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Bioengineering

Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV)

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64389
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Infectious Diseases/Virology, Section Viral Vector Technologies, Medical Faculty, University of Heidelberg, 2BioQuant Center, BQ0030, University of Heidelberg, 3Cluster of Excellence CellNetworks, 4German Center for Infection Research (DZIF), 5German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

Geração de biblioteca de exibição de peptídeos AAV e posterior validação através do código de barras de candidatos com novas propriedades para a criação de AAVs de próxima geração.

Abstract

Os vetores de liberação gênica derivados do vírus adenoassociado (AAV) são uma das ferramentas mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas, evidenciada por dados clínicos encorajadores e pela aprovação de várias terapias gênicas com AAV. Duas razões principais para o sucesso dos vetores AAV são (i) o isolamento prévio de vários sorotipos virais naturais com propriedades distintas, e (ii) o subsequente estabelecimento de tecnologias poderosas para sua engenharia molecular e reaproveitamento em alto rendimento. Aumentando ainda mais o potencial dessas técnicas são recentemente implementadas estratégias para a codificação de barras-capsídeos AAV selecionados no nível de DNA e RNA, permitindo sua estratificação in vivo abrangente e paralela em todos os principais órgãos e tipos celulares em um único animal. Aqui, apresentamos um pipeline básico que engloba esse conjunto de vias complementares, usando a exibição de peptídeos AAV para representar o arsenal diversificado de tecnologias de engenharia de capsídeos disponíveis. Assim, primeiro descrevemos as etapas fundamentais para a geração de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV para a seleção in vivo de candidatos com propriedades desejadas, seguido por uma demonstração de como codificar as variantes de capsídeos mais interessantes para triagem secundária in vivo. Em seguida, exemplificamos a metodologia para a criação de bibliotecas para sequenciamento de próxima geração (NGS), incluindo amplificação de código de barras e ligadura de adaptador, antes de concluir com uma visão geral das etapas mais críticas durante a análise de dados NGS. Como os protocolos relatados aqui são versáteis e adaptáveis, os pesquisadores podem facilmente aproveitá-los para enriquecer as variantes ideais do capsídeo AAV em seu modelo de doença favorito e para aplicações de terapia gênica.

Introduction

A terapia de transferência gênica é a introdução de material genético nas células para reparar, substituir ou alterar o material genético celular para prevenir, tratar, curar ou melhorar doenças. A transferência de genes, tanto in vivo quanto ex vivo, depende de diferentes sistemas de entrega, não virais e virais. Os vírus evoluíram naturalmente para transduzir eficientemente suas células-alvo e podem ser usados como vetores de entrega. Dentre os diferentes tipos de vetores virais empregados na terapia gênica, os vírus adenoassociados têm sido cada vez mais utilizados, devido à sua falta de patogenicidade, segurança, baixa imunogenicidade e, principalmente, sua capacidade de sustentar a expressão não integradora a longo prazo 1,2,3. A terapia gênica com AAV produziu conquistas consideráveis na última década; três terapias foram aprovadas pela Agência Europeia de Medicamentos e pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para uso em humanos 3,4. Vários ensaios clínicos também estão em andamento para tratar uma variedade de doenças, como hemofilia, doenças musculares, cardíacas e neurológicas, conforme revisado em outros estudos3. Apesar de décadas de avanço, o campo da terapia gênica tem experimentado uma série de contratempos nos últimos anos4 e, principalmente mortes em ensaios clínicos5 que foram suspensas devido a toxicidades limitantes da dose, particularmente para tecidos maciços, como o músculo, ou de difícil acesso, como océrebro6.

Os vetores do AAV atualmente utilizados em ensaios clínicos pertencem aos sorotipos naturais, com algumas exceções1. A engenharia AAV oferece a oportunidade de desenvolver vetores com especificidade e eficiência superior de órgãos ou células. Nas últimas duas décadas, várias abordagens têm sido aplicadas com sucesso, tais como exibição de peptídeos, loop-swap, embaralhamento de DNA do capsídeo, PCR propenso a erros e design direcionado, para gerar variantes individuais de AAV ou bibliotecas com propriedades diversas7. Estes são então submetidos a múltiplas rodadas de evolução dirigida para selecionar as variantes dentro deles com as propriedades desejadas, conforme revisado em outro artigo 1,3. De todas as estratégias de evolução do capsídeo, as bibliotecas AAV de exibição de peptídeos têm sido as mais utilizadas, devido a algumas propriedades únicas: são relativamente fáceis de gerar, e podem alcançar alta diversidade e sequenciamento de alto rendimento, o que permite acompanhar sua evolução.

As primeiras bibliotecas de AAV de inserção peptídica bem-sucedidas foram descritas há quase 20 anos. Em um dos primeiros, Perabo et al.8 construíram uma biblioteca de capsídeos AAV2 modificados, na qual um pool de oligonucleotídeos gerados aleatoriamente foi inserido em um plasmídeo em uma posição que corresponde ao aminoácido 587 da proteína VP1 capsídeo, no eixo de três vezes saliente do capsídeo. Usando a co-infecção de adenovírus, a biblioteca de AAV foi evoluída através de várias rodadas de seleção, e as variantes finais redirecionadas mostraram-se capazes de transduzir linhagens celulares refratárias ao AAV2 parental8. Pouco tempo depois, Müller et al.9 introduziram o sistema de duas etapas para a produção de bibliotecas, uma melhoria significativa do protocolo. Inicialmente, a biblioteca de plasmídeos, juntamente com um plasmídeo auxiliar adenoviral, são usados para produzir uma biblioteca de AAV que contém capsídeos quiméricos. Esta biblioteca de transporte AAV é usada para infectar células com baixa multiplicidade de infecção (MOI), com o objetivo de introduzir um genoma viral por célula. A co-infecção com adenovírus garante a produção de AAVs com genoma e capsídeo9 correspondentes. Cerca de uma década depois, Dalkara10 usou a evolução dirigida in vivo para criar a variante 7m8. Essa variante possui inserção de 10 aminoácidos (LALGETTRPA), três dos quais atuam como ligantes, e atingem eficientemente a retina externa após injeção intravítrea10. Este capsídeo projetado é uma história de sucesso excepcional, pois é um dos poucos capsídeos projetados a chegar à clínica até agora11.

O campo experimentou um segundo impulso com a introdução de técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS). Duas publicações de Adachi et al.12, em 2014, e de Marsic et al.13, em 2015, mostraram o poder da NGS para rastrear a distribuição de bibliotecas de capsídeos AAV com código de barras com alta precisão. Alguns anos depois, a NGS das regiões com código de barras foi adaptada à região de inserção do peptídeo para acompanhar a evolução do capsídeo. Körbelin et al.14 realizaram uma triagem guiada por NGS para identificar um capsídeo baseado em AAV2 direcionado para a pulmonar. A análise da NGS ajudou a calcular três escores de avaliação: o escore de enriquecimento entre as rodadas de seleção, o escore de especificidade geral para determinar a especificidade tecidual e, finalmente, o escore combinado14. O laboratório Gradinaru15 publicou o sistema de evolução direcionada AAV baseado em recombinação Cre (CREATE) no mesmo ano, o que facilita uma seleção específica do tipo de célula. Neste sistema, a biblioteca capsid carrega um switch Cre-invertible, já que o sinal polyA é flanqueado por dois sites loxP. A biblioteca AAV é então injetada em camundongos Cre, onde o sinal poliA é invertido apenas em células Cre+, fornecendo o molde para a ligação de um primer de PCR reverso com o primer forward dentro do gene do capsídeo. Este resgate por PCR altamente específico possibilitou a identificação do AAV-PHP. Variante B que pode atravessar a barreira hematoencefálica15. Este sistema evoluiu ainda para o M-CREATE (Multiplexed-CREATE), no qual NGS e geração de bibliotecas sintéticas foram integradas no pipeline16.

Uma versão melhorada desse sistema baseada em RNA do laboratório Maguire17, o iTransduce, permite a seleção no nível de DNA de capsídeos que transduzem funcionalmente as células e expressam seus genomas. O genoma viral da biblioteca de exibição de peptídeos compreende um gene Cre sob o controle de um promotor ubíquo e o gene do capsídeo sob o controle do promotor p41. A biblioteca é injetada em ratos que têm um loxP-STOP-loxP a montante de tdTomato. Células transduzidas com variantes do AAV que expressam o genoma viral e, portanto, Cre expressam tdTomato e, em combinação com marcadores celulares, podem ser classificadas e selecionadas17. Da mesma forma, Nonnenmacher et al.18 e Tabebordbar et al.19 colocaram a biblioteca gênica do capsídeo sob o controle de promotores tecido-específicos. Após injeção em diferentes modelos animais, o RNA viral foi usado para isolar as variantes do capsídeo.

