объем до 20 мкл с водой, не содержащей нуклеаз.
   2. Перенесите реакцию в термоциклер и запустите стадию денатурации в течение 3 мин при 98 °C, затем 30-35 циклов по 10 с при 98 °C, 10 с при 59 °C и 20 с при 72 °C, затем 5 мин при 72 °C и заключительную стадию охлаждения.
   3. Очистите образцы с помощью набора для очистки ПЦР. Количественно определите концентрацию в спектрофотометре и запустите 3% агарозный гель для проверки чистоты и размера фрагмента.
   4. Обработайте фрагменты ПЦР с помощью библиотечной системы для набора образцов низкой сложности в соответствии с инструкциями производителя по подготовке библиотеки NGS. Проведите реакцию репарации конца с 30 нг фрагмента ПЦР с последующим лигированием адаптера и амплификацией ПЦР в течение 10 циклов. Используйте набор для очистки ПЦР для очистки реакций.
   5. Обработайте конечные продукты на биоанализаторе, чтобы проверить размер и чистоту, используя набор реагентов ДНК в соответствии с инструкциями производителя.
   6. Количественно оцените ампликоны с помощью флуорометра и объедините их. Снова количественно оцените окончательную объединенную библиотеку NGS на флуорометре (в соответствии с инструкциями производителя) и проверьте качество на биоанализаторе.
   7. Секвенируйте библиотеки NGS в одностороннем (SE) режиме, используя 75-тактный комплект с высокой производительностью, с длиной чтения 84 и индексом 1 из 8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование примеров в этой статье было выполнено на установке GeneCore EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
   8. Анализируйте данные секвенирования NGS с помощью Python 3 и biopython. Файлы можно найти по адресу https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (в качестве альтернативы по адресу https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). Анализ NGS состоит из двух этапов.
      1. На первом шаге выполните поиск в файлах последовательностей последовательностей, удовлетворяющих определенным критериям (наличие последовательностей распознавания, расположенных по бокам от места вставки) (см. рис. 4, этап 1.9.8.5.). Это делается с помощью скрипта (Script#1) и файла конфигурации, который предоставляет необходимую информацию. После того, как правильная последовательность определена, программа извлекает и сохраняет последовательность в выходном файле, который представляет собой текстовый файл с тем же именем, что и файл виртуализации.
      2. Вторым шагом является анализ выходных файлов. Последовательности в библиотеке начинаются с любого из шести нуклеотидов (AGWggc, W = A / T) в девяти аминокислотных вставках. На основе этой стартовой последовательности транслируется пептид. При этом генерируются выходные файлы, содержащие варианты пептидов (PV).
      3. Подготовьте две папки: «Сценарий» и «Данные». Скопируйте сжатые gzip-файлы, полученные в результате виртуализации, в папку Data. В папку Script скопируйте следующие файлы, файл Python: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Файл Python: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Конфигурационный файл: Barcode_Script_JoVE.conf; и файл таблицы подстановки (LUT): Zuordnung.txt.
      4. Перед запуском сценариев отредактируйте следующие файлы в папке «Сценарий». Откройте файл «Zuordnung.txt» и добавьте в два столбца, разделенных табуляцией, имена файлов gzip (столбец 1) и желаемое конечное имя (столбец 2; значения, разделенные табуляцией).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры текстовых файлов находятся в папке GitHub "PV_analysis_script". Файлы, предоставленные в папке GitHub, подготовлены для анализа трех примеров данных из приведенной выше библиотеки: xaa.txt.gz, xab.txt.gz и xac.txt.gz. Выходные файлы также предоставляются.
      5. Измените следующие переменные в конфигурационном файле "Barcode_Script_JoVE.conf":
         my_dir = "~/Данные/"
         filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
         Переменные, зависящие от последовательности: BCV_size = 27,_{BCV слева} = TCCAGGGCCAG, BCV_справа = GCCCAGG, BCV_loc = 30,_маржа BCV = 8, BCV_{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC и BCV_{loc_revcomp} = 41 (подробнее см. Рисунок 4 ).
      6. Используйте следующую команду для вызова обнаружения и извлечения последовательности вариантов:
         >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
         ПРИМЕЧАНИЕ: На выходе получаются текстовые файлы с извлеченными последовательностями ДНК и их количеством прочтений. Заголовок этого файла содержит статистические данные (т.е. общее количество прочтений и извлеченных чтений). Эти данные переносятся в следующие файлы. Эти текстовые данные являются входными файлами для Script#2, в которых последовательности ДНК переводятся, ранжируются и анализируются.
      7. Выполните извлечение и анализ PV с помощью следующей команды:
         >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Проанализируйте текстовые выходные файлы Script#2. Выходные файлы Script#2 именуются с использованием второго столбца LUT в "Zuordnung.txt" с расширениями, основанными на типе анализа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что три выходных файла содержат статистические данные в первых строках («# допустимых считываний PV», «# недопустимых считываний PV» и «# уникальных считываний PV»), первом столбце с индексом каждой последовательности ДНК из входных текстовых файлов (вывод сценария # 1) и следующих столбцах: (1) «... analyzed_all.csv": "Образец:" (последовательность ДНК), "#" (количество считываний), "Frw или Rev" (прямое или обратное считывание) и "PVs" (переведенная пептидная последовательность). Недопустимые последовательности имеют «NA» и «недопустимо» в последних двух столбцах. (2) "... analyzed_validSeq.csv": то же, что и предыдущий файл, отфильтрованный по допустимым последовательностям. (3) "... analyzed_PV.csv": "PVs" (переведенная пептидная последовательность), "#" (количество прочтений) и "count" (счетчики frw и rev в предыдущих файлах объединяются, и количество дается 1 или 2).
      9. Визуализируйте выходные файлы с помощью доступного программного обеспечения в зависимости от потребностей пользователя.

2. Случайный выбор библиотеки 7-мерных пептидных дисплеев AAV2

1. Используйте библиотеку AAV после количественной оценки и контроля качества (раздел 1) для направленной эволюции в выбранной модели для итеративного отбора кандидатов с желаемыми свойствами (см. рис. 5)^16,18,21.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти кандидаты затем используются для создания библиотеки штрих-кодов, как описано ниже в разделе 3.

3. Подготовка и анализ библиотеки капсидов AAV со штрих-кодом

ПРИМЕЧАНИЕ: После идентификации набора потенциально специфических и эффективных капсидов AAV на экране пептидного дисплея проверьте функциональность идентифицированных пептидных последовательностей и сравните их с набором широко используемых или хорошо описанных эталонных вариантов капсида AAV. Для этого последовательность капсидов вставляется во вспомогательную конструкцию Rep/Cap без РМЭ.

1. Изготовление библиотеки AAV со штрих-кодом
   1. Продуцируют рекомбинантный AAV для каждого варианта капсида с использованием трехплазмидной системы, как описано ранее²⁴.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы различать различные варианты капсида, репортерная трансгенная плазмида, окруженная ITR, содержит уникальный штрих-код длиной 15 нуклеотидов. Штрих-код расположен в 3' UTR (нетранслируемой области) между усиленным желтым флуоресцентным белком (EYFP) и сигналом polyA (см. рис. 6A). Экспрессия EYFP обусловлена сильным вездесущим промотором цитомегаловируса (ЦМВ), который обеспечивает достаточный уровень транскриптов РНК.
   2. Дизайн штрих-кодов длиной 15 нуклеотидов с гомополимерами менее трех нуклеотидов, содержанием GC <65%²⁹ и расстоянием Хэмминга более четырех нуклеотидов²⁴.
   3. Производят каждый капсид отдельно в сочетании с трансгенной плазмидой, несущей уникальный штрих-код. Таким образом, каждый вариант капсида помечается отдельным штрих-кодом, который позволяет отслеживать его (см. рис. 6B).
2. Векторное титрование AAV с использованием dd-PCR
   1. Выполните титрование AAV, как описано ранее в разделе 1.8, заменив пару праймеров Rep2 парой праймеров YFP.
   2. Количественно оцените отдельные производства AAV и объедините равные количества каждого производства для создания окончательной библиотеки штрих-кодов.
   3. Еще раз количественно оцените окончательную библиотеку, чтобы проверить конечную концентрацию и качество (см. рис. 7).
3. Библиотека AAV со штрих-кодом в приложении vivo
   1. Системно примените библиотеку AAV со штрих-кодом к выбранной модельной системе (например, системно у мышей²⁴).
   2. Соберите ткани-мишени (например, печень, легкие, сердце, диафрагма, гладкие мышцы, двенадцатиперстная кишка, поджелудочная железа, толстая кишка, бицепсы, яичники, желудок, внутреннее ухо, почки, брюшная аорта, грудная аорта, мозг, бурый и белый жир и селезенка) или типы клеток на основе эксперимента. Заморозьте их при -80 °C, извлеките ДНК/РНК и примените количественный анализ NGS, как описано в следующем разделе.
4. Экстракция ДНК/РНК
   1. Извлеките ДНК и РНК из интересующих тканей с помощью мини-набора ДНК/РНК.
   2. Поместите небольшой кусочек интересующей ткани (1 мм³, около 5 мг) в реакционную пробирку объемом 2 мл.
   3. Добавьте в ткань 350 мкл лизисного буфера, смешанного с β-меркаптоэтанолом (1%) и стальными шариками толщиной 5 мм (обрабатывайте образцы с β-меркаптоэтанолом под вытяжным шкафом).
   4. Гомогенизируйте ткань в салфеткеLyser в течение 45 с при 40 Гц.
   5. Добавьте 10 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируйте в течение 15 мин при 55 ° C, встряхивая при 400 об/мин.
   6. Центрифугу при 20 000 x g в течение 3 мин при комнатной температуре, соберите надосадочную жидкость и следуйте протоколу производителя набора ДНК/РНК.
   7. Разделите этап стирки на два этапа с 350 мкл буфера для стирки на каждом этапе. В промежутках между этими этапами промывки расщепляют остаточную ДНК на колонке с помощью ДНКазы I, не содержащей РНКазы. Добавьте 80 мкл раствора ДНКазы I, приготовленного в соответствии с инструкцией производителя, в колонку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин.
   8. Элютировать РНК/ДНК из колонки с безнуклеазной водой. Храните выделенную РНК при -80 ° C, а гДНК - при -20 ° C.
5. Синтез кДНК
   1. Подвергните образцы РНК еще одному раунду обработки ДНКазой I в течение 15-30 минут (для полного удаления загрязняющей ДНК из образцов РНК) перед реакцией обратной транскрипции. Добавьте 1 мкл раствора ДНКазы I, 4 мкл буфера (входит в комплект) и воду без нуклеаз в конечный объем 40 мкл на 212 нг РНК. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре и инактивировать при температуре 70 °C в течение 10 минут.
   2. Синтезируйте кДНК, используя 150 нг РНК с помощью набора в соответствии с инструкциями производителя. Включите контрольную группу без обратной транскриптазы, чтобы убедиться в отсутствии загрязняющей вирусной ДНК в образце. КДНК хранится при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество входной РНК для оптимальной обратной транскрипции может варьироваться в зависимости от типа ткани и ожидаемой эффективности трансдукции в соответствующей ткани.
6. Анализ вирусной библиотеки AAV (in-vivo) от NGS
   1. Чтобы достичь высокой глубины секвенирования при низких затратах, выполните NGS с помощью секвенирования Illumina, как описано ранее (раздел 1.9). Усильте последовательность штрих-кода, а затем соедините адаптеры последовательности с ампликоном.
   2. Из-за короткой длины считывания и лигирования адаптеров секвенирования с обеих сторон ампликона при проектировании убедитесь, что ампликон достаточно мал, чтобы обеспечить наличие последовательности штрих-кода в считывании NGS. Для секвенирования штрих-кодов в вирусных геномах и вирусных транскриптов ампликон ПЦР рассчитан на длину 113.н. (см. рис. 8).
   3. Усильте область штрих-кода с помощью праймеров BC-seq вперед и BC-seq назад. Приготовьте следующую реакцию ПЦР: 0,5 мкл ДНК-полимеразы высокой точности, 10 мкл 5-кратного буфера, 0,25 мкл каждого 100 мкМ праймера (BC-seq fw/BC-seq rv) и 1 мкл 10 мМ dNTP. Используйте 25 нг кДНК или ДНК/реакции в качестве матрицы и отрегулируйте конечный объем до 50 мкл с водой, не содержащей нуклеаз.
   4. Приготовьте мастер-микс для ПЦР под чистым колпаком для ПЦР, чтобы избежать заражения. Используйте следующие условия циклирования: 30 с при 98 °C, затем 40 циклов при 98 °C в течение 10 с и 72 °C в течение 20 с и заключительный 5-минутный шаг при 72 °C.
   5. Включите ПЦР-контроль, чтобы подтвердить отсутствие загрязняющей ДНК в мастер-миксе ПЦР. Для образцов кДНК включите контрольную группу без обратной транскриптазы. Наконец, включите пример с входной библиотекой AAV. Эта информация будет использована для создания файла Normalization_Variant.txt, используемого в анализе.
   6. Проверьте размер ПЦР-фрагмента каждого образца с помощью гель-электрофореза перед очисткой ПЦР. Последнее достигается за счет использования либо коммерчески доступных магнитных шариков, либо систем очистки ДНК на основе колонок (см. Таблицу материалов).
   7. Подготовьте библиотеку NGS с помощью библиотечной системы для образцов низкой сложности в соответствии с инструкциями производителя, как описано ранее в разделе 1.9.
   8. Определите концентрацию ДНК с помощью набора dsDNA HS и проанализируйте качество библиотеки, как описано ранее (раздел 1.9.6), с последующим объединением. Количественно оцените объединенную библиотеку на флуорометре и оцените качество на биоанализаторе.
   9. Выполните секвенирование NGS, как описано в разделе 1.9.7.
   10. Количественно определите с помощью кПЦР количество копий трансгена (вирусных геномов) и гена, чтобы оценить распределение объединенной библиотеки между тканями или органами на ДНК.
   11. Настройте реакцию 30 мкл кПЦР следующим образом, чтобы определить число копий EYFP (трансген) и GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ген домашнего хозяйства):
       1. Приготовьте 60-кратную смесь праймера и зонда для EYFP (1,5 мкМ YFP_fw, 1,5 мкМ YFP_rv и 0,6 мкМ YFP_probe; см. Таблицу материалов). Используйте смесь праймера и зонда GAPDH (см. Таблицу материалов), чтобы определить число копий гена домработницы. Настройте реакцию на льду.
       2. Приготовьте мастер-смесь для ПЦР (15 мкл, см. Таблицу материалов) и добавьте 60-кратную смесь праймера/зонда (0,5 мкл) для всех образцов и стандартов (чтобы рассчитать количество копий стандартов, воспользуйтесь следующей ссылкой: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Настройте реакцию на льду.
       3. Перенесите 15,5 мкл мастер-смеси в 96-луночную пластину и добавьте 14,5 мкл образца (75 нг общей концентрации ДНК) или стандарта в соответствующую лунку. Запечатайте 96-луночную пластину фольгой, вихревом и ненадолго открутите.
       4. Перенесите 10 мкл каждого образца в 384-луночную пластину в двух экземплярах. Запечатайте пластину фольгой и отжимайте при 800 x g в течение 5 минут при 4 °C.
       5. Инкубируют реакционную смесь в термоциклере, используя начальную температуру 50 °C в течение 2 мин, после чего следует начальная стадия активации 10 мин при 95 °C. Выполните 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 15 с и отжига/удлинения при 60 °C в течение 1 мин²⁴.
       6. Чтобы получить количество диплоидных геномов (dg), используйте число копий GAPDH и разделите на два. Затем возьмите значение числа копий EYFP и разделите на количество dg, в результате чего получится векторные геномы на диплоидный геном (vg/dg). Используйте это значение для создания файла Normalization_Organ.txt для биоинформатического анализа.
   12. Выполните анализ данных секвенирования NGS, как Weinmann et al.²⁴, используя пользовательский код в Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Рабочий процесс включает в себя обнаружение последовательностей штрих-кодов с учетом фланкирующих последовательностей, их длины и местоположения (Script#1_BarcodeDetection.py), а также анализ обогащения и распределения штрих-кода по набору тканей (Script#2_BarcodeAnalysis.py).
       1. Обнаружение штрих-кодов и их отнесение к вариантам AAV. Поместите данные виртуализации в виде архивных файлов fastq в один каталог (например, «Data_to_analyze»). Файл данных виртуализации для входной библиотеки включен в этот каталог и используется только для вычисления пропорций капсида во входной библиотеке.
       2. Перед выполнением сценария создайте два текстовых файла с разделителями-табуляциями: файл вариантов капсида (см. пример файла «Варианты.txt») с последовательностями штрих-кодов, назначенными именам вариантов капсида AAV, и файл загрязнения (см. «Загрязнения.txt») с последовательностями штрих-кодов, которые происходят от возможного загрязнения (другие штрих-коды, доступные в лаборатории, способствуют загрязнению).
       3. Наконец, отредактируйте конфигурационный файл "Barcode_Script.conf", включив в него следующую информацию: путь к папке с данными секвенирования (например, "Data_to_analyze"), последовательность фланкирующих областей штрих-кодов, их положение и размер окна для обнаружения штрих-кода (аналогично 1.9.8.5, см. рисунок 8).
       4. Используйте следующую команду для вызова обнаружения штрих-кода с предоставленными путями к Script#1_BarcodeDetection.py и файлам конфигурации:
          >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
          ПРИМЕЧАНИЕ: Результатом выполнения Script#1_BarcodeDetection.py являются текстовые файлы с количеством прочтений для каждого варианта капсида, а также общим количеством прочтений, восстановленных из необработанных данных.
       5. Оцените распределение капсидов AAV со штрих-кодом между тканями или органами, выполнив Script#2_BarcodeAnalysis.py вместе со следующими текстовыми файлами:
          1. В файле «Zuordnung.txt» присвойте имя каждому текстовому файлу, полученному в результате обнаружения штрих-кода, имени ткани/органа: имена текстовых файлов в первом столбце и соответствующие названия тканей/органов в назначении с разделителями-табуляциями.
             ПРИМЕЧАНИЕ: Для примера проверьте папку «Пример» (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Следует отметить, что название ткани/органа может включать символы, определяющие измерение кДНК или гДНК и число биологической репликации (M1, M2 и т. Д.).
          2. Создайте текстовый файл "organs.txt" со списком названий органов-мишеней ON- и OFF, которые соответствуют именам, приведенным в файле задания "Zuordnung.txt" (см. папку "Example": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Создавайте текстовые файлы с разделителями-табуляциями «Normalization_Organ.txt» и «Normalization_Variant.txt» с нормализованными значениями для всех вариантов капсида и всех органов/тканей. В первом столбце файла «Normalization_Organ.txt» напишите имена, данные для каждого органа (как в файле присвоения «Zuordnung.txt»), а во втором столбце значения нормализации для соответствующих тканей, сгенерированные в разделе 3.6.11.
          4. Заполните первый столбец файла «Normalization_Variant.txt» списком имен капсидов, а второй столбец — нормализованными значениями количества прочитанных операций для каждого капсида в библиотеке в пуле (нормализация может быть рассчитана на основе выходного файла txt для входной библиотеки, полученного в результате первого скрипта).
          5. Отредактируйте конфигурационный файл, указав полные пути ко всем дополнительным файлам, упомянутым выше. Выполните Script#2_BarcodeAnalysis.py как:
             >python3 /script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
             ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарий анализа штрих-кода выводит несколько файлов: текстовые файлы со значениями относительной концентрации (RC) распределения капсида в различных тканях на основе нескольких этапов нормализации, описанных ранее, и файл электронной таблицы, который объединяет данные текстового файла в объединенные матричные данные. Последние могут быть использованы для кластерного анализа и визуализации.
          6. Визуализируйте данные и выполняйте кластерный анализ матричных данных, чтобы различать свойства капсида и оценивать их сходство на основе RC-профилей в тканях. Используйте дополнительный скрипт PCA_heatmap_plot. R размещен в репозитории:
             >Rscript --vanilla ~/PCA. R ~/относительная концентрация.xls
             ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарий принимает файлы относительной концентрации .xls в качестве входных данных и генерирует два графика иерархической тепловой карты кластера и анализа главных компонент (PCA).
          7. Чтобы изменить графики (оси тепловой карты, основные компоненты PCA) или параметры png (цвет, размер, маркировка), откройте скрипт R и следуйте инструкциям, приведенным в закомментированных разделах.

Representative Results

Генерация библиотеки пептидных дисплеев AAV2. В качестве первого шага к выбору инженерных AAV описана генерация плазмидной библиотеки. Пептидная вставка производится с использованием вырожденных праймеров. Сокращение комбинации кодонов у лиц от 64 до 20 имеет преимущества в устранении стоп-кодонов и облегчении анализа NGS за счет уменьшения разнообразия библиотек на уровне ДНК, но не на уровне белка. Олигонуклеотидная вставка приобретается в виде одноцепочечной ДНК (рис. 1), которая преобразуется в двухцепочечную ДНК с помощью реакции ПЦР. Качество этой реакции контролируется в биоанализаторе. Как показано на рисунке 2, три цикла дали более сильную полосу по сравнению с 10 или 30 циклами. Затем вставка расщепляется BglI для образования трехнуклеотидных выступов. Нуклеотид рядом с последовательностью выступа двухцепочечной вставки может быть A или T (W — код неоднозначности для A или T), который находится в третьей позиции кодона, кодирующего аргинин (R) или серин (S). Вектор (pRep2Cap2_PIS) имеет мутацию сдвига рамки в сайте вставки пептида, которая предотвращает образование капсида в отсутствие вставки из-за создания стоп-кодона вскоре после сайта вставки. При расщеплении этой плазмиды SfiI образуются трехнуклеотидные выступы, которые соответствуют выступам, образующимся в пептидно-кодирующей олигонуклеотидной вставке. Лигирование необходимо выполнять в оптимальных условиях, чтобы максимизировать сложность плазмидной библиотеки. С этой целью для трансформации проводили электропорацию с использованием коммерчески доступных бактерий с высокой эффективностью.

Разнообразие плазмидной библиотеки рассчитывается на основе количества колоний, которое обычно составляет около 1 x 10⁸ для этого типа библиотеки. Общее количество колоний соответствует максимальному потенциальному разнообразию библиотеки при NGS-анализе, о чем будет сказано ниже. Затем плазмидная библиотека используется для создания библиотеки AAV, которая подробно описана не здесь, а в другом месте²⁷.

Количественная оценка этой библиотеки проводилась с помощью dd-PCR. Как правило, количественно определяются две области: репсовый ген AAV2 в вирусном геноме и ITR (см. рис. 3 и таблицу 1). Как показано в таблице 1, из капель, положительных для вирусного генома, 99,2% также положительны на ITR (Ch1+ Ch2⁺), что является контролем качества для библиотеки AAV и предполагает, что капсиды AAV содержат полные вирусные геномы. Для получения концентрации в vg/мл рассчитывается соотношение двойных положительных капель к положительным и используется для получения правильного количества копий перед амплификацией по коэффициенту разведения.

Затем качество библиотеки AAV оценивается с помощью анализа NGS, начиная с ПЦР с использованием соответствующих праймеров. Затем продукт ПЦР обрабатывается с использованием коммерчески доступного набора, который добавляет к продукту ПЦР адаптеры, содержащие индексы. Продукты NGS секвенируются, а файлы анализируются с помощью Python. Предоставляются данные трех образцов из библиотеки пептидных дисплеев AAV2. Каждая последовательность во входном файле Script#1 (список последовательностей всех ПЦР-копий амплифицированного сегмента ДНК в образце) подвергается биоинформационному поиску_левых и_правых последовательностей BCV или последовательностей_{BCV left_comp} и BCV_{right_comp} . Если определена какая-либо комбинация, содержащаяся в ней последовательность извлекается и добавляется в выходной файл (см. рис. 4). Выходные данные обоих скриптов предоставляют статистические данные о подготовке библиотеки NGS. Во всех трех наборах извлеченные чтения, основанные на последовательностях сигнатур, характерных для библиотеки, составляли около 94% от общего числа чтений, что говорит о хорошем качестве. Выходные данные Script#2 предоставляют дополнительные статистические данные, а трансляция извлеченной последовательности ДНК дает дополнительные данные контроля качества. «# недействительных считываний PV» (т. е. последовательностей, в которых отсутствуют шесть нуклеотидов, используемых для инициации трансляции in silico и кодирования остатков RG или SG) составляет менее 1% восстановленных считываний, что подтверждает хорошее качество секвенирования. Результаты второго сценария (т.е. трансляция и ранжирование экстрагированных последовательностей ДНК) предоставляют дополнительную информацию, такую как количество считываний на вариант пептида или количество последовательностей ДНК, дающих начало каждому варианту пептида. Из файлов те, которые заканчиваются на «analyzed_PVs», содержат только действительные чтения ДНК, и анализ выполняется на уровне пептидных последовательностей. Из допустимых чтений более 99% являются уникальными, что говорит о сбалансированности библиотеки, а о высоком внутреннем разнообразии.

Выбор библиотеки пептидных дисплеев AAV2. Затем эту библиотеку можно использовать для отбора in vivo или in vitro . Это не включено в этот протокол, но схема представлена на рисунке 5. Вкратце, для отбора in vivo ткани собирают через 1 неделю после системной инъекции 1 x 10¹² мкг / мышь и выделяют ДНК. Проводится спасательная ПЦР на более крупном фрагменте гена cap , и продукт клонируется в плазмидный вектор с использованием различных сайтов рестрикции, но по протоколу, аналогичному описанному здесь, и готовятся библиотеки AAV раунда 1. Для анализа NGS ПЦР проводится на изолированной ДНК или библиотеках AAV. После отбора процент уникальных PV в библиотеке обычно уменьшается в зависимости от давления выбора. В зависимости от проекта, выбор может быть сделан после того, как NGS определит достаточное количество доминирующих фотоэлектрических систем.

Выбор и анализ библиотеки штрих-кодов. Данные из библиотеки AAV со штрих-кодом, содержащей 82 капсида, были описаны ранее²⁴. Количественное определение частиц AAV с помощью dd-PCR (см. рис. 7 и таблицу 1) показывает, что 94% капсидов, положительных для трансгена, также содержат ITR, что указывает на полный геном. Это ниже, чем в библиотеке дикого типа, описанной выше, но все же предполагает хорошее качество для рекомбинантных AAV, учитывая, что они обычно упаковываются менее эффективно. После инъекции объединенной библиотеки животным ткани собирают, выделяют ДНК и РНК. Затем проводят ПЦР для NGS, а также подготовку и секвенирование библиотеки NGS, как описано выше и ранее²⁴. Для расчета vg/dg проводится кПЦР, и в предоставленных выборочных данных значения находятся в диапазоне от 0,1 до 4. Как это типично для системной доставки AAV, печень имеет более 10 вг/дг.

В рамках конвейера анализа этапы нормализации выполняются на разных уровнях. В библиотеке входного пула варианты капсида, как правило, представлены неравномерно. Таким образом, NGS-анализ входной библиотеки используется для создания файла нормализации, который корректирует содержание каждого варианта капсида в конечной ткани/органе на основе содержания этого варианта капсида во входной библиотеке. Биораспределение членов объединенной библиотеки с помощью NGS осуществляется на уровне ДНК и РНК. Эта нормализация для входной библиотеки дает частное (P*αβ) пропорции в ткани/органе (P _αβ) к пропорции во входной библиотеке (L_a). Эти расчеты можно найти в файле «variant_comparison.txt». Затем это частное умножается на значения vg/dg из файла «Normalization_organ.txt», чтобы получить значение Β αβ, и пропорции значений Β_αβ вычисляются для одной ткани или для всех. Доля значения Β αβ для каждого варианта в пределах одной ткани (V_αβ) отражает распространение этого варианта в этой ткани («organ_comparison.txt»). Напротив, доля значения Β αβ для каждого варианта во всех тканях (T_αβ) указывает на распространение этого варианта во всем организме («относительные совпадения.xls»). Эти две пропорции отражают внутри- и межтканевое биораспределение каждого варианта. Все эти файлы могут быть использованы для различных визуализаций эффективности и специфичности капсида²⁴. В качестве примера, используя окончательную таблицу (найденную в разделе «relativeconcetrations.xls»), анализ главных компонент и иерархическая кластеризация представлены на рисунке 9.

Нормализация объединенной библиотеки из секвенирования NGS показывает, что каждый капсид имеет среднюю пропорцию 0,012, что также соответствует теоретической пропорции каждого из 82 капсидов и предполагает хорошо сбалансированную объединенную библиотеку 0,012 (1/82). Файл «относительной концентрации.xls», генерируемый биоинформационным конвейером, отражает биораспределение капсида между тканями, как показано на рисунке 9. Тепловая карта показывает значения относительных концентраций на шкале log2 для каждого капсида объединенной библиотеки, иерархически сгруппированных в соответствии с профилем биораспределения тканей. Анализ главных компонент позволяет выделить кластеры вариантов капсида AAV со сходными свойствами биораспределения, а также выделить отдаленные капсиды с уникальными закономерностями межтканевого биораспределения. Две основные ветви иерархии тепловых карт отражают разницу в эффективности трансдукции вариантов капсида. Левая ветвь с большинством вариантов капсида включает все капсиды, которые показывают высокое значение относительной концентрации в большинстве тканей. Помимо поразительно высокой специфичности печени, три других капсида (Var60, Var13 и Var63) проявляли специфичность в диафрагме (Di), скелетных мышцах (SM), бицепсе (BlC) и в головном мозге (B). Правая ветвь иерархической кластеризации включает капсидные варианты с общей более низкой эффективностью трансдукции, что выражено в двенадцатиперстной кишке (Du) и поджелудочной железе (P). PCA для исходного подмножества образует кластер вариантов капсида с высокой специфичностью печени (Var 64, 78, 65, 55, 56) и очерчивает капсид Var60 с выдающимся мышечным тропизмом.

Рисунок 1: Обзор стратегии клонирования для библиотеки случайных 7-мерных пептидных дисплеев AAV2.
Олигонуклеотид со случайной последовательностью вставки 7-мерного пептида окружен последовательностями, содержащими сайт сбраживания BglI и сайт связывания для реакции амплификации. Векторный pRep2Cap2_PIS содержит сайты SfiI. Выступы, образующиеся при переваривании BglI и SflI, дополняют друг друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Контроль качества биоанализатора синтеза второй цепи олигонуклеотидов.
Двухцепочечный синтез вырожденных олигонуклеотидов подтвержден анализом на биоанализаторе. Сравниваются реакции ПЦР с тремя, 10 и 30 циклами амплификации, показывая, что наиболее эффективными являются три цикла амплификации. (А) Данные биоанализатора представлены в виде гелевого изображения. (Б-Д) Построенные длины фрагментов (по оси bp, x) по сравнению с единицами флуоресценции (ось FU, ось y) по сравнению со стандартными пиками, видимыми при 15 и 1500.н. Красными стрелками обозначены двухцепочечные олигонуклеотиды. Обратите внимание, что самое высокое значение FU, представляющее наибольшую концентрацию ДНК, двухцепочечных олигонуклеотидов наблюдается после трех циклов амплификации (красные стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Титрование библиотеки пептидных дисплеев AAV2 с использованием dd-PCR.
(A) Обнаружение rep2-положительных капель в канале 1 (FAM, канал 1) для нешаблонного контроля воды и разбавленного образца вируса 1:10⁶ . (B) Обнаружение ITR-положительных капель в канале 2 (HEX, канал 2). (C) Обнаружение капель, которые являются положительными как для rep2, так и для ITR (выделены оранжевым цветом). Фиолетовые линии обозначают пороговые значения для обнаружения положительных и отрицательных капель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Обзор фрагмента ДНК, используемого для NGS, и настройки для анализа python.
NGS PCR амплифицирует 96-нуклеотидную область. Фрагмент ПЦР используется для генерации библиотеки NGS. Для биоинформатического анализа необходимо указать последовательности распознавания справа и слева от места вставки для обеих цепей, а также расстояние от начала фрагмента ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Итеративный выбор библиотек AAV in vivo.
Мышам вводят библиотеку AAV. Целевые ткани ON и OFF собирают через 1 неделю и подвергают NGS и анализу. Ткань-мишень ON-используется для спасения гена капсида, который клонируется в родительский вектор. Выбранная библиотека AAV создается и используется для повторения вышеупомянутого цикла выбора. Эта фигура была создана с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Обзор генерации библиотеки AAV со штрих-кодом.
(A) Графическое представление самокомплементарного генома AAV, несущего трансген eyfp, управляемый промотором ЦМВ, в окружении ITR. 3'-UTR содержит штрих-код длиной 15 нуклеотидов (BC), расположенный на 3'-UTR между eyfp и сигналом полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH). BC позволяет отслеживать капсид на уровне ДНК и мРНК. (B) Во время производства AAV уникальный геном со штрих-кодом упаковывается единственным вариантом гена cap , что облегчает идентификацию капсида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Титрование библиотеки AAV со штрих-кодом с использованием dd-PCR.
(A) Обнаружение YFP-положительных капель в канале 1 (FAM, канал 1) для нешаблонного контроля воды и разбавленной векторной пробы 1:10⁶ . (B) Обнаружение ITR-положительных капель в канале 2 (HEX, канал 2). (C) Обнаружение капель, которые являются положительными как для rep2, так и для ITR (выделены оранжевым цветом). Фиолетовые линии обозначают пороговые значения для обнаружения положительных и отрицательных капель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Обзор фрагмента ДНК, используемого для NGS, и настройки для анализа Python.
NGS PCR амплифицирует 113-нуклеотидную область. Для биоинформатического анализа необходимо указать последовательности распознавания справа и слева от штрих-кода для обеих цепей, а также расстояние от начала фрагмента ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Анализ главных компонент (PCA) и иерархический кластерный анализ.
(A) PCA значений относительной концентрации для 82 капсидов во всех тканях позволяет определить кластеры вариантов капсида со сходными свойствами и варианты с уникальными паттернами трансдукции. (B) Чтобы лучше отделить густонаселенный кластер, записи отдаленных уникальных вариантов были исключены из матрицы, и анализ PCA был повторен. (C) Иерархический кластерный анализ позволяет визуально оценить варианты профилей трансдукции в тканях в виде графика тепловой карты (Li = печень, Lu = легкие, FatB = бурый жир, H = сердце, Di = диафрагма, SM = гладкие мышцы, Du = двенадцатиперстная кишка, P = поджелудочная железа, C = толстая кишка, BIC = бицепс, O = яичники, St = желудок, I = внутреннее ухо, K = почка, Aa = брюшная аорта, At = грудная аорта, B = мозг, FatW = белый жир, а S = селезенка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Образец	Цель	Копии/скважина 20 мкл	Срабатываний	Ч1+ Ч2+	КФ	Копии исправлены	ДФ	ВГ/мл
H2O	REP2	28	2	0	0	0	1.00E+06	5.60E+09
AAV2lib	REP2	90600	16396	16266	0.99	89882	1.00E+06	1.80E+13
H2O	YFP	4	3	2	0.67	3	1.00E+06	8.00E+08
BCAAVlib	YFP	34680	13229	12452	0.94	32643	1.00E+06	6.53E+12

Таблица 1: Результаты титрования библиотеки пептидных дисплеев AAV2 («AAV2lib») и векторной библиотеки EYFP со штрих-кодом («BCAAVlib»).

Discussion

В этом протоколе изложены этапы, необходимые для разработки капсида AAV на пептидных дисплеях и для скрининга библиотек AAV со штрих-кодом, а также для биоинформатического анализа состава библиотеки и характеристик капсида. Этот протокол фокусируется на шагах, которые облегчают биоинформатический анализ этих типов библиотек, потому что большинство вирусологических лабораторий отстают в навыках программирования, чтобы соответствовать их мастерству в методах молекулярной биологии. Оба типа библиотек были подробно описаны в литературе, как указано во введении, и могут быть воспроизведены с относительной легкостью.

В качестве первого шага описана конструкция библиотеки пептидных дисплеев в положении 588 в переменной области VIII AAV2. Этот дизайн (AAV2_Peptide(ii) в предыдущей публикации 26) и описанный способ клонирования могут быть легко адаптированы к другим серотипам на основе информации, представленной в недавней публикации²⁶. Критическим шагом в конвейере клонирования является эффективность лигирования/трансформации (с использованием отсечки ~ 1 x 10⁸ колоний). Рекомендуется добавить одну реакцию лигирования только с вектором. Это помогает определить процент бактериальных колоний со вставкой, который должен быть выше 80%. Более низкая, чем ожидалось, эффективность, то есть количество бактериальных колоний (вычисление процента с вставкой) ниже, чем теоретическое разнообразие олигонуклеотидных вставок, отрицательно скажется на вариантах с низкой численностью. Несколько улучшений включают более длительное время переваривания и этапы очистки для реакции переносчика или лигирования с использованием коммерческих наборов.

Следующим этапом является контроль качества библиотеки вариантов с использованием NGS фрагмента ПЦР, охватывающего сайт вставки олигонуклеотидов. NGS выполняется с использованием системы секвенирования Illumina. Существует несколько альтернатив, в которых продукты ПЦР могут быть представлены напрямую без предварительной подготовки библиотеки NGS. Это больше подходит для мелкомасштабных экспериментов или когда не требуется высокая глубина считывания. Протокол, представленный здесь, включает подготовку библиотеки NGS, включая добавление адаптеров с индексами Illumina к продуктам ПЦР с использованием коммерчески доступного набора. Общим ограничением в отношении NGS является то, что эти фрагменты ПЦР имеют низкое разнообразие, поскольку последовательности, обрамляющие сайт вставки с высоким разнообразием, идентичны во всех вариантах, что, в свою очередь, снижает эффективность секвенирования. Чтобы решить эту проблему, этот набор добавляет любое количество от двух до восьми случайных нуклеотидов между фрагментом ПЦР и адаптером. В качестве альтернативы образец должен быть добавлен с помощью PhiX. Подробно описан конвейер Python для анализа библиотек пептидных дисплеев AAV2. В качестве шаблона предоставляются образцы файлов, извлеченных из исходного файла NGS библиотеки пептидных дисплеев AAV2. Это может быть адаптировано к другим серотипам с помощью приведенных инструкций. Выходные файлы этого анализа могут быть использованы в последующем анализе, таком как сравнение плазмиды и библиотеки 30 AAV, аминокислотного состава в каждой позиции³⁰, расчет оценки обогащения между библиотеками после отборочных раундов 14 или генерация логотипов последовательностей или графиков¹⁹. Что касается входной библиотеки, то желательно наличие большого процента уникальных вариантов. Однако некоторые варианты не производят так же хорошо, как другие, что может привести к искаженному распределению после производства. Низкое разнообразие вариантов, или, другими словами, наличие доминантных вариантов, может быть связано с низким качеством вставки олигонуклеотидов или большим числом циклов синтеза второй цепи (этап 1.2). Кроме того, производство может повлиять на состав аминокислот. Каждая аминокислота должна иметь частоту 5,00%. Если распределение сильно отличается от этого значения, предлагается выполнить тот же анализ на плазмидной библиотеке для выявления потенциальных смещений³⁰.

Поскольку протоколы генерации библиотек AAV и последующих раундов отбора на различных моделях животных и in vitro были подробно описаны в многочисленных публикациях и протоколах 27,30,31,32^, здесь описан только анализ библиотек со штрих-кодами выбранных инженерных вариантов и эталонов. Следует отметить, что клонирование библиотеки после каждого раунда отбора может быть выполнено путем выделения ПЦР гена cap, как указано в разделах протокола и результатов. Обширные раунды отбора и ПЦР-амплификации могут привести к накоплению мутаций или стоп-кодонов, которые можно наблюдать с помощью NGS. В качестве альтернативы, обогащенные варианты могут быть выбраны из данных NGS, а олигонуклеотиды упорядочены и клонированы так, как это было описано для генерации библиотеки пептидных дисплеев^16,18. Наконец, протокол содержит краткое описание отбора библиотек на уровне ДНК через 1 неделю после системной инъекции. Отбор на основе РНК является более строгим, поскольку он также отбирает варианты, которые проходят через инфекционные пути проникновения, хотя технически более сложны. Следует отметить, что отбор на основе РНК или трансгенов (т.е. Cre) требует более длительной продолжительности in vivo около 3-4 недель 15,16,17,18,19,33. Особенно для отбора на основе ДНК крайне важно проверить выбранные варианты на соответствие известным природным и сконструированным серотипам как на уровне ДНК, так и на уровне РНК с использованием библиотеки AAV со штрих-кодом.

Вторая часть протокола описывает генерацию и скрининг библиотек AAV со штрих-кодом с использованием ранее разработанного^{конвейера 24}. Каждый капсид AAV в пуле содержит один и тот же трансген (eyfp под контролем промотора ЦМВ) с отчетливым штрих-кодом между eyfp и сигналом polyA. Штрих-коды, используемые в этой библиотеке, можно найти в предыдущей публикации²⁴. Дизайн был основан на основном принципе расстояния Хэмминга (т.е. последовательности штрих-кодов должны быть адекватно разными), чтобы ошибки последовательности не приводили к ошибочному присвоению штрих-кодов. Как описано в Lyons et al²⁶, вероятность возникновения двух ошибок при чтении между 25-100 нуклеотидами очень мала. Расстояние Хэмминга, равное 4, означает, что потребуются две ошибки последовательности, чтобы назначить считывание как неправильный штрих-код. Чтения с одной ошибкой будут игнорироваться при анализе и в этом случае будут отнесены к категории «чтения с неизвестными вариантами». В соответствующей публикации приведены рекомендации и скрипт Python для генерации штрих-кодов²⁹, которые можно использовать в конвейере. Для идентификации полезных штрих-кодов можно использовать еще один популярный код, исправляющий ошибки, как описано в публикации Бушмана и Быстрых³⁴, а именно расстояние Левенштейна. Эта группа также предоставляет программный пакет для языка^{программирования R 35}.

После производства AAV объединенная библиотека AAV со штрих-кодом может быть использована для исследований биораспределения в различных моделях. В этом исследовании описывается конвейер с использованием библиотеки из 82 вариантов из предыдущей публикации²⁴ и приводятся примеры данных для практики. Этот протокол также может быть адаптирован в зависимости от потребностей каждого пользователя. Анализ биораспределения основан на сборе различных тканей или клеток-мишеней ON и OFF, выделении из них ДНК и РНК, ПЦР-амплификации области штрих-кода для секвенирования NGS и измерении vg/dg на уровне ДНК. Для РНК лучше всего рассчитать отношение к числу копий мРНК эталонного гена. Референсный ген выбора должен экспрессироваться одинаково в разных тканях 36, таких как RPP30 (рибонуклеаза P/MRP субъединица P30)³⁷ или Hprt (гипоксантинфосфорибозилтрансфераза 1)³⁶. Однако это трудно, поэтому для нормализации данных РНК может потребоваться одновременное использование нескольких эталонных генов. По этой причине нормализация dg на уровне ДНК может быть завершена, что примерно коррелирует с количеством клеток. Это также указывает на использование кПЦР для этого расчета, как описано ранее²⁴, хотя dd-PCR является более точным и, следовательно, предпочтительным для будущего использования, особенно с учетом прогресса в этой области³⁷. И последнее, но не менее важное: базовая оптимизация молекулярной биологии чрезвычайно важна для описанной здесь методологии. Реакции ПЦР должны быть оптимизированы, чтобы избежать смещения при распределении библиотек. Зонды dd-PCR должны быть спроектированы таким образом, чтобы включать интронные области для ДНК и межэкзонные области для РНК. Надлежащая лабораторная практика, такая как физическое разделение этапов, особенно производство ДНК и AAV из библиотечной подготовки, и надлежащая дезинфекция имеют первостепенное значение для предотвращения ошибочной амплификации и библиотечного загрязнения.

Примечательно, что использование библиотек пептидных дисплеев и векторного штрих-кодирования ДНК / РНК для выбора инженерных капсидов с новыми тропизмами или другими клинически значимыми свойствами представляет собой только два примера направленных технологий эволюции капсида AAV. Всех их объединяет то, что они имеют ограничения и требуют дальнейшей оптимизации для полной реализации своего потенциала. Например, простое введение пептида оставляет большую часть (~ 99%) лежащей в основе последовательности капсида неизменной, свойства которой, включая взаимодействие с нейтрализующими антителами против AAV, возможно, должны быть дополнительно изменены перед применением человеком³⁸. Кроме того, фактическое разнообразие пептидных дисплеев или других библиотек обычно ниже теоретического, например, из-за технических ограничений во время клонирования или бактериальной трансформации³¹. Как правило, также ведутся активные дебаты о трансляционной значимости направленной эволюции на животных или в моделях in vitro , чему способствует растущее количество доказательств возможных видоспецифических или даже штаммоспецифических характеристик синтетических капсидов AAV³⁸. Тем не менее, есть большая надежда на то, что многие или все эти ограничения будут преодолены и что нынешний арсенал технологий будет расширен до еще большего разнообразия моделей заболеваний и станет еще более доступным для большинства исследовательских групп. В этом отношении особенно обнадеживающим недавним событием является использование библиотек AAV со штрих-кодом, подобных тем, о которых сообщается здесь, для проверки выбранных капсидов уже не только на органе, но теперь и на клеточном уровне, что может быть достигнуто с помощью новых технологий, таких как секвенирование одноклеточной (sc) РНК³⁹. Представленные здесь протоколы будут способствовать более широкому внедрению методов эволюции AAV и, таким образом, ускорят разработку новых капсидов, адаптированных к потребностям множества исследовательских групп и пациентов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification primer	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	80204	DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	NGS Library preparation
BC-seq fw:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	ATCACTCTCGGCATGGACGAGC	NGS Library preparation
BC-seq rv:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	GGCTGGCAACTAGAAGGCACA	NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	44-420-3250ML	DNA/RNA extraction
BglI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0143	Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1851196	dd-PCR cycler
dNTPS	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	N0447S	NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863024	dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863005	dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864008	dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863051	dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863009	dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	12001925	dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells	Lucigen (Middleton, WI, USA)	60081-1	Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm	Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)	748050	Electroporation
GAPDH primer/probe mix	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Mm00186825_cn	Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1652660	Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)	4368814	cDNA reverse transcription
ITR_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	SY-415-1001	NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*	Roche AG (Basel, Switzerland)	KK2600 07958919001	NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	V8151	Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	ND-2000	Digestion of double-stranded insert
NGS_frw	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC	NGS primer
NGS_rev	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	CGC CTT GTG TGT TGA CAT C	NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	FC-404-2005	NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit	NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)	9092-256	NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814000	dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814040	dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F530S	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)	24765-1G	AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	NG2002	Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F549L	NGS Library preparation
Proteinase K	Roche AG (Basel, Switzerland)	5963117103	DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS			ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864002	dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864003	dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28306	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28704	Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	12162	Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28104	Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer	Invitrogen (Waltham, MA, USA)	Q32857	NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Q32851	NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix	Qiagen (Venlo, Netherlands)	1044234	Taqman qPCR
rep_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC	dd-PCR primer
rep_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CAATCACGGCGCACATGT	dd-PCR primer
rep_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1	dd-PCR probe
RNase-free DNase	Qiagen (Venlo, Netherlands)	79254	DNA/RNA extraction
SfiI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0123	Digestion of vector
5 mm, steel Beads	Qiagen (Venlo, Netherlands)	69989	DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	M0202L	Plasmid library ligation
TissueLyserLT	Qiagen (Venlo, Netherlands)	85600	DNA/RNA extraction
YFP_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GAGCGCACCATCTTCTTCAAG	dd-PCR primer
YFP_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	TGTCGCCCTCGAACTTCAC	dd-PCR primer
YFP_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1	dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)	Zymo research (Irvine, CA, USA)	D4013	Vector and Ligation purification