Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering av nästa generations genterapivektorer genom teknik, streckkodning och screening av adenoassocierade virus (AAV) kapsidvarianter

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64389
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Infectious Diseases/Virology, Section Viral Vector Technologies, Medical Faculty, University of Heidelberg, 2BioQuant Center, BQ0030, University of Heidelberg, 3Cluster of Excellence CellNetworks, 4German Center for Infection Research (DZIF), 5German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

Generering av AAV-peptidvisningsbibliotek och efterföljande validering genom streckkodning av kandidater med nya egenskaper för skapandet av nästa generations AAV.

Abstract

Genleveransvektorer härledda från adenoassocierat virus (AAV) är ett av de mest lovande verktygen för behandling av genetiska sjukdomar, vilket framgår av uppmuntrande kliniska data och godkännande av flera AAV-genterapier. Två viktiga orsaker till AAV-vektorernas framgång är (i) den tidigare isoleringen av olika naturligt förekommande virala serotyper med distinkta egenskaper, och (ii) den efterföljande etableringen av kraftfulla tekniker för deras molekylära teknik och återanvändning i hög genomströmning. Ytterligare förstärkning av potentialen hos dessa tekniker är nyligen implementerade strategier för streckkodning av utvalda AAV-kapsider på DNA- och RNA-nivå, vilket möjliggör deras omfattande och parallella in vivo-stratifiering i alla större organ och celltyper i ett enda djur. Här presenterar vi en grundläggande pipeline som omfattar denna uppsättning kompletterande vägar, med hjälp av AAV-peptiddisplay för att representera den mångsidiga arsenalen av tillgängliga kapsidtekniktekniker. Följaktligen beskriver vi först de avgörande stegen för generering av ett AAV-peptiddisplaybibliotek för in vivo-urval av kandidater med önskade egenskaper, följt av en demonstration av hur man streckkodar de mest intressanta kapsidvarianterna för sekundär in vivo-screening. Därefter exemplifierar vi metoden för skapandet av bibliotek för nästa generations sekvensering (NGS), inklusive streckkodsförstärkning och adapterligering, innan vi avslutar med en översikt över de mest kritiska stegen under NGS-dataanalys. Eftersom protokollen som rapporteras här är mångsidiga och anpassningsbara kan forskare enkelt utnyttja dem för att berika de optimala AAV-kapsidvarianterna i sin favoritsjukdomsmodell och för genterapiapplikationer.

Introduction

Genöverföringsterapi är införandet av genetiskt material i celler för att reparera, ersätta eller förändra det cellulära genetiska materialet för att förebygga, behandla, bota eller förbättra sjukdom. Genöverföring, både in vivo och ex vivo, bygger på olika leveranssystem, icke-virala och virala. Virus har utvecklats naturligt för att effektivt transducera sina målceller och kan användas som leveransvektorer. Bland de olika typerna av virala vektorer som används i genterapi har adenoassocierade virus använts alltmer på grund av deras brist på patogenicitet, säkerhet, låg immunogenicitet och viktigast av allt deras förmåga att upprätthålla långsiktigt, icke-integrerande uttryck 1,2,3. AAV-genterapi har gett betydande framsteg under det senaste decenniet; tre terapier har godkänts av Europeiska läkemedelsmyndigheten och US Food and Drug Administration för användning på människor 3,4. Flera kliniska prövningar pågår också för att behandla en mängd olika sjukdomar, såsom hemofili, muskulösa, hjärt- och neurologiska sjukdomar, som granskas någon annanstans3. Trots årtionden av framsteg har genterapiområdet upplevt en rad bakslag de senaste åren4, viktigast av allt dödsfall i kliniska prövningar5 som har lagts på is på grund av dosbegränsande toxiciteter, särskilt för vävnader som är massiva, såsom muskler, eller svåra att nå, såsom hjärna6.

AAV-vektorerna som för närvarande används i kliniska prövningar tillhör de naturliga serotyperna med några få undantag:1. AAV-teknik erbjuder möjligheten att utveckla vektorer med överlägsen organ- eller cellspecificitet och effektivitet. Under de senaste två decennierna har flera tillvägagångssätt framgångsrikt tillämpats, såsom peptiddisplay, loop-swap, kapsid-DNA-blandning, felbenägen PCR och riktad design, för att generera enskilda AAV-varianter eller bibliotek därav med olika egenskaper7. Dessa utsätts sedan för flera omgångar av riktad utveckling för att välja varianterna inom dem med önskade egenskaper, som granskas någon annanstans 1,3. Av alla kapsidutvecklingsstrategier har AAV-bibliotek för peptidvisning varit de mest använda på grund av några unika egenskaper: de är relativt lätta att generera och de kan uppnå hög mångfald och sekvensering med hög genomströmning, vilket möjliggör efterföljande utveckling.

De första framgångsrika AAV-biblioteken för peptidinsättning beskrevs för nästan 20 år sedan. I en av de första konstruerade Perabo et al.8 ett bibliotek av modifierade AAV2-kapsider, i vilka en pool av slumpmässigt genererade oligonukleotider infördes i en plasmid i en position som motsvarar aminosyra 587 av VP1-kapsidproteinet, i den trefaldiga axeln som sticker ut från kapsiden. Med hjälp av adenovirus-saminfektion utvecklades AAV-biblioteket genom flera urvalsomgångar, och de slutliga omriktade varianterna visade sig kunna transducera cellinjer som är eldfasta mot föräldra AAV28. Kort därefter introducerade Müller et al.9 tvåstegssystemet för biblioteksproduktion, en betydande förbättring av protokollet. Ursprungligen används plasmidbiblioteket, tillsammans med en adenoviral hjälparplasmid, för att producera ett AAV-bibliotek som innehåller chimära kapsider. Detta AAV-skyttelbibliotek används för att infektera celler vid låg infektionsmultiplicitet (MOI), med målet att införa ett viralt genom per cell. Saminfektion med adenovirus säkerställer produktion av AAV med ett matchande genom och kapsid9. Ungefär ett decennium senare använde Dalkara10 in vivo-riktad evolution för att skapa 7m8-varianten. Denna variant har en 10 aminosyrainsättning (LALGETTRPA), varav tre fungerar som länkar, och riktar sig effektivt mot den yttre näthinnan efter intravitreal injektion10. Denna konstruerade kapsid är en exceptionell framgångshistoria, eftersom det är en av få konstruerade kapsider som hittills har kommit till kliniken11.

Fältet upplevde ett andra uppsving med introduktionen av nästa generations sekvenseringstekniker (NGS). Två publikationer från Adachi et al.12 2014 och från Marsic et al.13 2015 visade kraften i NGS för att spåra distributionen av streckkodade AAV-kapsidbibliotek med hög noggrannhet. Några år senare anpassades NGS i streckkodade regioner till peptidinsättningsregionen för att följa kapsidutvecklingen. Körbelin et al.14 utförde en NGS-guidad screening för att identifiera en lungriktad AAV2-baserad kapsid. NGS-analysen hjälpte till att beräkna tre betygspoäng: anrikningspoängen mellan urvalsomgångar, den allmänna specificitetspoängen för att bestämma vävnadsspecificitet och slutligen den kombinerade poängen14. Gradinaru-labbet15 publicerade samma år det Cre-rekombinationsbaserade AAV-riktade evolutionssystemet (CREATE), vilket underlättar ett celltypspecifikt urval. I detta system bär kapsidbiblioteket en Cre-inverterbar switch, eftersom polyA-signalen flankeras av två loxP-platser. AAV-biblioteket injiceras sedan i Cre-möss, där polyA-signalen endast inverteras i Cre+-celler, vilket ger mallen för bindning av en omvänd PCR-primer med den framåtriktade primern i kapsidgenen. Denna mycket specifika PCR-räddning möjliggjorde identifieringen av AAV-PHP. B-variant som kan passera blod-hjärnbarriären15. Detta system utvecklades vidare till M-CREATE (Multiplexed-CREATE), där NGS och syntetisk biblioteksgenerering integrerades i pipeline16.

En förbättrad RNA-baserad version av detta system från Maguire lab17, iTransduce, möjliggör selektion på DNA-nivå av kapsider som funktionellt transducerar celler och uttrycker deras genom. Det virala genomet i peptidvisningsbiblioteket består av en Cre-gen under kontroll av en allestädes närvarande promotor och kapsidgenen under kontroll av p41-promotorn. Biblioteket injiceras i möss som har en loxP-STOP-loxP-kassett uppströms tdTomato. Celler transducerade med AAV-varianter som uttrycker virusgenomet och därför Cre uttrycker tdTomato och, i kombination med cellmarkörer, kan sorteras och väljas17. På liknande sätt placerade Nonnenmacher et al.18 och Tabebordbar et al.19 kapsidgenbiblioteket under kontroll av vävnadsspecifika promotorer. Efter injektion i olika djurmodeller användes viralt RNA för att isolera kapsidvarianterna.

Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda streckkodning för att tagga kapsidbibliotek. Björklunds labb20 använde detta tillvägagångssätt för att streckkodspeptidinsättningskapasidbibliotek och utvecklade streckkodsrationell AAV-vektorutveckling (BRAVE). I en plasmid klonas Rep2Cap-kassetten bredvid en inverterad terminal upprepar (ITR)-flankerad, gulfluorescerande protein (YFP)-uttryckande, streckkodsmärkt transgen. Med hjälp av loxP-platser mellan slutet av locket och början av streckkoden genererar en in vitro Cre-rekombination ett fragment som är tillräckligt litet för NGS, vilket möjliggör associering av peptidinsättning med den unika streckkoden (uppslagstabell, LUT). AAV-produktion utförs med hjälp av plasmidbiblioteket och streckkoderna uttryckta i mRNA screenas efter in vivo-applikation , återigen med NGS20. När kapsidbiblioteken består av varianter av hela kapsidgenen (dvs. blandade bibliotek) måste långläst sekvensering användas. Flera grupper har använt streckkoder för att tagga dessa olika bibliotek, vilket möjliggör NGS med högre läsdjup. Kay lab21 taggade mycket olika kapsidblandade bibliotek med streckkoder nedströms cap polyA-signalen. I ett första steg genererades ett streckkodat plasmidbibliotek och det blandade kapsidgenbiblioteket klonades in i det. Sedan användes en kombination av MiSeq (kortläsning, högre läsdjup) och PacBio (långläsning, lägre läsdjup) NGS samt Sanger-sekvensering för att generera deras LUT21. År 2019 avgränsade Ogden och kollegor från kyrkans labb22 AAV2-kapsidens lämplighet för flera funktioner med hjälp av bibliotek som hade enpunktsmutationer, infogningar och borttagningar i varje position, vilket i slutändan möjliggjorde maskinstyrd design. För genereringen av biblioteket syntetiserades mindre fragment av kapsidgenen, märktes med en streckkod, nästa generations sekvenserades och klonades sedan till hela kapsidgenen. NGS-data användes för att generera en LUT. Biblioteket screenades sedan med bara streckkoderna och kortläsningssekvenseringen, vilket i sin tur möjliggör högre läsdjup22.

Streckkodsbibliotek har främst använts för att screena en pool av kända, naturliga och konstruerade varianter efter flera omgångar av urval av kapsidbibliotek eller oberoende av en kapsidutvecklingsstudie. Fördelen med sådana bibliotek är möjligheten att screena flera kapsider, samtidigt som antalet djur minskas och variationen mellan djur minimeras. De första studierna som introducerade denna teknik till AAV-fältet publicerades för nästan ett decennium sedan. Nakai lab 12 taggade 191 dubbla alaninmutanter som täcker aminosyrorna 356 till 736 på VP1 från AAV9 med ett par 12-nukleotidstreckkoder. Med hjälp av NGS screenades biblioteket in vivo för galaktosbindning och andra egenskaper12. Marsic och kollegor avgränsade biodistributionen av AAV-varianter med hjälp av en dubbelbarcordad analys 1 år senare13. En nyare studie på icke-mänskliga primater jämförde biodistributionen i centrala nervsystemet av 29 kapsider med olika leveransvägar23. Vårt labb har nyligen publicerat streckkodade AAV-biblioteksskärmar med 183 varianter som inkluderade naturliga och konstruerade AAV. Dessa skärmar på DNA- och RNA-nivå ledde till identifieringen av en mycket myotrop AAV-variant24 hos möss såväl som andra som visar en hög celltypsspecificitet i mushjärnan25.

Här beskriver vi den metod som används i detta arbete och utökar den till att omfatta screening av AAV-peptidvisningsbibliotek. Detta omfattar generering av AAV2-peptiddisplaybibliotek, en digital dropp-PCR-metod (dd-PCR) för kvantifiering och slutligen en NGS-pipeline för att analysera AAV-varianterna, delvis baserat på Weinmanns och kollegorsarbete 24. Slutligen ges en beskrivning av genereringen av streckkodade AAV-bibliotek och NGS-rörledningen som används i samma publikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. AAV2 slumpmässig 7-mer peptid display bibliotek förberedelse

OBS: För beredning av ett AAV2 slumpmässigt peptidvisningsbibliotek, syntetisera de degenererade oligonukleotiderna som enkelsträngat DNA, konvertera det till dubbelsträngat DNA, smälta, ligera till acceptorplasmiden och elektroporat.

  1. Design av degenererade oligonukleotider
    1. Beställ de degenererade oligonukleotiderna och undvik kodonbias. I oligonukleotiden 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3' motsvarar X01 20 kodoner, var och en kodar för en av de 20 aminosyrorna. W kan vara A eller T, vilket producerar kodonerna AGA eller AGT, som kodar för aminosyrorna arginin (R) eller serin (S).
    2. Beställ förstärkningsprimern: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (se figur 1 för detaljer). Detta ger följande proteininsats: R / S G X7. Den teoretiska mångfalden beräknas enligt följande: 1 x 2 x 207 = 2,56 x 109 unika varianter.
      OBS: Det bör noteras att denna mångfald kan begränsas av omvandlingseffektiviteten.
  2. Andra strängens syntes
    1. Resuspendera båda oligonukleotiderna (degenererade oligonukleotider och amplifieringsprimer) till en slutlig koncentration på 100 μM med TE-buffert.
      1. För PCR-reaktionen, ställ in en 50 μL-reaktion med 1 μL av varje primer, 10 μL av bufferten, 1,5 μL DMSO, 0,5 μL dNTP (10 mM), 0,5 μL Hi-fidelity Hot Start Polymerase II och 35,5 μL nukleasfritt vatten.
      2. Överför reaktionen till en termocykler och kör ett förinkubationssteg i 10 s vid 98 °C, följt av tre cykler om 10 s vid 98 °C, 30 s vid 59 °C och 10 s vid 72 °C, därefter 5 min vid 72 °C och ett sista kylningssteg.
    2. Rena reaktionen med hjälp av en nukleotidborttagningssats och eluera i 100 μL nukleasfritt vatten.
    3. Bekräfta effektiviteten hos den andra strängsyntesen genom analys på en bioanalysator (se figur 2). Analysera storleken och renheten hos det dubbelsträngade skäret genom att ladda 1 μL av reaktionen på ett mikrofluidiskt chip från ett DNA 1000-reagenssats enligt tillverkarens instruktioner. Detta kit är optimerat för att mäta storleken och koncentrationen av dubbelsträngade DNA-fragment från 25-1,000 bps.
  3. Uppslutning av insats och plasmidvektor
    1. Smält 85 μl av det renade skäret med 10 μl 10x buffert och 5 μl BglI-enzym i en slutlig reaktionsvolym på 100 μl (se figur 1 för detaljer). Inkubera vid 37 °C över natten. Rena med hjälp av en nukleotidborttagningssats, eluera i 50 μL nukleasfritt vatten och kvantifiera med hjälp av typen "Oligo DNA" i en spektrofotometer.
    2. Smält 10 μg replikationskompetent AAV-plasmid (pRep2Cap2_PIS)26 (ITR-flankerat viralt genom) med 20 μL 10x buffert och 10 μL SfiI-enzym i en slutlig reaktionsvolym på 200 μl (se figur 1 för detaljer). Inkubera vid 50 °C över natten. Rengör vektorn på en 1% agarosgel med hjälp av gelextraktionssatsen följt av ett ytterligare reningssteg med ett DNA-reningssats. Kvantifiera koncentrationen i en spektrofotometer.
  4. Ligering av insats till vektor
    1. Ligate 955 ng plasmidvektor med 45 ng insats med 2 μL buffert och 2 μL ligas i en 20 μL ligeringsreaktion. Inkubera vid 16 °C över natten, följt av 10 minuter vid 70 °C för att värmeinaktivera ligaset.
  5. Transformation, komplexitetsberäkning och förberedelse av plasmidbibliotek
    1. Rengör reaktionen med ett DNA-reningssats enligt tillverkarens instruktioner. Eluera reaktionen i cirka 80% av startvolymen av nukleasfritt vatten och lagra på is för efterföljande omvandling.
    2. Transformera elektrokompetenta celler: tina en injektionsflaska med elektrokompetenta celler på is i 10 minuter. Tillsätt sedan 1-2 μL av den renade ligeringsreaktionen till 30 μL (en injektionsflaska) elektrokompetenta celler och blanda genom att försiktigt knacka. Pipettera sedan försiktigt cell/DNA-blandningen till en förkyld elektroporeringskyvett med 1 mm mellanrum utan att införa luftbubblor.
    3. Elektroporat med följande inställningar: 1800 V, 600 Ω och 10 μF. Inom 10 s från elektroporeringspulsen, tillsätt 970 μL förvärmt återvinningsmedium (försett med de elektrokompetenta cellerna) till kyvetten och blanda genom pipettering. Slutligen överför cellerna till ett mikrocentrifugrör och inkubera i 1 timme vid 37 °C vid 250 rpm. För att uppnå en önskad mångfald, utför 10-100 reaktioner, och efter inkubation, samla alla reaktioner i ett rör.
    4. Beräkna diversiteten genom att späda 10 μL av de poolade transformationerna 10-, 100- eller 1000-faldigt i PBS och fördela 100 μL på näringsagarplattor som innehåller lämpligt antibiotikum (75 mg/ml ampicillin). Inkubera agarplattorna över natten vid 37 °C och räkna sedan kolonierna på agarplattorna.
    5. Beräkna den teoretiska mångfalden enligt följande:
      Teoretisk maximal diversitet = 10 x utspädningsfaktor x antal kolonier x antal elektroporeringsreaktioner.
      OBS: För att bekräfta bibliotekskvaliteten, sekvensera minst 20 kolonier med Sanger-sekvensering. De flesta kloner bör innehålla en insats, och alla bör vara unika.
    6. Inokulera 400–1 000 ml LB-medium innehållande lämpligt antibiotikum med resten av de poolade transformationerna och inkubera över natten vid 37 °C, 180 rpm.
  6. Förberedelse av plasmidbibliotek
    1. Från kulturen över natten bereds en glycerolstam (blanda lika stora volymer bakteriekultur och 50% glycerollösning i nukleasfritt vatten och frys vid -80 ° C) och rena plasmidbiblioteket med ett plasmidmaxikit.
  7. Produktion av AAV-viralt bibliotek
    1. Förbered virusbiblioteket enligt beskrivningen27. Transfekt plasmidbiblioteket (pRep2Cap2_PI, peptidinsats) tillsammans med en adenohjälparplasmid till HEK293T-celler med användning av ett transfektionsreagens såsom polyetylenimin (PEI).
    2. Samla cellerna efter 3 dagar och utsätt dem för tre cykler av frys-tina. Rena viruslysatet med ultracentrifugering av cesiumkloridgradient, följt av buffertbyte till PBS och koncentrera slutligen viruspartiklarna.
  8. AAV-vektortitrering med dd-PCR
    1. Späd 2 μL av AAV-vektorstammen i 198 μL nukleasfritt vatten så att en slutlig utspädning erhålls på 1:106 . Blanda noggrant varje gång med en 200 μL pipett. Lägg till en kontroll utan mall (NTC) som en negativ kontroll.
      OBS: Ytterligare lägre eller högre utspädningar kan analyseras (1:105-1:107).
    2. Förbered en 20x primer-sondblandning. Tillsätt 3,6 μL av var och en av 100 μM-primrarna (framåt och bakåt, Rep2 och ITR), 1 μL vardera av 100 μM dd-PCR-proberna (Rep2 och ITR) och 3,6 μL nukleasfritt vatten till ett 1,5 ml centrifugrör.
      AAV-biblioteket mäts med hjälp av en transgenriktad primer-sonduppsättning (Rep2) detekterad med en FAM-märkt sond och en ITR-riktad primer-sonduppsättning detekterad med en HEX-märkt sond.
    3. Bered en 22 μL PCR-reaktion genom att tillsätta 5,5 μL prov, 1,1 μL 20x primer-sondblandning, 11 μL dd-PCR-supermix för sonder (ingen dUTP) och 4,4 μL nukleasfritt vatten. Detta ger koncentrationer på 900 nM och 250 nM för primrarna respektive sonden.
    4. Generera dropparna med hjälp av en droppgenerator, överför reaktionen till en platta med 96 brunnar, placera plattan i en termocykler och kör ett denatureringssteg i 10 minuter vid 94 °C, följt av 40 cykler på 30 s vid 94 °C och 1 min vid 58 °C. Värmeinaktivera sedan polymeraset i 10 minuter vid 98 °C och tillsätt ett sista kylningssteg. Läs reaktionerna i en droppläsare och fortsätt till analysen28.
    5. Öppna den sparade dd-PCR-plattfilen med analysprogramvaran. Använd tröskelverktyget på fliken 1D-amplitud (fluorescensamplitud kontra händelsenummer) för att separera de negativa och positiva dropparna för varje kanal, med NTC som vägledning, och exportera data till en csv-fil.
    6. För att beräkna vektorkoncentrationen, beräkna först korrektionsfaktorn CF med formeln:
      Equation 1
      CF bestämmer andelen droppar positiva för transgenen [Positiva] som är positiva för både transgen och ITR [Ch1+ Ch2+], för att säkerställa detektion av funktionella vektorpartiklar. Den slutliga vektorkoncentrationen c kan nu beräknas med följande ekvation:
      Equation 2
      DF är utspädningsfaktorn (1:10,5–1:10,7 , fastställd tidigare). Kopiorna per reaktion på 20 μl/brunn motsvarar 5 μl av det utspädda provet. Faktorn 1 000 korrigerar skalan till VG/ml (viralt genom/ml). Ett exemplifierande titreringsresultat visas i tabell 1 och figur 3.
  9. Analys av AAV-virusbiblioteket av NGS
    1. Förstärk 96-nukleotidpeptidinsättningsfragmentet genom att skapa en 20 μL PCR-reaktion med hjälp av ett polymeraskit för korrekturläsning (2x; se figur 4). Tillsätt 1 μl AAV-stam innehållande 1 x 108 vg, 0,5 μL vardera 100 μM primer (NGS_forward och NGS_reverse) och 10 μL av enzymblandningen till reaktionen. Justera den slutliga volymen till 20 μl med nukleasfritt vatten.
    2. Överför reaktionen till en termocykler och kör ett denatureringssteg i 3 minuter vid 98 °C, följt av 30–35 cykler om 10 s vid 98 °C, 10 s vid 59 °C och 20 s vid 72 °C, följt av 5 min vid 72 °C och ett sista kylningssteg.
    3. Rengör proverna med hjälp av ett PCR-reningssats. Kvantifiera koncentrationen i en spektrofotometer och kör en 3% agarosgel för att verifiera renhet och fragmentstorlek.
    4. Bearbeta PCR-fragmenten med hjälp av bibliotekssystemet för prover med låg komplexitet enligt tillverkarens instruktioner för beredning av ett NGS-bibliotek. Utför slutreparationsreaktionen med 30 ng PCR-fragment, följt av adapterligering och PCR-amplifiering i 10 cykler. Använd PCR-reningssatsen för rening av reaktionerna.
    5. Bearbeta slutprodukterna på en Bioanalyzer för att verifiera storlek och renhet med hjälp av ett DNA-reagenskit enligt tillverkarens instruktioner.
    6. Kvantifiera amplikonerna med hjälp av en fluorometer och slå ihop dem. Kvantifiera det slutliga poolade NGS-biblioteket igen på en fluorometer (enligt tillverkarens instruktioner) och verifiera kvaliteten på en bioanalysator.
    7. Sekvensera NGS-biblioteken i ett single-end (SE) -läge, med hjälp av ett 75-cykels högutgångskit, med en läslängd på 84 och ett index 1 på 8.
      OBS: Sekvensering av exemplen i denna artikel utfördes vid GeneCore-anläggningen i EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
    8. Analysera NGS-sekvenseringsdata med Python 3 och biopython. Filerna finns på https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternativt på https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). NGS-analysen består av två steg.
      1. I det första steget söker du i sekvensfilerna efter sekvenser som uppfyller vissa kriterier (förekomst av igenkänningssekvenser som flankerar insättningsstället) (se figur 4, steg 1.9.8.5.). Detta görs med hjälp av ett skript (Script#1) och en konfigurationsfil som tillhandahåller den information som behövs. När rätt sekvens har identifierats extraherar och lagrar programmet sekvensen i utdatafilen, som är en txt-fil med samma namn som sekvenseringsfilen.
      2. Det andra steget är analysen av utdatafilerna. Sekvenserna i biblioteket börjar med någon av sex nukleotider (AGWggc, W = A / T) i de nio aminosyrainsatserna. Baserat på denna startsekvens översätts peptiden. Detta genererar utdatafilerna som innehåller peptidvarianterna (PV).
      3. Förbered två mappar: Skript och Data. Till mappen Data kopierar du de gzip-komprimerade filerna som är resultatet av sekvenseringen. Kopiera följande filer, Python-fil, till mappen Script: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Python-fil: Skript#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Konfigurationsfil: Barcode_Script_JoVE.conf; och uppslagstabellfil (LUT): Zuordnung.txt.
      4. Innan du kör skripten redigerar du följande filer i mappen Script. Öppna filen "Zuordnung.txt" och lägg till namnen på gzip-filerna (kolumn 1) och önskat slutnamn (kolumn 2; tabbseparerade värden) i två tabbseparerade kolumner).
        Exempel på txt-filer finns i GitHub-mappen "PV_analysis_script". Filerna i GitHub-mappen förbereds för analys av tre exempeldata från ovanstående bibliotek: xaa.txt.gz, xab.txt.gz och xac.txt.gz. Utdatafilerna tillhandahålls också.
      5. Ändra följande variabler i konfigurationsfilen "Barcode_Script_JoVE.conf":
        my_dir = "~/Data/"
        filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
        De sekvensspecifika variablerna: BCV_size = 27, BCVvänster = TCCAGGGCCAG, BCVhöger = GCCCAGG, BCVloc = 30, BCVmarginal = 8, BCVleft_revcomp = GCCGCCTGGGC, BCVright_revcomp = CTGGCCC och BCVloc_revcomp = 41 (se figur 4 för detaljer).
      6. Använd följande kommando för att anropa identifiering och extrahering av variantsekvensen:
        >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
        OBS: Utdata är txt-filer med de extraherade DNA-sekvenserna och deras antal läsningar. Rubriken på den här filen innehåller statistiska data (dvs. det totala antalet läsningar och de extraherade läsningarna). Dessa data överförs till nästa filer. Dessa txt-data är indatafilerna för Script # 2, där DNA-sekvenserna översätts, rangordnas och analyseras.
      7. Utför PV-extraktion och analys med följande kommando:
        >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analysera textutdatafilerna i Script # 2. Utdatafilerna för Script # 2 namnges med den andra kolumnen i LUT i "Zuordnung.txt" med tillägg baserat på typen av analys.
        OBS: Se till att de tre utdatafilerna innehåller statistiska data i de första raderna ("# av giltiga PV-läsningar", "# av ogiltiga PV-läsningar" och "# av unika PV-läsningar"), en första kolumn med indexet för varje DNA-sekvens från de inmatade txt-filerna (utdata från Script # 1) och följande kolumner: (1) "... analyzed_all.csv": "Prov:" (DNA-sekvens), "#" (antal läsningar), "Frw eller Rev" (läsning framåt eller bakåt) och "PV" (översatt peptidsekvens). De ogiltiga sekvenserna har "NA" och "not valid" i de två sista kolumnerna. (2) "... analyzed_validSeq.csv": samma som föregående fil, filtrerad för giltiga sekvenser. (3) "... analyzed_PV.csv": "PV" (översatt peptidsekvens), "#" (antal läsningar) och "antal" (antalet frw och rev i föregående filer slås samman och antalet ges 1 eller 2).
      9. Visualisera utdatafilerna med hjälp av tillgänglig programvara baserat på användarens behov.