Uma abordagem alternativa é usar código de barras para marcar bibliotecas de capsídeos. O laboratório de Björklund20 usou essa abordagem para bibliotecas de capsídeos de inserção de peptídeos de código de barras e desenvolveu a evolução vetorial AAV racional com código de barras (BRAVE). Em um plasmídeo, o Rep2Cap é clonado ao lado de um transgene marcado com código de barras e repetições terminais invertidas (ITR), com expressão de proteína fluorescente amarela (YFP). Usando sítios loxP entre o final da tampa e o início do código de barras, uma recombinação de Cre in vitro gera um fragmento pequeno o suficiente para NGS, permitindo assim a associação da inserção do peptídeo com o código de barras único (look-up table, LUT). A produção de AAV é realizada utilizando a biblioteca de plasmídeos e os códigos de barras expressos no RNAm são triados após aplicação in vivo , novamente com NGS20. Quando as bibliotecas do capsídeo compreendem variantes de todo o gene do capsídeo (ou seja, bibliotecas embaralhadas), o sequenciamento de leitura longa precisa ser usado. Vários grupos têm usado códigos de barras para marcar essas diversas bibliotecas, o que permite NGS com maior profundidade de leitura. O laboratório Kay21 marcou bibliotecas embaralhadas de capsídeos altamente diversos com códigos de barras a jusante do sinal poliA da tampa . Em uma primeira etapa, uma biblioteca de plasmídeos com código de barras foi gerada, e a biblioteca de genes do capsídeo embaralhada foi clonada nela. Em seguida, uma combinação de MiSeq (leitura curta, maior profundidade de leitura) e PacBio (leitura longa, menor profundidade de leitura), NGS e sequenciamento de Sanger foram usados para gerar sua LUT21. Em 2019, Ogden e colegas do laboratório da Igreja22 delinearam a aptidão do capsídeo AAV2 para múltiplas funções usando bibliotecas que tinham mutações de ponto único, inserções e exclusões em todas as posições, o que finalmente permitiu o design guiado por máquina. Para a geração da biblioteca, fragmentos menores do gene do capsídeo foram sintetizados, marcados com um código de barras, sequenciados de próxima geração e, em seguida, clonados no gene completo do capsídeo. Os dados de NGS foram usados para gerar uma LUT. A biblioteca foi então triada utilizando-se apenas os códigos de barras e o sequenciamento de leitura curta, o que, por sua vez, permite maior profundidade de leitura22.

As bibliotecas com código de barras têm sido predominantemente usadas para selecionar um conjunto de variantes conhecidas, naturais e projetadas após várias rodadas de seleção de bibliotecas de capsídeos ou independentes de um estudo de evolução de capsídeos. A vantagem de tais bibliotecas é a oportunidade de rastrear vários capsídeos, reduzindo o número de animais e minimizando a variação entre os animais. Os primeiros estudos que introduziram essa tecnologia no campo dos AAV foram publicados há quase uma década. O laboratório Nakai 12 marcou 191 mutantes duplos de alanina cobrindo aminoácidos 356 a 736 no VP1 de AAV9 com um par de códigos de barras de12 nucleotídeos. Usando NGS, a biblioteca foi triada in vivo para ligação de galactose e outras propriedades12. Marsic e colaboradores delinearam a biodistribuição de variantes do AAV usando também uma análise de barra dupla 1 ano depois13. Um estudo mais recente em primatas não humanos comparou a biodistribuição no sistema nervoso central de 29 capsídeos utilizando diferentes vias de parto23. Nosso laboratório publicou recentemente telas de biblioteca AAV com código de barras de 183 variantes que incluíam AAVs naturais e projetados. Essas telas no nível de DNA e RNA levaram à identificação de uma variante altamente miotrópica do AAV24 em camundongos, bem como outras exibindo uma alta especificidade do tipo celular no cérebro de camundongos25.

Aqui, descrevemos a metodologia usada neste trabalho e a expandimos para incluir a triagem de bibliotecas de exibição de peptídeos AAV. Isso compreende a geração de bibliotecas de exibição de peptídeos AAV2, um método de PCR digital em gotículas (dd-PCR) para quantificação e, finalmente, um pipeline NGS para analisar as variantes do AAV, baseado em parte no trabalho de Weinmann e colaboradores24. Finalmente, uma descrição da geração de bibliotecas AAV com código de barras e do pipeline NGS usado na mesma publicação é fornecida.

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Protocol

1. AAV2 aleatório 7-mer peptídeo display biblioteca preparação

NOTA: Para a preparação de uma biblioteca de exibição de peptídeos aleatórios AAV2, sintetize os oligonucleotídeos degenerados como DNA de fita simples, converta-o em DNA de fita dupla, digerir, ligar-se ao plasmídeo aceitador e eletroporato.

  1. Projeto de oligonucleotídeos degenerados
    1. Ordene os oligonucleotídeos degenerados e evite o viés do códon. No oligonucleotídeo 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 corresponde a 20 códons, cada um codificando um dos 20 aminoácidos. O W pode ser A ou T, produzindo os códons AGA ou AGT, que codificam os aminoácidos arginina (R) ou serina (S).
    2. Solicite o primer de amplificação: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (veja a Figura 1 para detalhes). Isso produz a seguinte inserção de proteína: R/S G X7. A diversidade teórica é calculada da seguinte forma: 1 x 2 x 207 = 2,56 x 109 variantes únicas.
      NOTA: Deve-se notar que essa diversidade pode ser restringida pela eficiência da transformação.
  2. Síntese de segunda vertente
    1. Ressuspender ambos os oligonucleotídeos (oligonucleotídeos degenerados e primer de amplificação) para uma concentração final de 100 μM com tampão TE.
      1. Para a reação de PCR, estabelecer uma reação de 50 μL com 1 μL de cada primer, 10 μL de tampão, 1,5 μL de DMSO, 0,5 μL de dNTPs (10 mM), 0,5 μL de Polimerase de Início Quente de Alta Fidelidade II e 35,5 μL de água livre de nuclease.
      2. Transfira a reação para um termociclador e execute uma etapa de pré-incubação por 10 s a 98 °C, seguida por três ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 59 °C e 10 s a 72 °C, depois 5 min a 72 °C e uma etapa final de resfriamento.
    2. Purificar a reação usando um kit de remoção de nucleotídeos e eluir em 100 μL de água livre de nucleases.
    3. Confirme a eficiência da síntese da segunda fita por análise em um Bioanalisador (ver Figura 2). Analise o tamanho e a pureza da pastilha de fita dupla carregando 1 μL da reação a um chip microfluídico de um kit de reagentes DNA 1000 de acordo com as instruções do fabricante. Este kit é otimizado para medir o tamanho e a concentração de fragmentos de DNA de fita dupla de 25-1.000 bps.
  3. Digestão de inserção e vetor plasmidial
    1. Digerir 85 μL da pastilha purificada com 10 μL de tampão 10x e 5 μL da enzima BglI num volume final de reacção de 100 μL (ver figura 1 para mais pormenores). Incubar a 37 °C durante a noite. Purificar usando um kit de remoção de nucleotídeos, eluir em 50 μL de água livre de nucleases e quantificar usando o tipo "Oligo DNA" em espectrofotômetro.
    2. Digerir 10 μg de um plasmídeo AAV competente em replicação (pRep2Cap2_PIS)26 (genoma viral flanqueado por ITR) com 20 μL de tampão 10x e 10 μL de enzima SfiI em um volume final de reação de 200 μL (ver Figura 1 para detalhes). Incubar a 50 °C durante a noite. Purificar o vetor em um gel de agarose a 1% usando o kit de extração em gel, seguido por uma etapa adicional de purificação usando um kit de purificação de DNA. Quantificar a concentração em espectrofotômetro.
  4. Ligadura do inserto ao vetor
    1. Ligate 955 ng de vetor plasmidial com 45 ng de inserção com 2 μL de tampão e 2 μL de ligase em uma reação de ligadura de 20 μL. Incubar a 16 °C durante a noite, seguido de 10 min a 70 °C para inativar a ligase pelo calor.
  5. Transformação, cálculo de complexidade e preparação da biblioteca de plasmídeos
    1. Purifice a reação com um kit purificador de DNA seguindo as instruções do fabricante. Eluir a reação em cerca de 80% do volume inicial de água livre de nucleases e armazenar no gelo para posterior transformação.
    2. Transforme células eletrocompetentes: descongele um frasco de células eletrocompetentes no gelo por 10 min. Em seguida, adicione 1-2 μL da reação de ligadura purificada a 30 μL (um frasco para injetáveis) de células eletrocompetentes e misture batendo suavemente. Em seguida, pipetar cuidadosamente a mistura célula/DNA para uma cubeta de eletroporação pré-refrigerada de 1 mm sem introduzir bolhas de ar.
    3. Eletroporato usando as seguintes configurações: 1800 V, 600 Ω e 10 μF. Dentro de 10 s do pulso de eletroporação, adicione 970 μL de meio de recuperação pré-aquecido (fornecido com as células eletrocompetentes) à cubeta e misture por pipetagem. Por fim, transfira as células para um tubo de microcentrífuga e incube por 1 h a 37 °C a 250 rpm. Para alcançar a diversidade desejada, realize de 10 a 100 reações e, após a incubação, agrupe todas as reações em um tubo.
    4. Calcular a diversidade diluindo 10 μL das transformações agrupadas 10, 100 ou 1.000 vezes em PBS e espalhar 100 μL em placas de ágar nutriente contendo o antibiótico apropriado (75 mg/mL de ampicilina). Incubar as placas de ágar durante a noite a 37 °C e, em seguida, contar as colónias nas placas de ágar.
    5. Calcule a diversidade teórica da seguinte forma:
      Diversidade teórica máxima = 10 x fator de diluição x número de colônias x número de reações de eletroporação.
      NOTA: Para confirmar a qualidade da biblioteca, sequencie pelo menos 20 colônias por sequenciamento de Sanger. A maioria dos clones deve conter uma inserção e todos devem ser exclusivos.
    6. Inocular 400-1.000 mL de meio LB contendo o antibiótico apropriado com o restante das transformações agrupadas e incubar durante a noite a 37 °C, 180 rpm.
  6. Preparação da biblioteca de plasmídeos
    1. A partir da cultura noturna, preparar um estoque de glicerol (misturar volumes iguais de cultura bacteriana e solução de glicerol a 50% em água livre de nuclease e congelar a -80 °C) e purificar a biblioteca de plasmídeos usando um kit maxi de plasmídeo.
  7. Produção da biblioteca viral de AAV
    1. Preparar a biblioteca viral conforme descrito anteriormente27. Transfectar a biblioteca de plasmídeos (pRep2Cap2_PI, inserção de peptídeos) juntamente com um plasmídeo adeno-helper para células HEK293T usando um reagente de transfecção como a polietilenimina (PEI).
    2. Recolher as células após 3 dias e submetê-las a três ciclos de congelamento-descongelamento. Purificar o lisado viral usando ultracentrifugação com gradiente de cloreto de césio, seguido de troca tampão para PBS e, finalmente, concentrar as partículas virais.
  8. Titulação vetorial de AAV por dd-PCR
    1. Diluir serialmente 2 μL do estoque do vetor AAV em 198 μL de água livre de nuclease para obter uma diluição final de 1:106 . Misture bem cada vez usando uma pipeta de 200 μL. Adicione um controle sem modelo (NTC) como um controle negativo.
      NOTA: Diluições adicionais inferiores ou superiores podem ser ensaiadas (1:105-1:107).
    2. Prepare uma mistura de primer-sonda de 20x. Adicionar 3,6 μL de cada um dos primers de 100 μM (forward e reverse, Rep2 e ITR), 1 μL de cada uma das sondas de 100 μM dd-PCR (Rep2 e ITR) e 3,6 μL de água livre de nucleases a um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: A biblioteca AAV é medida usando um conjunto de sondas de primer direcionadas a transgenes (Rep2) detectadas com uma sonda marcada com FAM e um conjunto de sondas de primer direcionadas a ITR detectadas com uma sonda marcada com HEX.
    3. Preparar uma reação de PCR de 22 μL adicionando 5,5 μL de amostra, 1,1 μL de mistura 20x primer-sonda, 11 μL de supermistura dd-PCR para sondas (sem dUTP) e 4,4 μL de água livre de nuclease. Isso produz concentrações de 900 nM e 250 nM para os primers e a sonda, respectivamente.
    4. Gere as gotículas usando um gerador de gotículas, transfira a reação para uma placa de 96 poços, coloque a placa em um termociclador e execute uma etapa de desnaturação por 10 min a 94 °C, seguida por 40 ciclos de 30 s a 94 °C e 1 min a 58 °C. Em seguida, inative a polimerase por 10 min a 98 °C e adicione uma etapa final de resfriamento. Leia as reações em um leitor de gotículas e prossiga para a análise28.
    5. Abra o arquivo de placa dd-PCR salvo usando o software de análise. Use a ferramenta de limite na guia Amplitude 1D (amplitude de fluorescência vs. número de evento) para separar as gotículas negativas e positivas para cada canal, usando o NTC como guia, e exportar os dados para um arquivo csv.
    6. Para calcular a concentração vetorial, primeiro calcule o fator de correção CF usando a fórmula:
      Equation 1
      A FC determina a proporção de gotículas positivas para o transgene [Positivos] que são positivas para ambos, transgene e ITR [Ch1+ Ch2+], para garantir a detecção de partículas vetoriais funcionais. A concentração vetorial final c pode agora ser calculada usando a seguinte equação:
      Equation 2
      DF é o fator de diluição (1:105-1:107 conforme determinado anteriormente). As cópias por reação de 20 μL/poço correspondem a 5 μL da amostra diluída. O fator 1.000 corrige a escala para VG/mL (genoma viral/mL). Um resultado exemplar de titulação é demonstrado na Tabela 1 e na Figura 3.
  9. Análise da biblioteca viral de AAV por NGS
    1. Amplificar o fragmento de inserção do peptídeo de 96 nucleotídeos configurando uma reação de PCR de 20 μL usando um kit de revisão de polimerase (2x; ver Figura 4). Adicionar 1 μL de estoque de AAV contendo 1 x 108 vg, 0,5 μL de cada um dos 100 μM de primer (NGS_forward e NGS_reverse) e 10 μL da mistura enzimática à reação. Ajustar o volume final para 20 μL com água sem nuclease.
    2. Transfira a reação para um termociclador e execute uma etapa de desnaturação por 3 min a 98 °C, seguida por 30-35 ciclos de 10 s a 98 °C, 10 s a 59 °C e 20 s a 72 °C, seguido por 5 min a 72 °C e uma etapa final de resfriamento.
    3. Purificar as amostras usando um kit de purificação PCR. Quantifique a concentração em espectrofotômetro e execute um gel de agarose a 3% para verificar a pureza e o tamanho do fragmento.
    4. Processar os fragmentos de PCR usando o sistema de bibliotecas para amostras de baixa complexidade kit de acordo com as instruções do fabricante para a preparação de uma biblioteca NGS. Realizar a reação de reparo final com 30 ng de fragmento de PCR, seguido de ligadura do adaptador e amplificação por PCR por 10 ciclos. Use o kit de purificação PCR para a purificação das reações.
    5. Processar os produtos finais em um Bioanalisador para verificar o tamanho e pureza, usando um kit de reagentes de DNA de acordo com as instruções do fabricante.
    6. Quantifique os amplicons usando um fluorômetro e agrupe-os. Quantificar a biblioteca NGS agrupada final novamente em um fluorômetro (de acordo com as instruções do fabricante) e verificar a qualidade em um Bioanalisador.
    7. Sequencie as bibliotecas NGS em um modo de extremidade única (SE), usando um kit de alta saída de 75 ciclos, com um comprimento de leitura de 84 e um índice 1 de 8.
      NOTA: O sequenciamento dos exemplos neste artigo foi realizado nas instalações GeneCore da EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
    8. Analise os dados de sequenciamento NGS com Python 3 e biopython. Os arquivos podem ser encontrados em https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternativamente em https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). A análise da NGS é composta por duas etapas.
      1. Na primeira etapa, pesquise nos arquivos de sequência sequências que satisfaçam determinados critérios (presença de sequências de reconhecimento flanqueando o local de inserção) (ver Figura 4, etapa 1.9.8.5.). Isso é feito usando um script (Script#1) e um arquivo de configuração que fornece as informações necessárias. Uma vez que a sequência correta é identificada, o programa extrai e armazena a sequência no arquivo de saída, que é um arquivo txt com o mesmo nome do arquivo de sequenciamento.
      2. O segundo passo é a análise dos arquivos de saída. As sequências na biblioteca começam com qualquer um dos seis nucleotídeos (AGWggc, W =A/T) na inserção de nove aminoácidos. Com base nessa sequência inicial, o peptídeo é traduzido. Isso gera os arquivos de saída que contêm as variantes de peptídeo (PVs).
      3. Prepare duas pastas: Script e Dados. Para a pasta Dados, copie os arquivos compactados com gzip resultantes do sequenciamento. Para a pasta Script, copie os seguintes arquivos, arquivo Python: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Arquivo Python: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Arquivo de configuração: Barcode_Script_JoVE.conf; e arquivo de tabela de pesquisa (LUT): Zuordnung.txt.
      4. Antes de executar os scripts, edite os seguintes arquivos na pasta Script. Abra o arquivo "Zuordnung.txt" e adicione em duas colunas separadas por tabulações, os nomes dos arquivos gzip (coluna 1) e o nome final desejado (coluna 2; valores separados por tabulação).
        Observação : arquivos txt de exemplo são encontrados na pasta GitHub "PV_analysis_script". Os arquivos fornecidos na pasta GitHub são preparados para a análise de três dados de exemplo da biblioteca acima: xaa.txt.gz, xab.txt.gz e xac.txt.gz. Os arquivos de saída também são fornecidos.
      5. Altere as seguintes variáveis no arquivo de configuração "Barcode_Script_JoVE.conf":
        my_dir = "~/Dados/"
        filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
        As variáveis específicas da sequência: BCV_size = 27, BCVesquerda = TCCAGGGCCAG, BCVdireita = GCCCAGG, BCVloc = 30,margem BCV = 8, BCVleft_revcomp = GCCGCCTGGGC, BCVright_revcomp = CTGGCCC e BCVloc_revcomp = 41 (veja a Figura 4 para detalhes).
      6. Use o seguinte comando para chamar a detecção e extração de sequência de variantes:
        >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
        NOTA: A saída são arquivos txt com as sequências de DNA extraídas e seus números de leituras. O cabeçalho desse arquivo contém dados estatísticos (ou seja, o número total de leituras e as leituras extraídas). Esses dados são transferidos para os próximos arquivos. Esses dados txt são os arquivos de entrada para o Script#2, nos quais as sequências de DNA são traduzidas, classificadas e analisadas.
      7. Execute a extração e análise PV usando o seguinte comando:
        >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analise os arquivos de saída de texto do Script #2. Os arquivos de saída do Script#2 são nomeados usando a segunda coluna do LUT em "Zuordnung.txt" com extensões baseadas no tipo de análise.
        NOTA: Certifique-se de que os três arquivos de saída contenham dados estatísticos nas primeiras linhas ("# de leituras PV válidas", "# de leituras PV inválidas" e "# de leituras PV exclusivas"), uma primeira coluna com o índice de cada sequência de DNA dos arquivos txt de entrada (saída do Script #1) e as seguintes colunas: (1) "... analyzed_all.csv": "Amostra:" (sequência de DNA), "#" (número de leituras), "Frw ou Rev" (leitura direta ou reversa) e "PVs" (sequência peptídica traduzida). As sequências inválidas têm "NA" e "not valid" nas duas últimas colunas. (2) "... analyzed_validSeq.csv": igual ao arquivo anterior, filtrado para sequências válidas. (3) "... analyzed_PV.csv": "PVs" (sequência peptídica traduzida), "#" (número de leituras) e "count" (as contagens frw e rev nos arquivos anteriores são mescladas e a contagem é dada 1 ou 2).
      9. Visualize os arquivos de saída usando o software disponível com base nas necessidades do usuário.

