Summary

Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu

Published: October 18, 2022
doi:

Summary

AAV peptit görüntüleme kütüphanesi üretimi ve yeni nesil AAV’lerin oluşturulması için yeni özelliklere sahip adayların barkodlaması yoluyla daha sonra doğrulanması.

Abstract

Adeno ilişkili virüsten (AAV) türetilen gen dağıtım vektörleri, klinik verilerin teşvik edilmesi ve çeşitli AAV gen tedavilerinin onaylanmasıyla kanıtlanan genetik hastalıkların tedavisi için en umut verici araçlardan biridir. AAV vektörlerinin başarısının iki ana nedeni, (i) farklı özelliklere sahip çeşitli doğal olarak oluşan viral serotiplerin önceden izole edilmesi ve (ii) moleküler mühendisliği için güçlü teknolojilerin daha sonra kurulması ve yüksek verimde yeniden kullanılmasıdır. Bu tekniklerin potansiyelini daha da artırmak, son zamanlarda DNA ve RNA düzeyinde seçilmiş AAV kapsidlerini barkodlamak için stratejiler uygulanmakta ve tek bir hayvandaki tüm ana organlarda ve hücre tiplerinde kapsamlı ve paralel in vivo tabakalaşmalarına izin vermektedir. Burada, mevcut kapsid mühendisliği teknolojilerinin çeşitli cephaneliğini temsil etmek için AAV peptid ekranını kullanarak, bu tamamlayıcı caddeler kümesini kapsayan temel bir boru hattı sunuyoruz. Buna göre, ilk olarak, istenen özelliklere sahip adayların in vivo seçimi için bir AAV peptid görüntüleme kütüphanesinin oluşturulması için önemli adımları açıklıyoruz, ardından ikincil in vivo tarama için en ilginç kapsid varyantlarının nasıl barkodlanacağının bir gösterimi ile devam ediyoruz. Daha sonra, NGS veri analizi sırasında en kritik adımlara genel bir bakışla bitirmeden önce, barkod amplifikasyonu ve adaptör ligasyonu dahil olmak üzere yeni nesil dizileme (NGS) için kütüphanelerin oluşturulmasına yönelik metodolojiyi örneklendiriyoruz. Burada bildirilen protokoller çok yönlü ve uyarlanabilir olduğundan, araştırmacılar en sevdikleri hastalık modelinde ve gen terapisi uygulamalarında optimal AAV kapsid varyantlarını zenginleştirmek için bunları kolayca kullanabilirler.

Introduction

Gen transfer terapisi, hastalığı önlemek, tedavi etmek, iyileştirmek veya iyileştirmek için hücresel genetik materyali onarmak, değiştirmek veya değiştirmek için hücrelere genetik materyalin sokulmasıdır. Hem in vivo hem de ex vivo gen transferi, viral olmayan ve viral olan farklı dağıtım sistemlerine dayanır. Virüsler, hedef hücrelerini verimli bir şekilde dönüştürmek için doğal olarak evrimleşmiştir ve dağıtım vektörleri olarak kullanılabilir. Gen terapisinde kullanılan farklı viral vektör türleri arasında, adeno ilişkili virüsler, patojenite, güvenlik, düşük immünojenite eksikliği ve en önemlisi uzun vadeli, entegre olmayan ekspresyonu sürdürme yetenekleri nedeniyle giderek daha fazla kullanılmaktadır 1,2,3. AAV gen tedavisi son on yılda önemli başarılar sağlamıştır; Avrupa İlaç Ajansı ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından insanlarda kullanılmak üzere üç tedavi onaylanmıştır 3,4. Hemofili, kas, kalp ve nörolojik hastalıklar gibi çeşitli hastalıkların tedavisi için başka yerlerde gözden geçirildiği gibi çeşitli klinik çalışmalar da devam etmektedir3. On yıllardır süren ilerlemeye rağmen, gen terapisi alanı son yıllarda bir dizi aksilik yaşamıştır4, en önemlisi klinik çalışmalarda ölümler5, özellikle kas gibi büyük veya beyin gibi ulaşılması zor dokular için doz sınırlayıcı toksisiteler nedeniyle beklemeye alınmıştır6.

