AAV peptit görüntüleme kütüphanesi üretimi ve yeni nesil AAV’lerin oluşturulması için yeni özelliklere sahip adayların barkodlaması yoluyla daha sonra doğrulanması.
Adeno ilişkili virüsten (AAV) türetilen gen dağıtım vektörleri, klinik verilerin teşvik edilmesi ve çeşitli AAV gen tedavilerinin onaylanmasıyla kanıtlanan genetik hastalıkların tedavisi için en umut verici araçlardan biridir. AAV vektörlerinin başarısının iki ana nedeni, (i) farklı özelliklere sahip çeşitli doğal olarak oluşan viral serotiplerin önceden izole edilmesi ve (ii) moleküler mühendisliği için güçlü teknolojilerin daha sonra kurulması ve yüksek verimde yeniden kullanılmasıdır. Bu tekniklerin potansiyelini daha da artırmak, son zamanlarda DNA ve RNA düzeyinde seçilmiş AAV kapsidlerini barkodlamak için stratejiler uygulanmakta ve tek bir hayvandaki tüm ana organlarda ve hücre tiplerinde kapsamlı ve paralel in vivo tabakalaşmalarına izin vermektedir. Burada, mevcut kapsid mühendisliği teknolojilerinin çeşitli cephaneliğini temsil etmek için AAV peptid ekranını kullanarak, bu tamamlayıcı caddeler kümesini kapsayan temel bir boru hattı sunuyoruz. Buna göre, ilk olarak, istenen özelliklere sahip adayların in vivo seçimi için bir AAV peptid görüntüleme kütüphanesinin oluşturulması için önemli adımları açıklıyoruz, ardından ikincil in vivo tarama için en ilginç kapsid varyantlarının nasıl barkodlanacağının bir gösterimi ile devam ediyoruz. Daha sonra, NGS veri analizi sırasında en kritik adımlara genel bir bakışla bitirmeden önce, barkod amplifikasyonu ve adaptör ligasyonu dahil olmak üzere yeni nesil dizileme (NGS) için kütüphanelerin oluşturulmasına yönelik metodolojiyi örneklendiriyoruz. Burada bildirilen protokoller çok yönlü ve uyarlanabilir olduğundan, araştırmacılar en sevdikleri hastalık modelinde ve gen terapisi uygulamalarında optimal AAV kapsid varyantlarını zenginleştirmek için bunları kolayca kullanabilirler.
Gen transfer terapisi, hastalığı önlemek, tedavi etmek, iyileştirmek veya iyileştirmek için hücresel genetik materyali onarmak, değiştirmek veya değiştirmek için hücrelere genetik materyalin sokulmasıdır. Hem in vivo hem de ex vivo gen transferi, viral olmayan ve viral olan farklı dağıtım sistemlerine dayanır. Virüsler, hedef hücrelerini verimli bir şekilde dönüştürmek için doğal olarak evrimleşmiştir ve dağıtım vektörleri olarak kullanılabilir. Gen terapisinde kullanılan farklı viral vektör türleri arasında, adeno ilişkili virüsler, patojenite, güvenlik, düşük immünojenite eksikliği ve en önemlisi uzun vadeli, entegre olmayan ekspresyonu sürdürme yetenekleri nedeniyle giderek daha fazla kullanılmaktadır 1,2,3. AAV gen tedavisi son on yılda önemli başarılar sağlamıştır; Avrupa İlaç Ajansı ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından insanlarda kullanılmak üzere üç tedavi onaylanmıştır 3,4. Hemofili, kas, kalp ve nörolojik hastalıklar gibi çeşitli hastalıkların tedavisi için başka yerlerde gözden geçirildiği gibi çeşitli klinik çalışmalar da devam etmektedir3. On yıllardır süren ilerlemeye rağmen, gen terapisi alanı son yıllarda bir dizi aksilik yaşamıştır4, en önemlisi klinik çalışmalarda ölümler5, özellikle kas gibi büyük veya beyin gibi ulaşılması zor dokular için doz sınırlayıcı toksisiteler nedeniyle beklemeye alınmıştır6.