2. AAV2 seleção aleatória da biblioteca de exibição de peptídeos de 7 meros

  1. Use a biblioteca AAV após quantificação e controle de qualidade (seção 1) para evolução dirigida em um modelo de escolha para selecionar iterativamente candidatos com propriedades desejadas (ver Figura 5)16,18,21.
    NOTA: Esses candidatos são usados para a geração de uma biblioteca com código de barras, conforme descrito abaixo na seção 3.

3. Preparação e análise da biblioteca de capsídeos AAV com código de barras

NOTA: Após a identificação de um conjunto de capsídeos AAV potencialmente específicos e eficientes na tela de exibição de peptídeos, verifique a funcionalidade das sequências peptídicas identificadas e compare-as com um conjunto de variantes de capsídeos AAV de referência comumente usadas ou bem descritas. Para fazer isso, a sequência do capsídeo é inserida em uma construção auxiliar Rep/Cap sem ITRs.

  1. Produção de biblioteca AAV com código de barras
    1. Realizar a produção de AAV recombinante para cada variante do capsídeo utilizando o sistema de três plasmídeos, conforme descrito anteriormente24.
      NOTA: Para distinguir as diferentes variantes do capsídeo, o plasmídeo transgênico do repórter do ITR abriga um código de barras único de 15 nucleotídeos de comprimento. O código de barras está localizado na UTR 3' (região não traduzida) entre a proteína fluorescente amarela reforçada (EYFP) e o sinal poliA (ver Figura 6A). A expressão de EYFP é impulsionada por um forte promotor de citomegalovírus (CMV) ubíquo que fornece níveis suficientes de transcritos de RNA.
    2. Projetar códigos de barras de 15 nucleotídeos de comprimento com homopolímeros de menos de três nucleotídeos, conteúdo de CG de <65%29 e distância de Hamming maior que quatro nucleotídeos24.
    3. Produza cada capsídeo separadamente em combinação com um plasmídeo transgênico que carrega um código de barras único. Dessa forma, cada variante do capsídeo é marcada com um código de barras distinto que permite seu rastreamento específico (consulte a Figura 6B).
  2. Titulação vetorial de AAV por dd-PCR
    1. Realizar a titulação do AAV conforme descrito anteriormente na secção 1.8, substituindo o par de primers Rep2 pelo par de primers YFP.
    2. Quantifique as produções AAV individuais e agrupe quantidades iguais de cada produção para gerar a biblioteca final com código de barras.
    3. Quantificar novamente a biblioteca final para verificar a concentração e a qualidade finais (ver Figura 7).
  3. Biblioteca AAV com código de barras aplicação in vivo
    1. Aplique a biblioteca AAV com código de barras sistemicamente ao sistema modelo de escolha (por exemplo, sistemicamente em ratos24).
    2. Coletar tecidos alvo ON e OFF (ou seja, fígado, pulmão, coração, diafragma, músculo liso, duodeno, pâncreas, cólon, bíceps, ovários, estômago, orelha interna, rim, aorta abdominal, aorta torácica, cérebro, gordura marrom e branca e baço) ou tipos celulares com base no experimento. Congelá-los a -80 °C, extrair o DNA/RNA e aplicar a análise de quantificação de NGS, conforme descrito na próxima seção.
  4. Extração de DNA/RNA
    1. Extrair o DNA e RNA dos tecidos de interesse utilizando o Mini Kit DNA/RNA.
    2. Coloque um pequeno pedaço do tecido de interesse (1 mm3, cerca de 5 mg) em um tubo de reação de 2 mL.
    3. Adicionar 350 μL de tampão de lise misturado com β-mercaptoetanol (1%) e esferas de aço de 5 mm ao tecido (manusear amostras com β-mercaptoetanol sob uma capela de fumos).
    4. Homogeneizar o tecido em um tissueLyser por 45 s a 40 Hz.
    5. Adicionar 10 μL de proteinase K (10 mg/mL) e incubar por 15 min a 55 °C enquanto agita a 400 rpm.
    6. Centrifugar a 20.000 x g por 3 min à temperatura ambiente, coletar o sobrenadante e prosseguir com o protocolo do fabricante do Kit DNA/RNA.
    7. Divida a etapa de lavagem em duas etapas com 350 μL de tampão de lavagem em cada etapa. Entre estas etapas de lavagem, digerir o ADN remanescente na coluna com DNase I sem RNase. Adicionar 80 μL da solução de DNase I, preparada de acordo com as instruções do fabricante, na coluna e incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos.
    8. Elute RNA/DNA da coluna com água livre de nucleases. Armazenar o RNA isolado a -80 °C e o gDNA a -20 °C.
  5. síntese de cDNA
    1. Submeter as amostras de RNA a outra rodada de tratamento com DNase I de 15-30 min (para remoção completa do DNA contaminante das amostras de RNA) antes da reação de transcrição reversa. Adicionar 1 μL da solução de DNase I, 4 μL de tampão (fornecido com o kit) e água livre de nuclease a um volume final de 40 μL a 212 ng de RNA. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente e inactivar o calor a 70 °C durante 10 min.
    2. Sintetizar cDNA, usando 150 ng de RNA usando um kit de acordo com as instruções do fabricante. Incluir controles sem a transcriptase reversa, para garantir a ausência de contaminação do DNA viral da amostra. O cDNA é armazenado a -20 °C.
      NOTA: A quantidade de RNA de entrada para transcrição reversa ideal pode variar dependendo do tipo de tecido e da eficiência de transdução esperada no respectivo tecido.
  6. Análise da biblioteca viral de AAV (in-vivo) por NGS
    1. Para alcançar alta profundidade de sequenciamento a baixo custo, execute NGS via sequenciamento Illumina, conforme descrito anteriormente (seção 1.9). Amplifique a sequência de código de barras e, em seguida, ligue os adaptadores de sequenciamento ao amplicon.
    2. Devido ao comprimento de leitura curto e à ligação dos adaptadores de sequenciamento em ambos os lados do amplicon, ao projetar, verifique se o amplicon é suficientemente pequeno para garantir a presença da sequência de código de barras dentro da leitura NGS. Para o sequenciamento dos códigos de barras dentro dos genomas virais e dos transcritos virais, o amplicon de PCR é projetado para ter 113 pb de comprimento (ver Figura 8).
    3. Amplificar a região do código de barras com os primers BC-seq forward e BC-seq reverse. Preparar a seguinte reação de PCR: 0,5 μL de DNA polimerase de alta fidelidade, 10 μL de tampão 5x, 0,25 μL de cada primer de 100 μM (BC-seq fw/BC-seq rv) e 1 μl de 10 mM dNTPs. Use 25 ng do cDNA ou DNA/reação como molde e ajuste o volume final para 50 μL com água livre de nucleases.
    4. Prepare a mistura mestra de PCR sob uma capa de PCR limpa para evitar contaminação. Use as seguintes condições de ciclo: 30 s a 98 °C, seguido por 40 ciclos a 98 °C por 10 s e 72 °C por 20 s, e um passo final de 5 minutos a 72 °C.
    5. Inclua controles de PCR para confirmar a ausência de DNA contaminante no master-mix de PCR. Para as amostras de cDNA, incluir os controles sem transcriptase reversa. Finalmente, inclua um exemplo com a biblioteca de entrada AAV. Essas informações serão usadas para gerar o arquivo Normalization_Variant.txt usado na análise.
    6. Verificar o tamanho do fragmento de PCR de cada amostra por eletroforese em gel antes da purificação da PCR. Este último é obtido usando esferas magnéticas comercialmente disponíveis ou sistemas de purificação de DNA baseados em colunas (ver Tabela de Materiais).
    7. Prepare a biblioteca NGS usando o sistema de bibliotecas para amostras de baixa complexidade de acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito anteriormente na seção 1.9.
    8. Determinar a concentração de ADN através do dsDNA HS Kit e analisar a qualidade da biblioteca conforme descrito anteriormente (secção 1.9.6), seguido de agrupamento. Quantifique a biblioteca agrupada em um fluorômetro e avalie a qualidade em um Bioanalisador.
    9. Execute o sequenciamento NGS conforme discutido na seção 1.9.7.
    10. Quantificar por qPCR o número de cópias do transgene (genomas virais) e o gene housekeeping para avaliar a distribuição da biblioteca agrupada entre tecidos ou órgãos no DNA.
    11. Estabeleça uma reação de qPCR de 30 μL da seguinte forma, para determinar o número de cópias de EYFP (transgene) e GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, gene housekeeping):
      1. Preparar uma mistura de primer/sonda de 60x para EYFP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv e 0,6 μM YFP_probe; ver Tabela de Materiais). Use a mistura de primer/sonda GAPDH (consulte Tabela de Materiais) para determinar o número de cópia do gene da governanta. Configure a reação no gelo.
      2. Prepare uma mistura mestre de PCR (15 μL, consulte Tabela de Materiais) e adicione 60x mistura de primer/sonda (0,5 μL) para todas as amostras e padrões (para calcular os números de cópia para os padrões, use o seguinte link: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Configure a reação no gelo.
      3. Transfira 15,5 μL da mistura mestre para uma placa de 96 poços e adicione 14,5 μL de amostra (75 ng de concentração total de DNA) ou padrão para o respectivo poço. Sele a placa de 96 poços com papel alumínio, vórtice e gire brevemente.
      4. Transfira 10 μL de cada amostra para uma placa de 384 poços em duplicatas. Sele a placa com papel alumínio e gire a 800 x g por 5 min a 4 °C.
      5. Incubar a mistura de reacção num termociclador utilizando uma temperatura inicial de 50 °C durante 2 minutos, seguida de uma fase de activação inicial de 10 minutos a 95 °C. Realizar 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s e recozimento/extensão a 60 °C por 1 min24.
      6. Para obter o número de genomas diploides (dg), use o número de cópias do GAPDH e divida por dois. Em seguida, pegue o valor do número de cópias do EYFP e divida pelo número de dg, resultando em genomas vetoriais por genoma diploide (vg/dg). Use esse valor para gerar o arquivo Normalization_Organ.txt para a análise de bioinformática.
    12. Realizar a análise dos dados de sequenciamento de NGS como Weinmann et al.24, usando código personalizado em Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). O fluxo de trabalho compreende a detecção de sequências de código de barras guiadas por sequências de flanco, seu comprimento e localização (Script#1_BarcodeDetection.py), bem como a análise do enriquecimento e distribuição do código de barras sobre o conjunto de tecidos (Script#2_BarcodeAnalysis.py).
      1. Detecte códigos de barras e atribua-os a variantes AAV. Coloque os dados de sequenciamento como arquivos fastq arquivados em um diretório (por exemplo, "Data_to_analyze"). O arquivo de dados de sequenciamento para a biblioteca de entrada é incluído nesse diretório e usado apenas para calcular as proporções do capsid na biblioteca de entrada.
      2. Antes de executar o script, crie dois arquivos de texto delimitados por tabulações: o arquivo de variantes de capsid (veja o arquivo de exemplo "Variants.txt") com as sequências de código de barras atribuídas a nomes de variantes de capsid AAV e o arquivo de contaminação (consulte "Contaminações.txt") com sequências de código de barras provenientes de possível contaminação (outros códigos de barras disponíveis no laboratório, contribuindo para a contaminação).
      3. Finalmente, edite o arquivo de configuração "Barcode_Script.conf" para incluir as seguintes informações: caminho para a pasta com dados de sequenciamento (por exemplo, "Data_to_analyze"), sequência de regiões flanqueadoras dos códigos de barras, sua posição e tamanho da janela para detecção de código de barras (semelhante à 1.9.8.5, consulte a Figura 8).
      4. Use o seguinte comando para chamar a detecção de código de barras com caminhos fornecidos para Script#1_BarcodeDetection.py e arquivos de configuração:
        >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
        Observação : A saída da execução de Script#1_BarcodeDetection.py é arquivos de texto com contagens de leitura por variante capsid, bem como o número total de leituras recuperadas dos dados brutos.
      5. Avalie a distribuição de capsídeos AAV com código de barras entre tecidos ou órgãos, executando Script#2_BarcodeAnalysis.py juntamente com os seguintes arquivos txt:
        1. No arquivo "Zuordnung.txt", atribua o nome a cada arquivo txt obtido da execução de detecção de código de barras a um nome de tecido/órgão: nomes de arquivos txt na primeira coluna e nomes de tecidos/órgãos correspondentes em atribuição delimitada por tabulação.
          Observação : para um exemplo, verifique a pasta "Exemplo" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). É importante notar que o nome do tecido/órgão pode incluir caracteres que definem a medição de cDNA ou gDNA e o número de réplicas biológicas (M1, M2, etc.).
        2. Crie um arquivo de texto "órgãos.txt" com a lista de nomes para órgãos de destino ON e OFF, que correspondem aos nomes fornecidos no arquivo de atribuição "Zuordnung.txt" (consulte a pasta "Exemplo": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
        3. Crie arquivos de texto delimitados por tabulações "Normalization_Organ.txt" e "Normalization_Variant.txt" com valores normalizados para todas as variantes do capsídeo e todos os órgãos/tecidos. Na primeira coluna do ficheiro "Normalization_Organ.txt", escreva os nomes indicados para cada órgão (como no ficheiro de atribuição "Zuordnung.txt") e na segunda coluna os valores de normalização para os tecidos correspondentes, gerados na secção 3.6.11.
        4. Preencha a primeira coluna do arquivo "Normalization_Variant.txt" com a lista de nomes de capsid e a segunda coluna com os valores normalizados das contagens de leitura para cada capsid na biblioteca em pool (a normalização pode ser calculada com base no arquivo de saída txt para a biblioteca de entrada resultante do primeiro script).
        5. Edite o arquivo de configuração especificando os caminhos completos para todos os arquivos adicionais mencionados acima. Execute Script#2_BarcodeAnalysis.py como:
          >python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
          NOTA: O script de análise de código de barras produz vários arquivos: arquivos de texto com valores de concentração relativa (RC) de distribuição de capsídeo dentro de diferentes tecidos com base em várias etapas de normalização descritas anteriormente e o arquivo de planilha que combina dados de arquivo de texto em dados de matriz mesclados. Este último pode ser usado para análise e visualização de clusters.
        6. Visualize os dados e realize a análise de agrupamento dos dados da matriz para distinguir as propriedades do capsídeo e avaliar suas semelhanças com base nos perfis de CR entre os tecidos. Use o script adicional PCA_heatmap_plot. R colocado no repositório:
          >Rscript --baunilha ~/PCA. R ~/concentração relativa.xls
          Observação : O script usa arquivos de concentração relativa.xls como entrada e gera dois gráficos de mapa de calor de cluster hierárquico e análise de componente principal (PCA).
        7. Para modificar gráficos (eixos do mapa de calor, componentes principais da ACP) ou parâmetros png (cor, tamanho, rotulagem), abra o script R e siga as instruções fornecidas nas seções comentadas.

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Representative Results

Geração de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV2. Como um primeiro passo para a seleção de AAVs projetados, a geração de uma biblioteca de plasmídeos é descrita. A inserção peptídica é produzida usando primers degenerados. Reduzir a combinação de códons naqueles de 64 para 20 tem as vantagens de eliminar os códons de parada e facilitar a análise de NGS, reduzindo a diversidade de bibliotecas no DNA, mas não o nível de proteínas. A inserção do oligonucleotídeo é adquirida como DNA de fita simples (Figura 1), que é convertido em DNA de fita dupla usando uma reação de PCR. A qualidade desta reação é controlada em um Bioanalisador. Como mostrado na Figura 2, três ciclos produziram uma banda mais forte, em comparação com 10 ou 30 ciclos. A inserção é então digerida com BglI para gerar saliências de três nucleotídeos. O nucleotídeo próximo à sequência de saliência da inserção de fita dupla pode ser um A ou um T (W é o código de ambiguidade para A ou T), que está na terceira posição de um códon que codifica arginina (R) ou serina (S). O vetor (pRep2Cap2_PIS) tem uma mutação frameshift no sítio de inserção do peptídeo que impede a produção do capsídeo na ausência de uma inserção, devido à criação de um códon de parada logo após o sítio de inserção. A digestão SfiI deste plasmídeo gera saliências de três nucleotídeos que correspondem às saliências geradas na inserção de oligonucleotídeos codificadores de peptídeos. A ligadura precisa ser realizada em condições ideais para maximizar a complexidade da biblioteca de plasmídeos. Para tanto, para a transformação, foi realizada eletroporação utilizando bactérias comercialmente disponíveis com alta eficiência.

A diversidade da biblioteca de plasmídeos é calculada com base na contagem de colônias, que normalmente é em torno de 1 x 108 para esse tipo de biblioteca. O número total de colônias corresponde à diversidade potencial máxima da biblioteca na análise NGS, como será discutido mais adiante. A biblioteca de plasmídeos é então usada para gerar a biblioteca AAV, que não é descrita em detalhes aqui, mas em outros lugares27.

A quantificação dessa biblioteca foi realizada por dd-PCR. Normalmente, duas regiões são quantificadas, o gene representante AAV2 dentro do genoma viral e o ITR (ver Figura 3 e Tabela 1). Como mostrado na Tabela 1, das gotículas positivas para o genoma viral, 99,2% também são positivas para ITR (Ch1+ Ch2+), que é um controle de qualidade para a biblioteca de AAV e sugere que os capsídeos AAV contêm genomas virais completos. Para obter uma concentração em vg/mL, a proporção de gotículas duplamente positivas para positivas é calculada e usada para obter o número correto de cópias antes da amplificação pelo fator de diluição.