Şu anda klinik çalışmalarda kullanılmakta olan AAV vektörleri, birkaç istisna dışında doğal serotiplere aittir1. AAV mühendisliği, üstün organ veya hücre özgüllüğü ve verimliliğine sahip vektörler geliştirme fırsatı sunar. Son yirmi yılda, peptid gösterimi, döngü değişimi, kapsid DNA karıştırma, hataya eğilimli PCR ve hedefli tasarım gibi çeşitli yaklaşımlar, farklı özelliklere sahip bireysel AAV varyantları veya kütüphaneleri oluşturmak için başarıyla uygulanmıştır7. Bunlar daha sonra, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi, istenen özelliklere sahip varyantları seçmek için birden fazla yönlendirilmiş evrim turuna tabi tutulur 1,3. Tüm kapsid evrim stratejileri arasında, peptid görüntüleme AAV kütüphaneleri, bazı benzersiz özelliklerden dolayı en yaygın kullanılanı olmuştur: üretilmeleri nispeten kolaydır ve evrimlerini takip etmelerini sağlayan yüksek çeşitlilik ve yüksek verimli dizileme elde edebilirler.

İlk başarılı peptit yerleştirme AAV kütüphaneleri yaklaşık 20 yıl önce tanımlanmıştır. İlklerinden birinde, Perabo ve ark.8 , rastgele üretilen oligonükleotidlerin bir havuzunun, VP1 kapsid proteininin amino-asit 587’sine karşılık gelen bir pozisyonda, kapsidden çıkıntı yapan üç katlı eksende bir plazmid içine yerleştirildiği modifiye AAV2 kapsidlerinden oluşan bir kütüphane oluşturmuştur. Adenovirüs ko-enfeksiyonu kullanılarak, AAV kütüphanesi çoklu seçim turları yoluyla geliştirildi ve son yeniden hedeflenen varyantların, ebeveyn AAV28’e dirençli hücre hatlarını dönüştürebildiği gösterildi. Bundan kısa bir süre sonra, Müller ve ark.9 , kütüphane üretimi için protokolde önemli bir gelişme olan iki aşamalı sistemi tanıttı. Başlangıçta, plazmid kütüphanesi, bir adenoviral yardımcı plazmid ile birlikte, kimerik kapsidler içeren bir AAV kütüphanesi üretmek için kullanılır. Bu AAV mekik kütüphanesi, hücre başına bir viral genom tanıtmak amacıyla, düşük enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Adenovirüs ile birlikte enfeksiyon, eşleşen bir genom ve kapsid9 ile AAV’lerin üretimini sağlar. Yaklaşık on yıl sonra, Dalkara10 , 7m8 varyantını oluşturmak için in vivo yönlendirilmiş evrimi kullandı. Bu varyant, üçü bağlayıcı görevi gören 10 amino asit yerleştirmesine (LALGETTRPA) sahiptir ve intravitreal enjeksiyon10’dan sonra dış retinayı etkili bir şekilde hedefler. Bu mühendislik kapsid, olağanüstü bir başarı öyküsüdür, çünkü şimdiye kadar kliniğe ulaşan birkaç mühendislik kapsidinden biridir11.

Alan, yeni nesil dizileme (NGS) tekniklerinin tanıtılmasıyla ikinci bir artış yaşadı. 2014 yılında Adachi ve ark.12’den ve 2015 yılında Marsic ve ark.13’ten iki yayın, barkodlu AAV kapsid kütüphanelerinin dağılımını yüksek doğrulukla izlemek için NGS’nin gücünü sergiledi. Birkaç yıl sonra, barkodlu bölgelerin NGS’si, kapsid evrimini takip etmek için peptit yerleştirme bölgesine uyarlandı. Körbelin ve ark.14, pulmoner hedefli AAV2 bazlı kapsid tanımlamak için NGS rehberliğinde bir tarama gerçekleştirdi. NGS analizi üç derecelendirme puanının hesaplanmasına yardımcı oldu: seçim turları arasındaki zenginleştirme puanı, doku özgüllüğünü belirlemek için genel özgüllük puanı ve son olarak birleşik puan14. Gradinaru laboratuvarı15, aynı yıl içinde hücre tipine özgü bir seçimi kolaylaştıran Cre-rekombinasyon tabanlı AAV hedefli evrim (CREATE) sistemini yayınladı. Bu sistemde, kapsid kütüphanesi Cre-ters çevrilebilir bir anahtar taşır, çünkü poliA sinyali iki loxP bölgesi tarafından çevrelenir. AAV kütüphanesi daha sonra Cre farelere enjekte edilir, burada poliA sinyali sadece Cre + hücrelerinde ters çevrilir ve kapsid geni içindeki ileri astar ile ters PCR primerinin bağlanması için şablon sağlar. Bu son derece spesifik PCR kurtarma, AAV-PHP’nin tanımlanmasını sağladı. Kan-beyin bariyerini geçebilen B varyantı15. Bu sistem ayrıca NGS ve sentetik kütüphane üretiminin boru hattı16’ya entegre edildiği M-CREATE’e (Multiplexed-CREATE) dönüştürüldü.