Şu anda klinik çalışmalarda kullanılmakta olan AAV vektörleri, birkaç istisna dışında doğal serotiplere aittir1. AAV mühendisliği, üstün organ veya hücre özgüllüğü ve verimliliğine sahip vektörler geliştirme fırsatı sunar. Son yirmi yılda, peptid gösterimi, döngü değişimi, kapsid DNA karıştırma, hataya eğilimli PCR ve hedefli tasarım gibi çeşitli yaklaşımlar, farklı özelliklere sahip bireysel AAV varyantları veya kütüphaneleri oluşturmak için başarıyla uygulanmıştır7. Bunlar daha sonra, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi, istenen özelliklere sahip varyantları seçmek için birden fazla yönlendirilmiş evrim turuna tabi tutulur 1,3. Tüm kapsid evrim stratejileri arasında, peptid görüntüleme AAV kütüphaneleri, bazı benzersiz özelliklerden dolayı en yaygın kullanılanı olmuştur: üretilmeleri nispeten kolaydır ve evrimlerini takip etmelerini sağlayan yüksek çeşitlilik ve yüksek verimli dizileme elde edebilirler.
İlk başarılı peptit yerleştirme AAV kütüphaneleri yaklaşık 20 yıl önce tanımlanmıştır. İlklerinden birinde, Perabo ve ark.8 , rastgele üretilen oligonükleotidlerin bir havuzunun, VP1 kapsid proteininin amino-asit 587’sine karşılık gelen bir pozisyonda, kapsidden çıkıntı yapan üç katlı eksende bir plazmid içine yerleştirildiği modifiye AAV2 kapsidlerinden oluşan bir kütüphane oluşturmuştur. Adenovirüs ko-enfeksiyonu kullanılarak, AAV kütüphanesi çoklu seçim turları yoluyla geliştirildi ve son yeniden hedeflenen varyantların, ebeveyn AAV28’e dirençli hücre hatlarını dönüştürebildiği gösterildi. Bundan kısa bir süre sonra, Müller ve ark.9 , kütüphane üretimi için protokolde önemli bir gelişme olan iki aşamalı sistemi tanıttı. Başlangıçta, plazmid kütüphanesi, bir adenoviral yardımcı plazmid ile birlikte, kimerik kapsidler içeren bir AAV kütüphanesi üretmek için kullanılır. Bu AAV mekik kütüphanesi, hücre başına bir viral genom tanıtmak amacıyla, düşük enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Adenovirüs ile birlikte enfeksiyon, eşleşen bir genom ve kapsid9 ile AAV’lerin üretimini sağlar. Yaklaşık on yıl sonra, Dalkara10 , 7m8 varyantını oluşturmak için in vivo yönlendirilmiş evrimi kullandı. Bu varyant, üçü bağlayıcı görevi gören 10 amino asit yerleştirmesine (LALGETTRPA) sahiptir ve intravitreal enjeksiyon10’dan sonra dış retinayı etkili bir şekilde hedefler. Bu mühendislik kapsid, olağanüstü bir başarı öyküsüdür, çünkü şimdiye kadar kliniğe ulaşan birkaç mühendislik kapsidinden biridir11.
Alan, yeni nesil dizileme (NGS) tekniklerinin tanıtılmasıyla ikinci bir artış yaşadı. 2014 yılında Adachi ve ark.12’den ve 2015 yılında Marsic ve ark.13’ten iki yayın, barkodlu AAV kapsid kütüphanelerinin dağılımını yüksek doğrulukla izlemek için NGS’nin gücünü sergiledi. Birkaç yıl sonra, barkodlu bölgelerin NGS’si, kapsid evrimini takip etmek için peptit yerleştirme bölgesine uyarlandı. Körbelin ve ark.14, pulmoner hedefli AAV2 bazlı kapsid tanımlamak için NGS rehberliğinde bir tarama gerçekleştirdi. NGS analizi üç derecelendirme puanının hesaplanmasına yardımcı oldu: seçim turları arasındaki zenginleştirme puanı, doku özgüllüğünü belirlemek için genel özgüllük puanı ve son olarak birleşik puan14. Gradinaru laboratuvarı15, aynı yıl içinde hücre tipine özgü bir seçimi kolaylaştıran Cre-rekombinasyon tabanlı AAV hedefli evrim (CREATE) sistemini yayınladı. Bu sistemde, kapsid kütüphanesi Cre-ters çevrilebilir bir anahtar taşır, çünkü poliA sinyali iki loxP bölgesi tarafından çevrelenir. AAV kütüphanesi daha sonra Cre farelere enjekte edilir, burada poliA sinyali sadece Cre + hücrelerinde ters çevrilir ve kapsid geni içindeki ileri astar ile ters PCR primerinin bağlanması için şablon sağlar. Bu son derece spesifik PCR kurtarma, AAV-PHP’nin tanımlanmasını sağladı. Kan-beyin bariyerini geçebilen B varyantı15. Bu sistem ayrıca NGS ve sentetik kütüphane üretiminin boru hattı16’ya entegre edildiği M-CREATE’e (Multiplexed-CREATE) dönüştürüldü.