A qualidade da biblioteca de AAV é então avaliada pela análise de NGS, começando com uma PCR usando primers apropriados. Em seguida, o produto PCR é processado usando um kit disponível comercialmente, que adiciona adaptadores contendo índice ao produto PCR. Os produtos NGS são sequenciados e os arquivos são analisados usando Python. Três dados de amostra de uma biblioteca de exibição de peptídeo AAV2 são fornecidos. Cada sequência no arquivo de entrada Script#1 (lista de sequências de todas as cópias de PCR do segmento de DNA amplificado na amostra) é bioinformaticamente pesquisada para as sequências BCVesquerda eBCV direita, ou assequências BCV left_comp e BCVright_comp. Se uma combinação for identificada, a sequência contida será extraída e adicionada ao arquivo de saída (consulte a Figura 4). A saída de ambos os scripts fornece dados estatísticos sobre a preparação da biblioteca NGS. Nos três conjuntos, as leituras extraídas, baseadas em sequências de assinaturas específicas da biblioteca, representaram cerca de 94% do total de leituras, o que sugere uma boa qualidade. A saída do Script#2 fornece dados estatísticos adicionais, e a tradução da sequência de DNA extraída produz dados adicionais de controle de qualidade. O "# de leituras PV inválidas" (ou seja, sequências que não possuem os seis nucleotídeos usados para iniciar a tradução in-silico e codificar resíduos RG ou SG) é inferior a 1% das leituras recuperadas, o que confirma uma boa qualidade de sequenciamento. As saídas do segundo script (isto é, a tradução e classificação das sequências de DNA extraídas) fornecem informações adicionais, como o número de leituras por variante peptídica ou o número de sequências de DNA que dão origem a cada variante peptídica. Dos arquivos, aqueles que terminam em "analyzed_PVs" contêm apenas leituras de DNA válidas, e a análise é realizada no nível de sequência peptídica. Das leituras válidas, mais de 99% são únicas, o que sugere que a biblioteca é equilibrada e a diversidade interna é alta.

Seleção de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV2. Esta biblioteca pode então ser usada para seleção in vivo ou in vitro . Isso não está incluído neste protocolo, mas um esboço é fornecido na Figura 5. Resumidamente, para seleção in vivo , os tecidos são coletados 1 semana após a injeção sistêmica de 1 x10 12 vg/camundongo e o DNA é isolado. Uma PCR de resgate em um fragmento maior do gene cap é realizada, e o produto é clonado no vetor plasmidial usando diferentes sítios de restrição, mas um protocolo semelhante ao descrito aqui, e bibliotecas de AAV round-1 são preparadas. Para a análise de NGS, a PCR é realizada no DNA isolado ou nas bibliotecas de AAV. Após a seleção, a porcentagem de PVs únicos na biblioteca normalmente diminui de acordo com a pressão da seleção. Dependendo do projeto, a seleção pode ser concluída assim que PVs dominantes suficientes forem identificados pela NGS.

Seleção e análise de bibliotecas com código de barras. Os dados de uma biblioteca de AAV com código de barras composta por 82 capsídeos foram descritos anteriormente24. A quantificação por dd-PCR das partículas de AAV (ver Figura 7 e Tabela 1) mostra que 94% dos capsídeos positivos para o transgene também contêm ITR, indicativo de genoma completo. Isso é menor do que a biblioteca de tipos selvagens descrita acima, mas ainda sugere uma boa qualidade para AAVs recombinantes, considerando que eles geralmente empacotam de forma menos eficiente. Após a injeção da biblioteca agrupada em animais, os tecidos são coletados e DNA e RNA são isolados. A PCR para NGS, bem como a preparação e sequenciamento da biblioteca NGS são então realizadas conforme descrito acima e anteriormente24. Para o cálculo da vg/dg, é realizada a qPCR e, nos dados amostrais fornecidos, os valores variam de 0,1-4. Como é típico para a entrega sistêmica de AAV, o fígado tem mais de 10 vg/dg.

Como parte do pipeline de análise, as etapas de normalização são executadas em diferentes níveis. Na biblioteca agrupada de entrada, as variantes do capsídeo normalmente não são representadas igualmente. Portanto, a análise NGS da biblioteca de entrada é usada para gerar um arquivo de normalização, que corrige a abundância de cada variante do capsídeo no tecido/órgão final com base na abundância dessa variante do capsídeo na biblioteca de entrada. A biodistribuição dos membros da biblioteca agrupados por NGS é realizada no nível de DNA e RNA. Essa normalização para a biblioteca de entrada produz o quociente (P*αβ) de proporção dentro do tecido/órgão (P αβ) para a proporção na biblioteca de entrada (La). Esses cálculos podem ser encontrados no arquivo "variant_comparison.txt". Este quociente é então multiplicado pelos valores vg/dg do arquivo "Normalization_organ.txt" para produzir o valor Β αβ, e as proporções dos valores de Βαβ são calculadas para um único tecido ou para todos. A proporção do valor de β αβ para cada variante dentro de um tecido (Vαβ) reflete a disseminação dessa variante dentro desse tecido ("organ_comparison.txt"). Em contraste, a proporção do valor βαβ para cada variante em todos os tecidos (Tαβ) indica a disseminação dessa variante em todo o corpo ("relativeconcetrations.xls"). Essas duas proporções refletem a biodistribuição intra e intertecidual de cada variante. Todos esses arquivos podem ser utilizados para diferentes visualizações da eficiência e especificidade do capsídeo24. Como exemplo, usando a tabela final (encontrada em "relativeconcetrations.xls), a análise de componentes principais e agrupamento hierárquico é apresentada na Figura 9.

A normalização da biblioteca agrupada a partir do sequenciamento NGS mostra que cada capsídeo tem uma proporção média de 0,012, o que também corresponde à proporção teórica de cada um dos 82 capsídeos e sugere uma biblioteca agrupada bem equilibrada de 0,012 (1/82). O arquivo "concentração relativa.xls" gerado pelo pipeline de bioinformática reflete a biodistribuição intertecidual do capsídeo, conforme ilustrado na Figura 9. O mapa de calor mostra valores de concentração relativa em uma escala log2 para cada capsídeo da biblioteca agrupada hierarquicamente de acordo com o perfil de biodistribuição do tecido. A análise de componentes principais permite distinguir clusters de variantes de capsídeos AAV com propriedades de biodistribuição semelhantes e também destaca os capsídeos periféricos com padrões únicos de biodistribuição intertecidual. Os dois principais ramos da hierarquia do mapa de calor refletem a diferença na eficiência de transdução das variantes do capsídeo. O ramo esquerdo com a maioria das variantes do capsídeo inclui todos os capsídeos, que mostram um alto valor de concentração relativa na maioria dos tecidos. Além da especificidade hepática notavelmente alta, três outros capsídeos (Var60, Var13 e Var63) exibiram especificidade no diafragma (Di), músculo esquelético (SM), bíceps (BlC) e no cérebro (B). O ramo direito do agrupamento hierárquico inclui as variantes do capsídeo com menor eficiência de transdução geral, que é pronunciada no duodeno (Du) e pâncreas (P). A ACP para o subconjunto original forma o grupo de variantes do capsídeo com alta especificidade hepática (Var 64, 78, 65, 55, 56) e descreve o capsídeo Var60 com tropismo muscular excepcional.

Figure 1
Figura 1: Visão geral da estratégia de clonagem para a biblioteca de exibição aleatória de peptídeos de 7 mer AAV2.
O oligonucleotídeo com a sequência aleatória de inserção do peptídeo 7-mer é flanqueado por sequências que contêm o sítio de digestão BglI e um sítio de ligação para a reação de amplificação. O pRep2Cap2_PIS vetorial contém sites SfiI. As saliências geradas pela digestão BglI e SflI são complementares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Controle de qualidade do bioanalisador da síntese de oligonucleotídeos de segunda fita.
A síntese de segunda fita de oligonucleotídeos degenerados é confirmada pela análise em um bioanalisador. As reações de PCR com três, 10 e 30 ciclos de amplificação são comparadas, mostrando que o mais eficiente é o de amplificação de três ciclos. (A) Dados do bioanalisador representados como imagem em gel. (B-D) Comprimentos de fragmentos plotados (em pb, eixo x) versus unidades de fluorescência (FU, eixo y), em comparação com picos padrão, visíveis em 15 e 1500 pb. As setas vermelhas indicam oligonucleotídeos de fita dupla. Nota-se que o maior valor de UF, representando a maior concentração de DNA, de oligonucleotídeos de fita dupla é observado após três ciclos de amplificação (setas vermelhas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Titulação de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV2 usando dd-PCR.
(A) Detecção de gotículas rep2-positivas no canal 1 (FAM, canal 1) para um controle de água não molde e uma amostra de vírus diluída 1:106 . (B) Detecção de gotículas ITR-positivas no canal 2 (HEX, canal 2). (C) Detecção de gotículas positivas tanto para rep2 quanto para ITR (destacadas em laranja). As linhas roxas indicam limiares para a detecção de gotículas positivas versus negativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Visão geral do fragmento de DNA usado para NGS e configurações para a análise de python.
A NGS PCR amplifica uma região de 96 nucleotídeos. O fragmento de PCR é usado para gerar a biblioteca NGS. Para a análise bioinformática, é necessário reconhecer as sequências direita e esquerda do sítio de inserção para ambas as fitas, bem como a distância do início do fragmento de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Seleção iterativa de bibliotecas AAV in vivo.
Os ratos são injetados com a biblioteca AAV. Os tecidos-alvo ON e OFF são coletados 1 semana depois e submetidos a NGS e análise. O tecido alvo ON é usado para resgatar o gene do capsídeo, que é clonado no vetor pai. A biblioteca AAV selecionada é produzida e usada para repetir o ciclo de seleção acima mencionado. Esta figura foi criada com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Visão geral da geração da biblioteca AAV com código de barras.
(A) Representação gráfica de um genoma auto-complementar de AAV com um transgene eyfp impulsionado por promotor de CMV flanqueado por ITRs. O 3' UTR contém um código de barras longo de 15 nucleotídeos (BC) localizado no 3' UTR entre o eyfp e o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH). O BC permite o rastreamento do capsídeo no nível de DNA e mRNA. (B) Durante a produção de AAV, um genoma único com código de barras é empacotado por uma única variante do gene cap , facilitando a identificação do capsídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Titulação de uma biblioteca AAV com código de barras usando dd-PCR.
(A) Detecção de gotículas positivas para YFP no canal 1 (FAM, Canal 1) para um controle de água não molde e uma amostra de vetor diluída 1:106 . (B) Detecção de gotículas ITR-positivas no canal 2 (HEX, canal 2). (C) Detecção de gotículas positivas tanto para rep2 quanto para ITR (destacadas em laranja). As linhas roxas indicam limiares para a detecção de gotículas positivas versus negativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Visão geral do fragmento de DNA usado para NGS e configurações para a análise de Python.
A NGS PCR amplifica uma região de 113 nucleotídeos. Para a análise bioinformática, as sequências de reconhecimento à direita e à esquerda do código de barras precisam ser dadas para ambas as fitas, bem como a distância do início do fragmento de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Análise de componentes principais (ACP) e análise de agrupamento hierárquico.
(A) PCA de valores de concentração relativa para 82 capsídeos em todos os tecidos permite definir agrupamentos de variantes de capsídeos com propriedades semelhantes e variantes com padrões de transdução únicos. (B) Para melhor separar o cluster altamente povoado, os registros de variantes únicas periféricas foram excluídos da matriz e a análise de PCA foi repetida. (C) A análise hierárquica de agrupamento permite avaliar visualmente perfis de transdução variantes entre os tecidos como um gráfico de mapa de calor (Li = fígado, Lu = pulmão, FatB = gordura marrom, H = coração, Di = diafragma, SM = músculo liso, Du = duodeno, P = pâncreas, C = cólon, BIC = bíceps, O = ovários, St = estômago, I = orelha interna, K = rim, Aa = aorta abdominal, At = aorta torácica, B = cérebro, FatW = gordura branca e S = baço). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra Alvo Cópias/poço de 20 μL Positivos Ch1+ Ch2+ CF cópias corrigidas DF VG/mL
H2O rep2 28 2 0 0 0 1,00E+06 5,60E+09
AAV2lib rep2 90600 16396 16266 0.99 89882 1,00E+06 1,80E+13
H2O YFP 4 3 2 0.67 3 1,00E+06 8.00E+08
BCAAVlib YFP 34680 13229 12452 0.94 32643 1,00E+06 6,53E+12

Tabela 1: Resultados de titulação de uma biblioteca de exibição de peptídeo AAV2 ("AAV2lib") e da biblioteca vetorial EYFP com código de barras ("BCAAVlib").

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Discussion

Neste protocolo, são descritas as etapas necessárias para a engenharia do capsídeo AAV de exibição de peptídeos e para a triagem de bibliotecas de AAV com código de barras, bem como para a análise bioinformática da composição da biblioteca e do desempenho do capsídeo. Este protocolo se concentra nas etapas que facilitam a análise bioinformática desses tipos de bibliotecas, porque a maioria dos laboratórios de virologia tem atraso em habilidades de programação para corresponder à sua proficiência em técnicas de biologia molecular. Ambos os tipos de bibliotecas foram extensivamente descritos na literatura, como descrito na introdução, e podem ser reproduzidos com relativa facilidade.

Como primeiro passo, o projeto de uma biblioteca de exibição de peptídeos na posição 588 na região variável VIII do AAV2 é descrito. Esse desenho (AAV2_Peptide(ii) em publicação anterior26) e o método de clonagem descrito podem ser facilmente adaptados a outros sorotipos com base nas informações fornecidas em publicação recente26. Uma etapa crítica no pipeline de clonagem é a eficiência de ligadura/transformação (usando o ponto de corte de ~1 x 108 colônias). Recomenda-se adicionar uma reação de ligadura apenas com vetor. Isso ajuda a identificar o percentual de colônias bacterianas com inserção, que deve ser superior a 80%. Uma eficiência abaixo do esperado, ou seja, um número de colônias bacterianas (calculando a porcentagem com inserção) menor do que a diversidade teórica das inserções de oligonucleotídeos, impactaria negativamente as variantes de baixa abundância. Várias melhorias incluem tempos de digestão mais longos e etapas de limpeza para o vetor ou reação de ligadura, usando kits comerciais.

O próximo passo é o controle de qualidade da biblioteca de variantes usando NGS de um fragmento de PCR que engloba o sítio de inserção de oligonucleotídeos. O NGS é realizado usando um sistema de sequenciamento Illumina. Existem várias alternativas, nas quais os produtos de PCR podem ser submetidos diretamente sem preparação prévia da biblioteca NGS. Isso é mais adequado para experimentos em pequena escala ou quando uma alta profundidade de leitura não é necessária. O protocolo aqui relatado compreende a preparação da biblioteca NGS, incluindo a adição de adaptadores com índices Illumina aos produtos de PCR, usando um kit disponível comercialmente. Uma limitação comum em relação à NGS é que esses fragmentos de PCR têm uma baixa diversidade, porque as sequências que flanqueiam o sítio de inserção de alta diversidade são idênticas em todas as variantes, o que por sua vez reduz a eficiência do sequenciamento. Para resolver isso, este kit adiciona qualquer número de dois a oito nucleotídeos aleatórios entre o fragmento de PCR e o adaptador. Alternativamente, a amostra precisa ser cravada com PhiX. O pipeline detalhado do Python é descrito para analisar bibliotecas de exibição de peptídeos AAV2. Como um modelo, arquivos de exemplo extraídos do arquivo NGS original da biblioteca de exibição de peptídeo AAV2 são fornecidos. Isso pode ser adaptado a outros sorotipos com as instruções dadas. Os arquivos de saída dessa análise podem ser usados em análises a jusante, como a comparação de plasmídios e bibliotecas de AAV 30, composição de aminoácidos em cada posição30, cálculo do escore de enriquecimento entre bibliotecas após rodadas de seleção 14, ou geração de logotipos ou gráficos de sequência 19. No que diz respeito à biblioteca de entrada, a presença de uma alta porcentagem de variantes exclusivas é desejada. No entanto, algumas variantes não produzem tão bem quanto outras, o que poderia levar a distribuições distorcidas após a produção. Uma baixa diversidade de variantes, ou em outras palavras, a presença de variantes dominantes, pode ser atribuída à baixa qualidade de inserção de oligonucleotídeos ou a um alto número de ciclos de síntese de segunda fita (etapa 1.2). Além disso, a composição de aminoácidos pode ser afetada pela produção. Cada aminoácido deve ter uma frequência de 5,00%. Se a distribuição variar muito desse valor, sugere-se realizar a mesma análise na biblioteca de plasmídeos para identificar possíveis vieses30.

Como os protocolos para geração de bibliotecas de AAV e as subsequentes rodadas de seleção em diferentes modelos animais e in vitro foram extensivamente descritos em múltiplas publicações e protocolos27,30,31,32, aqui apenas a análise de bibliotecas com código de barras de variantes e benchmarks projetados selecionados é descrita. Vale ressaltar que a clonagem da biblioteca após cada rodada de seleção pode ser realizada por PCR para isolamento do gene cap, conforme mencionado nas seções de protocolo e resultados. Extensas rodadas de seleção e amplificação por PCR podem levar ao acúmulo de mutações ou parar códons, que podem ser observados por NGS. Alternativamente, variantes enriquecidas podem ser selecionadas a partir dos dados de NGS, e os oligonucleotídeos ordenados e clonados da forma como foram descritos para a geração de uma biblioteca de exibição de peptídeos16,18. Finalmente, o protocolo contém uma breve descrição para a seleção de bibliotecas em nível de DNA, 1 semana após a injeção sistêmica. As seleções baseadas em RNA são mais rigorosas, pois também selecionam variantes que trafegam por vias de entrada infecciosas, embora sejam tecnicamente mais desafiadoras. Deve-se notar que as seleções baseadas em RNA ou transgenes (i.e., Cre) requerem uma duração in vivo mais longa, de cerca de 3-4 semanas 15,16,17,18,19,33. Para seleções baseadas em DNA, especialmente, é fundamental validar as variantes selecionadas contra sorotipos naturais e projetados conhecidos no nível de DNA e RNA usando uma biblioteca AAV com código de barras.

A segunda parte do protocolo descreve a geração e triagem de bibliotecas de AAV com código de barras utilizando o pipeline previamente desenvolvido24. Cada capsídeo AAV no pool contém o mesmo transgene (eyfp sob o controle de um promotor de CMV) com um código de barras distinto entre eyfp e o sinal polyA. Os códigos de barras utilizados nesta biblioteca encontram-se na publicação anterior24. O projeto foi baseado no princípio básico da distância de Hamming (ou seja, as sequências de código de barras precisam ser adequadamente diferentes), para que erros de sequenciamento não levem a atribuições errôneas de código de barras. Como descrito em Lyons e cols.26, a chance de dois erros ocorrerem em leituras entre 25-100 nucleotídeos é muito baixa. Uma distância de Hamming de 4 significa que dois erros de sequenciamento seriam necessários para atribuir uma leitura como o código de barras errado. Leituras com um erro serão ignoradas durante a análise e, neste caso, serão categorizadas como "leituras com variantes desconhecidas". Em uma publicação relevante, são fornecidas diretrizes e um script Python para gerar códigosde barras 29 que podem ser usados no pipeline. Para a identificação de códigos de barras úteis, outro código popular de correção de erros pode ser usado, conforme descrito na publicação de Buschmann e Bystrykh34, a saber, a distância de Levenshtein. Este grupo também fornece um pacote de software para a linguagem de programação R35.

Após a produção de AAV, a biblioteca de AAV com código de barras agrupado pode ser usada para estudos de biodistribuição em diferentes modelos. Este estudo descreve o pipeline usando a biblioteca de 82 variantes da publicação anterior24 e fornece dados de amostra para a prática. Este protocolo também pode ser adaptado de acordo com as necessidades de cada usuário. A análise de biodistribuição é baseada na coleta de diferentes tecidos ou células alvo ON e OFF, na extração de DNA e RNA a partir deles, na amplificação por PCR da região do código de barras para sequenciamento de NGS e na medição de vg/dg no nível de DNA. Para o RNA, seria melhor calcular a razão para o número de cópias de mRNA de um gene de referência. O gene de referência de escolha deve ser expresso de forma semelhante em diferentestecidos36, como RPP30 (Ribonuclease P/MRP Subunidade P30)37 ou Hprt (hipoxantina fosforibosiltransferase 1)36. No entanto, isso é árduo, então pode ser necessário usar vários genes de referência ao mesmo tempo para normalizar os dados de RNA. Por esta razão, a normalização para dg no nível de DNA pode ser completada, o que se correlaciona aproximadamente com o número de células. Isso também ressalta o uso da qPCR para esse cálculo, como descritoanteriormente24, embora a dd-PCR seja mais precisa e, portanto, preferida para uso futuro, especialmente considerando o progresso nesse campo37. Por último, mas não menos importante, otimizações básicas de biologia molecular são extremamente críticas para a metodologia aqui descrita. As reações de PCR precisam ser otimizadas para evitar a introdução de vieses na distribuição das bibliotecas. As sondas dd-PCR precisam ser projetadas para incluir regiões intrônicas para DNA e regiões interexônicas para RNA. Boas práticas laboratoriais, como compartimentalização física das etapas, especialmente produção de DNA e AAV a partir da preparação da biblioteca, e desinfecção adequada são de suma importância para evitar amplificação errônea e contaminações da biblioteca.

Notavelmente, o uso de bibliotecas de exibição de peptídeos e código de barras vetorial de DNA/RNA para selecionar capsídeos projetados com novos tropismos ou outras propriedades clinicamente relevantes representa apenas dois exemplos de tecnologias de evolução de capsídeos AAV dirigidos. Todos eles têm em comum o fato de que eles vêm com limitações e exigem mais otimização para realizar todo o seu potencial. Por exemplo, a simples inserção de um peptídeo deixa inalterada uma grande proporção (~99%) da sequência subjacente do capsídeo, cujas propriedades, incluindo interação com anticorpos neutralizantes anti-AAV, podem precisar ser modificadas ainda mais antes da aplicação humana38. Além disso, a diversidade real de exibição de peptídeos ou outras bibliotecas é tipicamente menor do que a teórica, devido, por exemplo, a limitações técnicas durante a clonagem ou transformação bacteriana31. De modo geral, há também um debate ativo sobre a relevância translacional da evolução dirigida em modelos animais ou in vitro , fomentado por evidências crescentes de um possível desempenho espécie-específico ou mesmo cepa-específica de capsídeos AAVsintéticos 38. No entanto, há uma esperança substancial de que muitas ou todas essas limitações sejam superadas e que o arsenal atual de tecnologias seja expandido para uma variedade ainda maior de modelos de doenças e se torne ainda mais acessível à maioria dos grupos de pesquisa. A esse respeito, um desenvolvimento recente particularmente encorajador é o uso de bibliotecas de AAV com código de barras, como as aqui relatadas, para validar capsídeos selecionados não mais apenas no órgão, mas agora também no nível celular, o que pode ser alcançado com novas tecnologias, como o sequenciamento de RNA de célula única (sc)39. Os protocolos aqui apresentados facilitarão o estabelecimento mais amplo de técnicas de evolução do AAV e, assim, acelerarão o desenvolvimento de novos capsídeos adaptados às necessidades de uma infinidade de grupos de pesquisa e pacientes humanos.

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Disclosures

D.G. é co-fundador da AaviGen GmbH. D.G. e K.R. são inventores de um pedido de patente pendente relacionado à geração de variantes do capsídeo AAV que evade a imunidade. Os demais autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

D.G. agradece muito o apoio da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) através dos Centros de Pesquisa Colaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) e TRR179 (Projektnummer 272983813), bem como do Centro Alemão de Pesquisa de Infecção (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplification primer ELLA Biotech (Munich, Germany) - Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit  Qiagen (Venlo, Netherlands) 80204 DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C NGS Library preparation
BC-seq fw:  IDT (San Joce, CA, CA, USA) ATCACTCTCGGCATGGACGAGC  NGS Library preparation
BC-seq rv:   IDT (San Joce, CA, CA, USA) GGCTGGCAACTAGAAGGCACA  NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) 44-420-3250ML DNA/RNA extraction
BglI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0143 Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1851196 dd-PCR cycler
dNTPS  New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) N0447S NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863024 dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863005 dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864008 dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863051 dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863009 dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 12001925 dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells Lucigen (Middleton, WI, USA) 60081-1 Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) 748050 Electroporation
GAPDH primer/probe mix Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Mm00186825_cn Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1652660 Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) 4368814 cDNA reverse transcription
ITR_fw IDT (San Joce, CA, USA) GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_rv IDT (San Joce, CA, USA) CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_probe IDT (San Joce, CA, USA) HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system Illumina Inc (San Diego, CA, USA) SY-415-1001 NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* Roche AG (Basel, Switzerland) KK2600 07958919001 NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device Promega GmbH (Madison, WI, USA) V8151 Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) ND-2000 Digestion of double-stranded insert
NGS_frw Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC NGS primer
NGS_rev Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) CGC CTT GTG TGT TGA CAT C NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina Inc (San Diego, CA, USA) FC-404-2005 NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit  NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) 9092-256 NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer  Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814000 dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814040 dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F530S Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) 24765-1G AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System Promega GmbH (Madison, WI, USA) NG2002 Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase  Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F549L NGS Library preparation
Proteinase K Roche AG (Basel, Switzerland) 5963117103 DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab 
QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864002 dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864003 dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28306 Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28704 Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 12162 Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28104 Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer Invitrogen (Waltham, MA, USA) Q32857 NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Q32851 NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix Qiagen (Venlo, Netherlands) 1044234 Taqman qPCR
rep_fw IDT (San Joce, CA, USA) AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC dd-PCR primer
rep_rv IDT (San Joce, CA, USA) CAATCACGGCGCACATGT dd-PCR primer
rep_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 dd-PCR probe
RNase-free DNase Qiagen (Venlo, Netherlands) 79254 DNA/RNA extraction
SfiI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0123 Digestion of vector
5 mm, steel Beads Qiagen (Venlo, Netherlands) 69989 DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides ELLA Biotech (Munich, Germany) - Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) M0202L Plasmid library ligation
TissueLyserLT Qiagen (Venlo, Netherlands) 85600 DNA/RNA extraction
YFP_fw IDT (San Joce, CA, USA) GAGCGCACCATCTTCTTCAAG dd-PCR primer
YFP_rv IDT (San Joce, CA, USA) TGTCGCCCTCGAACTTCAC dd-PCR primer
YFP_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) Zymo research (Irvine, CA, USA) D4013 Vector and Ligation purification

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Bioengenharia Edição 188 AAV bibliotecas AAV engenharia de capsídeo terapia gênica triagem de alto rendimento NGS bibliotecas com código de barras
Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV)
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Rapti, K., Maiakovska, O., Becker,… More

Rapti, K., Maiakovska, O., Becker, J., Szumska, J., Zayas, M., Bubeck, F., Liu, J., Gerstmann, E., Krämer, C., Wiedtke, E., Grimm, D. Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants. J. Vis. Exp. (188), e64389, doi:10.3791/64389 (2022).

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