Maguire lab17’den bu sistemin geliştirilmiş bir RNA tabanlı versiyonu olan iTransduce, hücreleri işlevsel olarak dönüştüren ve genomlarını ifade eden kapsidlerin DNA seviyesinde seçime izin verir. Peptid görüntüleme kütüphanesinin viral genomu, her yerde bulunan bir promotörün kontrolü altındaki bir Cre genini ve p41 promotörünün kontrolü altındaki kapsid genini içerir. Kütüphane, tdTomato’nun yukarı akımında bir loxP-STOP-loxP kasetine sahip farelere enjekte edilir. Viral genomu ve dolayısıyla Cre’yi eksprese eden AAV varyantları ile transdübe edilen hücreler tdTomato’yu eksprese eder ve hücre belirteçleri ile kombinasyon halinde sıralanabilir ve seçilebilir17. Benzer şekilde, Nonnenmacher ve ark.18 ve Tabebordbar ve ark.19, kapsid gen kütüphanesini dokuya özgü promotörlerin kontrolü altına yerleştirmiştir. Farklı hayvan modellerinde enjeksiyondan sonra, kapsid varyantlarını izole etmek için viral RNA kullanıldı.

Alternatif bir yaklaşım, capsid kitaplıklarını etiketlemek için barkodlama kullanmaktır. Björklund laboratuvarı20 , bu yaklaşımı barkod peptit yerleştirme kapsid kütüphaneleri için kullandı ve barkodlu rasyonel AAV vektör evrimini (BRAVE) geliştirdi. Bir plazmidde, Rep2Cap kaseti ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR) ile çevrili, sarı floresan protein (YFP) eksprese eden, barkod etiketli transgenin yanında klonlanır. Kapağın sonu ile barkodun başlangıcı arasındaki loxP bölgelerini kullanarak, bir in vitro Cre rekombinasyonu NGS için yeterince küçük bir parça üretir, böylece peptid yerleştirmenin benzersiz barkodla (arama tablosu, LUT) ilişkilendirilmesine izin verir. AAV üretimi plazmid kütüphanesi kullanılarak gerçekleştirilir ve mRNA’da eksprese edilen barkodlar in vivo uygulamadan sonra yine NGS20 ile taranır. Kapsid kütüphaneleri tüm kapsid geninin varyantlarını (yani, karıştırılmış kütüphaneler) içerdiğinde, uzun okunan dizilemenin kullanılması gerekir. Birçok grup, NGS’nin daha yüksek okuma derinliğine sahip olmasını sağlayan bu çeşitli kütüphaneleri etiketlemek için barkodlar kullandı. Kay lab21 , çok çeşitli kapsid karıştırılmış kütüphaneleri, kapak poliA sinyalinin aşağı yönündeki barkodlarla etiketledi. İlk adımda, barkodlu bir plazmid kütüphanesi oluşturuldu ve karıştırılmış kapsid gen kütüphanesi klonlandı. Daha sonra LUT21’lerini oluşturmak için MiSeq (kısa okuma, daha yüksek okuma derinliği) ve PacBio (uzun okuma, daha düşük okuma derinliği) NGS ve Sanger diziliminin bir kombinasyonu kullanıldı. 2019 yılında, Ogden ve Church lab 22’den meslektaşları, her pozisyonda tek nokta mutasyonları, eklemeleri ve silmeleri olan kütüphaneleri kullanarakAAV2 kapsid uygunluğunu tanımladılar ve sonuçta makine rehberliğinde tasarıma olanak sağladılar. Kütüphanenin oluşturulması için, kapsid geninin daha küçük parçaları sentezlendi, bir barkodla etiketlendi, yeni nesil sıralandı ve daha sonra tam kapsid genine klonlandı. NGS verileri bir LUT oluşturmak için kullanıldı. Kütüphane daha sonra sadece barkodlar ve kısa okuma sıralaması kullanılarak tarandı ve bu da daha yüksek okuma derinliği22’ye izin verdi.

Barkodlu kütüphaneler ağırlıklı olarak, kapsid kütüphanelerinin birkaç tur seçimini takiben veya bir kapsid evrimi çalışmasından bağımsız olarak bilinen, doğal ve mühendislik varyantlarından oluşan bir havuzu taramak için kullanılmıştır. Bu tür kütüphanelerin avantajı, hayvan sayısını azaltırken ve hayvanlar arasındaki çeşitliliği en aza indirirken birden fazla kapsid tarama fırsatıdır. Bu teknolojiyi AAV alanına tanıtan ilk çalışmalar neredeyse on yıl önce yayınlandı. Nakai laboratuvarı 12, AAV9’dan VP1’de 356 ila 736 amino asitleri kapsayan 191 çift alanin mutantını bir çift 12-nükleotid barkodla etiketledi. NGS kullanılarak, kütüphane galaktoz bağlama ve diğer özellikler12 için in vivo olarak tarandı. Marsic ve meslektaşları, AAV varyantlarının biyolojik dağılımını, 1 yıl sonra13 çift barkablolu bir analiz kullanarak tanımladılar. İnsan olmayan primatlarda yapılan daha yeni bir çalışma, farklı doğum yolları kullanarak 29 kapsidin merkezi sinir sistemindeki biyodağılımını karşılaştırmıştır23. Laboratuvarımız yakın zamanda doğal ve mühendislik ürünü AAV’leri içeren 183 varyantın barkodlu AAV kütüphane ekranlarını yayınladı. DNA ve RNA seviyesindeki bu ekranlar, farelerde oldukça miyotropik bir AAV varyantı24’ün tanımlanmasına ve fare beyninde yüksek hücre tipi özgüllük gösteren diğerlerine yol açtı25.

Burada, bu çalışmada kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz ve AAV peptid görüntüleme kütüphanelerinin taranmasını içerecek şekilde genişletiyoruz. Bu, AAV2 peptit görüntüleme kütüphanelerinin oluşturulmasını, niceleme için bir dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini ve son olarak kısmen Weinmann ve meslektaşlarının çalışmalarına dayanan AAV varyantlarını analiz etmek için bir NGS boru hattını içerir24. Son olarak, barkodlu AAV kütüphanelerinin neslinin ve aynı yayında kullanılan NGS boru hattının bir açıklaması verilmiştir.

Protocol

1. AAV2 rastgele 7-mer peptid ekran kütüphanesi hazırlığı NOT: Bir AAV2 rastgele peptid görüntüleme kütüphanesinin hazırlanması için, dejenere oligonükleotidleri tek sarmallı DNA olarak sentezleyin, çift sarmallı DNA’ya dönüştürün, sindirin, alıcı plazmidine ve elektroporata bağlayın. Dejenere oligonükleotidlerin tasarımıDejenere oligonükleotidleri sipariş edin ve kodon yanlılığından kaçının. Oligonükleotid 5′ CAGTCGGCC…

Representative Results

AAV2 peptit görüntüleme kitaplığının oluşturulması. Mühendislik AAV’lerinin seçimine yönelik ilk adım olarak, bir plazmid kütüphanesinin oluşturulması açıklanmaktadır. Peptit kesici ucu, dejenere primerler kullanılarak üretilir. 64’ten 20’ye kadar olanlardaki kodonların kombinasyonunu azaltmak, DNA üzerindeki kütüphane çeşitliliğini azaltarak ancak protein seviyesini azaltmayarak durdurma kodonları ortadan kaldırma ve NGS analizini kolaylaştırma avantajlarına sahiptir. …

Discussion

Bu protokolde, peptid gösterimi AAV kapsid mühendisliği ve barkodlu AAV kütüphane taramasının yanı sıra kütüphane kompozisyonunun ve kapsid performansının biyoinformatik analizi için gerekli adımlar özetlenmiştir. Bu protokol, bu tür kütüphanelerin biyoinformatik analizini kolaylaştıran adımlara odaklanmaktadır, çünkü çoğu viroloji laboratuvarı, moleküler biyoloji tekniklerindeki yeterliliklerine uyacak şekilde programlama becerilerinde gecikmektedir. Her iki kütüphane türü de girişte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.G., DFG İşbirlikçi Araştırma Merkezleri SFB1129 (Projektnummer 240245660) ve TRR179 (Projektnummer 272983813) aracılığıyla Alman Araştırma Vakfı’nın (DFG) ve Alman Enfeksiyon Araştırma Merkezi’nin (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

Materials

Amplification primer ELLA Biotech (Munich, Germany) Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit  Qiagen (Venlo, Netherlands) 80204 DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C NGS Library preparation
BC-seq fw:  IDT (San Joce, CA, CA, USA) ATCACTCTCGGCATGGACGAGC  NGS Library preparation
BC-seq rv:   IDT (San Joce, CA, CA, USA) GGCTGGCAACTAGAAGGCACA  NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) 44-420-3250ML DNA/RNA extraction
BglI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0143 Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1851196 dd-PCR cycler
dNTPS  New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) N0447S NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863024 dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863005 dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864008 dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863051 dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863009 dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 12001925 dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells Lucigen (Middleton, WI, USA) 60081-1 Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) 748050 Electroporation
GAPDH primer/probe mix Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Mm00186825_cn Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1652660 Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) 4368814 cDNA reverse transcription
ITR_fw IDT (San Joce, CA, USA) GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_rv IDT (San Joce, CA, USA) CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_probe IDT (San Joce, CA, USA) HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system Illumina Inc (San Diego, CA, USA) SY-415-1001 NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* Roche AG (Basel, Switzerland) KK2600 07958919001 NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device Promega GmbH (Madison, WI, USA) V8151 Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) ND-2000 Digestion of double-stranded insert
NGS_frw Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC NGS primer
NGS_rev Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) CGC CTT GTG TGT TGA CAT C NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina Inc (San Diego, CA, USA) FC-404-2005 NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit  NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) 9092-256 NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer  Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814000 dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814040 dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F530S Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) 24765-1G AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System Promega GmbH (Madison, WI, USA) NG2002 Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase  Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F549L NGS Library preparation
Proteinase K Roche AG (Basel, Switzerland) 5963117103 DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab 
QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864002 dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864003 dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28306 Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28704 Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 12162 Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28104 Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer Invitrogen (Waltham, MA, USA) Q32857 NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Q32851 NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix Qiagen (Venlo, Netherlands) 1044234 Taqman qPCR
rep_fw IDT (San Joce, CA, USA) AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC dd-PCR primer
rep_rv IDT (San Joce, CA, USA) CAATCACGGCGCACATGT dd-PCR primer
rep_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 dd-PCR probe
RNase-free DNase Qiagen (Venlo, Netherlands) 79254 DNA/RNA extraction
SfiI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0123 Digestion of vector
5 mm, steel Beads Qiagen (Venlo, Netherlands) 69989 DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides ELLA Biotech (Munich, Germany) Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) M0202L Plasmid library ligation
TissueLyserLT Qiagen (Venlo, Netherlands) 85600 DNA/RNA extraction
YFP_fw IDT (San Joce, CA, USA) GAGCGCACCATCTTCTTCAAG dd-PCR primer
YFP_rv IDT (San Joce, CA, USA) TGTCGCCCTCGAACTTCAC dd-PCR primer
YFP_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) Zymo research (Irvine, CA, USA) D4013 Vector and Ligation purification

References

  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
  3. Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
  6. Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).
  7. Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756 (2022).
  8. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
  9. Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
  10. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
  11. Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
  12. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075 (2014).
  13. Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041 (2015).
  14. Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
  15. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  16. Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
  17. Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
  18. Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
  19. Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
  20. Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
  21. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
  22. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
  23. Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
  24. Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).
  25. Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
  26. Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  27. Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).
  28. Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
  29. Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).
  30. Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
  31. Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
  32. Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
  33. Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
  34. Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).
  35. Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
  36. Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).
  37. Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
  38. Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
  39. Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).

Play Video

Cite This Article
Rapti, K., Maiakovska, O., Becker, J., Szumska, J., Zayas, M., Bubeck, F., Liu, J., Gerstmann, E., Krämer, C., Wiedtke, E., Grimm, D. Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants. J. Vis. Exp. (188), e64389, doi:10.3791/64389 (2022).

View Video