Maguire lab17’den bu sistemin geliştirilmiş bir RNA tabanlı versiyonu olan iTransduce, hücreleri işlevsel olarak dönüştüren ve genomlarını ifade eden kapsidlerin DNA seviyesinde seçime izin verir. Peptid görüntüleme kütüphanesinin viral genomu, her yerde bulunan bir promotörün kontrolü altındaki bir Cre genini ve p41 promotörünün kontrolü altındaki kapsid genini içerir. Kütüphane, tdTomato’nun yukarı akımında bir loxP-STOP-loxP kasetine sahip farelere enjekte edilir. Viral genomu ve dolayısıyla Cre’yi eksprese eden AAV varyantları ile transdübe edilen hücreler tdTomato’yu eksprese eder ve hücre belirteçleri ile kombinasyon halinde sıralanabilir ve seçilebilir17. Benzer şekilde, Nonnenmacher ve ark.18 ve Tabebordbar ve ark.19, kapsid gen kütüphanesini dokuya özgü promotörlerin kontrolü altına yerleştirmiştir. Farklı hayvan modellerinde enjeksiyondan sonra, kapsid varyantlarını izole etmek için viral RNA kullanıldı.
Alternatif bir yaklaşım, capsid kitaplıklarını etiketlemek için barkodlama kullanmaktır. Björklund laboratuvarı20 , bu yaklaşımı barkod peptit yerleştirme kapsid kütüphaneleri için kullandı ve barkodlu rasyonel AAV vektör evrimini (BRAVE) geliştirdi. Bir plazmidde, Rep2Cap kaseti ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR) ile çevrili, sarı floresan protein (YFP) eksprese eden, barkod etiketli transgenin yanında klonlanır. Kapağın sonu ile barkodun başlangıcı arasındaki loxP bölgelerini kullanarak, bir in vitro Cre rekombinasyonu NGS için yeterince küçük bir parça üretir, böylece peptid yerleştirmenin benzersiz barkodla (arama tablosu, LUT) ilişkilendirilmesine izin verir. AAV üretimi plazmid kütüphanesi kullanılarak gerçekleştirilir ve mRNA’da eksprese edilen barkodlar in vivo uygulamadan sonra yine NGS20 ile taranır. Kapsid kütüphaneleri tüm kapsid geninin varyantlarını (yani, karıştırılmış kütüphaneler) içerdiğinde, uzun okunan dizilemenin kullanılması gerekir. Birçok grup, NGS’nin daha yüksek okuma derinliğine sahip olmasını sağlayan bu çeşitli kütüphaneleri etiketlemek için barkodlar kullandı. Kay lab21 , çok çeşitli kapsid karıştırılmış kütüphaneleri, kapak poliA sinyalinin aşağı yönündeki barkodlarla etiketledi. İlk adımda, barkodlu bir plazmid kütüphanesi oluşturuldu ve karıştırılmış kapsid gen kütüphanesi klonlandı. Daha sonra LUT21’lerini oluşturmak için MiSeq (kısa okuma, daha yüksek okuma derinliği) ve PacBio (uzun okuma, daha düşük okuma derinliği) NGS ve Sanger diziliminin bir kombinasyonu kullanıldı. 2019 yılında, Ogden ve Church lab 22’den meslektaşları, her pozisyonda tek nokta mutasyonları, eklemeleri ve silmeleri olan kütüphaneleri kullanarakAAV2 kapsid uygunluğunu tanımladılar ve sonuçta makine rehberliğinde tasarıma olanak sağladılar. Kütüphanenin oluşturulması için, kapsid geninin daha küçük parçaları sentezlendi, bir barkodla etiketlendi, yeni nesil sıralandı ve daha sonra tam kapsid genine klonlandı. NGS verileri bir LUT oluşturmak için kullanıldı. Kütüphane daha sonra sadece barkodlar ve kısa okuma sıralaması kullanılarak tarandı ve bu da daha yüksek okuma derinliği22’ye izin verdi.
Barkodlu kütüphaneler ağırlıklı olarak, kapsid kütüphanelerinin birkaç tur seçimini takiben veya bir kapsid evrimi çalışmasından bağımsız olarak bilinen, doğal ve mühendislik varyantlarından oluşan bir havuzu taramak için kullanılmıştır. Bu tür kütüphanelerin avantajı, hayvan sayısını azaltırken ve hayvanlar arasındaki çeşitliliği en aza indirirken birden fazla kapsid tarama fırsatıdır. Bu teknolojiyi AAV alanına tanıtan ilk çalışmalar neredeyse on yıl önce yayınlandı. Nakai laboratuvarı 12, AAV9’dan VP1’de 356 ila 736 amino asitleri kapsayan 191 çift alanin mutantını bir çift 12-nükleotid barkodla etiketledi. NGS kullanılarak, kütüphane galaktoz bağlama ve diğer özellikler12 için in vivo olarak tarandı. Marsic ve meslektaşları, AAV varyantlarının biyolojik dağılımını, 1 yıl sonra13 çift barkablolu bir analiz kullanarak tanımladılar. İnsan olmayan primatlarda yapılan daha yeni bir çalışma, farklı doğum yolları kullanarak 29 kapsidin merkezi sinir sistemindeki biyodağılımını karşılaştırmıştır23. Laboratuvarımız yakın zamanda doğal ve mühendislik ürünü AAV’leri içeren 183 varyantın barkodlu AAV kütüphane ekranlarını yayınladı. DNA ve RNA seviyesindeki bu ekranlar, farelerde oldukça miyotropik bir AAV varyantı24’ün tanımlanmasına ve fare beyninde yüksek hücre tipi özgüllük gösteren diğerlerine yol açtı25.
Burada, bu çalışmada kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz ve AAV peptid görüntüleme kütüphanelerinin taranmasını içerecek şekilde genişletiyoruz. Bu, AAV2 peptit görüntüleme kütüphanelerinin oluşturulmasını, niceleme için bir dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini ve son olarak kısmen Weinmann ve meslektaşlarının çalışmalarına dayanan AAV varyantlarını analiz etmek için bir NGS boru hattını içerir24. Son olarak, barkodlu AAV kütüphanelerinin neslinin ve aynı yayında kullanılan NGS boru hattının bir açıklaması verilmiştir.
Bu protokolde, peptid gösterimi AAV kapsid mühendisliği ve barkodlu AAV kütüphane taramasının yanı sıra kütüphane kompozisyonunun ve kapsid performansının biyoinformatik analizi için gerekli adımlar özetlenmiştir. Bu protokol, bu tür kütüphanelerin biyoinformatik analizini kolaylaştıran adımlara odaklanmaktadır, çünkü çoğu viroloji laboratuvarı, moleküler biyoloji tekniklerindeki yeterliliklerine uyacak şekilde programlama becerilerinde gecikmektedir. Her iki kütüphane türü de girişte…
The authors have nothing to disclose.
D.G., DFG İşbirlikçi Araştırma Merkezleri SFB1129 (Projektnummer 240245660) ve TRR179 (Projektnummer 272983813) aracılığıyla Alman Araştırma Vakfı’nın (DFG) ve Alman Enfeksiyon Araştırma Merkezi’nin (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).
Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |