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Bioengineering

इंजीनियरिंग, बारकोडिंग और एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) कैप्सिड वेरिएंट की स्क्रीनिंग के माध्यम से अगली पीढ़ी के जीन थेरेपी वैक्टर का अलगाव

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64389
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Infectious Diseases/Virology, Section Viral Vector Technologies, Medical Faculty, University of Heidelberg, 2BioQuant Center, BQ0030, University of Heidelberg, 3Cluster of Excellence CellNetworks, 4German Center for Infection Research (DZIF), 5German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

एएवी पेप्टाइड अगली पीढ़ी के एएवी के निर्माण के लिए नए गुणों वाले उम्मीदवारों की बारकोडिंग के माध्यम से पुस्तकालय उत्पादन और बाद में सत्यापन प्रदर्शित करता है।

Abstract

एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) से प्राप्त जीन डिलीवरी वैक्टर आनुवंशिक रोगों के उपचार के लिए सबसे आशाजनक उपकरणों में से एक हैं, जो नैदानिक डेटा को प्रोत्साहित करने और कई एएवी जीन उपचारों के अनुमोदन से स्पष्ट हैं। एएवी वैक्टर की सफलता के दो प्रमुख कारण हैं (i) अलग-अलग गुणों के साथ विभिन्न स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले वायरल सीरोटाइप का पूर्व अलगाव, और (ii) उनके आणविक इंजीनियरिंग के लिए शक्तिशाली प्रौद्योगिकियों की स्थापना और उच्च थ्रूपुट में पुन: उत्पादन। इन तकनीकों की क्षमता को और बढ़ाने के लिए हाल ही में डीएनए और आरएनए स्तर पर चयनित एएवी कैप्सिड्स को बारकोडिंग करने के लिए रणनीतियों को लागू किया गया है, जिससे एक ही जानवर में सभी प्रमुख अंगों और सेल प्रकारों में विवो स्तरीकरण में उनके व्यापक और समानांतर की अनुमति मिलती है। यहां, हम उपलब्ध कैप्सिड इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों के विविध शस्त्रागार का प्रतिनिधित्व करने के लिए एएवी पेप्टाइड डिस्प्ले का उपयोग करते हुए पूरक मार्गों के इस सेट को शामिल करते हुए एक बुनियादी पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं। तदनुसार, हम पहले वांछित गुणों वाले उम्मीदवारों के विवो चयन के लिए एएवी पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी की पीढ़ी के लिए निर्णायक चरणों का वर्णन करते हैं, इसके बाद विवो स्क्रीनिंग में माध्यमिक के लिए सबसे दिलचस्प कैप्सिड वेरिएंट को बारकोड करने का प्रदर्शन करते हैं। इसके बाद, हम एनजीएस डेटा विश्लेषण के दौरान सबसे महत्वपूर्ण चरणों के अवलोकन के साथ निष्कर्ष निकालने से पहले, बारकोड प्रवर्धन और एडाप्टर लिगेशन सहित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के लिए पुस्तकालयों के निर्माण के लिए पद्धति का उदाहरण देते हैं। चूंकि यहां बताए गए प्रोटोकॉल बहुमुखी और अनुकूलनीय हैं, शोधकर्ता आसानी से अपने पसंदीदा रोग मॉडल में और जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम एएवी कैप्सिड वेरिएंट को समृद्ध करने के लिए उनका उपयोग कर सकते हैं।

Introduction

जीन ट्रांसफर थेरेपी कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री की शुरुआत है जो बीमारी को रोकने, इलाज, इलाज या सुधारने के लिए सेलुलर आनुवंशिक सामग्री की मरम्मत, प्रतिस्थापन या परिवर्तन करती है। जीन स्थानांतरण, विवो और एक्स विवो दोनों में, विभिन्न वितरण प्रणालियों, गैर-वायरल और वायरल पर निर्भर करता है। वायरस अपने लक्ष्य कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक ट्रांसड्यूस करने के लिए स्वाभाविक रूप से विकसित हुए हैं और इसका उपयोग वितरण वैक्टर के रूप में किया जा सकता है। जीन थेरेपी में नियोजित विभिन्न प्रकार के वायरल वैक्टर के बीच, एडेनो से जुड़े वायरस का तेजी से उपयोग किया गया है, रोगजनकता, सुरक्षा, कम इम्युनोजेनेसिटी की कमी के कारण, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि दीर्घकालिक, गैर-एकीकृत अभिव्यक्ति 1,2,3 को बनाए रखने की उनकी क्षमता है। एएवी जीन थेरेपी ने पिछले दशक में काफी उपलब्धियां हासिल की हैं; मनुष्यों में उपयोग के लिए यूरोपीय मेडिसिन एजेंसी और यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन द्वारा तीन उपचारों को मंजूरी दी गई है। विभिन्न प्रकार की बीमारियों, जैसे हीमोफिलिया, मांसपेशियों, हृदय और न्यूरोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए कई नैदानिक परीक्षण भी चल रहे हैं, जैसा कि कहीं और समीक्षा की गईहै। दशकों की प्रगति के बावजूद, जीन थेरेपी के क्षेत्र ने हाल के वर्षों में असफलताओं की एक श्रृंखला का अनुभव किया है, सबसे महत्वपूर्ण रूप से नैदानिक परीक्षणों5 में मौतें जिन्हें खुराक-सीमित विषाक्तताओं के कारण रोक दिया गया है, विशेष रूप से ऊतकों के लिए जो बड़े पैमाने पर हैं, जैसे कि मांसपेशी, या पहुंचना मुश्किल है, जैसे कि मस्तिष्क6।

वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में उपयोग किए जा रहे एएवी वैक्टर कुछ अपवादों के साथ प्राकृतिक सीरोटाइप सेसंबंधित हैं। एएवी इंजीनियरिंग बेहतर अंग- या सेल-विशिष्टता और दक्षता के साथ वैक्टर विकसित करने का अवसर प्रदान करता है। पिछले दो दशकों में, पेप्टाइड डिस्प्ले, लूप-स्वैप, कैप्सिड डीएनए फेरबदल, त्रुटि-प्रवण पीसीआर और लक्षित डिजाइन जैसे कई दृष्टिकोणों को सफलतापूर्वक लागू किया गया है, ताकि अलग-अलग एएवी वेरिएंट या विभिन्न गुणों वाले पुस्तकालयों को उत्पन्नकिया जा सके। फिर इन्हें वांछित गुणों के साथ उनके भीतर वेरिएंट का चयन करने के लिए निर्देशित विकास के कई दौरों के अधीन किया जाता है, जैसा कि कहीं और समीक्षा कीगई है। सभी कैप्सिड विकास रणनीतियों में से, पेप्टाइड डिस्प्ले एएवी पुस्तकालयों का सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, कुछ अद्वितीय गुणों के कारण: वे उत्पन्न करने में अपेक्षाकृत आसान हैं, और वे उच्च विविधता और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्राप्त कर सकते हैं, जो उनके विकास को पीछे छोड़ने की अनुमति देता है।

पहला सफल पेप्टाइड सम्मिलन एएवी पुस्तकालयों को लगभग 20 साल पहले वर्णित किया गया था। पहले में से एक में, पेराबो एट अल.8 ने संशोधित एएवी 2 कैप्सिड्स की एक लाइब्रेरी का निर्माण किया, जिसमें यादृच्छिक रूप से उत्पन्न ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का एक पूल एक प्लास्मिड में एक ऐसी स्थिति में डाला गया था जो वीपी 1 कैप्सिड प्रोटीन के एमिनो-एसिड 587 से मेल खाती है, कैप्सिड से निकलने वाली तीन गुना धुरी में। एडेनोवायरस सह-संक्रमण का उपयोग करते हुए, एएवी लाइब्रेरी को चयन के कई दौरों के माध्यम से विकसित किया गया था, और अंतिम पुन: लक्षित वेरिएंट को माता-पिता के एएवी 28 के लिए सेल लाइनों को अपवर्तक ट्रांसड्यूस करने में सक्षम दिखाया गया था। इसके तुरंत बाद, मुलर एट अल.9 ने पुस्तकालय उत्पादन के लिए दो-चरणीय प्रणाली पेश की, प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण सुधार। प्रारंभ में, प्लास्मिड लाइब्रेरी, एक एडेनोवायरल हेल्पर प्लास्मिड के साथ, एक एएवी लाइब्रेरी का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है जिसमें चिमेरिक कैप्सिड होते हैं। इस एएवी शटल लाइब्रेरी का उपयोग संक्रमण की कम बहुलता (एमओआई) पर कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए किया जाता है, जिसका उद्देश्य प्रति सेल एक वायरल जीनोम पेश करना है। एडेनोवायरस के साथ सह-संक्रमण एक मिलान जीनोम और कैप्सिड 9 के साथ एएवी के उत्पादन को सुनिश्चित करताहै। लगभग एक दशक बाद, 7 एम 8 संस्करण बनाने के लिए विवो निर्देशित विकास में उपयोग किए गए दलकारा10। इस संस्करण में 10 एमिनो-एसिड सम्मिलन (LALGETTRPA) है, जिनमें से तीन लिंकर के रूप में कार्य करते हैं, और इंट्राविट्रल इंजेक्शन10 के बाद बाहरी रेटिना को कुशलतापूर्वक लक्षित करते हैं। यह इंजीनियर कैप्सिड एक असाधारण सफलता की कहानी है, क्योंकियह क्लिनिक में इसे बनाने के लिए कुछ इंजीनियर कैप्सिड्स में से एक है।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) तकनीकों की शुरूआत के साथ क्षेत्र ने दूसरा बढ़ावा दिया। 2014 में अडाची एट अल.12 और 2015 में मार्सिक एट अल.13 के दो प्रकाशनों ने उच्च सटीकता के साथ बारकोडेड एएवी कैप्सिड पुस्तकालयों के वितरण को ट्रैक करने के लिए एनजीएस की शक्ति का प्रदर्शन किया। कुछ साल बाद, बारकोडेड क्षेत्रों के एनजीएस को कैप्सिड विकास का पालन करने के लिए पेप्टाइड सम्मिलन क्षेत्र के लिए अनुकूलित किया गया था। कोर्बेलिन एट अल .14 ने फुफ्फुसीय-लक्षित एएवी 2-आधारित कैप्सिड की पहचान करने के लिए एक एनजीएस-निर्देशित स्क्रीनिंग का प्रदर्शन किया। एनजीएस विश्लेषण ने तीन रेटिंग स्कोर की गणना करने में मदद की: चयन राउंड के बीच संवर्धन स्कोर, ऊतक विशिष्टता निर्धारित करने के लिए सामान्य विशिष्टता स्कोर, और अंत में संयुक्त स्कोर14। ग्रैडिनारू लैब15 ने उसी वर्ष क्रे-पुनर्संयोजन-आधारित एएवी लक्षित विकास (क्रिएट) प्रणाली प्रकाशित की, जो सेल-प्रकार-विशिष्ट चयन की सुविधा प्रदान करती है। इस प्रणाली में, कैप्सिड लाइब्रेरी में एक क्रे-इनवर्टिबल स्विच होता है, क्योंकि पॉलीए सिग्नल दो लॉक्सपी साइटों से घिरा होता है। एएवी लाइब्रेरी को तब क्रे चूहों में इंजेक्ट किया जाता है, जहां पॉलीए सिग्नल केवल सीआरई + कोशिकाओं में उल्टा होता है, जो कैप्सिड जीन के भीतर फॉरवर्ड प्राइमर के साथ रिवर्स पीसीआर प्राइमर के बंधन के लिए टेम्पलेट प्रदान करता है। इस अत्यधिक विशिष्ट पीसीआर बचाव ने एएवी-पीएचपी की पहचान को सक्षम किया। बी संस्करण जो रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करसकता है 15. इस प्रणाली को आगे एम-क्रिएट (मल्टीप्लेक्स-क्रिएट) में विकसित किया गया था, जिसमें एनजीएस और सिंथेटिक लाइब्रेरी उत्पादन को पाइपलाइन16 में एकीकृत किया गया था।

मैगुइरे लैब17, आईट्रांसड्यूस से इस प्रणाली का एक बेहतर आरएनए-आधारित संस्करण, कैप्सिड्स के डीएनए स्तर पर चयन की अनुमति देता है जो कार्यात्मक रूप से कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करते हैं और उनके जीनोम को व्यक्त करते हैं। पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी के वायरल जीनोम में एक सर्वव्यापी प्रमोटर के नियंत्रण में एक सीआरई जीन और पी 41 प्रमोटर के नियंत्रण में कैप्सिड जीन शामिल है। पुस्तकालय को चूहों में इंजेक्ट किया जाता है जिनके पास टीडीटोमेटो के अपस्ट्रीम में एक लोक्सपी-स्टॉप-लॉक्सपी कैसेट होता है। कोशिकाओं को एएवी वेरिएंट के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है जो वायरल जीनोम को व्यक्त करते हैं और इसलिए सीआरई एक्सप्रेस टीडीटोमेटो और सेल मार्करों के साथ संयोजन में, क्रमबद्ध और चयनित किया जा सकताहै। इसी तरह, नोनेनमेकर एट अल.18 और टैबेबोर्डबार एट अल.19 ने कैप्सिड जीन लाइब्रेरी को ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में रखा। विभिन्न पशु मॉडल में इंजेक्शन के बाद, वायरल आरएनए का उपयोग कैप्सिड वेरिएंट को अलग करने के लिए किया गया था।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण कैप्सिड पुस्तकालयों को टैग करने के लिए बारकोडिंग का उपयोग करना है। ब्योर्कलुंड लैब20 ने बारकोड पेप्टाइड सम्मिलन कैप्सिड पुस्तकालयों के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया और बारकोडेड तर्कसंगत एएवी वेक्टर विकास (ब्रेव) विकसित किया। एक प्लास्मिड में, रेप 2कैप कैसेट को उल्टे टर्मिनल रिपीट (आईटीआर) -फ्लैंक्ड, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) -व्यक्त, बारकोड-टैग किए गए ट्रांसजीन के बगल में क्लोन किया जाता है। कैप के अंत और बारकोड की शुरुआत के बीच लोक्सपी साइटों का उपयोग करते हुए, एक इन विट्रो सीआरई पुनर्संयोजन एनजीएस के लिए पर्याप्त छोटा टुकड़ा उत्पन्न करता है, जिससे अद्वितीय बारकोड (लुक-अप टेबल, एलयूटी) के साथ पेप्टाइड सम्मिलन के जुड़ाव की अनुमति मिलती है। एएवी उत्पादन प्लास्मिड लाइब्रेरी का उपयोग करके किया जाता है और एमआरएनए में व्यक्त बारकोड को विवो एप्लिकेशन में फिर से एनजीएस20 के साथ जांचा जाता है। जब कैप्सिड पुस्तकालयों में पूरे कैप्सिड जीन (यानी, फेरबदल पुस्तकालय) के रूप शामिल होते हैं, तो लंबे समय तक पढ़ने वाले अनुक्रमण का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। कई समूहों ने इन विविध पुस्तकालयों को टैग करने के लिए बारकोड का उपयोग किया है, जो एनजीएस को उच्च पढ़ने की गहराई के साथ सक्षम बनाता है। केए लैब21 ने कैप पॉलीए सिग्नल के डाउनस्ट्रीम बारकोड के साथ अत्यधिक विविध कैप्सिड फेरबदल पुस्तकालयों को टैग किया। पहले चरण में, एक बारकोडेड प्लास्मिड लाइब्रेरी उत्पन्न की गई थी, और फेरबदल कैप्सिड जीन लाइब्रेरी को इसमें क्लोन किया गया था। फिर उनके एलयूटी21 को उत्पन्न करने के लिए मिसेक (लघु पठन, उच्च पठन गहराई) और पीएसीबायो (लंबे समय तक पढ़ने, कम पढ़ने की गहराई) एनजीएस के साथ-साथ सेंगर अनुक्रमण के संयोजन का उपयोग किया गया था। 2019 में, ओग्डेन और चर्च लैब22 के सहयोगियों ने पुस्तकालयों का उपयोग करके कई कार्यों के लिए एएवी 2 कैप्सिड फिटनेस को चित्रित किया, जिसमें हर स्थिति में एकल बिंदु उत्परिवर्तन, सम्मिलन और विलोपन थे, जिसने अंततः मशीन-निर्देशित डिजाइन को सक्षम किया। लाइब्रेरी की पीढ़ी के लिए, कैप्सिड जीन के छोटे टुकड़ों को संश्लेषित किया गया, एक बारकोड के साथ टैग किया गया, अगली पीढ़ी के अनुक्रम, और फिर पूर्ण कैप्सिड जीन में क्लोन किया गया। एनजीएस डेटा का उपयोग एलयूटी उत्पन्न करने के लिए किया गया था। लाइब्रेरी को तब केवल बारकोड और शॉर्ट रीड सीक्वेंसिंग का उपयोग करके स्क्रीन किया गया था, जो बदले में उच्च पठन गहराई22 की अनुमति देता है।

बारकोडेड पुस्तकालयों का उपयोग मुख्य रूप से कैप्सिड पुस्तकालयों के चयन के कई दौर के बाद या कैप्सिड विकास अध्ययन से स्वतंत्र ज्ञात, प्राकृतिक और इंजीनियर वेरिएंट के पूल को स्क्रीन करने के लिए किया गया है। ऐसे पुस्तकालयों का लाभ जानवरों की संख्या को कम करने और जानवरों के बीच भिन्नता को कम करते हुए, कई कैप्सिड्स को स्क्रीन करने का अवसर है। एएवी क्षेत्र में इस तकनीक को पेश करने वाले पहले अध्ययन लगभग एक दशक पहले प्रकाशित हुए थे। नकई लैब12 ने 12-न्यूक्लियोटाइड बारकोड की एक जोड़ी के साथ एएवी 9 से वीपी 1 पर अमीनो एसिड 356 से 736 को कवर करने वाले 191 डबल एलानिन उत्परिवर्ती को टैग किया। एनजीएस का उपयोग करते हुए, लाइब्रेरी को गैलेक्टोज बाइंडिंग और अन्य गुणों के लिए विवो में जांचकी गई थी। मार्सिक और उनके सहयोगियों ने 1 साल बाद13 के डबल-बारकॉर्डेड विश्लेषण का उपयोग करके एएवी वेरिएंट के जैव वितरण को चित्रित किया। गैर-मानव प्राइमेट्स में एक और हालिया अध्ययनने प्रसव के विभिन्न मार्गों का उपयोग करके 29 कैप्सिड्स के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में जैव वितरण की तुलना की। हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में 183 वेरिएंट के बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी स्क्रीन प्रकाशित किए हैं जिनमें प्राकृतिक और इंजीनियर एएवी शामिल हैं। डीएनए और आरएनए स्तर पर इन स्क्रीनों ने चूहों में एक अत्यधिक मायोट्रोपिक एएवी संस्करण24 की पहचान की और साथ ही माउस मस्तिष्क25 में एक उच्च सेल-प्रकार विशिष्टता प्रदर्शित की।

यहां, हम इस काम में उपयोग की जाने वाली पद्धति का वर्णन करते हैं और एएवी पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग को शामिल करने के लिए इसका विस्तार करते हैं। इसमें एएवी 2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी, परिमाणीकरण के लिए एक डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) विधि और अंत में एएवी वेरिएंट का विश्लेषण करने के लिए एक एनजीएस पाइपलाइन शामिल है, जो वेनमैन और सहयोगियों24 द्वारा किए गए काम पर आधारित है। अंत में, बारकोडेड एएवी पुस्तकालयों की पीढ़ी और एक ही प्रकाशन में उपयोग की जाने वाली एनजीएस पाइपलाइन का विवरण प्रदान किया गया है।

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Protocol

1. एएवी 2 यादृच्छिक 7-मेर पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी तैयारी

नोट: एएवी 2 यादृच्छिक पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी की तैयारी के लिए, पतित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को एकल-फंसे डीएनए के रूप में संश्लेषित करें, इसे डबल-फंसे हुए डीएनए में परिवर्तित करें, पचाएं, स्वीकर्ता प्लास्मिड में लिगेट करें, और इलेक्ट्रोपोरेट करें।

  1. पतित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का डिजाइन
    1. पतित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का आदेश दें और कोडन पूर्वाग्रह से बचें। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5 'CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 20 कोडन से मेल खाता है, प्रत्येक एन्कोडिंग 20 अमीनो एसिड में से एक है। डब्ल्यू ए या टी हो सकता है, जो कोडन एजीए या एजीटी का उत्पादन करता है, जो अमीनो एसिड आर्गिनिन (आर) या सेरीन (एस) को एन्कोड करता है।
    2. प्रवर्धन प्राइमर का आदेश दें: 5 'CTCGTCAGCCGCTGG 3' (विवरण के लिए चित्रा 1 देखें)। यह निम्नलिखित प्रोटीन सम्मिलित करता है: आर / एस जी एक्स7। सैद्धांतिक विविधता की गणना निम्नानुसार की जाती है: 1 x 2 x 207 = 2.56 x 109 अद्वितीय रूप।
      नोट: यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह विविधता परिवर्तन दक्षता द्वारा प्रतिबंधित हो सकती है।
  2. दूसरा-स्ट्रैंड संश्लेषण
    1. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (पतित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और प्रवर्धन प्राइमर) दोनों को टीई बफर के साथ 100 μM अंतिम एकाग्रता में पुन: निलंबित करें।
      1. पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, प्रत्येक प्राइमर के 1 μL, बफर के 10 μL, DMSO के 1.5 μL, dNTPs (10 mM) के 0.5 μL, हाई-फिडेलिटी हॉट स्टार्ट पोलीमरेज़ II के 0.5 μL और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 35.5 μL के साथ एक 50 μL प्रतिक्रिया सेट करें।
      2. प्रतिक्रिया को थर्मोसाइक्लर में स्थानांतरित करें और 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के लिए एक पूर्व-इनक्यूबेशन चरण चलाएं, इसके बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड, 59 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड, फिर 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और एक अंतिम शीतलन चरण।
    2. न्यूक्लियस मुक्त पानी के 100 μL में न्यूक्लियोटाइड हटाने की किट और इल्यूट का उपयोग करके प्रतिक्रिया को शुद्ध करें।
    3. बायोएनालाइज़र पर विश्लेषण द्वारा दूसरे स्ट्रैंड संश्लेषण की दक्षता की पुष्टि करें ( चित्रा 2 देखें)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए 1000 अभिकर्मकों किट से माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर प्रतिक्रिया के 1 μL लोड करके डबल-फंसे हुए इंसर्ट के आकार और शुद्धता का विश्लेषण करें। यह किट 25-1,000 बीपीएस से डबल-फंसे डीएनए टुकड़ों के आकार और एकाग्रता को मापने के लिए अनुकूलित है।
  3. इंसर्ट और प्लास्मिड वेक्टर का पाचन
    1. शुद्ध किए गए इंसर्ट के 85 μL को अंतिम 100 μL प्रतिक्रिया मात्रा में 10x बफर के 10 μL और Bgli एंजाइम के 5 μL के साथ पचाएं (विवरण के लिए चित्र 1 देखें)। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक न्यूक्लियोटाइड हटाने की किट का उपयोग करके शुद्ध करें, न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 50 μL में एल्यूट करें, और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में "ओलिगो डीएनए" प्रकार का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करें।
    2. अंतिम 200 μL प्रतिक्रिया मात्रा में प्रतिकृति-सक्षम AAV प्लास्मिड (pRep2Cap2_PIS)26 (ITR-फ्लैंक्ड वायरल जीनोम) के 10 μg को डाइजेस्ट करें, जिसमें 10x बफर के 20 μL और SfiI एंजाइम के 10 μL होते हैं (विवरण के लिए चित्र 1 देखें)। रात भर 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके 1% अगारोस जेल पर वेक्टर को शुद्ध करें, इसके बाद डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके एक अतिरिक्त शुद्धिकरण चरण है। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  4. वेक्टर में सम्मिलित करने का बंधाव
    1. 20 μL लिगेशन प्रतिक्रिया में 2 μL बफर और 2 μL लिगेज के साथ 45 ng के साथ प्लास्मिड वेक्टर का लिगेट 955 ng होता है। रात भर 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, इसके बाद लिगेज को गर्म करने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट करें।
  5. परिवर्तन, जटिलता गणना, और प्लास्मिड लाइब्रेरी की तैयारी
    1. निर्माता के निर्देशों के बाद डीएनए शुद्ध करने वाली किट के साथ प्रतिक्रिया को शुद्ध करें। न्यूक्लियस मुक्त पानी की शुरुआती मात्रा के लगभग 80% में प्रतिक्रिया और बाद के परिवर्तन के लिए बर्फ पर स्टोर करें।
    2. विद्युतक्षम कोशिकाओं को बदलें: 10 मिनट के लिए बर्फ पर विद्युतक्षम कोशिकाओं की एक शीशी को पिघलाएं। फिर इलेक्ट्रोकॉम्पिटेंट कोशिकाओं के 30 μL (एक शीशी) में शुद्ध बंधाव प्रतिक्रिया के 1-2 μL जोड़ें और धीरे से टैप करके मिलाएं। इसके बाद, हवा के बुलबुले पेश किए बिना सेल / डीएनए मिश्रण को पूर्व-ठंडा 1 मिमी गैप इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में सावधानीपूर्वक पाइप करें।
    3. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेट करें: 1800 वी, 600 Ω, और 10 μF। इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स के 10 सेकंड के भीतर, क्यूवेट में 970 μL प्री-वार्म्ड रिकवरी मीडिया (इलेक्ट्रोकॉम्पिटेंट कोशिकाओं के साथ प्रदान किया गया) जोड़ें और पिपेटिंग द्वारा मिश्रण करें। अंत में, कोशिकाओं को एक माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 250 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। वांछित विविधता प्राप्त करने के लिए, 10-100 प्रतिक्रियाएं करें, और इनक्यूबेशन के बाद, सभी प्रतिक्रियाओं को एक ट्यूब में पूल करें।
    4. पीबीएस में 10-, 100-या 1,000 गुना पूल किए गए परिवर्तनों के 10 μL को पतला करके विविधता की गणना करें और उपयुक्त एंटीबायोटिक (एम्पीसिलीन के 75 मिलीग्राम / एमएल) वाले पोषक तत्वों की आगर प्लेटों पर 100 μL फैलाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें और फिर आगर प्लेटों पर कॉलोनियों की गिनती करें।
    5. सैद्धांतिक विविधता की गणना निम्नानुसार करें:
      सैद्धांतिक अधिकतम विविधता = 10 x कमजोर पड़ने कारक x कॉलोनियों की संख्या x इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रियाओं की संख्या।
      नोट: पुस्तकालय की गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए, सेंगर अनुक्रमण द्वारा कम से कम 20 कॉलोनियों को अनुक्रमित करें। अधिकांश क्लोनों में एक सम्मिलित होना चाहिए, और सभी अद्वितीय होना चाहिए।
    6. एलबी माध्यम के 400-1,000 एमएल को शेष पूल किए गए परिवर्तनों के साथ उपयुक्त एंटीबायोटिक युक्त टीका लगाएं और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 180 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
  6. प्लास्मिड लाइब्रेरी की तैयारी
    1. रात भर की संस्कृति से, ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करें (न्यूक्लियस मुक्त पानी में बैक्टीरियल कल्चर और 50% ग्लिसरॉल समाधान की समान मात्रा मिलाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें) और प्लास्मिड मैक्सी किट का उपयोग करके प्लास्मिड लाइब्रेरी को शुद्ध करें।
  7. एएवी वायरल लाइब्रेरी का उत्पादन
    1. वायरल लाइब्रेरी तैयार करें जैसा कि पहले वर्णित27 है। प्लास्मिड लाइब्रेरी (pRep2Cap2_PI, पेप्टाइड इंसर्ट) को एडेनो-हेल्पर प्लास्मिड के साथ एचईके 293 टी कोशिकाओं में पॉलीथाइलेनिमाइन (पीईआई) जैसे अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके स्थानांतरित करें।
    2. 3 दिनों के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें फ्रीज-पिघलने के तीन चक्रों के अधीन करें। सीज़ियम क्लोराइड ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके वायरल लाइसेट को शुद्ध करें, इसके बाद पीबीएस के लिए बफर एक्सचेंज करें, और अंत में वायरल कणों को केंद्रित करें।
  8. डीडी-पीसीआर का उपयोग करके एएवी वेक्टर अनुमापन
    1. 198 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी में एएवी वेक्टर स्टॉक के 2 μL को क्रमिक रूप से पतला करें ताकि 1: 106 अंतिम कमजोर पड़ने का उत्पादन हो सके। हर बार 200 μL पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक नो-टेम्पलेट नियंत्रण (NTC) जोड़ें।
      नोट: अतिरिक्त कम या उच्च कमजोर पड़ने की परख की जा सकती है (1: 105-1: 107)।
    2. एक 20x प्राइमर-प्रोब मिश्रण तैयार करें। 100 μM प्राइमरों (फॉरवर्ड और रिवर्स, Rep2, और ITR) में से प्रत्येक का 3.6 μL जोड़ें, 100 μM dd-PCR प्रोब्स (Rep2 और ITR) में से प्रत्येक 1 μL, और 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 3.6 μL जोड़ें।
      नोट: एएवी लाइब्रेरी को एफएएम-लेबल जांच के साथ पता लगाए गए ट्रांसजेन-लक्षित प्राइमर-प्रोब सेट (रेप 2) और एचईएक्स-लेबल जांच के साथ पता लगाए गए आईटीआर-लक्षित प्राइमर-प्रोब सेट का उपयोग करके मापा जाता है।
    3. 5.5 μL नमूना, 20x प्राइमर-प्रोब मिश्रण का 1.1 μL, प्रोब के लिए डीडी-पीसीआर सुपरमिक्स का 11 μL (कोई dUTP नहीं), और न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 4.4 μL जोड़कर 22 μL पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें। यह प्राइमरों और जांच के लिए क्रमशः 900 एनएम और 250 एनएम की सांद्रता पैदा करता है।
    4. ड्रॉपलेट जनरेटर का उपयोग करके बूंदों को उत्पन्न करें, प्रतिक्रिया को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, प्लेट को थर्मोसाइक्लर में रखें, और 94 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक विकृतीकरण चरण चलाएं, इसके बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के 40 चक्र और 58 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट। इसके बाद, पोलीमरेज़ को 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्म करें और एक अंतिम शीतलन चरण जोड़ें। एक ड्रॉपलेट रीडर में प्रतिक्रियाओं को पढ़ें और विश्लेषण 28 पर आगेबढ़ें।
    5. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर सहेजी गई DD-PCR प्लेट फ़ाइल खोलें। गाइड के रूप में एनटीसी का उपयोग करके, प्रत्येक चैनल के लिए नकारात्मक और सकारात्मक बूंदों को अलग करने के लिए 1 डी आयाम टैब (प्रतिदीप्ति आयाम बनाम घटना संख्या) में थ्रेशोल्ड टूल का उपयोग करें, और डेटा को सीएसवी फ़ाइल में निर्यात करें।
    6. वेक्टर एकाग्रता की गणना करने के लिए, पहले सूत्र का उपयोग करके सुधार कारक सीएफ की गणना करें:
      Equation 1
      सीएफ ट्रांसजीन [पॉजिटिव] के लिए सकारात्मक बूंदों के अनुपात को निर्धारित करता है जो ट्रांसजीन और आईटीआर [सीएच 1 + सीएच 2 +] दोनों के लिए सकारात्मक हैं, ताकि कार्यात्मक वेक्टर कणों का पता लगाना सुनिश्चित किया जा सके। अंतिम वेक्टर एकाग्रता सी की गणना अब निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की जा सकती है:
      Equation 2
      डीएफ कमजोर पड़ने वाला कारक है (1: 105-1: 107 जैसा कि पहले निर्धारित किया गया था)। प्रति 20 μL / अच्छी प्रतिक्रिया की प्रतियां पतला नमूने के 5 μL के अनुरूप हैं। कारक 1,000 वीजी / एमएल (वायरल जीनोम / एमएल) के पैमाने को सही करता है। एक अनुकरणीय अनुमापन परिणाम तालिका 1 और चित्रा 3 में प्रदर्शित किया गया है।
  9. एनजीएस द्वारा एएवी वायरल लाइब्रेरी का विश्लेषण
    1. प्रूफ-रीडिंग पोलीमरेज़ किट का उपयोग करके 20 μL पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित करके 96-न्यूक्लियोटाइड पेप्टाइड सम्मिलन टुकड़े को बढ़ाएं (2x; चित्रा 4 देखें)। प्रतिक्रिया के लिए 1 x 108 vg, 100 μM प्राइमर (NGS_forward और NGS_reverse) में से प्रत्येक का 0.5 μL, और एंजाइम मिश्रण का 10 μL जोड़ें। न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ अंतिम मात्रा को 20 μL में समायोजित करें।
    2. प्रतिक्रिया को थर्मोसाइक्लर में स्थानांतरित करें और 98 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए एक विकृतीकरण चरण चलाएं, इसके बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के 30-35 चक्र, 59 डिग्री सेल्सियस पर 10 और 72 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड, इसके बाद 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और अंतिम शीतलन चरण।
    3. पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके नमूनों को शुद्ध करें। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें और शुद्धता और टुकड़े के आकार को सत्यापित करने के लिए 3% अगारोस जेल चलाएं।
    4. एनजीएस लाइब्रेरी की तैयारी के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार कम जटिलता नमूने किट के लिए लाइब्रेरी सिस्टम का उपयोग करके पीसीआर टुकड़ों को संसाधित करें। 30 एनजी पीसीआर टुकड़े के साथ अंतिम मरम्मत प्रतिक्रिया करें, इसके बाद 10 चक्रों के लिए एडाप्टर लिगेशन और पीसीआर प्रवर्धन करें। प्रतिक्रियाओं के शुद्धिकरण के लिए पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करें।
    5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए अभिकर्मकों किट का उपयोग करके आकार और शुद्धता को सत्यापित करने के लिए बायोएनालाइज़र पर अंतिम उत्पादों को संसाधित करें।
    6. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके एम्प्लिकॉन की मात्रा निर्धारित करें और उन्हें पूल करें। फ्लोरोमीटर (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) पर फिर से अंतिम पूल किए गए एनजीएस पुस्तकालय की मात्रा निर्धारित करें और बायोएनालाइज़र पर गुणवत्ता को सत्यापित करें।
    7. एनजीएस पुस्तकालयों को एकल-अंत (एसई) मोड में अनुक्रमित करें, 75-चक्र उच्च आउटपुट किट का उपयोग करके, 84 की पढ़ने की लंबाई और 8 के सूचकांक 1 के साथ।
      नोट: इस लेख में उदाहरणों का अनुक्रमण ईएमबीएल हीडलबर्ग (http://www.genecore.embl.de/) की जीनकोर सुविधा में किया गया था।
    8. पायथन 3 और बायोपीथन के साथ एनजीएस अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करें। फाइलें https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 पर पाई जा सकती हैं (वैकल्पिक रूप से https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215 पर)। एनजीएस विश्लेषण दो चरणों से बना है।
      1. पहले चरण में, उन अनुक्रमों के लिए अनुक्रम फ़ाइलों को खोजें जो कुछ मानदंडों को पूरा करते हैं (सम्मिलन साइट को फ्लैंक करने वाले मान्यता अनुक्रमों की उपस्थिति) ( चित्रा 4, चरण 1.9.8.5 देखें)। यह एक स्क्रिप्ट (स्क्रिप्ट # 1) और एक कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल का उपयोग करके किया जाता है जो आवश्यक जानकारी प्रदान करता है। एक बार सही अनुक्रम की पहचान हो जाने के बाद, प्रोग्राम आउटपुट फ़ाइल में अनुक्रम निकालता है और संग्रहीत करता है, जो अनुक्रमण फ़ाइल के समान नाम के साथ एक txt फ़ाइल है।
      2. दूसरा चरण आउटपुट फ़ाइलों का विश्लेषण है। लाइब्रेरी में अनुक्रम नौ एमिनो-एसिड सम्मिलित में छह न्यूक्लियोटाइड (एजीडब्ल्यूजीजीसी, डब्ल्यू = ए / टी) में से किसी एक के साथ शुरू होते हैं। इस प्रारंभ अनुक्रम के आधार पर, पेप्टाइड का अनुवाद किया जाता है। यह आउटपुट फ़ाइलों को उत्पन्न करता है जिसमें पेप्टाइड वेरिएंट (पीवी) होते हैं।
      3. दो फ़ोल्डर तैयार करें: स्क्रिप्ट और डेटा। डेटा फ़ोल्डर में, अनुक्रमण से उत्पन्न gzip-संपीड़ित फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएँ। स्क्रिप्ट फ़ोल्डर में, निम्न फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएँ, पायथन फ़ाइल: स्क्रिप्ट # 1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; पायथन फ़ाइल: स्क्रिप्ट # 2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल: Barcode_Script_JoVE.conf; और लुक-अप टेबल (एलयूटी) फ़ाइल: ज़ुओर्डनुंग.txt।
      4. स्क्रिप्ट चलाने से पहले, स्क्रिप्ट फ़ोल्डर में निम्न फ़ाइलों को संपादित करें। "ज़ुओर्डनुंग.txt" फ़ाइल खोलें और दो टैब-अलग कॉलम, gzip फ़ाइलों के नाम (कॉलम 1), और वांछित अंतिम नाम (कॉलम 2; टैब-अलग मान) जोड़ें।
        नोट: नमूना txt फ़ाइलें GitHub फ़ोल्डर "PV_analysis_script" में पाए जाते हैं। GitHub फ़ोल्डर में प्रदान की गई फ़ाइलें उपरोक्त लाइब्रेरी से तीन नमूना डेटा के विश्लेषण के लिए तैयार की जाती हैं: xaa.txt.gz, xab.txt.gz, और xac.txt.gz। आउटपुट फ़ाइलें भी प्रदान की जाती हैं।
      5. कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल "Barcode_Script_JoVE.conf" में निम्न चर परिवर्तित करें:
        my_dir = "~/Data/"
        filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
        अनुक्रम-विशिष्ट चर: BCV_size = 27, बीसीवीबाएं = टीसीसीएजीजीसीसीएजी, बीसीवीदाएं = जीसीसीसीएजीजीजीजी, बीसीवीएलओसी = 30, बीसीवीमार्जिन = 8, बीसीवीleft_revcomp = जीसीसीजीसीसीटीजीजीसी, बीसीवीright_revcomp = सीटीजीजीसीसीसीसी, और बीसीवीloc_revcomp = 41 (विवरण के लिए चित्रा 4 देखें)।
      6. वेरिएंट अनुक्रम का पता लगाने और निष्कर्षण को कॉल करने के लिए निम्न आदेश का उपयोग करें:
        >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
        नोट: आउटपुट निकाले गए डीएनए अनुक्रमों और उनकी पढ़ने की संख्या के साथ टीएक्सटी फाइलें हैं। इस फ़ाइल के शीर्ष लेख में सांख्यिकीय डेटा होता है (यानी, पढ़ने की कुल संख्या और निकाले गए रीड)। इन डेटा को अगली फ़ाइलों में स्थानांतरित कर दिया जाता है। ये txt डेटा स्क्रिप्ट # 2 के लिए इनपुट फाइलें हैं, जिसमें डीएनए अनुक्रमों का अनुवाद, रैंक और विश्लेषण किया जाता है।
      7. निम्न आदेश का उपयोग कर पीवी निष्कर्षण और विश्लेषण करें:
        >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. स्क्रिप्ट # 2 की टेक्स्ट आउटपुट फ़ाइलों का विश्लेषण करें। स्क्रिप्ट # 2 की आउटपुट फ़ाइलों को विश्लेषण के प्रकार के आधार पर एक्सटेंशन के साथ "ज़ुओर्डनुंग.txt" में एलयूटी के दूसरे कॉलम का उपयोग करके नामित किया गया है।
        नोट: सुनिश्चित करें कि तीन आउटपुट फ़ाइलों में पहली पंक्तियों में सांख्यिकीय डेटा है ("वैध पीवी रीड्स का #", "अमान्य पीवी रीड का # ", और "अद्वितीय पीवी रीड का # "), इनपुट टीएक्सटी फ़ाइलों (स्क्रिप्ट # 1 का आउटपुट) से प्रत्येक डीएनए अनुक्रम के सूचकांक के साथ एक पहला कॉलम, और निम्नलिखित कॉलम: (1) "... analyzed_all.csv": "नमूना:" (डीएनए अनुक्रम), "#" (पढ़ने की संख्या), "Frw या Rev" (आगे या रिवर्स रीड), और "पीवी" (अनुवादित पेप्टाइड अनुक्रम)। अमान्य अनुक्रमों में पिछले दो कॉलम में "एनए" और "मान्य नहीं" हैं। (2) "... analyzed_validSeq.csv": पिछली फ़ाइल के समान, मान्य अनुक्रमों के लिए फ़िल्टर किया गया। (3) "... analyzed_PV.csv": "पीवी" (अनुवादित पेप्टाइड अनुक्रम), "#" (पढ़ने की संख्या), और "गिनती" (पिछली फ़ाइलों में एफआरडब्ल्यू और रेव गणनाओं को विलय कर दिया जाता है और गिनती 1 या 2 दी जाती है)।
      9. उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के आधार पर उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके आउटपुट फ़ाइलों की कल्पना करें।

2. एएवी 2 यादृच्छिक 7-मेर पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी चयन

  1. वांछित गुणों वाले उम्मीदवारों के लिए पुनरावर्ती चयन करने के लिए पसंद के मॉडल में निर्देशित विकास के लिए परिमाणीकरण और गुणवत्ता-नियंत्रण (अनुभाग 1) के बाद एएवी लाइब्रेरी का उपयोग करें (चित्र 5)16,18,21 देखें।
    नोट: इन उम्मीदवारों का उपयोग तब बारकोडेड लाइब्रेरी की पीढ़ी के लिए किया जाता है जैसा कि अनुभाग 3 में नीचे वर्णित है।

3. बारकोडेड एएवी कैप्सिड लाइब्रेरी तैयारी और विश्लेषण

नोट: पेप्टाइड डिस्प्ले स्क्रीन में संभावित विशिष्ट और कुशल एएवी कैप्सिड्स के एक सेट की पहचान के बाद, पहचाने गए पेप्टाइड अनुक्रमों की कार्यक्षमता को सत्यापित करें और आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले या अच्छी तरह से वर्णित संदर्भ एएवी कैप्सिड वेरिएंट के सेट के साथ उनकी तुलना करें। ऐसा करने के लिए, कैप्सिड अनुक्रम को आईटीआर के बिना एक प्रतिनिधि / कैप हेल्पर निर्माण में डाला जाता है।

  1. बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी का उत्पादन
    1. तीन-प्लास्मिड प्रणाली का उपयोग करके प्रत्येक कैप्सिड संस्करण के लिए पुनः संयोजक एएवी उत्पादन करें, जैसा कि पहले वर्णित24 है।
      नोट: विभिन्न कैप्सिड वेरिएंट को अलग करने के लिए, आईटीआर-फ्लैंक्ड रिपोर्टर ट्रांसजीन प्लास्मिड लंबाई में 15 न्यूक्लियोटाइड का एक अनूठा बारकोड रखता है। बारकोड उन्नत पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईवाईएफपी) और पॉलीए सिग्नल ( चित्रा 6 ए देखें) के बीच 3 'यूटीआर (अअनुवादित क्षेत्र) पर स्थित है। ईवाईएफपी अभिव्यक्ति एक मजबूत सर्वव्यापी साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर द्वारा संचालित होती है जो आरएनए प्रतिलेख के पर्याप्त स्तर प्रदान करती है।
    2. तीन से कम न्यूक्लियोटाइड के होमोपॉलिमर, <65% 29 की जीसी सामग्री और चार न्यूक्लियोटाइड24 से अधिक हैमिंग दूरी के साथ लंबाई में 15 न्यूक्लियोटाइड के बारकोड डिजाइन करें।
    3. एक अद्वितीय बारकोड ले जाने वाले ट्रांसजीन प्लास्मिड के साथ संयोजन में प्रत्येक कैप्सिड का अलग से उत्पादन करें। इस तरह, प्रत्येक कैप्सिड संस्करण को एक अलग बारकोड के साथ टैग किया जाता है जो इसकी विशिष्ट ट्रैकिंग को सक्षम करता है ( चित्रा 6 बी देखें)।
  2. डीडी-पीसीआर का उपयोग करके एएवी वेक्टर अनुमापन
    1. एएवी अनुमापन करें जैसा कि पहले अनुभाग 1.8 में वर्णित है, Rep2 प्राइमर जोड़ी को YFP प्राइमर जोड़ी के साथ बदलकर।
    2. व्यक्तिगत एएवी प्रस्तुतियों को निर्धारित करें और अंतिम बारकोडेड लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक उत्पादन की समान मात्रा को पूल करें।
    3. अंतिम एकाग्रता और गुणवत्ता की जांच करने के लिए अंतिम पुस्तकालय को फिर से निर्धारित करें ( चित्रा 7 देखें)।
  3. विवो अनुप्रयोग में बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी
    1. बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी को व्यवस्थित रूप से पसंद की मॉडल प्रणाली पर लागू करें (उदाहरण के लिए चूहों में व्यवस्थित रूप से24)।
    2. प्रयोग के आधार पर ऑन-और ऑफ-टारगेट ऊतकों (यानी, यकृत, फेफड़े, हृदय, डायाफ्राम, चिकनी मांसपेशी, ग्रहणी, अग्न्याशय, बृहदान्त्र, बाइसेप्स, अंडाशय, पेट, आंतरिक कान, गुर्दे, पेट की महाधमनी, वक्ष महाधमनी, मस्तिष्क, भूरे और सफेद वसा, और प्लीहा) या सेल प्रकारों को इकट्ठा करें। उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें, डीएनए / आरएनए निकालें, और एनजीएस मात्रा विश्लेषण लागू करें, जैसा कि अगले खंड में वर्णित है।
  4. डीएनए / आरएनए निष्कर्षण
    1. आरएनए मिनी किट का उपयोग करके रुचि के ऊतकों से डीएनए और आरएनए निकालें।
    2. 2 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में रुचि के ऊतक (1 मिमी3, लगभग 5 मिलीग्राम) का एक छोटा टुकड़ा रखें।
    3. ऊतक में β-मर्काप्टोएथेनॉल (1%) और 5 मिमी स्टील बीड्स के साथ मिश्रित लाइसिस बफर के 350 μL जोड़ें (फ्यूम हुड के तहत β-मर्काप्टोएथेनॉल के साथ नमूने संभालें)।
    4. 40 हर्ट्ज पर 45 सेकंड के लिए एक ऊतक लाइज़र में ऊतक को समरूप करें।
    5. 10 μL प्रोटीन K (10 mg/mL) जोड़ें और 400 आरपीएम पर हिलाते हुए 55 °C पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, सतह पर तैरने वाला एकत्र करें, और डीएनए / आरएनए किट के निर्माता के प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
    7. प्रत्येक चरण में 350 μL वॉश बफर के साथ धोने के चरण को दो चरणों में विभाजित करें। इन धोने के चरणों के बीच में, RNase-मुक्त DNase I के साथ कॉलम पर शेष डीएनए को पचाएं। निर्माता के निर्देश के अनुसार तैयार DNase I समाधान के 80 μL को कॉलम पर जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    8. न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ स्तंभ से एल्यूट आरएनए / डीएनए। पृथक आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस और जीडीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. सीडीएनए संश्लेषण
    1. रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया से पहले आरएनए नमूनों को 15-30 मिनट (आरएनए नमूनों से दूषित डीएनए को पूरी तरह से हटाने के लिए) के डीएनएस आई उपचार के एक और दौर के अधीन करें। डीएनएस आई समाधान का 1 μL, बफर का 4 μL (किट के साथ प्रदान किया गया), और न्यूक्लियस-मुक्त पानी को 40 μL से 212 ng RNA की अंतिम मात्रा में जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी निष्क्रिय करें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार किट का उपयोग करके आरएनए के 150 एनजी का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित करें। नमूने से वायरल डीएनए को दूषित करने की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस के बिना नियंत्रण शामिल करें। सीडीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
      नोट: इष्टतम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए इनपुट आरएनए की मात्रा ऊतक प्रकार और संबंधित ऊतक में अपेक्षित पारगमन दक्षता के आधार पर भिन्न हो सकती है।
  6. एएवी वायरल लाइब्रेरी का विश्लेषण (in-vivo) एनजीएस द्वारा
    1. कम लागत पर उच्च अनुक्रमण गहराई प्राप्त करने के लिए, इलुमिना अनुक्रमण के माध्यम से एनजीएस करें जैसा कि पहले वर्णित है (खंड 1.9)। बारकोड अनुक्रम को बढ़ाएं, और फिर अनुक्रमण एडाप्टर को एम्प्लिकॉन में बदल दें।
    2. एम्प्लिकॉन के दोनों किनारों पर अनुक्रमण एडाप्टर की छोटी-पठन लंबाई और बंधाव के कारण, डिजाइन करते समय, जांचें कि एनजीएस रीड के भीतर बारकोड अनुक्रम की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए एम्प्लिकॉन पर्याप्त रूप से छोटा है। वायरल जीनोम और वायरल ट्रांस्क्रिप्ट के भीतर बारकोड के अनुक्रमण के लिए, पीसीआर एम्प्लिकॉन को 113 बीपी लंबा बनाया गया है ( चित्रा 8 देखें)।
    3. बारकोडेड क्षेत्र को प्राइमर बीसी-सेक फॉरवर्ड और बीसी-सेक रिवर्स के साथ बढ़ाएं। निम्नलिखित पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें: हाई-फिडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़ का 0.5 μL, 5x बफर का 10 μL, प्रत्येक 100 μM प्राइमर (BC-seq fw/ BC-seq rv) का 0.25 μL, और 10 mM dNTPs का 1 μL। एक टेम्पलेट के रूप में सीडीएनए या डीएनए / प्रतिक्रिया के 25 एनजी का उपयोग करें और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ अंतिम मात्रा को 50 μL तक समायोजित करें।
    4. संदूषण से बचने के लिए एक स्वच्छ पीसीआर हुड के तहत पीसीआर मास्टर-मिक्स तैयार करें। निम्नलिखित साइकिल िंग स्थितियों का उपयोग करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, इसके बाद 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर 40 चक्र और 20 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम 5 मिनट का कदम।
    5. पीसीआर मास्टर-मिक्स में दूषित डीएनए की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पीसीआर नियंत्रण शामिल करें। सीडीएनए नमूनों के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस के बिना नियंत्रण शामिल करें। अंत में, AAV इनपुट लाइब्रेरी के साथ एक नमूना शामिल करें। इस जानकारी का उपयोग विश्लेषण में उपयोग की जाने वाली Normalization_Variant.txt फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा।
    6. पीसीआर शुद्धिकरण से पहले जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रत्येक नमूने के पीसीआर टुकड़े के आकार को सत्यापित करें। उत्तरार्द्ध व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुंबकीय मोतियों या कॉलम-आधारित डीएनए शुद्धिकरण प्रणालियों का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कम जटिलता नमूने के लिए पुस्तकालय प्रणाली का उपयोग करके एनजीएस लाइब्रेरी तैयार करें, जैसा कि पहले खंड 1.9 में वर्णित है।
    8. डीएसडीएनए एचएस किट के माध्यम से डीएनए एकाग्रता निर्धारित करें और पहले वर्णित (अनुभाग 1.9.6) के रूप में पुस्तकालय की गुणवत्ता का विश्लेषण करें, इसके बाद पूलिंग। फ्लोरोमीटर पर पूल किए गए पुस्तकालय की मात्रा निर्धारित करें और बायोएनालाइज़र पर गुणवत्ता का आकलन करें।
    9. खंड 1.9.7 में चर्चा के अनुसार एनजीएस अनुक्रमण करें।
    10. डीएनए पर ऊतकों या अंगों के बीच पूल किए गए पुस्तकालय के वितरण का आकलन करने के लिए क्यूपीसीआर द्वारा ट्रांसजीन (वायरल जीनोम) और हाउसकीपिंग जीन की प्रतिलिपि संख्या की मात्रा निर्धारित करें।
    11. ईवाईएफपी (ट्रांसजीन) और जीएपीडीएच (ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज, हाउसकीपिंग जीन) की प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए निम्नानुसार 30 μL qPCR प्रतिक्रिया सेट करें:
      1. ईवाईएफपी के लिए 60x प्राइमर/प्रोब मिक्स तैयार करें (1.5 μM YFP_fw, 1.5 μM YFP_rv, और 0.6 μM YFP_probe; सामग्री की तालिका देखें)। हाउसकीपर जीन की प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए जीएपीडीएच प्राइमर / प्रोब मिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। बर्फ पर प्रतिक्रिया सेट करें।
      2. एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें (15 μL, सामग्री की तालिका देखें) और सभी नमूनों और मानकों के लिए 60x प्राइमर / प्रोब मिक्स (0.5 μL) जोड़ें (मानकों के लिए प्रतिलिपि संख्याओं की गणना करने के लिए, निम्नलिखित लिंक का उपयोग करें: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html)। बर्फ पर प्रतिक्रिया सेट करें।
      3. मास्टर मिश्रण के 15.5 μL को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें और संबंधित कुएं में 14.5 μL नमूना (कुल डीएनए एकाग्रता का 75 ng) या मानक जोड़ें। पन्नी, भंवर और स्पिन के साथ 96-वेल प्लेट को संक्षिप्त रूप से सील करें।
      4. डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूने के 10 μL को 384-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। पन्नी के साथ प्लेट को सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर स्पिन करें।
      5. प्रतिक्रिया मिश्रण को 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के प्रारंभिक तापमान का उपयोग करके थर्मोसाइक्लर में इनक्यूबेट करें, इसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट का प्रारंभिक सक्रियण चरण। 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 40 चक्र और 1 मिनट24 के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग / विस्तार करें।
      6. द्विगुणित जीनोम (डीजी) की संख्या प्राप्त करने के लिए, जीएपीडीएच कॉपी नंबर का उपयोग करें और दो से विभाजित करें। फिर, ईवाईएफपी कॉपी नंबर का मान लें और डीजी की संख्या से विभाजित करें, जिसके परिणामस्वरूप वेक्टर जीनोम प्रति द्विगुणित जीनोम (वीजी / डीजी) होता है। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए Normalization_Organ.txt फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए इस मान का उपयोग करें।
    12. वेनमैन एट अल जैसे एनजीएस अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करें।24, Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022) में कस्टम कोड का उपयोग करना। वर्कफ़्लो में फ्लैंकिंग अनुक्रमों, उनकी लंबाई और स्थान (स्क्रिप्ट # 1_BarcodeDetection.py) द्वारा निर्देशित बारकोड अनुक्रमों का पता लगाना शामिल है, साथ ही ऊतकों के सेट पर बारकोड संवर्धन और वितरण का विश्लेषण (स्क्रिप्ट # 2_BarcodeAnalysis.py)।
      1. बारकोड का पता लगाएं और उन्हें एएवी वेरिएंट को असाइन करें। अनुक्रमण डेटा को एक निर्देशिका में संग्रहीत फास्टक्यू फ़ाइलों के रूप में रखें (उदाहरण के लिए, "Data_to_analyze")। इनपुट लाइब्रेरी के लिए अनुक्रमण डेटा फ़ाइल इस निर्देशिका में शामिल है और केवल इनपुट लाइब्रेरी में कैप्सिड अनुपात की गणना करने के लिए उपयोग की जाती है।
      2. स्क्रिप्ट निष्पादित करने से पहले, दो टैब-सीमांकित टेक्स्ट फाइलें बनाएं: कैप्सिड वेरिएंट फ़ाइल (उदाहरण फ़ाइल "वेरिएंट.txt") एएवी कैप्सिड वेरिएंट नामों को सौंपे गए बारकोड अनुक्रमों के साथ, और संदूषण फ़ाइल ("संदूषण.txt देखें") जो संभावित संदूषण (प्रयोगशाला में उपलब्ध अन्य बारकोड, संदूषण में योगदान) से आते हैं।
      3. अंत में, निम्नलिखित जानकारी को शामिल करने के लिए कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल "Barcode_Script.conf" संपादित करें: अनुक्रमण डेटा के साथ फ़ोल्डर का पथ (जैसे, "Data_to_analyze"), बारकोड के फ्लैंकिंग क्षेत्रों का अनुक्रम, उनकी स्थिति, और बारकोड डिटेक्शन के लिए विंडो आकार (1.9.8.5 के समान, चित्रा 8 देखें)।
      4. स्क्रिप्ट # 1_BarcodeDetection.py और कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइलों के लिए प्रदान किए गए पथों के साथ बारकोड का पता लगाने के लिए कॉल करने के लिए निम्न आदेश का उपयोग करें:
        >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
        नोट: स्क्रिप्ट # 1_BarcodeDetection.py निष्पादन का आउटपुट प्रति कैप्सिड संस्करण में पढ़ने की गिनती के साथ-साथ कच्चे डेटा से पुनर्प्राप्त रीड की कुल संख्या के साथ टेक्स्ट फाइलें हैं।
      5. निम्नलिखित txt फ़ाइलों के साथ स्क्रिप्ट # 2_BarcodeAnalysis.py निष्पादित करके ऊतकों या अंगों के बीच बारकोडेड एएवी कैप्सिड्स के वितरण का मूल्यांकन करें:
        1. "ज़ुओर्डनुंग.txt" फ़ाइल में, बारकोड डिटेक्शन रन से प्राप्त प्रत्येक txt फ़ाइल का नाम एक ऊतक / अंग नाम पर असाइन करें: पहले कॉलम में txt फ़ाइलों के नाम और टैब-सीमांकित असाइनमेंट में संबंधित ऊतक / अंग नाम।
          नोट: एक उदाहरण के लिए, "उदाहरण" फ़ोल्डर (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022) में जाँचें। अंग के नाम में सीडीएनए या जीडीएनए माप और जैविक प्रतिकृति संख्या (एम 1, एम 2, आदि) को परिभाषित करने वाले वर्ण शामिल हो सकते हैं।
        2. ऑन- और ऑफ-टारगेट अंगों के नामों की सूची के साथ एक "अंग.txt" पाठ फ़ाइल बनाएं, जो असाइनमेंट "ज़ुओर्डनुंग.txt" फ़ाइल में दिए गए नामों के अनुरूप है ("उदाहरण" फ़ोल्डर देखें: https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022)।
        3. सभी कैप्सिड वेरिएंट और सभी अंगों / ऊतकों के लिए सामान्यीकृत मूल्यों के साथ "Normalization_Organ.txt" और "Normalization_Variant.txt" टैब-सीमांकित टेक्स्ट फाइलें बनाएं। "Normalization_Organ.txt" फ़ाइल के पहले कॉलम में, प्रत्येक अंग के लिए दिए गए नाम लिखें (जैसा कि असाइनमेंट फ़ाइल "ज़ुओर्डनुंग.txt" में) और दूसरे कॉलम में संबंधित ऊतकों के लिए सामान्यीकरण मान, अनुभाग 3.6.11 में उत्पन्न होता है।
        4. "Normalization_Variant.txt" फ़ाइल के पहले कॉलम को कैप्सिड नामों की सूची के साथ भरें और दूसरे कॉलम को पूल की गई लाइब्रेरी में प्रत्येक कैप्सिड के लिए रीड काउंट के सामान्यीकृत मूल्यों के साथ भरें (सामान्यीकरण की गणना पहली स्क्रिप्ट से उत्पन्न इनपुट लाइब्रेरी के लिए टीएक्सटी आउटपुट फ़ाइल के आधार पर की जा सकती है)।
        5. ऊपर उल्लिखित सभी अतिरिक्त फ़ाइलों के पूर्ण पथ निर्दिष्ट करके कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल संपादित करें. स्क्रिप्ट # 2_BarcodeAnalysis.py को निष्पादित करें:
          >python3 / Script #2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
          नोट: बारकोड विश्लेषण स्क्रिप्ट कई फ़ाइलों को आउटपुट करती है: पहले वर्णित कई सामान्यीकरण चरणों के आधार पर विभिन्न ऊतकों के भीतर कैप्सिड वितरण के सापेक्ष एकाग्रता (आरसी) मूल्यों वाली टेक्स्ट फाइलें, और स्प्रेडशीट फ़ाइल जो टेक्स्ट फ़ाइल डेटा को मर्ज किए गए मैट्रिक्स डेटा में जोड़ती है। उत्तरार्द्ध का उपयोग क्लस्टर विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जा सकता है।
        6. कैप्सिड गुणों को अलग करने और ऊतकों में आरसी प्रोफाइल के आधार पर उनकी समानता का मूल्यांकन करने के लिए डेटा की कल्पना करें और मैट्रिक्स डेटा का क्लस्टर विश्लेषण करें। अतिरिक्त स्क्रिप्ट PCA_heatmap_plot का उपयोग करें। R को भंडार में रखा गया है:
          >आरस्क्रिप्ट -- वेनिला ~ / पीसीए। आर ~ / सापेक्ष एकाग्रता.xls
          नोट: स्क्रिप्ट इनपुट के रूप में सापेक्ष एकाग्रता.xls फ़ाइलों को लेती है और पदानुक्रमित क्लस्टर हीटमैप और प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के दो भूखंड उत्पन्न करती है।
        7. प्लॉट (हीटमैप के अक्ष, पीसीए के प्रमुख घटक) या पीएनजी पैरामीटर (रंग, आकार, लेबलिंग) को संशोधित करने के लिए, आर स्क्रिप्ट खोलें और टिप्पणी किए गए अनुभागों में दिए गए निर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

एक एएवी 2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी की पीढ़ी। इंजीनियर एएवी के चयन की दिशा में पहले कदम के रूप में, प्लास्मिड लाइब्रेरी की पीढ़ी का वर्णन किया गया है। पेप्टाइड इंसर्ट का उत्पादन पतित प्राइमरों का उपयोग करके किया जाता है। 64 से 20 तक के लोगों में कोडन के संयोजन को कम करने से डीएनए पर पुस्तकालय विविधता को कम करके स्टॉप कोडन को खत्म करने और एनजीएस विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के फायदे हैं, लेकिन प्रोटीन स्तर नहीं। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड इंसर्ट को एकल-फंसे हुए डीएनए (चित्रा 1) के रूप में खरीदा जाता है, जिसे पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग करके डबल-फंसे हुए डीएनए में परिवर्तित किया जाता है। इस प्रतिक्रिया की गुणवत्ता को बायोएनालाइज़र में नियंत्रित किया जाता है। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, तीन चक्रों ने 10 या 30 चक्रों की तुलना में एक मजबूत बैंड का उत्पादन किया। फिर तीन-न्यूक्लियोटाइड ओवरहैंग उत्पन्न करने के लिए इंसर्ट को बीजीएलआई के साथ पचाया जाता है। डबल-फंसे हुए इंसर्ट के ओवरहैंग अनुक्रम के बगल में न्यूक्लियोटाइड एक ए या टी हो सकता है (डब्ल्यू ए या टी के लिए अस्पष्टता कोड है), जो एक कोडन की तीसरी स्थिति में है जो आर्जिनिन (आर) या सेरीन (एस) को एन्कोड करता है। वेक्टर (pRep2Cap2_PIS) में पेप्टाइड सम्मिलन साइट में एक फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन होता है जो सम्मिलन साइट के तुरंत बाद स्टॉप कोडन के निर्माण के कारण, एक सम्मिलन की अनुपस्थिति में कैप्सिड के उत्पादन को रोकता है। इस प्लास्मिड का एसएफआईआई पाचन तीन-न्यूक्लियोटाइड ओवरहैंग उत्पन्न करता है जो पेप्टाइड-एन्कोडिंग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड इंसर्ट में उत्पन्न ओवरहैंग से मेल खाते हैं। प्लास्मिड लाइब्रेरी की जटिलता को अधिकतम करने के लिए लिगेशन को इष्टतम परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। इस अंत तक, परिवर्तन के लिए, उच्च दक्षता के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बैक्टीरिया का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन किया गया था।

प्लास्मिड लाइब्रेरी की विविधता की गणना कॉलोनी गणना के आधार पर की जाती है, जो आमतौर पर इस प्रकार के पुस्तकालय के लिए लगभग 1 x 108 होती है। उपनिवेशों की कुल संख्या एनजीएस विश्लेषण में पुस्तकालय की अधिकतम संभावित विविधता से मेल खाती है, जैसा कि बाद में चर्चा की गई है। प्लास्मिड लाइब्रेरी का उपयोग तब एएवी लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, जिसे यहां विस्तार से वर्णित नहीं किया गया है, लेकिन कहीं और27।

डीडी-पीसीआर का उपयोग करके इस पुस्तकालय का परिमाणीकरण किया गया था। आमतौर पर, दो क्षेत्रों की मात्रा निर्धारित की जाती है, वायरल जीनोम के भीतर एएवी 2 प्रतिनिधि जीन और आईटीआर ( चित्रा 3 और तालिका 1 देखें)। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, वायरल जीनोम के लिए सकारात्मक बूंदों में से, 99.2% आईटीआर (सीएच 1 + सीएच 2 +) के लिए भी सकारात्मक हैं, जो एएवी लाइब्रेरी के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण है और सुझाव देता है कि एएवी कैप्सिड में पूर्ण वायरल जीनोम होते हैं। vg/mL में एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, डबल-पॉजिटिव बूंदों के सकारात्मक अनुपात की गणना की जाती है और कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा प्रवर्धन से पहले प्रतियों की सही संख्या प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है।

एएवी लाइब्रेरी की गुणवत्ता का मूल्यांकन तब एनजीएस विश्लेषण द्वारा किया जाता है, जो उपयुक्त प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर से शुरू होता है। इसके बाद, पीसीआर उत्पाद को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके संसाधित किया जाता है, जो पीसीआर उत्पाद में इंडेक्स युक्त एडाप्टर जोड़ता है। एनजीएस उत्पादों को अनुक्रमित किया जाता है, और पायथन का उपयोग करके फ़ाइलों का विश्लेषण किया जाता है। एक एएवी 2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी से तीन नमूना डेटा प्रदान किए जाते हैं। स्क्रिप्ट # 1 इनपुट फ़ाइल में प्रत्येक अनुक्रम (नमूने में प्रवर्धित डीएनए खंड की सभी पीसीआर प्रतियों के अनुक्रमों की सूची) को जैव सूचना विज्ञान द्वारा बीसीवीबाएं और बीसीवीदाएं अनुक्रमों, या बीसीवीleft_comp और बीसीवीright_comp अनुक्रमों के लिए खोजा जाता है। यदि किसी भी संयोजन की पहचान की जाती है, तो निहित अनुक्रम निकाला जाता है और आउटपुट फ़ाइल में जोड़ा जाता है (चित्रा 4 देखें)। दोनों लिपियों का आउटपुट एनजीएस लाइब्रेरी तैयारी के बारे में सांख्यिकीय डेटा प्रदान करता है। सभी तीन सेटों में, लाइब्रेरी के लिए विशिष्ट हस्ताक्षर अनुक्रमों के आधार पर निकाले गए रीड, कुल पढ़ने का लगभग 94% प्रतिनिधित्व करते हैं, जो एक अच्छी गुणवत्ता का सुझाव देता है। स्क्रिप्ट # 2 का आउटपुट आगे सांख्यिकीय डेटा प्रदान करता है, और निकाले गए डीएनए अनुक्रम का अनुवाद अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण डेटा उत्पन्न करता है। "अमान्य पीवी रीड्स का #" (यानी, अनुक्रम जिनमें इन-सिलिको अनुवाद शुरू करने और अवशेषों आरजी या एसजी को एन्कोड करने के लिए उपयोग किए जाने वाले छह न्यूक्लियोटाइड की कमी होती है) बरामद रीडिंग के 1% से कम है, जो एक अच्छी अनुक्रमण गुणवत्ता की पुष्टि करता है। दूसरी स्क्रिप्ट के आउटपुट (यानी, निकाले गए डीएनए अनुक्रमों का अनुवाद और रैंकिंग) अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं, जैसे कि प्रति पेप्टाइड संस्करण पढ़ने की संख्या या प्रत्येक पेप्टाइड संस्करण को जन्म देने वाले डीएनए अनुक्रमों की संख्या। फ़ाइलों में से, जो "analyzed_PVs" में समाप्त होते हैं, उनमें केवल वैध डीएनए पढ़ते हैं, और विश्लेषण पेप्टाइड अनुक्रम स्तर पर किया जाता है। वैध पठनों में से, 99% से अधिक अद्वितीय हैं, जो बताता है कि पुस्तकालय संतुलित है, और आंतरिक विविधता अधिक है।

एक AAV2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी का चयन। इस पुस्तकालय का उपयोग विवो या इन विट्रो चयन में किया जा सकता है। यह इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, लेकिन चित्रा 5 में एक रूपरेखा प्रदान की गई है। संक्षेप में, विवो चयन में , ऊतकों को 1 x 1012 vg / माउस के प्रणालीगत इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद एकत्र किया जाता है और डीएनए को अलग किया जाता है। कैप जीन के एक बड़े टुकड़े पर एक बचाव पीसीआर किया जाता है, और उत्पाद को विभिन्न प्रतिबंध साइटों का उपयोग करके प्लास्मिड वेक्टर में क्लोन किया जाता है, लेकिन यहां वर्णित प्रोटोकॉल के समान प्रोटोकॉल, और राउंड -1 एएवी पुस्तकालय तैयार किए जाते हैं। एनजीएस विश्लेषण के लिए, पीसीआर को पृथक डीएनए या एएवी पुस्तकालयों पर किया जाता है। चयन के बाद, पुस्तकालय में अद्वितीय पीवी का प्रतिशत आमतौर पर चयन के दबाव के अनुसार कम हो जाता है। परियोजना के आधार पर, एनजीएस द्वारा पर्याप्त प्रमुख पीवी की पहचान करने के बाद चयन समाप्त किया जा सकता है।

बारकोडेड लाइब्रेरी चयन और विश्लेषण। 82 कैप्सिड्स वाली बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी के डेटा को पहले24 वर्णित किया गया है। एएवी कणों की डीडी-पीसीआर मात्रा का ठहराव ( चित्रा 7 और तालिका 1 देखें) से पता चलता है कि ट्रांसजीन के लिए सकारात्मक कैप्सिड्स में से 94% में आईटीआर भी होता है, जो एक पूर्ण जीनोम का संकेत देता है। यह ऊपर वर्णित जंगली प्रकार के पुस्तकालय की तुलना में कम है, लेकिन फिर भी पुनः संयोजक एएवी के लिए एक अच्छी गुणवत्ता का सुझाव देता है, यह देखते हुए कि वे आमतौर पर कम कुशलता से पैकेज करते हैं। जानवरों में पूल किए गए पुस्तकालय के इंजेक्शन के बाद, ऊतकों को एकत्र किया जाता है, और डीएनए और आरएनए को अलग किया जाता है। एनजीएस के साथ-साथ एनजीएस लाइब्रेरी की तैयारी और अनुक्रमण के लिए पीसीआर तब ऊपर वर्णित और पहले24 के रूप में किया जाता है। vg/dg की गणना करने के लिए, qPCR किया जाता है और, प्रदान किए गए नमूना डेटा में, मान 0.1-4 से होते हैं। जैसा कि प्रणालीगत एएवी डिलीवरी के लिए विशिष्ट है, यकृत में 10 वीजी / डीजी से अधिक है।

विश्लेषण पाइपलाइन के हिस्से के रूप में, सामान्यीकरण चरण विभिन्न स्तरों पर किए जाते हैं। इनपुट पूल लाइब्रेरी में, कैप्सिड वेरिएंट आमतौर पर समान रूप से प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। इसलिए, इनपुट लाइब्रेरी के एनजीएस विश्लेषण का उपयोग एक सामान्यीकरण फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, जो इनपुट लाइब्रेरी में इस कैप्सिड संस्करण की प्रचुरता के आधार पर अंतिम ऊतक / अंग में प्रत्येक कैप्सिड संस्करण की बहुतायत को सही करता है। एनजीएस द्वारा पूल किए गए पुस्तकालय के सदस्यों का जैव वितरण डीएनए और आरएनए स्तर पर किया जाता है। इनपुट लाइब्रेरी के लिए यह सामान्यीकरण ऊतक/अंग के भीतर अनुपात का भागफल (P*a) इनपुट लाइब्रेरी (La) के अनुपात तक उत्पन्न करता है। ये गणना "variant_comparison.txt" फ़ाइल में पाई जा सकती है। इस भागफल को तब "Normalization_organ.txt" फ़ाइल से vg/dg मानों से गुणा किया जाताहै ताकि मान प्राप्त किया जा सके। एक ऊतक के भीतर प्रत्येक प्रकार के लिएत्रिभुज मान का अनुपात ("organ_comparison.txt") इस ऊतक के भीतर इस प्रकार के प्रसार को दर्शाता है। इसके विपरीत, सभी ऊतकों में प्रत्येक प्रकार के लिए ए का अनुपात(टी) पूरे शरीर के भीतर इस संस्करण के प्रसार को इंगित करता है ("सापेक्षसंक्रमण.xls")। ये दो अनुपात प्रत्येक संस्करण के इंट्रा- और इंटर-टिशू बायोडिस्ट्रीब्यूशन को दर्शाते हैं। इन सभी फ़ाइलों का उपयोग कैप्सिड दक्षता और विशिष्टता24 के विभिन्न विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, अंतिम तालिका का उपयोग करते हुए ("सापेक्षकेंद्रण.xls" में पाया जाता है), प्रमुख घटक विश्लेषण और पदानुक्रमित क्लस्टरिंग चित्रा 9 में प्रस्तुत किया गया है।

एनजीएस अनुक्रमण से पूल किए गए पुस्तकालय के सामान्यीकरण से पता चलता है कि प्रत्येक कैप्सिड का औसत अनुपात 0.012 है, जो 82 कैप्सिड्स में से प्रत्येक के सैद्धांतिक अनुपात से भी मेल खाता है और 0.012 (1/82) की एक अच्छी तरह से संतुलित पूल लाइब्रेरी का सुझाव देता है। जैव सूचना त्मक पाइपलाइन द्वारा उत्पन्न फ़ाइल "सापेक्ष एकाग्रता.xls" अंतर-ऊतक कैप्सिड जैव वितरण को दर्शाती है, जैसा कि चित्र 9 में दिखाया गया है। हीटमैप ऊतक जैव वितरण प्रोफ़ाइल के अनुसार पदानुक्रमित रूप से क्लस्टर किए गए पूल लाइब्रेरी के प्रत्येक कैप्सिड के लिए लॉग 2 पैमाने पर सापेक्ष एकाग्रता मान दिखाता है। प्रमुख घटक विश्लेषण समान जैव वितरण गुणों के साथ एएवी कैप्सिड वेरिएंट के समूहों को अलग करने की अनुमति देता है और अंतर-ऊतक जैव वितरण के अद्वितीय पैटर्न के साथ बाहरी कैप्सिड्स पर भी प्रकाश डालता है। हीटमैप पदानुक्रम की दो प्रमुख शाखाएं कैप्सिड वेरिएंट की पारगमन दक्षता में अंतर को दर्शाती हैं। कैप्सिड वेरिएंट के बहुमत के साथ बाईं शाखा में सभी कैप्सिड शामिल हैं, जो अधिकांश ऊतकों में सापेक्ष एकाग्रता का उच्च मूल्य दिखाते हैं। आश्चर्यजनक रूप से उच्च यकृत विशिष्टता के अलावा, तीन अन्य कैप्सिड्स (Var60, Var13, और Var63) ने डायाफ्राम (Di), कंकाल की मांसपेशी (SM), बाइसेप्स (BLC), और मस्तिष्क (B) में विशिष्टता का प्रदर्शन किया। पदानुक्रमित क्लस्टरिंग की दाईं शाखा में समग्र कम पारगमन दक्षता वाले कैप्सिड वेरिएंट शामिल हैं, जो ग्रहणी (डू) और अग्न्याशय (पी) में स्पष्ट है। मूल उप-समूह के लिए पीसीए उच्च यकृत विशिष्टता (वर 64, 78, 65, 55, 56) के साथ कैप्सिड वेरिएंट का समूह बनाता है और उत्कृष्ट मांसपेशी ट्रोपिज्म के साथ वर 60 कैप्सिड को रेखांकित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एएवी 2 यादृच्छिक 7-मेर पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी के लिए क्लोनिंग रणनीति का अवलोकन।
यादृच्छिक 7-मेर पेप्टाइड सम्मिलन अनुक्रम के साथ ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों से घिरा होता है जिसमें बीजीएलआई पाचन साइट और प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए एक बाध्यकारी साइट होती है। वेक्टर pRep2Cap2_PIS में SfiI साइटें होती हैं। बीजीएलआई और एसएफएलआई पाचन द्वारा उत्पन्न ओवरहैंग पूरक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड सेकंड-स्ट्रैंड संश्लेषण का बायोएनालाइज़र गुणवत्ता नियंत्रण।
पतित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के दूसरे-स्ट्रैंड संश्लेषण की पुष्टि बायोएनालाइज़र पर विश्लेषण द्वारा की जाती है। प्रवर्धन के तीन, 10 और 30 चक्रों के साथ पीसीआर प्रतिक्रियाओं की तुलना की जाती है, यह दिखाते हुए कि सबसे कुशल प्रवर्धन के तीन चक्र हैं। (ए) बायोएनालाइज़र डेटा को जेल छवि के रूप में दर्शाया गया है। (बी-डी) मानक चोटियों की तुलना में प्लॉटेड टुकड़ा लंबाई (बीपी, एक्स अक्ष में) बनाम फ्लोरेसेंस यूनिट (एफयू, वाई अक्ष), 15 और 1500 बीपी पर दिखाई देती है। लाल तीर डबल-फंसे हुए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का संकेत देते हैं। ध्यान दें कि उच्चतम एफयू मूल्य, उच्चतम डीएनए एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, डबल-फंसे हुए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स प्रवर्धन (लाल तीर) के तीन चक्रों के बाद देखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: डीडी-पीसीआर का उपयोग करके एक एएवी 2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी का अनुमापन।
(ए) गैर-टेम्पलेट जल नियंत्रण और 1:106 पतला वायरस नमूने के लिए चैनल 1 (एफएएम, चैनल 1) में प्रतिनिधि 2-पॉजिटिव बूंदों का पता लगाना। (बी) चैनल 2 (एचईएक्स, चैनल 2) में आईटीआर पॉजिटिव बूंदों का पता लगाना। (सी) उन बूंदों का पता लगाना जो रेप 2 और आईटीआर दोनों के लिए सकारात्मक हैं (नारंगी में हाइलाइट किया गया है)। बैंगनी रेखाएं सकारात्मक बनाम नकारात्मक बूंदों का पता लगाने के लिए थ्रेसहोल्ड का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एनजीएस के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनए टुकड़े का अवलोकन और पायथन विश्लेषण के लिए सेटिंग्स।
एनजीएस पीसीआर एक 96-न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र को बढ़ाता है। पीसीआर टुकड़े का उपयोग एनजीएस लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए, सम्मिलन स्थल के दाएं और बाएं मान्यता अनुक्रमों को दोनों किस्में के साथ-साथ डीएनए टुकड़े की शुरुआत से दूरी के लिए दिया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विवो में एएवी पुस्तकालयों का पुनरावृत्ति चयन।
चूहों को एएवी लाइब्रेरी के साथ इंजेक्शन दिया जाता है। लक्ष्य ऑन- और ऑफ-ऊतकों को 1 सप्ताह बाद एकत्र किया जाता है और एनजीएस और विश्लेषण के अधीन किया जाता है। ओएन-टारगेट ऊतक का उपयोग कैप्सिड जीन को बचाने के लिए किया जाता है, जिसे मूल वेक्टर में क्लोन किया जाता है। चयनित एएवी लाइब्रेरी का उत्पादन किया जाता है और उपरोक्त चयन चक्र को दोहराने के लिए उपयोग किया जाता है। यह आंकड़ा BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी पीढ़ी का अवलोकन।
(ए) एक स्व-पूरक एएवी जीनोम का ग्राफिक प्रतिनिधित्व जिसमें आईटीआर के साथ सीएमवी प्रमोटर-संचालित ईएफपी ट्रांसजेन होता है। 3 'यूटीआर में 15 न्यूक्लियोटाइड-लॉन्ग बारकोड (बीसी) होता है जो ईएफपी और गोजातीय विकास हार्मोन (बीजीएच) पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल के बीच 3 'यूटीआर पर स्थित होता है। बीसी डीएनए और एमआरएनए स्तर पर कैप्सिड ट्रेसिंग को सक्षम बनाता है। (बी) एएवी उत्पादन के दौरान, कैप जीन के एकमात्र संस्करण द्वारा एक अद्वितीय बारकोडेड जीनोम को पैक किया जाता है, जिससे कैप्सिड पहचान की सुविधा मिलती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: डीडी-पीसीआर का उपयोग करके बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी का अनुमापन।
(ए) गैर-टेम्पलेट जल नियंत्रण और 1:106 पतला वेक्टर नमूने के लिए चैनल 1 (एफएएम, चैनल 1) में वाईएफपी-पॉजिटिव बूंदों का पता लगाना। (बी) चैनल 2 (एचईएक्स, चैनल 2) में आईटीआर पॉजिटिव बूंदों का पता लगाना। (सी) उन बूंदों का पता लगाना जो रेप 2 और आईटीआर दोनों के लिए सकारात्मक हैं (नारंगी में हाइलाइट किया गया है)। बैंगनी रेखाएं सकारात्मक बनाम नकारात्मक बूंदों का पता लगाने के लिए थ्रेसहोल्ड का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: एनजीएस के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनए टुकड़े का अवलोकन और पायथन विश्लेषण के लिए सेटिंग्स।
एनजीएस पीसीआर एक 113-न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र को बढ़ाता है। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए, बारकोड के दाएं और बाएं पहचान अनुक्रमों को दोनों किस्में के साथ-साथ डीएनए टुकड़े की शुरुआत से दूरी के लिए दिया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) और पदानुक्रमित क्लस्टर विश्लेषण।
(ए) सभी ऊतकों में 82 कैप्सिड के लिए सापेक्ष एकाग्रता मूल्यों का पीसीए समान गुणों और अद्वितीय पारगमन पैटर्न वाले वेरिएंट के साथ कैप्सिड वेरिएंट के समूहों को परिभाषित करने की अनुमति देता है। (बी) अत्यधिक आबादी वाले क्लस्टर को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए, बाहरी अद्वितीय वेरिएंट के रिकॉर्ड को मैट्रिक्स से बाहर रखा गया था और पीसीए विश्लेषण दोहराया गया था। (सी) पदानुक्रमित क्लस्टर विश्लेषण हीटमैप प्लॉट (ली = यकृत, लू = फेफड़े, वसाबी = भूरा वसा, एच = हृदय, डीआई = डायाफ्राम, एसएम = चिकनी मांसपेशी, डु = ग्रहणी, पी = अग्न्याशय, सी = बृहदान्त्र, बीआईसी = बाइसेप्स, ओ = अंडाशय, सेंट = पेट, आई = आंतरिक कान, के = किडनी, एए = पेट की महाधमनी, एटी = थोरैसिक महाधमनी, बी = मस्तिष्क) के रूप में ऊतकों में वेरिएंट ट्रांसडक्शन प्रोफाइल का नेत्रहीन मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। FatW = सफेद वसा, और S = प्लीहा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना लक्ष्य प्रतियां/ 20 μL अच्छी तरह से सकारात्मक Ch1 + Ch2+ CF प्रतियां ठीक की गईं लोमो VG/mL
H2O rep2 28 2 0 0 0 1.00E+06 5.60E+09
AAV2lib rep2 90600 16396 16266 0.99 89882 1.00E+06 1.80E +13
H2O YFP 4 3 2 0.67 3 1.00E+06 8.00E +08
BCAAVlib YFP 34680 13229 12452 0.94 32643 1.00E+06 6.53E +12

तालिका 1: एक एएवी 2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी ("एएवी 2लिब") और बारकोडेड ईवाईएफपी वेक्टर लाइब्रेरी ("बीसीएएवीएलआईबी") के अनुमापन परिणाम।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, पेप्टाइड डिस्प्ले एएवी कैप्सिड इंजीनियरिंग और बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी स्क्रीनिंग के साथ-साथ लाइब्रेरी संरचना और कैप्सिड प्रदर्शन के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए आवश्यक चरणों को रेखांकित किया गया है। यह प्रोटोकॉल उन चरणों पर केंद्रित है जो इस प्रकार के पुस्तकालयों के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं, क्योंकि अधिकांश वायरोलॉजी प्रयोगशालाएं आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में अपनी प्रवीणता से मेल खाने के लिए प्रोग्रामिंग कौशल में पिछड़ जाती हैं। दोनों प्रकार के पुस्तकालयों को साहित्य में बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है, जैसा कि परिचय में उल्लिखित है, और सापेक्ष आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है।

पहले चरण के रूप में, एएवी 2 के चर क्षेत्र VIII में स्थिति 588 में पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी के डिजाइन को रेखांकित किया गया है। यह डिजाइन (पिछले प्रकाशन26 में AAV2_Peptide (ii) और वर्णित क्लोनिंग विधि को हाल के प्रकाशन26 में प्रदान की गई जानकारी के आधार पर आसानी से अन्य सीरोटाइप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। क्लोनिंग पाइपलाइन में एक महत्वपूर्ण कदम बंधाव / परिवर्तन दक्षता (~ 1 x 108 कॉलोनियों कट-ऑफ का उपयोग करके) है। केवल वेक्टर के साथ एक बंधाव प्रतिक्रिया जोड़ने की सिफारिश की जाती है। यह सम्मिलित के साथ जीवाणु कालोनियों के प्रतिशत की पहचान करने में मदद करता है, जो 80% से अधिक होना चाहिए। एक कम-से-अपेक्षा दक्षता, जो कि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड इंसर्ट की सैद्धांतिक विविधता से कम कई जीवाणु कॉलोनियों (सम्मिलित के साथ प्रतिशत की गणना) है, कम बहुतायत वेरिएंट को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगी। कई सुधारों में वाणिज्यिक किट का उपयोग करके वेक्टर या बंधाव प्रतिक्रिया के लिए लंबे पाचन समय और सफाई के कदम शामिल हैं।

अगला कदम पीसीआर टुकड़े के एनजीएस का उपयोग करके वेरिएंट लाइब्रेरी का गुणवत्ता नियंत्रण है जिसमें ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड सम्मिलन साइट शामिल है। एनजीएस एक इलुमिना अनुक्रमण प्रणाली का उपयोग करके किया जाता है। कई विकल्प हैं, जिसमें पीसीआर उत्पादों को पूर्व एनजीएस लाइब्रेरी तैयारी के बिना सीधे प्रस्तुत किया जा सकता है। यह छोटे पैमाने पर प्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त है या जब उच्च पढ़ने की गहराई की आवश्यकता नहीं होती है। यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल में एनजीएस लाइब्रेरी की तैयारी शामिल है, जिसमें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों में इलुमिना इंडेक्स के साथ एडाप्टर को जोड़ना शामिल है। एनजीएस के संबंध में एक आम सीमा यह है कि इन पीसीआर टुकड़ों में कम विविधता होती है, क्योंकि उच्च-विविधता सम्मिलन साइट को फ्लैंक करने वाले अनुक्रम सभी वेरिएंट में समान होते हैं, जो बदले में अनुक्रमण दक्षता को कम करता है। इसे संबोधित करने के लिए, यह किट पीसीआर टुकड़े और एडाप्टर के बीच दो से आठ यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड की किसी भी संख्या को जोड़ती है। वैकल्पिक रूप से, नमूने को PhiX के साथ स्पाइक करने की आवश्यकता है। विस्तृत पायथन पाइपलाइन एएवी 2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी का विश्लेषण करने के लिए वर्णित है। एक टेम्पलेट के रूप में, AAV2 पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी की मूल NGS फ़ाइल से निकाली गई नमूना फ़ाइलें प्रदान की जाती हैं। इसे दिए गए निर्देशों के साथ अन्य सीरोटाइप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस विश्लेषण की आउटपुट फ़ाइलों का उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में किया जा सकता है, जैसे कि प्लास्मिड और एएवी लाइब्रेरी30 की तुलना, प्रत्येक स्थिति30 में एमिनो-एसिड संरचना, चयन राउंड14 के बाद पुस्तकालयों के बीच संवर्धन स्कोर की गणना, या अनुक्रम लोगो या ग्राफ19 की पीढ़ी। जहां तक इनपुट लाइब्रेरी का संबंध है, अद्वितीय वेरिएंट के उच्च प्रतिशत की उपस्थिति वांछित है। हालांकि, कुछ वेरिएंट उतना अच्छा उत्पादन नहीं करते हैं, जिससे उत्पादन के बाद विषम वितरण हो सकता है। एक कम वेरिएंट विविधता, या दूसरे शब्दों में प्रमुख वेरिएंट की उपस्थिति, को कम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड इंसर्ट गुणवत्ता या उच्च संख्या में सेकंड-स्ट्रैंड संश्लेषण चक्र (चरण 1.2) के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसके अलावा, अमीनो-एसिड संरचना उत्पादन से प्रभावित हो सकती है। प्रत्येक एमिनो एसिड में 5.00% की आवृत्ति होनी चाहिए। यदि वितरण इस मूल्य से बहुत भिन्न होता है, तो संभावित पूर्वाग्रहों की पहचान करने के लिए प्लास्मिड लाइब्रेरी पर एक ही विश्लेषण करने का सुझाव दियाजाता है।

चूंकि एएवी लाइब्रेरी उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल और विभिन्न पशु और इन विट्रो मॉडल में बाद के चयन राउंड को कई प्रकाशनों और प्रोटोकॉल27,30,31,32 में बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है, यहां केवल चयनित इंजीनियर वेरिएंट और बेंचमार्क के बारकोडेड पुस्तकालयों का विश्लेषण वर्णित है। ध्यान दें, चयन के प्रत्येक दौर के बाद लाइब्रेरी क्लोनिंग कैप जीन के पीसीआर अलगाव द्वारा की जा सकती है, जैसा कि प्रोटोकॉल और परिणाम अनुभागों में उल्लेख किया गया है। चयन और पीसीआर प्रवर्धन के व्यापक दौर से उत्परिवर्तन या स्टॉप कोडन की प्राप्ति हो सकती है, जिसे एनजीएस द्वारा देखा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, समृद्ध वेरिएंट को एनजीएस डेटा से चुना जा सकता है, और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को ऑर्डर और क्लोन किया जा सकता है जिस तरह से पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी16,18 की पीढ़ी के लिए वर्णित किया गया है। अंत में, प्रोटोकॉल में प्रणालीगत इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद डीएनए स्तर पर पुस्तकालयों के चयन के लिए एक संक्षिप्त विवरण शामिल है। आरएनए-आधारित चयन अधिक कठोर हैं, क्योंकि वे संक्रामक प्रवेश मार्गों के माध्यम से ट्रैफ़िक करने वाले वेरिएंट के लिए भी चयन करते हैं, हालांकि तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरएनए- या ट्रांसजीन-आधारित चयन (यानी, सीआरई) को लगभग 3-4 सप्ताह 15,16,17,18,19,33 की विवो अवधि में अधिक समय की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से डीएनए-आधारित चयनों के लिए, बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी का उपयोग करके डीएनए- और आरएनए-स्तर दोनों पर ज्ञात प्राकृतिक और इंजीनियर सीरोटाइप के खिलाफ चयनित वेरिएंट को मान्य करना महत्वपूर्ण है।

प्रोटोकॉल का दूसरा भाग पहले से विकसित पाइपलाइन24 का उपयोग करके बारकोडेड एएवी पुस्तकालयों की पीढ़ी और स्क्रीनिंग का वर्णन करता है। पूल में प्रत्येक एएवी कैप्सिड में एक ही ट्रांसजीन (सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण में ईवाईएफपी) होता है जिसमें ईएफपी और पॉलीए सिग्नल के बीच एक अलग बारकोड होता है। इस लायब्रेरी में उपयोग किए गए बारकोड पूर्व प्रकाशन24 में पाए जा सकते हैं. डिजाइन हैमिंग दूरी के मूल सिद्धांत पर आधारित था (यानी, बारकोड अनुक्रमों को पर्याप्त रूप से अलग होने की आवश्यकता है), ताकि अनुक्रमण त्रुटियों से गलत बारकोड असाइनमेंट न हों। जैसा कि ल्योंस एट अल26 में वर्णित है, 25-100 न्यूक्लियोटाइड के बीच पढ़ने में होने वाली दो त्रुटियों की संभावना बहुत कम है। 4 की हैमिंग दूरी का मतलब है कि गलत बारकोड के रूप में पढ़ने के लिए दो अनुक्रमण त्रुटियों की आवश्यकता होगी। विश्लेषण के दौरान एक त्रुटि के साथ पढ़ने को अनदेखा किया जाएगा, और इस मामले में "अज्ञात वेरिएंट के साथ पढ़ने" के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा। एक प्रासंगिक प्रकाशन में, बारकोड29 उत्पन्न करने के लिए दिशानिर्देश और एक पायथन स्क्रिप्ट प्रदान की जाती है जिसका उपयोग पाइपलाइन में किया जा सकता है। उपयोगी बारकोड की पहचान के लिए, एक और लोकप्रिय त्रुटि-सुधार कोड का उपयोग किया जा सकता है जैसा कि बुशमैन और बायस्ट्रीख34 द्वारा प्रकाशन में उल्लिखित है, अर्थात्, लेवेंस्टीन दूरी। यह समूह आर प्रोग्रामिंग भाषा35 के लिए एक सॉफ्टवेयर पैकेज भी प्रदान करता है।

एएवी उत्पादन के बाद, पूल किए गए बारकोडेड एएवी लाइब्रेरी का उपयोग विभिन्न मॉडलों में जैव वितरण अध्ययन के लिए किया जा सकता है। यह अध्ययन पिछले प्रकाशन24 से 82-वेरिएंट लाइब्रेरी का उपयोग करके पाइपलाइन को रेखांकित करता है और अभ्यास के लिए नमूना डेटा प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को प्रत्येक उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के आधार पर भी अनुकूलित किया जा सकता है। जैव वितरण विश्लेषण विभिन्न ऑन-और ऑफ-टारगेट ऊतकों या कोशिकाओं के संग्रह, उनसे डीएनए और आरएनए के निष्कर्षण, एनजीएस अनुक्रमण के लिए बारकोड क्षेत्र के पीसीआर प्रवर्धन और डीएनए स्तर पर वीजी / डीजी के माप पर आधारित है। आरएनए के लिए, एक संदर्भ जीन की एमआरएनए प्रतिलिपि संख्या के अनुपात की गणना करना सबसे अच्छा होगा। पसंद के संदर्भ जीन को विभिन्न ऊतकों36 में समान रूप से व्यक्त किया जाना चाहिए, जैसे कि आरपीपी 30 (राइबोन्यूक्लिज़ पी / एमआरपी सबयूनिट पी 30)37 या एचपीआरटी (हाइपोक्सिंथिन फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफेरेज़ 1)36। हालांकि, यह कठिन है, इसलिए आरएनए डेटा को सामान्य करने के लिए एक ही समय में कई संदर्भ जीनों का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है। इस कारण से, डीएनए स्तर पर डीजी के सामान्यीकरण को पूरा किया जा सकता है, जो लगभग कोशिकाओं की संख्या के साथ संबंधित है। यह इस गणना के लिए क्यूपीसीआर के उपयोग को भी इंगित करता है, जैसा कि पहलेवर्णित किया गया था 24, हालांकि डीडी-पीसीआर अधिक सटीक है और इस प्रकार भविष्य के उपयोग के लिए पसंद किया जाता है, खासकर इस क्षेत्र में प्रगति कोदेखते हुए। अंतिम लेकिन कम से कम नहीं, बुनियादी आणविक जीव विज्ञान अनुकूलन यहां वर्णित पद्धति के लिए बेहद महत्वपूर्ण हैं। पुस्तकालयों के वितरण में पूर्वाग्रहों को पेश करने से बचने के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। डीडी-पीसीआर जांच को डीएनए के लिए इनट्रोनिक क्षेत्रों और आरएनए के लिए अंतर-एक्सोनिक क्षेत्रों को शामिल करने के लिए डिज़ाइन करने की आवश्यकता है। अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास, जैसे कि चरणों का भौतिक विभाजन, विशेष रूप से पुस्तकालय की तैयारी से डीएनए और एएवी उत्पादन, और गलत प्रवर्धन और पुस्तकालय संदूषण से बचने के लिए उचित कीटाणुशोधन सर्वोपरि महत्व का है।

विशेष रूप से, नए ट्रोपिज्म या अन्य चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक गुणों के साथ इंजीनियर कैप्सिड्स के लिए चयन करने के लिए पेप्टाइड डिस्प्ले लाइब्रेरी और वेक्टर डीएनए / आरएनए बारकोडिंग का उपयोग केवल निर्देशित एएवी कैप्सिड विकास प्रौद्योगिकियों के दो उदाहरणों का प्रतिनिधित्व करता है। उन सभी में आम है कि वे सीमाओं के साथ आते हैं और उनकी पूरी क्षमता का एहसास करने के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड के सम्मिलन से अंतर्निहित कैप्सिड अनुक्रम का एक बड़ा हिस्सा (~ 99%) अपरिवर्तित हो जाता है, जिसके एंटी-एएवी एंटीबॉडी को बेअसर करने के साथ बातचीत सहित गुणों को मानव अनुप्रयोग से पहले और संशोधित करने की आवश्यकता हो सकतीहै। इसके अलावा, पेप्टाइड डिस्प्ले या अन्य पुस्तकालयों की वास्तविक विविधता आमतौर पर सैद्धांतिक से कम होती है, उदाहरण के लिए, क्लोनिंग या जीवाणु परिवर्तन के दौरान तकनीकी सीमाएं। आम तौर पर, जानवरों या इन विट्रो मॉडल में निर्देशित विकास की ट्रांसलेशनल प्रासंगिकता के बारे में भी एक सक्रिय बहस होती है, जो सिंथेटिक एएवी कैप्सिड्स 38 की संभावित प्रजातियों या यहां तक कि तनाव-विशिष्ट प्रदर्शन के लिए बढ़तेसबूतों से बढ़ावा देती है। बहरहाल, पर्याप्त उम्मीद है कि कई या इन सभी सीमाओं को दूर किया जाएगा और प्रौद्योगिकियों के वर्तमान शस्त्रागार को रोग मॉडल की एक बड़ी विविधता तक विस्तारित किया जाएगा और अधिकांश शोध समूहों के लिए और भी अधिक सुलभ हो जाएगा। इस संबंध में, एक विशेष रूप से उत्साहजनक हालिया विकास बारकोडेड एएवी पुस्तकालयों का उपयोग है जैसे कि चयनित कैप्सिड्स को न केवल अंग पर, बल्कि अब सेलुलर स्तर पर भी मान्य करने के लिए यहां रिपोर्ट किया गया है, जिसे एकल-सेल (एससी) आरएनए अनुक्रमण39 जैसी नई तकनीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एएवी विकास तकनीकों की व्यापक स्थापना की सुविधा प्रदान करेंगे और इस प्रकार अनुसंधान समूहों और मानव रोगियों की जरूरतों के अनुरूप नए कैप्सिड के विकास में तेजी लाएंगे।

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Disclosures

डीजी और केआर प्रतिरक्षा-बचने वाले एएवी कैप्सिड वेरिएंट की पीढ़ी से संबंधित एक लंबित पेटेंट आवेदन पर आविष्कारक हैं। बाकी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

डी.जी. जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा डीएफजी सहयोगी अनुसंधान केंद्रों एसएफबी 1129 (प्रोजेक्तनुमर 240245660) और टीआरआर 179 (प्रोजेक्तनुमर 272983813) के साथ-साथ जर्मन सेंटर फॉर इंफेक्शन रिसर्च (डीजेडआईएफ, बीएमबीएफ) द्वारा समर्थन की बहुत सराहना करता है; टीटीयू-एचआईवी 04.819)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplification primer ELLA Biotech (Munich, Germany) - Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit  Qiagen (Venlo, Netherlands) 80204 DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C NGS Library preparation
BC-seq fw:  IDT (San Joce, CA, CA, USA) ATCACTCTCGGCATGGACGAGC  NGS Library preparation
BC-seq rv:   IDT (San Joce, CA, CA, USA) GGCTGGCAACTAGAAGGCACA  NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) 44-420-3250ML DNA/RNA extraction
BglI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0143 Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1851196 dd-PCR cycler
dNTPS  New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) N0447S NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863024 dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863005 dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864008 dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863051 dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863009 dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 12001925 dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells Lucigen (Middleton, WI, USA) 60081-1 Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) 748050 Electroporation
GAPDH primer/probe mix Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Mm00186825_cn Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1652660 Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) 4368814 cDNA reverse transcription
ITR_fw IDT (San Joce, CA, USA) GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_rv IDT (San Joce, CA, USA) CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_probe IDT (San Joce, CA, USA) HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system Illumina Inc (San Diego, CA, USA) SY-415-1001 NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* Roche AG (Basel, Switzerland) KK2600 07958919001 NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device Promega GmbH (Madison, WI, USA) V8151 Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) ND-2000 Digestion of double-stranded insert
NGS_frw Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC NGS primer
NGS_rev Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) CGC CTT GTG TGT TGA CAT C NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina Inc (San Diego, CA, USA) FC-404-2005 NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit  NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) 9092-256 NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer  Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814000 dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814040 dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F530S Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) 24765-1G AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System Promega GmbH (Madison, WI, USA) NG2002 Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase  Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F549L NGS Library preparation
Proteinase K Roche AG (Basel, Switzerland) 5963117103 DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab 
QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864002 dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864003 dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28306 Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28704 Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 12162 Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28104 Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer Invitrogen (Waltham, MA, USA) Q32857 NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Q32851 NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix Qiagen (Venlo, Netherlands) 1044234 Taqman qPCR
rep_fw IDT (San Joce, CA, USA) AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC dd-PCR primer
rep_rv IDT (San Joce, CA, USA) CAATCACGGCGCACATGT dd-PCR primer
rep_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 dd-PCR probe
RNase-free DNase Qiagen (Venlo, Netherlands) 79254 DNA/RNA extraction
SfiI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0123 Digestion of vector
5 mm, steel Beads Qiagen (Venlo, Netherlands) 69989 DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides ELLA Biotech (Munich, Germany) - Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) M0202L Plasmid library ligation
TissueLyserLT Qiagen (Venlo, Netherlands) 85600 DNA/RNA extraction
YFP_fw IDT (San Joce, CA, USA) GAGCGCACCATCTTCTTCAAG dd-PCR primer
YFP_rv IDT (San Joce, CA, USA) TGTCGCCCTCGAACTTCAC dd-PCR primer
YFP_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) Zymo research (Irvine, CA, USA) D4013 Vector and Ligation purification

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References

  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
  3. Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
  6. Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).
  7. Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756 (2022).
  8. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
  9. Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
  10. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
  11. Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
  12. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075 (2014).
  13. Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041 (2015).
  14. Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
  15. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  16. Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
  17. Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
  18. Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
  19. Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
  20. Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
  21. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
  22. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
  23. Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
  24. Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).
  25. Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
  26. Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  27. Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).
  28. Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
  29. Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).
  30. Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
  31. Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
  32. Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
  33. Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
  34. Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).
  35. Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
  36. Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).
  37. Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
  38. Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
  39. Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).

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Rapti, K., Maiakovska, O., Becker, J., Szumska, J., Zayas, M., Bubeck, F., Liu, J., Gerstmann, E., Krämer, C., Wiedtke, E., Grimm, D. Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants. J. Vis. Exp. (188), e64389, doi:10.3791/64389 (2022).

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