2. AAV2 slumpmässigt 7-mer peptiddisplaybiblioteksval

  1. Använd AAV-biblioteket efter kvantifiering och kvalitetskontroll (avsnitt 1) för riktad utveckling i en valfri modell för att iterativt välja kandidater med önskade egenskaper (se figur 5)16,18,21.
    OBS: Dessa kandidater används sedan för generering av ett streckkodsbibliotek enligt beskrivningen nedan i avsnitt 3.

3. Förberedelse och analys av streckkodade AAV-kapsidbibliotek

OBS: Efter identifieringen av en uppsättning potentiellt specifika och effektiva AAV-kapsider på peptidskärmen, verifiera funktionaliteten hos de identifierade peptidsekvenserna och jämför dem med en uppsättning vanliga eller välbeskrivna referens-AAV-kapsidvarianter. För att göra detta infogas kapsidsekvensen i en Rep/Cap-hjälpkonstruktion utan ITR.

  1. Produktion av streckkodat AAV-bibliotek
    1. Utför rekombinant AAV-produktion för varje kapsidvariant med hjälp av treplasmidsystemet, som tidigare beskrivits24.
      OBS: För att skilja de olika kapsidvarianterna har den ITR-flankerade reportertransgenplasmiden en unik streckkod med 15 nukleotider i längd. Streckkoden är placerad vid 3' UTR (oöversatt område) mellan det förstärkta gula fluorescerande proteinet (EYFP) och polyA-signalen (se figur 6A). EYFP-uttryck drivs av en stark allestädes närvarande cytomegalovirus (CMV) promotor som ger tillräckliga nivåer av RNA-transkript.
    2. Konstruera streckkoder med en längd på 15 nukleotider med homopolymerer med mindre än tre nukleotider, GC-innehåll på <65%29 och ett Hammingavstånd större än fyra nukleotider24.
    3. Producera varje kapsid separat i kombination med en transgen plasmid som bär en unik streckkod. På så sätt märks varje kapsidvariant med en distinkt streckkod som möjliggör dess specifika spårning (se figur 6B).
  2. AAV-vektortitrering med dd-PCR
    1. Utför AAV-titreringen enligt beskrivningen i avsnitt 1.8 genom att ersätta Rep2-primerparet med YFP-primerparet.
    2. Kvantifiera de enskilda AAV-produktionerna och slå samman lika stora mängder av varje produktion för att generera det slutliga streckkodsbiblioteket.
    3. Kvantifiera det slutliga biblioteket igen för att kontrollera den slutliga koncentrationen och kvaliteten (se figur 7).
  3. Streckkodat AAV-bibliotek in vivo-applikation
    1. Tillämpa det streckkodade AAV-biblioteket systematiskt på det valda modellsystemet (t.ex. systemiskt hos möss24).
    2. Samla ON- och OFF-målvävnader (dvs. lever, lunga, hjärta, membran, glatt muskulatur, tolvfingertarmen, bukspottkörteln, tjocktarmen, biceps, äggstockar, mage, innerörat, njure, bukaorta, bröstaorta, hjärna, brunt och vitt fett och mjälte) eller celltyper baserat på experimentet. Frys dem vid -80 °C, extrahera DNA/RNA och använd NGS-kvantifieringsanalys, enligt beskrivningen i nästa avsnitt.
  4. DNA/RNA-extraktion
    1. Extrahera DNA och RNA från vävnaderna av intresse med hjälp av DNA / RNA Mini Kit.
    2. Placera en liten bit av vävnaden av intresse (1 mm3, ca 5 mg) i ett 2 ml reaktionsrör.
    3. Tillsätt 350 μL lysbuffert blandad med β-merkaptoetanol (1%) och 5 mm stålpärlor till vävnaden (hantera prover med β-merkaptoetanol under dragskåp).
    4. Homogenisera vävnaden i en vävnadLyser i 45 s vid 40 Hz.
    5. Tillsätt 10 μl proteinas K (10 mg/ml) och inkubera i 15 minuter vid 55 °C under skakning vid 400 rpm.
    6. Centrifugera vid 20 000 x g i 3 minuter vid rumstemperatur, samla upp supernatanten och fortsätt med tillverkarens protokoll för DNA/RNA-satsen.
    7. Dela tvättsteget i två steg med 350 μL tvättbuffert i varje steg. Mellan dessa tvättsteg smälter du kvarvarande DNA på kolonnen med RNase-fri DNas I. Tillsätt 80 μL DNas I-lösningen, beredd enligt tillverkarens anvisningar, på kolonnen och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
    8. Eluera RNA/DNA från kolonnen med nukleasfritt vatten. Förvara det isolerade RNA vid -80 °C och gDNA vid -20 °C.
  5. cDNA-syntes
    1. Utsätt RNA-proverna för ytterligare en omgång DNas I-behandling på 15-30 minuter (för fullständigt avlägsnande av kontaminerande DNA från RNA-proverna) före omvänd transkriptionsreaktion. Tillsätt 1 μL DNas I-lösning, 4 μL buffert (medföljer satsen) och nukleasfritt vatten till en slutlig volym av 40 μl till 212 ng RNA. Inkubera i 30 min vid rumstemperatur och värm inaktivera vid 70 °C i 10 minuter.
    2. Syntetisera cDNA med användning av 150 ng RNA med hjälp av ett kit enligt tillverkarens instruktioner. Inkludera kontroller utan omvänt transkriptas för att säkerställa frånvaron av kontaminerande viralt DNA från provet. CDNA lagras vid -20 °C.
      OBS: Mängden inmatat RNA för optimal omvänd transkription kan variera beroende på vävnadstyp och förväntad transduktionseffektivitet i respektive vävnad.
  6. Analys av AAV-virusbibliotek (in-vivo) av NGS
    1. För att uppnå högt sekvenseringsdjup till låg kostnad, utför NGS via Illumina-sekvensering som tidigare beskrivits (avsnitt 1.9). Förstärk streckkodssekvensen och ligera sedan sekvenseringsadaptrarna till ampliconen.
    2. På grund av den kortlästa längden och ligeringen av sekvenseringsadaptrarna på båda sidor av ampliconen, kontrollera vid utformningen att amplikonen är tillräckligt liten för att säkerställa närvaron av streckkodssekvensen i NGS-läsningen. För sekvensering av streckkoderna inom virusgenomerna och virala transkript är PCR-amplikonen utformad för att vara 113 bp lång (se figur 8).
    3. Förstärk det streckkodade området med primrarna BC-seq framåt och BC-seq omvända. Bered följande PCR-reaktion: 0,5 μL Hi-fidelity DNA-polymeras, 10 μL 5x buffert, 0,25 μL av varje 100 μM primer (BC-seq fw/BC-seq rv) och 1 μl 10 mM dNTP. Använd 25 ng av cDNA eller DNA/reaktion som mall och justera den slutliga volymen till 50 μL med nukleasfritt vatten.
    4. Förbered PCR-masterblandningen under en ren PCR-huva för att undvika kontaminering. Använd följande cykelförhållanden: 30 s vid 98 °C, följt av 40 cykler vid 98 °C i 10 s och 72 °C i 20 s, och ett sista 5 minuters steg vid 72 °C.
    5. Inkludera PCR-kontroller för att bekräfta frånvaron av kontaminerande DNA i PCR-mastermixen. För cDNA-proverna, inkludera kontrollerna utan omvänt transkriptas. Slutligen inkluderar du ett exempel med AAV-indatabiblioteket. Denna information kommer att användas för att generera den Normalization_Variant.txt filen som används i analysen.
    6. Kontrollera storleken på PCR-fragmentet i varje prov genom gelelektrofores före PCR-rening. Det senare uppnås genom att använda antingen kommersiellt tillgängliga magnetiska pärlor eller kolonnbaserade DNA-reningssystem (se materialförteckning).
    7. Förbered NGS-biblioteket med hjälp av bibliotekssystemet för prover med låg komplexitet enligt tillverkarens instruktioner, som tidigare beskrivits i avsnitt 1.9.
    8. Bestäm DNA-koncentrationen via dsDNA HS Kit och analysera bibliotekets kvalitet enligt tidigare beskrivet (avsnitt 1.9.6), följt av poolning. Kvantifiera det poolade biblioteket på en fluorometer och bedöm kvaliteten på en Bioanalyzer.
    9. Utför NGS-sekvensering enligt beskrivningen i avsnitt 1.9.7.
    10. Kvantifiera med qPCR antalet kopior av transgenen (virala genom) och hushållsgenen för att bedöma fördelningen av det poolade biblioteket mellan vävnader eller organ på DNA.
    11. Ställ in en 30 μL qPCR-reaktion enligt följande för att bestämma kopienumret för EYFP (transgen) och GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas, hushållningsgen):
      1. Bered en 60x primer/sondblandning för EYFP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv och 0,6 μM YFP_probe; se Materialförteckning). Använd GAPDH primer / sondblandning (se materialförteckning) för att bestämma kopieringsnumret för hushållerskans gen. Ställ in reaktionen på is.
      2. Förbered en PCR-masterblandning (15 μL, se materialtabell) och tillsätt 60x primer/sondblandning (0,5 μL) för alla prover och standarder (för att beräkna kopienummer för standarderna, använd följande länk: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Ställ in reaktionen på is.
      3. Överför 15,5 μl av masterblandningen till en platta med 96 brunnar och tillsätt 14,5 μl prov (75 ng total DNA-koncentration) eller standard till respektive brunn. Försegla plattan med 96 brunnar med folie, virvel och snurra kort.
      4. Överför 10 μl av varje prov till en platta med 384 brunnar i två exemplar. Försegla plattan med folie och snurra vid 800 x g i 5 min vid 4 °C.
      5. Inkubera reaktionsblandningen i en termocykler med en utgångstemperatur på 50 °C i 2 minuter, följt av ett första aktiveringssteg på 10 minuter vid 95 °C. Utför 40 denatureringscykler vid 95 °C i 15 s och glödgning/förlängning vid 60 °C i 1 min24.
      6. För att få antalet diploida genom (dg), använd GAPDH-kopieringsnumret och dela med två. Ta sedan värdet på EYFP-kopieringsnumret och dela med antalet dg, vilket resulterar i vektorgenomer per diploida genom (vg / dg). Använd det här värdet för att generera Normalization_Organ.txt filen för den bioinformatiska analysen.
    12. Utför analysen av NGS-sekvenseringsdata som Weinmann et al.24med anpassad kod i Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Arbetsflödet omfattar detektering av streckkodssekvenser som styrs av flankeringssekvenser, deras längd och plats (Script # 1_BarcodeDetection.py), samt analys av streckkodsanrikning och distribution över uppsättningen vävnader (Script # 2_BarcodeAnalysis.py).
      1. Identifiera streckkod och tilldela dem till AAV-varianter. Placera sekvenseringsdata som arkiverade fastq-filer i en katalog (t.ex. "Data_to_analyze"). Sekvenseringsdatafilen för indatabiblioteket ingår i den här katalogen och används endast för att beräkna kapsidproportionerna i indatabiblioteket.
      2. Innan du kör skriptet skapar du två tabbavgränsade textfiler: filen med kapsidvarianter (se exempelfilen "Varianter.txt") med streckkodssekvenserna tilldelade AAV-kapsidvariantnamn och kontamineringsfilen (se "Föroreningar.txt") med streckkodssekvenser som kommer från möjlig kontaminering (andra streckkoder finns i labbet, vilket bidrar till kontaminering).
      3. Redigera slutligen konfigurationsfilen "Barcode_Script.conf" så att den innehåller följande information: sökväg till mapp med sekvenseringsdata (t.ex. "Data_to_analyze"), sekvens av streckkodernas flankerande regioner, deras position och fönsterstorlek för streckkodsdetektering (liknande 1.9.8.5, se figur 8).
      4. Använd följande kommando för att anropa streckkodsidentifiering med angivna sökvägar till skript#1_BarcodeDetection.py och konfigurationsfiler:
        >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
        Utdata från Script#1_BarcodeDetection.py-körningen är textfiler med antal läsningar per capsid-variant samt det totala antalet läsningar som återställts från rådata.
      5. Utvärdera fördelningen av streckkodade AAV-kapsider mellan vävnader eller organ genom att köra Script#2_BarcodeAnalysis.py tillsammans med följande txt-filer:
        1. I filen "Zuordnung.txt" tilldelar du namnet till varje txt-fil som hämtas från streckkodsdetekteringskörningen till ett vävnads-/organnamn: namn på txt-filer i den första kolumnen och motsvarande vävnads-/organnamn i tabbavgränsad tilldelning.
          OBS: För ett exempel, kolla i mappen "Exempel" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Observera att vävnads-/organnamnet kan innehålla tecken som definierar cDNA- eller gDNA-mätning och biologiskt replikatnummer (M1, M2, etc.).
        2. Skapa en "organ.txt" textfil med listan över namn för ON- och OFF-målorgan, som motsvarar namnen i tilldelningsfilen "Zuordnung.txt" (se mappen "Exempel": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
        3. Skapa tabbavgränsade textfiler med "Normalization_Organ.txt" och "Normalization_Variant.txt" med normaliserade värden för alla kapsidvarianter och alla organ/vävnader. I den första kolumnen i "Normalization_Organ.txt" -filen skriver du namnen på varje organ (som i uppdragsfilen "Zuordnung.txt") och i den andra kolumnen normaliseringsvärdena för motsvarande vävnader, genererade i avsnitt 3.6.11.
        4. Fyll den första kolumnen i filen "Normalization_Variant.txt" med listan över kapsidnamn och den andra kolumnen med de normaliserade värdena för antalet läsningar för varje kapsid i det poolade biblioteket (normalisering kan beräknas baserat på txt-utdatafilen för indatabiblioteket som härrör från det första skriptet).
        5. Redigera konfigurationsfilen genom att ange de fullständiga sökvägarna till alla ytterligare filer som nämns ovan. Kör skript#2_BarcodeAnalysis.py som:
          >python3 /skript#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
          OBS: Streckkodsanalysskriptet matar ut flera filer: textfiler med relativa koncentrationsvärden (RC) för kapsidfördelning inom olika vävnader baserat på flera normaliseringssteg som beskrivits tidigare och kalkylbladsfilen som kombinerar textfildata till sammanslagna matrisdata. Den senare kan användas för klusteranalys och visualisering.
        6. Visualisera data och utföra klusteranalys av matrisdata för att särskilja kapsidegenskaper och utvärdera deras likheter baserat på RC-profiler över vävnader. Använd det extra skriptet PCA_heatmap_plot. R placerad i förvaret:
          >Rscript --vanilj ~/PCA. R ~/relativ koncentration.xls
          Skriptet tar relativkoncentration.xls filer som indata och genererar två diagram med hierarkisk klustervärmekarta och principalkomponentanalys (PCA).
        7. Om du vill ändra diagram (värmekartans axlar, huvudkomponenterna i PCA) eller png-parametrar (färg, storlek, märkning) öppnar du R-skriptet och följer instruktionerna i de kommenterade avsnitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering av ett AAV2-peptidvisningsbibliotek. Som ett första steg mot valet av konstruerade AAV beskrivs genereringen av ett plasmidbibliotek. Peptidinsatsen produceras med hjälp av degenererade primers. Att minska kombinationen av kodon i de från 64 till 20 har fördelarna med att eliminera stoppkodon och underlätta NGS-analys genom att minska biblioteksdiversiteten på DNA men inte proteinnivån. Oligonukleotidinsatsen köps som enkelsträngat DNA (figur 1), som omvandlas till dubbelsträngat DNA med hjälp av en PCR-reaktion. Kvaliteten på denna reaktion styrs i en bioanalysator. Som visas i figur 2 gav tre cykler ett starkare band jämfört med 10 eller 30 cykler. Insatsen smälts sedan med BglI för att generera tre nukleotidöverhäng. Nukleotiden bredvid överhängssekvensen för den dubbelsträngade insatsen kan vara en A eller en T (W är tvetydighetskoden för A eller T), som ligger i den tredje positionen för ett kodon som kodar arginin (R) eller serin (S). Vektorn (pRep2Cap2_PIS) har en frameshift-mutation i peptidinsättningsstället som förhindrar produktion av kapsiden i frånvaro av en insats på grund av skapandet av ett stoppkodon strax efter införingsstället. SfiI-uppslutning av denna plasmid genererar tre nukleotidöverhäng som matchar de överhäng som genereras i den peptidkodande oligonukleotidinsatsen. Ligering måste utföras under optimala förhållanden för att maximera komplexiteten hos plasmidbiblioteket. För detta ändamål utfördes elektroporering för omvandlingen med användning av kommersiellt tillgängliga bakterier med hög effektivitet.

Plasmidbibliotekets mångfald beräknas baserat på antalet kolonier, vilket vanligtvis är cirka 1 x 108 för denna typ av bibliotek. Det totala antalet kolonier motsvarar bibliotekets maximala potentiella mångfald vid NGS-analysen, vilket diskuteras senare. Plasmidbiblioteket används sedan för att generera AAV-biblioteket, vilket inte beskrivs i detalj här utan någon annanstans27.

Kvantifieringen av detta bibliotek utfördes med hjälp av dd-PCR. Vanligtvis kvantifieras två regioner, AAV2-repgenen i virusgenomet och ITR (se figur 3 och tabell 1). Som visas i tabell 1, från dropparna positiva för virusgenomet, är 99,2% också positiva för ITR (Ch1 + Ch2 +), vilket är en kvalitetskontroll för AAV-biblioteket och föreslår att AAV-kapsiderna innehåller fullständiga virala genomer. För att erhålla en koncentration i vg/ml beräknas andelen dubbelpositiva droppar till positiva droppar och används för att få rätt antal kopior före amplifiering med utspädningsfaktorn.

AAV-bibliotekets kvalitet bedöms sedan genom NGS-analys, som börjar med en PCR med lämpliga primers. Därefter bearbetas PCR-produkten med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit, vilket lägger till indexinnehållande adaptrar till PCR-produkten. NGS-produkterna sekvenseras och filerna analyseras med Python. Tre exempeldata från ett AAV2-peptidvisningsbibliotek tillhandahålls. Varje sekvens i Script#1-indatafilen (lista över sekvenser av alla PCR-kopior av det amplifierade DNA-segmentet i provet) söks bioinformatiskt efter BCV-sekvenserna tillvänster och BCV, eller BCV-left_comp- och BCV-right_comp sekvenserna. Om någon av kombinationerna identifieras extraheras den inneslutna sekvensen och läggs till i utdatafilen (se figur 4). Utdata från båda skripten ger statistiska data om förberedelsen av NGS-biblioteket. I alla tre uppsättningarna representerade de extraherade läsningarna, baserat på signatursekvenser som är specifika för biblioteket, cirka 94% av de totala läsningarna, vilket tyder på en god kvalitet. Utdata från Script # 2 ger ytterligare statistiska data, och översättningen av den extraherade DNA-sekvensen ger ytterligare kvalitetskontrolldata. "# för ogiltiga PV-läsningar" (dvs. sekvenser som saknar de sex nukleotider som används för att initiera in-silico-översättningen och koda för rester RG eller SG) är mindre än 1% av de återvunna läsningarna, vilket bekräftar en god sekvenseringskvalitet. Utdata från det andra skriptet (dvs. översättning och rangordning av de extraherade DNA-sekvenserna) ger ytterligare information, såsom antalet läsningar per peptidvariant eller antalet DNA-sekvenser som ger upphov till varje peptidvariant. Av filerna innehåller de som slutar på "analyzed_PVs" endast giltiga DNA-läsningar, och analysen utförs på peptidsekvensnivå. Av de giltiga läsningarna är mer än 99% unika, vilket tyder på att biblioteket är balanserat och den interna mångfalden är hög.

Val av ett AAV2-peptidvisningsbibliotek. Detta bibliotek kan sedan användas för in vivo - eller in vitro-urval . Detta ingår inte i detta protokoll, men en översikt finns i figur 5. För in vivo-selektion samlas vävnaderna in 1 vecka efter systemisk injektion av 1 x 1012 vg/mus och DNA isoleras. En räddnings-PCR på ett större fragment av cap-genen utförs, och produkten klonas in i plasmidvektorn med olika restriktionsställen men ett liknande protokoll som det som beskrivs här, och runda-1 AAV-bibliotek förbereds. För NGS-analysen utförs PCR på det isolerade DNA- eller AAV-biblioteken. Efter valet minskar procentandelen unika PV i biblioteket vanligtvis beroende på urvalstrycket. Beroende på projektet kan urvalet slutföras när tillräckligt många dominerande solceller har identifierats av NGS.

Val och analys av streckkodade bibliotek. Data från ett streckkodat AAV-bibliotek bestående av 82 kapsider har tidigare beskrivits24. DD-PCR-kvantifieringen av AAV-partiklarna (se figur 7 och tabell 1) visar att 94% av kapsiderna som är positiva för transgenen också innehåller en ITR, vilket indikerar ett komplett genom. Detta är lägre än vildtypsbiblioteket som beskrivs ovan, men föreslår fortfarande en bra kvalitet för rekombinanta AAV: er, med tanke på att de vanligtvis paketerar mindre effektivt. Efter injektion av det poolade biblioteket hos djur samlas vävnaderna in och DNA och RNA isoleras. PCR för NGS samt NGS-biblioteksberedning och sekvensering utförs sedan enligt beskrivningen ovan och tidigare24. För att beräkna vg/dg utförs qPCR och i de angivna provdata varierar värdena från 0,1-4. Som är typiskt för systemisk AAV-leverans har levern över 10 vg / dg.

Som en del av analyspipelinen utförs normaliseringssteg på olika nivåer. I biblioteket med indatapooler är kapsidvarianterna vanligtvis inte lika representerade. Därför används NGS-analysen av indatabiblioteket för att generera en normaliseringsfil, som korrigerar överflödet av varje kapsidvariant i den slutliga vävnaden / organet baserat på överflödet av denna kapsidvariant i ingångsbiblioteket. Biodistributionen av de poolade biblioteksmedlemmarna av NGS utförs på DNA- och RNA-nivå. Denna normalisering för indatabiblioteket ger kvoten (P * αβ) av proportionen inom vävnaden / organet (P αβ) till andelen i ingångsbiblioteket (La). Dessa beräkningar finns i filen "variant_comparison.txt". Denna kvot multipliceras sedan med vg / dg-värdena från "Normalization_organ.txt" -filen för att ge värdet Β αβ, och proportionerna av Βαβ-värden beräknas för en enda vävnad eller för alla. Andelen βαβ-värde för varje variant inom en vävnad (Vαβ) återspeglar spridningen av denna variant inom denna vävnad ("organ_comparison.txt"). Däremot indikerar andelen av β αβ-värdet för varje variant i alla vävnader (Tαβ) spridningen av denna variant inom hela kroppen ("relativeconcetrations.xls"). Dessa två proportioner återspeglar biodistributionen inom och mellan vävnader för varje variant. Alla dessa filer kan användas för olika visualiseringar av kapsid effektivitet och specificitet24. Som ett exempel, med hjälp av den slutliga tabellen (finns i "relativeconcetrations.xls") presenteras huvudkomponentanalysen och hierarkisk klustring i figur 9.

Normaliseringen av det poolade biblioteket från NGS-sekvenseringen visar att varje kapsid har en genomsnittlig andel på 0,012, vilket också matchar den teoretiska andelen av var och en av de 82 kapsiderna och föreslår ett välbalanserat poolat bibliotek på 0,012 (1/82). Filen "relativ koncentration.xls" som genereras av den bioinformatiska rörledningen återspeglar biodistributionen av kapsider mellan vävnader, vilket illustreras i figur 9. Värmekartan visar relativa koncentrationsvärden på en log2-skala för varje kapsid i det poolade biblioteket hierarkiskt grupperade enligt vävnadsbiodistributionsprofilen. Huvudkomponentanalysen gör det möjligt att skilja kluster av AAV-kapsidvarianter med liknande biodistributionsegenskaper och belyser också de avlägsna kapsiderna med unika mönster för biodistribution mellan vävnader. De två huvudgrenarna i värmekarthierarkin återspeglar skillnaden i transduktionseffektiviteten för kapsidvarianter. Den vänstra grenen med majoriteten av kapsidvarianterna inkluderar alla kapsider, som visar ett högt värde av relativ koncentration över majoriteten av vävnaderna. Förutom påfallande hög leverspecificitet uppvisade tre andra kapsider (Var60, Var13 och Var63) specificitet i membranet (Di), skelettmuskulaturen (SM), biceps (BlC) och i hjärnan (B). Den högra grenen av den hierarkiska klustringen inkluderar kapsidvarianterna med totalt lägre transduktionseffektivitet, vilket uttalas i tolvfingertarmen (Du) och bukspottkörteln (P). PCA för den ursprungliga delmängden bildar klustret av kapsidvarianter med hög leverspecificitet (Var 64, 78, 65, 55, 56) och beskriver Var60-kapsiden med enastående muskeltropism.

Figure 1
Figur 1: Översikt över kloningsstrategin för AAV2 slumpmässigt 7-mer peptidvisningsbibliotek.
Oligonukleotiden med den slumpmässiga 7-mer-peptidinsättningssekvensen flankeras av sekvenser som innehåller BglI-uppslutningsstället och ett bindningsställe för amplifieringsreaktionen. Vektorn innehåller pRep2Cap2_PIS SfiI-platser. Överhängen som genereras av BglI- och SflI-nedbrytningen kompletterar varandra. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Bioanalysatorns kvalitetskontroll av oligonukleotidsyntesen i andra strängen.
Andra strängsyntesen av degenererade oligonukleotider bekräftas genom analys på en bioanalysator. PCR-reaktioner med tre, 10 och 30 amplifieringscykler jämförs, vilket visar att den mest effektiva är de tre förstärkningscyklerna. (A) Bioanalysatordata representerade som gelbild. (B-D) Plottade fragmentlängder (i bp, x-axeln) jämfört med fluorescensenheter (FU, y-axeln), jämfört med standardtoppar, synliga vid 15 och 1500 bp. Röda pilar indikerar dubbelsträngade oligonukleotider. Observera att det högsta FU-värdet, som representerar den högsta DNA-koncentrationen, av dubbelsträngade oligonukleotider observeras efter tre amplifieringscykler (röda pilar). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Titrering av ett AAV2-peptidvisningsbibliotek med dd-PCR.
(A) Påvisande av rep2-positiva droppar i kanal 1 (FAM, kanal 1) för en icke-mall vattenkontroll och ett 1:106 utspätt virusprov. b) Påvisande av ITR-positiva droppar i kanal 2 (HEX, kanal 2). (C) Detektion av droppar som är positiva för både rep2 och ITR (markerade med orange). Lila linjer indikerar tröskelvärden för detektering av positiva kontra negativa droppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Översikt över DNA-fragmentet som används för NGS och inställningar för pythonanalysen.
NGS PCR förstärker en 96-nukleotidregion. PCR-fragmentet används för att generera NGS-biblioteket. För den bioinformatiska analysen måste igenkänningssekvenser till höger och vänster om insättningsstället ges för båda strängarna, liksom avståndet från början av DNA-fragmentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Iterativt urval av AAV-bibliotek in vivo.
Möss injiceras med AAV-biblioteket. Target ON- och OFF-vävnader samlas in 1 vecka senare och utsätts för NGS och analys. ON-målvävnaden används för att rädda kapsidgenen, som klonas in i modervektorn. Det valda AAV-biblioteket produceras och används för att upprepa ovannämnda urvalscykel. Denna siffra skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Bild 6: Översikt över genereringen av streckkodade AAV-bibliotek.
(A) Grafisk framställning av ett självkompletterande AAV-genom som bär en CMV-promotordriven eyfp-transgen flankerad av ITR. 3' UTR innehåller en 15 nukleotidlång streckkod (BC) belägen vid 3' UTR mellan eyfp och bovint tillväxthormon (BGH) polyadenyleringssignal. BC möjliggör kapsidspårning på DNA- och mRNA-nivå. (B) Under AAV-produktion förpackas ett unikt streckkodat genom av en enda variant av cap-genen, vilket underlättar kapsididentifiering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Titrering av ett streckkodat AAV-bibliotek med dd-PCR.
(A) Påvisande av YFP-positiva droppar i kanal 1 (FAM, kanal 1) för en vattenkontroll som inte är en mall och ett 1:106 utspätt vektorprov. b) Påvisande av ITR-positiva droppar i kanal 2 (HEX, kanal 2). (C) Detektion av droppar som är positiva för både rep2 och ITR (markerade med orange). Lila linjer indikerar tröskelvärden för detektering av positiva kontra negativa droppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Översikt över DNA-fragmentet som används för NGS och inställningar för Python-analysen.
NGS PCR förstärker en 113-nukleotidregion. För den bioinformatiska analysen måste igenkänningssekvenser till höger och vänster om streckkoden ges för båda strängarna, liksom avståndet från början av DNA-fragmentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Huvudkomponentanalys (PCA) och hierarkisk klusteranalys.
(A) PCA med relativa koncentrationsvärden för 82 kapsider i alla vävnader gör det möjligt att definiera kluster av kapsidvarianter med liknande egenskaper och varianter med unika transduktionsmönster. (B) För att bättre separera det högbefolkade klustret uteslöts registreringarna av avlägsna unika varianter från matrisen och PCA-analysen upprepades. (C) Hierarkisk klusteranalys gör det möjligt att visuellt utvärdera varianttransduktionsprofiler över vävnader som ett värmekartdiagram (Li = lever, Lu = lunga, FatB = brunt fett, H = hjärta, Di = membran, SM = glatt muskulatur, Du = tolvfingertarmen, P = bukspottkörteln, C = kolon, BIC = biceps, O = äggstockar, St = mage, I = innerörat, K = njure, Aa = bukaorta, At = bröstaorta, B = hjärna, FatW = vitt fett och S = mjälte). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Prov Mål Kopior/20 μL brunn Positiva Ch1+ Ch2+ JFR kopior korrigerade DF VG/ml
H2O rep2 28 2 0 0 0 1.00E+06 5.60E+09
AAV2lib rep2 90600 16396 16266 0.99 89882 1.00E+06 1.80E+13
H2O YFP 4 3 2 0.67 3 1.00E+06 8.00E+08
BCAAVlib YFP 34680 13229 12452 0.94 32643 1.00E+06 6.53E+12

Tabell 1: Titreringsresultat för ett AAV2-peptidvisningsbibliotek ("AAV2lib") och det streckkodade EYFP-vektorbiblioteket ("BCAAVlib").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll beskrivs de steg som behövs för peptidvisning av AAV-kapsidteknik och för streckkodad AAV-biblioteksscreening, samt för bioinformatisk analys av bibliotekssammansättning och kapsidprestanda. Detta protokoll fokuserar på de steg som underlättar bioinformatisk analys av dessa typer av bibliotek, eftersom de flesta virologilaboratorier släpar efter i programmeringsförmåga för att matcha deras kunskaper i molekylärbiologiska tekniker. Båda typerna av bibliotek har beskrivits utförligt i litteraturen, som beskrivs i introduktionen, och kan reproduceras relativt enkelt.

Som ett första steg beskrivs utformningen av ett peptiddisplaybibliotek i position 588 i variabel region VIII av AAV2. Denna utformning (AAV2_Peptide (ii) i tidigare publikation 26) och den beskrivna kloningsmetoden kan lätt anpassas till andra serotyper på grundval av informationen i en nyligen publiceradpublikation 26. Ett kritiskt steg i kloningsrörledningen är ligerings-/transformationseffektiviteten (med ~1 x 108 kolonier cut-off). Det rekommenderas att lägga till en ligeringsreaktion med bara vektor. Detta hjälper till att identifiera andelen bakteriekolonier med insats, som bör vara högre än 80%. En lägre effektivitet än förväntat, det vill säga ett antal bakteriekolonier (beräkning av procentandelen med insats) lägre än den teoretiska mångfalden av oligonukleotidinsatserna, skulle påverka varianter med låg förekomst negativt. Flera förbättringar inkluderar längre matsmältningstider och rengöringssteg för vektor- eller ligeringsreaktionen, med hjälp av kommersiella kit.

Nästa steg är kvalitetskontrollen av variantbiblioteket med hjälp av NGS av ett PCR-fragment som omfattar oligonukleotidinsättningsstället. NGS utförs med hjälp av ett Illumina-sekvenseringssystem. Det finns flera alternativ, där PCR-produkter kan skickas direkt utan föregående NGS-biblioteksförberedelse. Detta är mer lämpligt för småskaliga experiment eller när ett högt läsdjup inte krävs. Protokollet som rapporteras här omfattar NGS-biblioteksförberedelser, inklusive tillägg av adaptrar med Illumina-index till PCR-produkterna, med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit. En vanlig begränsning med avseende på NGS är att dessa PCR-fragment har en låg mångfald, eftersom sekvenserna som flankerar insättningsstället med hög mångfald är identiska i alla varianter, vilket i sin tur minskar sekvenseringseffektiviteten. För att ta itu med detta lägger detta kit till valfritt antal två till åtta slumpmässiga nukleotider mellan PCR-fragmentet och adaptern. Alternativt måste provet spetsas med PhiX. Den detaljerade Python-pipelinen beskrivs för att analysera AAV2-peptidvisningsbibliotek. Som mall tillhandahålls exempelfiler som extraherats från den ursprungliga NGS-filen i AAV2-peptidvisningsbiblioteket. Detta kan anpassas till andra serotyper med de instruktioner som ges. Utdatafilerna för denna analys kan användas i nedströmsanalys, såsom jämförelse av plasmid och AAV-bibliotek 30, aminosyrasammansättning i varje position30, beräkning av anrikningspoängen mellan bibliotek efter urvalsomgångar 14 eller generering av sekvenslogotyper eller grafer19. När det gäller inmatningsbiblioteket önskas närvaron av en hög andel unika varianter. Vissa varianter producerar dock inte lika bra som andra, vilket kan leda till skeva fördelningar efter produktion. En låg variantdiversitet, eller med andra ord förekomsten av dominerande varianter, kan tillskrivas låg kvalitet på oligonukleotidinsatsen eller ett stort antal andra strängsyntescykler (steg 1.2). Dessutom kan aminosyrasammansättningen påverkas av produktionen. Varje aminosyra bör ha en frekvens på 5,00%. Om fördelningen skiljer sig mycket från detta värde föreslås att samma analys utförs på plasmidbiblioteket för att identifiera potentiella fördomar30.

Eftersom protokollen för AAV-biblioteksgenerering och de efterföljande urvalsomgångarna i olika djur- och in vitro-modeller har beskrivits utförligt i flera publikationer och protokoll 27,30,31,32, beskrivs här endast analysen av streckkodsbibliotek av utvalda konstruerade varianter och riktmärken. Observera att bibliotekskloningen efter varje urvalsomgång kan utföras genom PCR-isolering av cap-genen, som nämns i protokoll- och resultatavsnitten. Omfattande selektionsrundor och PCR-amplifiering kan leda till ackumulering av mutationer eller stoppkodoner, som kan observeras av NGS. Alternativt kan anrikade varianter väljas från NGS-data, och oligonukleotiderna ordnas och klonas på det sätt som det har beskrivits för generering av ett peptidvisningsbibliotek16,18. Slutligen innehåller protokollet en kort beskrivning för valet av bibliotek på DNA-nivå, 1 vecka efter systemisk injektion. RNA-baserade val är strängare, eftersom de också väljer för varianter som trafikerar genom infektiösa ingångsvägar, om än är tekniskt mer utmanande. Det bör noteras att RNA- eller transgenbaserade selektioner, dvs. Cre, kräver en längre in vivo-duration på cirka 3-4 veckor 15,16,17,18,19,33. Särskilt för DNA-baserade urval är det viktigt att validera de valda varianterna mot kända naturliga och konstruerade serotyper på både DNA- och RNA-nivå med hjälp av ett streckkodat AAV-bibliotek.

Den andra delen av protokollet beskriver generering och screening av streckkodade AAV-bibliotek med hjälp av den pipeline som tidigare utvecklats24. Varje AAV-kapsid i poolen innehåller samma transgen (eyfp under kontroll av en CMV-promotor) med en distinkt streckkod mellan eyfp- och polyA-signalen. De streckkoder som används i detta bibliotek finns i den tidigare publikationen24. Designen baserades på grundprincipen för Hammingavstånd (dvs. streckkodssekvenserna måste vara tillräckligt olika), så att sekvenseringsfel inte leder till felaktiga streckkodstilldelningar. Som beskrivs i Lyons et al26 är chansen att två fel uppstår i läsningar mellan 25-100 nukleotider mycket låg. Ett Hamming-avstånd på 4 innebär att två sekvenseringsfel skulle behövas för att tilldela en läsning som fel streckkod. Läsningar med ett fel ignoreras under analysen och kategoriseras i det här fallet som "läsningar med okända varianter". I en relevant publikation tillhandahålls riktlinjer och ett Python-skript för att generera streckkoder29 som kan användas i pipelinen. För identifiering av användbara streckkoder kan en annan populär felkorrigeringskod användas som beskrivs i publikationen av Buschmann och Bystrykh34, nämligen Levenshtein-avståndet. Denna grupp tillhandahåller också ett mjukvarupaket för R-programmeringsspråket35.

Efter AAV-produktion kan det poolade streckkodade AAV-biblioteket användas för biodistributionsstudier i olika modeller. Denna studie beskriver pipelinen med hjälp av 82-variantbiblioteket från föregående publikation24 och ger exempeldata för övning. Detta protokoll kan också anpassas utifrån varje användares behov. Biodistributionsanalysen baseras på insamling av olika ON- och OFF-målvävnader eller celler, extraktion av DNA och RNA från dem, PCR-amplifiering av streckkodsregionen för NGS-sekvensering och mätning av vg / dg på DNA-nivå. För RNA är det bäst att beräkna förhållandet till mRNA-kopieringsnumret för en referensgen. Den valda referensgenen bör uttryckas på liknande sätt i olika vävnader 36, såsom RPP30 (ribonukleas P/MRP subenhet P30)37 eller Hprt (hypoxantinfosforibosyltransferas 1)36. Detta är dock svårt, så man kan behöva använda flera referensgener samtidigt för att normalisera RNA-data. Av denna anledning kan normaliseringen till dg på DNA-nivå slutföras, vilket korrelerar ungefär med antalet celler. Detta pekar också på användningen av qPCR för denna beräkning, som tidigare beskrivits24, även om dd-PCR är mer exakt och därför föredras för framtida användning, särskilt med tanke på framstegen på detta område37. Sist men inte minst är grundläggande molekylärbiologiska optimeringar extremt kritiska för den metodik som beskrivs här. PCR-reaktionerna måste optimeras för att undvika att införa bias i distributionen av biblioteken. DD-PCR-proberna måste utformas för att inkludera introniska regioner för DNA och inter-exoniska regioner för RNA. God laboratoriepraxis, såsom fysisk uppdelning av stegen, särskilt DNA- och AAV-produktion från biblioteksberedning, och korrekt desinfektion är av största vikt för att undvika felaktig förstärkning och bibliotekskontaminering.

I synnerhet representerar användningen av peptidvisningsbibliotek och vektor-DNA / RNA-streckkodning för att välja konstruerade kapsider med nya tropismer eller andra kliniskt relevanta egenskaper endast två exempel på riktad AAV-kapsidutvecklingsteknik. De har alla gemensamt att de kommer med begränsningar och kräver ytterligare optimering för att förverkliga sin fulla potential. Till exempel lämnar blotta införandet av en peptid en stor andel (~ 99%) av den underliggande kapsidsekvensen oförändrad, vars egenskaper inklusive interaktion med neutraliserande anti-AAV-antikroppar kan behöva modifieras ytterligare före mänsklig applicering38. Dessutom är den faktiska mångfalden av peptiddisplayer eller andra bibliotek typiskt lägre än den teoretiska, till exempel på grund av tekniska begränsningar under kloning eller bakteriell transformation31. I allmänhet finns det också en aktiv debatt om den translationella relevansen av riktad evolution i djur- eller in vitro-modeller , främjad av ökande bevis för en möjlig art- eller till och med stamspecifik prestanda för syntetiska AAV-kapsider38. Det finns dock stora förhoppningar om att många eller alla dessa begränsningar kommer att övervinnas och att den nuvarande arsenalen av tekniker kommer att utvidgas till en ännu större variation av sjukdomsmodeller och bli ännu mer tillgänglig för de flesta forskargrupper. I detta avseende är en särskilt uppmuntrande utveckling på senare tid användningen av streckkodade AAV-bibliotek som de som rapporteras här för att validera utvalda kapsider inte längre bara på organet utan nu också på cellulär nivå, vilket kan uppnås med ny teknik som encells (sc) RNA-sekvensering39. Protokollen som presenteras här kommer att underlätta en bredare etablering av AAV-utvecklingstekniker och därmed påskynda utvecklingen av nya kapsider skräddarsydda för behoven hos en mängd forskargrupper och mänskliga patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.G. är en av grundarna av AaviGen GmbH. D.G. och K.R. är uppfinnare på en pågående patentansökan relaterad till generering av immunundvikande AAV-kapsidvarianter. Resten av författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

D.G. uppskattar mycket stöd från den tyska forskningsstiftelsen (DFG) genom DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) och TRR179 (Projektnummer 272983813), liksom från det tyska centret för infektionsforskning (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplification primer ELLA Biotech (Munich, Germany) - Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit  Qiagen (Venlo, Netherlands) 80204 DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C NGS Library preparation
BC-seq fw:  IDT (San Joce, CA, CA, USA) ATCACTCTCGGCATGGACGAGC  NGS Library preparation
BC-seq rv:   IDT (San Joce, CA, CA, USA) GGCTGGCAACTAGAAGGCACA  NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) 44-420-3250ML DNA/RNA extraction
BglI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0143 Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1851196 dd-PCR cycler
dNTPS  New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) N0447S NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863024 dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863005 dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864008 dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863051 dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863009 dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 12001925 dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells Lucigen (Middleton, WI, USA) 60081-1 Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) 748050 Electroporation
GAPDH primer/probe mix Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Mm00186825_cn Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1652660 Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) 4368814 cDNA reverse transcription
ITR_fw IDT (San Joce, CA, USA) GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_rv IDT (San Joce, CA, USA) CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_probe IDT (San Joce, CA, USA) HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system Illumina Inc (San Diego, CA, USA) SY-415-1001 NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* Roche AG (Basel, Switzerland) KK2600 07958919001 NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device Promega GmbH (Madison, WI, USA) V8151 Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) ND-2000 Digestion of double-stranded insert
NGS_frw Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC NGS primer
NGS_rev Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) CGC CTT GTG TGT TGA CAT C NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina Inc (San Diego, CA, USA) FC-404-2005 NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit  NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) 9092-256 NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer  Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814000 dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814040 dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F530S Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) 24765-1G AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System Promega GmbH (Madison, WI, USA) NG2002 Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase  Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F549L NGS Library preparation
Proteinase K Roche AG (Basel, Switzerland) 5963117103 DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab 
QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864002 dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864003 dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28306 Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28704 Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 12162 Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28104 Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer Invitrogen (Waltham, MA, USA) Q32857 NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Q32851 NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix Qiagen (Venlo, Netherlands) 1044234 Taqman qPCR
rep_fw IDT (San Joce, CA, USA) AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC dd-PCR primer
rep_rv IDT (San Joce, CA, USA) CAATCACGGCGCACATGT dd-PCR primer
rep_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 dd-PCR probe
RNase-free DNase Qiagen (Venlo, Netherlands) 79254 DNA/RNA extraction
SfiI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0123 Digestion of vector
5 mm, steel Beads Qiagen (Venlo, Netherlands) 69989 DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides ELLA Biotech (Munich, Germany) - Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) M0202L Plasmid library ligation
TissueLyserLT Qiagen (Venlo, Netherlands) 85600 DNA/RNA extraction
YFP_fw IDT (San Joce, CA, USA) GAGCGCACCATCTTCTTCAAG dd-PCR primer
YFP_rv IDT (San Joce, CA, USA) TGTCGCCCTCGAACTTCAC dd-PCR primer
YFP_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) Zymo research (Irvine, CA, USA) D4013 Vector and Ligation purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
  3. Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
  6. Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).
  7. Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756 (2022).
  8. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
  9. Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
  10. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
  11. Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
  12. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075 (2014).
  13. Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041 (2015).
  14. Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
  15. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  16. Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
  17. Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
  18. Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
  19. Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
  20. Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
  21. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
  22. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
  23. Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
  24. Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).
  25. Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
  26. Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  27. Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).
  28. Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
  29. Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).
  30. Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
  31. Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
  32. Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
  33. Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
  34. Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).
  35. Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
  36. Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).
  37. Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
  38. Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
  39. Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).

Tags

Bioengineering AAV AAV-bibliotek kapsidteknik genterapi screening med hög genomströmning NGS streckkodsbibliotek
Isolering av nästa generations genterapivektorer genom teknik, streckkodning och screening av adenoassocierade virus (AAV) kapsidvarianter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rapti, K., Maiakovska, O., Becker,… More

Rapti, K., Maiakovska, O., Becker, J., Szumska, J., Zayas, M., Bubeck, F., Liu, J., Gerstmann, E., Krämer, C., Wiedtke, E., Grimm, D. Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants. J. Vis. Exp. (188), e64389, doi:10.3791/64389 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter