Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV)

Summary

Generierung von AAV-Peptid-Display-Bibliotheken und anschließende Validierung durch Barcoding von Kandidaten mit neuartigen Eigenschaften für die Erstellung von AAVs der nächsten Generation.

Abstract

Genübertragungsvektoren, die vom Adeno-assoziierten Virus (AAV) abgeleitet sind, sind eines der vielversprechendsten Werkzeuge für die Behandlung genetischer Krankheiten, was durch ermutigende klinische Daten und die Zulassung mehrerer AAV-Gentherapien belegt wird. Zwei Hauptgründe für den Erfolg von AAV-Vektoren sind (i) die vorherige Isolierung verschiedener natürlich vorkommender viraler Serotypen mit unterschiedlichen Eigenschaften und (ii) die anschließende Etablierung leistungsfähiger Technologien für ihr molekulares Engineering und ihre Wiederverwendung im Hochdurchsatz. Das Potenzial dieser Techniken wird durch kürzlich implementierte Strategien zur Barcodierung ausgewählter AAV-Kapside auf DNA- und RNA-Ebene weiter gesteigert, die eine umfassende und parallele In-vivo-Stratifizierung in allen wichtigen Organen und Zelltypen eines einzigen Tieres ermöglichen. Hier stellen wir eine grundlegende Pipeline vor, die diese Reihe komplementärer Wege umfasst und die AAV-Peptidanzeige verwendet, um das vielfältige Arsenal der verfügbaren Kapsid-Engineering-Technologien darzustellen. Dementsprechend beschreiben wir zunächst die entscheidenden Schritte für die Generierung einer AAV-Peptid-Display-Bibliothek für die In-vivo-Auswahl von Kandidaten mit den gewünschten Eigenschaften, gefolgt von einer Demonstration, wie die interessantesten Kapsidvarianten für das sekundäre In-vivo-Screening mit einem Barcode versehen werden können. Als nächstes veranschaulichen wir die Methodik für die Erstellung von Bibliotheken für Next-Generation-Sequencing (NGS), einschließlich Barcode-Amplifikation und Adapterligation, bevor wir mit einem Überblick über die kritischsten Schritte während der NGS-Datenanalyse schließen. Da die hier berichteten Protokolle vielseitig und anpassungsfähig sind, können Forscher sie leicht nutzen, um die optimalen AAV-Kapsidvarianten in ihrem bevorzugten Krankheitsmodell und für Gentherapieanwendungen anzureichern.

Introduction

Gentransfertherapie ist die Einführung von genetischem Material in Zellen, um das zelluläre genetische Material zu reparieren, zu ersetzen oder zu verändern, um Krankheiten vorzubeugen, zu behandeln, zu heilen oder zu verbessern. Der Gentransfer, sowohl in vivo als auch ex vivo, beruht auf unterschiedlichen Verabreichungssystemen, nicht-viralen und viralen. Viren haben sich auf natürliche Weise entwickelt, um ihre Zielzellen effizient zu transduzieren, und können als Liefervektoren verwendet werden. Unter den verschiedenen Arten von viralen Vektoren, die in der Gentherapie eingesetzt werden, werden zunehmend Adeno-assoziierte Viren verwendet, da sie nicht pathogen sind, Sicherheit, geringe Immunogenität und vor allem ihre Fähigkeit, eine langfristige, nicht integrierende Expression aufrechtzuerhalten ^1,2,3. Die AAV-Gentherapie hat in den letzten zehn Jahren beachtliche Erfolge erzielt. drei Therapien wurden von der Europäischen Arzneimittel-Agentur und der US-amerikanischen Food and Drug Administration für die Anwendung beim Menschen zugelassen ^3,4. Mehrere klinische Studien sind auch im Gange, um eine Vielzahl von Krankheiten wie Hämophilie, Muskel-, Herz- und neurologische Erkrankungen zu behandeln, wie an anderer Stelle beschrieben³. Trotz jahrzehntelanger Fortschritte hat der Bereich der Gentherapie in den letzten Jahren eine Reihe von Rückschlägen erlitten⁴, vor allem Todesfälle in klinischen Studien⁵, die aufgrund dosislimitierender Toxizitäten auf Eis gelegt wurden, insbesondere für Gewebe, die massiv sind, wie z. B. Muskeln, oder schwer zu erreichen, wie z. B. Gehirn⁶.

Die AAV-Vektoren, die derzeit in klinischen Studien verwendet werden, gehören mit wenigen Ausnahmen zu den natürlichen Serotypen¹. AAV-Engineering bietet die Möglichkeit, Vektoren mit überlegener Organ- oder Zellspezifität und Effizienz zu entwickeln. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene Ansätze erfolgreich angewendet, wie z. B. Peptid-Display, Loop-Swap, Kapsid-DNA-Shuffling, fehleranfällige PCR und gezieltes Design, um einzelne AAV-Varianten oder Bibliotheken davon mit unterschiedlichen Eigenschaften zu generieren⁷. Diese werden dann mehreren Runden der gerichteten Evolution unterzogen, um die darin enthaltenen Varianten mit den gewünschten Eigenschaften auszuwählen, wie an anderer Stelle ^1,3 beschrieben. Von allen Kapsid-Evolutionsstrategien sind Peptid-Display-AAV-Bibliotheken aufgrund einiger einzigartiger Eigenschaften am weitesten verbreitet: Sie sind relativ einfach zu generieren und können eine hohe Diversität und eine Hochdurchsatz-Sequenzierung erreichen, die es ermöglicht, ihre Evolution zu verfolgen.

Die ersten erfolgreichen Peptidinsertions-AAV-Bibliotheken wurden vor fast 20 Jahren beschrieben. In einem der ersten konstruierten Perabo et ^al.8 eine Bibliothek modifizierter AAV2-Kapside, in der ein Pool zufällig generierter Oligonukleotide in ein Plasmid an einer Position eingefügt wurde, die der Aminosäure 587 des VP1-Kapsidproteins entspricht, und zwar in der dreifachen Achse, die aus dem Kapsid herausragt. Unter Verwendung einer Adenovirus-Koinfektion wurde die AAV-Bibliothek durch mehrere Selektionsrunden entwickelt, und es wurde gezeigt, dass die endgültigen Re-Targeting-Varianten in der Lage sind, Zelllinien zu transduzieren, die refraktär auf das elterliche AAV2⁸ sind. Kurz darauf führten Müller et ^al.9 das zweistufige System für die Bibliotheksproduktion ein, eine deutliche Verbesserung des Protokolls. Zunächst wird die Plasmidbibliothek zusammen mit einem adenoviralen Helferplasmid verwendet, um eine AAV-Bibliothek zu erzeugen, die chimäre Kapside enthält. Diese AAV-Shuttle-Bibliothek wird verwendet, um Zellen mit geringer Infektionsvielfalt (MOI) zu infizieren, mit dem Ziel, ein virales Genom pro Zelle einzuführen. Die Koinfektion mit dem Adenovirus gewährleistet die Produktion von AAVs mit einem übereinstimmenden Genom und Kapsid⁹. Etwa ein Jahrzehnt später nutzte Dalkara¹⁰ die in vivo gerichtete Evolution, um die 7m8-Variante zu schaffen. Diese Variante hat eine 10-Aminosäure-Insertion (LALGETTRPA), von denen drei als Linker fungieren, und zielt nach intravitrealer Injektion effizient auf die äußere Netzhaut^{ab 10}. Dieses technisch hergestellte Kapsid ist eine außergewöhnliche Erfolgsgeschichte, da es eines der wenigen künstlich hergestellten Kapside ist, das es bisher in die Klinik geschafft hat¹¹.

Einen zweiten Schub erlebte das Feld mit der Einführung von Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS). Zwei Veröffentlichungen von Adachi et al.12 aus dem Jahr 2014 und von Marsic et ^al.13 aus dem Jahr 2015 zeigten die Leistungsfähigkeit von NGS, die Verteilung von barcodierten AAV-Kapsidbibliotheken mit hoher Genauigkeit zu verfolgen. Einige Jahre später wurde das NGS der barcodierten Regionen an die Peptidinsertionsregion angepasst, um die Kapsidentwicklung zu verfolgen. Körbelin et ^al.14 führten ein NGS-gesteuertes Screening durch, um ein pulmonales AAV2-basiertes Kapsid zu identifizieren. Die NGS-Analyse half bei der Berechnung von drei Bewertungswerten: dem Anreicherungswert zwischen den Selektionsrunden, dem allgemeinen Spezifitätswert zur Bestimmung der Gewebespezifität und schließlich dem kombinierten Wert¹⁴. Das Gradinaru-Labor¹⁵ veröffentlichte im selben Jahr das Cre-Rekombinations-basierte AAV-Targeted-Evolutionssystem (CREATE), das eine zelltypspezifische Selektion ermöglicht. In diesem System trägt die Kapsidbibliothek einen Cre-invertierbaren Schalter, da das polyA-Signal von zwei loxP-Stellen flankiert wird. Die AAV-Bibliothek wird dann in Cre-Mäuse injiziert, wobei das polyA-Signal nur in Cre+-Zellen invertiert wird, was die Vorlage für die Bindung eines Reverse-PCR-Primers an den Forward-Primer innerhalb des Kapsidgens liefert. Diese hochspezifische PCR-Rettung ermöglichte die Identifizierung des AAV-PHP. B-Variante, die die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann¹⁵. Dieses System wurde zu M-CREATE (Multiplexed-CREATE) weiterentwickelt, bei dem NGS und die Generierung synthetischer Bibliotheken in die Pipeline¹⁶ integriert wurden.

Eine verbesserte RNA-basierte Version dieses Systems aus dem Maguire-Labor¹⁷, iTransduce, ermöglicht die Selektion auf DNA-Ebene von Kapsiden, die Zellen funktionell transduzieren und ihre Genome exprimieren. Das virale Genom der Peptid-Display-Bibliothek besteht aus einem Cre-Gen unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotors und dem Kapsidgen unter der Kontrolle des p41-Promotors. Die Bibliothek wird Mäusen injiziert, die eine loxP-STOP-loxP-Kassette stromaufwärts von tdTomato haben. Zellen, die mit AAV-Varianten transduziert wurden, die das virale Genom und damit Cre exprimieren, exprimieren tdTomato und können in Kombination mit Zellmarkern sortiert und selektiert werden¹⁷. In ähnlicher Weise stellten Nonnenmacher et al.18 und Tabebordbar et ^al.19 die Kapsidgenbibliothek unter die Kontrolle gewebespezifischer Promotoren. Nach der Injektion in verschiedene Tiermodelle wurde virale RNA verwendet, um die Kapsidvarianten zu isolieren.

Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von Barcoding zum Markieren von Kapsidbibliotheken. Das Björklund-Labor²⁰ nutzte diesen Ansatz für Barcode-Peptid-Insertionskapsidbibliotheken und entwickelte die barcoded rationale AAV-Vektorevolution (BRAVE). In einem Plasmid wird die Rep2Cap-Kassette neben einem ITR-flankierten, gelb fluoreszierenden Protein (YFP)-exprimierenden, Barcode-markierten Transgen kloniert. Unter Verwendung von loxP-Stellen zwischen dem Ende der Kappe und dem Anfang des Barcodes erzeugt eine in vitro Cre-Rekombination ein Fragment, das klein genug für NGS ist, wodurch die Assoziation der Peptidinsertion mit dem eindeutigen Barcode ermöglicht wird (Look-up-Tabelle, LUT). Die AAV-Produktion wird unter Verwendung der Plasmidbibliothek durchgeführt, und die in der mRNA exprimierten Barcodes werden nach der In-vivo-Anwendung erneut mit NGS²⁰ gescreent. Wenn die Kapsidbibliotheken Varianten des gesamten Kapsidgens enthalten (d. h. gemischte Bibliotheken), muss eine Long-Read-Sequenzierung verwendet werden. Mehrere Gruppen haben Barcodes verwendet, um diese verschiedenen Bibliotheken zu kennzeichnen, was NGS eine höhere Lesetiefe ermöglicht. Das Kay Lab²¹ markierte sehr unterschiedliche Kapsid-gemischte Bibliotheken mit Barcodes , die dem Cap-PolyA-Signal nachgeschaltet waren. In einem ersten Schritt wurde eine barcodierte Plasmidbibliothek generiert und die gemischte Kapsidgenbibliothek in diese kloniert. Dann wurde eine Kombination aus MiSeq (Short Read, höhere Lesetiefe) und PacBio (Long Read, niedrigere Lesetiefe) NGS sowie Sanger-Sequenzierung verwendet, um ihre LUT²¹ zu generieren. Im Jahr 2019 beschrieben Ogden und seine Kollegen aus dem Church-Labor²² die AAV2-Kapsideignung für mehrere Funktionen mithilfe von Bibliotheken, die in jeder Position Einzelpunktmutationen, Insertionen und Deletionen aufwiesen, was letztendlich ein maschinengeführtes Design ermöglichte. Für die Generierung der Bibliothek wurden kleinere Fragmente des Kapsidgens synthetisiert, mit einem Barcode markiert, sequenziert und dann in das vollständige Kapsidgen kloniert. Die NGS-Daten wurden verwendet, um eine LUT zu generieren. Die Bibliothek wurde dann nur mit den Barcodes und der Short-Read-Sequenzierung gescreent, was wiederum eine höhere Lesetiefe²² ermöglicht.

Barcode-Bibliotheken wurden überwiegend verwendet, um einen Pool bekannter, natürlicher und technisch entwickelter Varianten nach mehreren Auswahlrunden von Kapsidbibliotheken oder unabhängig von einer Kapsidentwicklungsstudie zu überprüfen. Der Vorteil solcher Bibliotheken ist die Möglichkeit, mehrere Kapside zu screenen und gleichzeitig die Anzahl der Tiere zu reduzieren und die Variation zwischen den Tieren zu minimieren. Die ersten Studien, die diese Technologie in den AAV-Bereich einführten, wurden vor fast einem Jahrzehnt veröffentlicht. Das Nakai-Labor 12 markierte 191 Doppel-Alanin-Mutanten, die die Aminosäuren 356 bis 736 auf dem VP1 von AAV9 mit einem Paar 12-Nukleotid-Barcodes abdecken. Unter Verwendung von NGS wurde die Bibliothek in vivo auf Galaktosebindung und andere Eigenschaften untersucht¹². Marsic und Kollegen beschrieben die Bioverteilung von AAV-Varianten mit Hilfe einer Doppel-Barcord-Analyse 1 Jahr später¹³. Eine neuere Studie an nichtmenschlichen Primaten verglich die Bioverteilung von 29 Kapsiden im Zentralnervensystem auf verschiedenen Verabreichungswegen²³. Unser Labor hat kürzlich barcodierte AAV-Bibliotheksbildschirme von 183 Varianten veröffentlicht, die natürliche und technisch hergestellte AAVs enthielten. Diese Screenings auf DNA- und RNA-Ebene führten zur Identifizierung einer hochgradig myotropen AAV-Variante²⁴ bei Mäusen sowie anderen, die eine hohe Zelltypspezifität im Mäusegehirn aufwiesen²⁵.

Hier beschreiben wir die in dieser Arbeit verwendete Methodik und erweitern sie um das Screening von AAV-Peptid-Display-Bibliotheken. Dies umfasst die Generierung von AAV2-Peptid-Display-Bibliotheken, eine digitale Tröpfchen-PCR-Methode (dd-PCR) zur Quantifizierung und schließlich eine NGS-Pipeline zur Analyse der AAV-Varianten, die zum Teil auf der Arbeit von Weinmann und Kollegen²⁴ basiert. Schließlich wird eine Beschreibung der Generierung von barcodierten AAV-Bibliotheken und der NGS-Pipeline bereitgestellt, die in derselben Publikation verwendet wird.

Protocol

1. Vorbereitung der AAV2-Random-7-Mer-Peptid-Display-Bibliothek

HINWEIS: Für die Herstellung einer AAV2-Random-Peptid-Display-Bibliothek synthetisieren Sie die entarteten Oligonukleotide als einzelsträngige DNA, wandeln Sie sie in doppelsträngige DNA um, verdauen Sie, ligieren Sie sich an das Akzeptorplasmid und elektroporat.

1. Design von entarteten Oligonukleotiden
   1. Ordnen Sie die entarteten Oligonukleotide und vermeiden Sie Codon-Bias. Im Oligonukleotid 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3' entspricht X01 20 Codons, die jeweils für eine der 20 Aminosäuren kodieren. Das W kann A oder T sein und die Codons AGA oder AGT erzeugen, die für die Aminosäuren Arginin (R) oder Serin (S) kodieren.
   2. Bestellen Sie den Amplifikationsprimer: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (siehe Abbildung 1 für Details). Dabei entsteht folgender Proteineinsatz: R/S G_{X 7}. Die theoretische Diversität wird wie folgt berechnet: 1 x 2 x 20⁷ = 2,56 x 10⁹ eindeutige Varianten.
      HINWEIS: Es ist zu beachten, dass diese Vielfalt durch die Transformationseffizienz eingeschränkt sein kann.
2. Synthese des zweiten Strangs
   1. Resuspendieren Sie beide Oligonukleotide (entartete Oligonukleotide und Amplifikationsprimer) mit TE-Puffer auf eine Endkonzentration von 100 μM.
      1. Für die PCR-Reaktion wird eine 50-μl-Reaktion mit 1 μl jedes Primers, 10 μl des Puffers, 1,5 μl DMSO, 0,5 μl dNTPs (10 mM), 0,5 μl Hi-Fidelity-Hot-Start-Polymerase II und 35,5 μl nukleasefreiem Wasser eingerichtet.
      2. Übertragen Sie die Reaktion auf einen Thermocycler und führen Sie einen Vorinkubationsschritt für 10 s bei 98 °C durch, gefolgt von drei Zyklen von 10 s bei 98 °C, 30 s bei 59 °C und 10 s bei 72 °C, dann 5 min bei 72 °C und einem abschließenden Abkühlschritt.
   2. Reinigen Sie die Reaktion mit einem Nukleotidentfernungskit und eluieren Sie sie in 100 μl nukleasefreiem Wasser.
   3. Bestätigen Sie die Effizienz der Zweitstrangsynthese durch Analyse auf einem Bioanalysator (siehe Abbildung 2). Analysieren Sie die Größe und Reinheit des doppelsträngigen Einsatzes, indem Sie 1 μl der Reaktion auf einen mikrofluidischen Chip aus einem DNA 1000-Reagenzien-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers laden. Dieses Kit ist optimiert, um die Größe und Konzentration von doppelsträngigen DNA-Fragmenten von 25-1.000 bps zu messen.
3. Aufschluss von Insert und Plasmidvektor
   1. Aufschluss von 85 μl des gereinigten Einsatzes mit 10 μl 10-fachem Puffer und 5 μl BglI-Enzym in einem abschließenden Reaktionsvolumen von 100 μl (siehe Abbildung 1 für Details). Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Mit einem Nukleotidentfernungskit reinigen, in 50 μl nukleasefreiem Wasser eluieren und mit dem Typ "Oligo-DNA" in einem Spektralphotometer quantifizieren.
   2. Verdauen Sie 10 μg eines replikationskompetenten AAV-Plasmids (pRep2Cap2_PIS)²⁶ (ITR-flankiertes virales Genom) mit 20 μl 10-fachem Puffer und 10 μl SfiI-Enzym in einem abschließenden 200-μl-Reaktionsvolumen (siehe Abbildung 1 für Details). Über Nacht bei 50 °C inkubieren. Reinigen Sie den Vektor auf einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung des Gelextraktionskits, gefolgt von einem zusätzlichen Reinigungsschritt unter Verwendung eines DNA-Reinigungskits. Quantifizieren Sie die Konzentration in einem Spektralphotometer.
4. Ligation des Inserts an den Vektor
   1. Ligat 955 ng Plasmidvektor mit 45 ng Insert mit 2 μl Puffer und 2 μl Ligase in einer 20 μL Ligationsreaktion. Inkubation bei 16 °C über Nacht, gefolgt von 10 min bei 70 °C, um die Ligase hitzeinaktiv zu machen.
5. Transformation, Komplexitätsberechnung und Vorbereitung von Plasmidbibliotheken
   1. Reinigen Sie die Reaktion mit einem DNA-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Reaktion wird in etwa 80% des Ausgangsvolumens von nukleasefreiem Wasser eluiert und zur anschließenden Umwandlung auf Eis gelagert.
   2. Transformieren Sie elektrokompetente Zellen: Tauen Sie ein Fläschchen mit elektrokompetenten Zellen 10 Minuten lang auf Eis auf. Geben Sie dann 1-2 μl der gereinigten Ligationsreaktion in 30 μl (eine Durchstechflasche) elektrokompetente Zellen und mischen Sie durch leichtes Klopfen. Anschließend pipettieren Sie das Zell/DNA-Gemisch vorsichtig in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette mit 1 mm Spalt, ohne Luftblasen einzuführen.
   3. Elektroporat mit den folgenden Einstellungen: 1800 V, 600 Ω und 10 μF. Innerhalb von 10 s nach dem Elektroporationsimpuls werden 970 μl vorgewärmtes Rückgewinnungsmedium (mit den elektrokompetenten Zellen geliefert) in die Küvette gegeben und durch Pipettieren gemischt. Zum Schluss werden die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 1 h bei 37 °C bei 250 U/min inkubiert. Um eine gewünschte Vielfalt zu erreichen, führen Sie 10-100 Reaktionen durch und fassen Sie nach der Inkubation alle Reaktionen in einem Röhrchen zusammen.
   4. Berechnen Sie die Diversität, indem Sie 10 μl der gepoolten Transformationen 10-, 100- oder 1.000-fach in PBS verdünnen und 100 μl auf Nähr-Agar-Platten verteilen, die das entsprechende Antibiotikum (75 mg/ml Ampicillin) enthalten. Inkubieren Sie die Agarplatten über Nacht bei 37 °C und zählen Sie dann die Kolonien auf den Agarplatten.
   5. Berechnen Sie die theoretische Diversität wie folgt:
      Theoretische maximale Diversität = 10 x Verdünnungsfaktor x Anzahl der Kolonien x Anzahl der Elektroporationsreaktionen.
      HINWEIS: Um die Qualität der Bibliothek zu bestätigen, sequenzieren Sie mindestens 20 Kolonien durch Sanger-Sequenzierung. Die meisten Klone sollten eine Einfügung enthalten, und alle sollten eindeutig sein.
   6. Inokulieren Sie 400-1.000 ml LB-Medium, das das geeignete Antibiotikum enthält, mit dem Rest der gepoolten Transformationen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C, 180 U / min.
6. Vorbereitung der Plasmidbibliothek
   1. Bereiten Sie aus der Nachtkultur einen Glycerinvorrat vor (mischen Sie gleiche Volumina der Bakterienkultur und 50% Glycerinlösung in nukleasefreiem Wasser und frieren Sie ihn bei -80 °C ein) und reinigen Sie die Plasmidbibliothek mit einem Plasmid-Maxi-Kit.
7. Produktion einer viralen AAV-Bibliothek
   1. Bereiten Sie die virale Bibliothek wie zuvor beschrieben vor²⁷. Transfektieren Sie die Plasmidbibliothek (pRep2Cap2_PI, Peptidinsert) zusammen mit einem Adeno-Helfer-Plasmid in HEK293T-Zellen unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes wie Polyethylenimin (PEI).
   2. Sammeln Sie die Zellen nach 3 Tagen und unterziehen Sie sie drei Zyklen des Einfrierens und Auftauens. Reinigen Sie das Viruslysat mit Cäsiumchlorid-Gradienten-Ultrazentrifugation, gefolgt von einem Pufferaustausch zu PBS, und konzentrieren Sie schließlich die Viruspartikel.
8. AAV-Vektortitration mittels dd-PCR
   1. 2 μl des AAV-Vektorstamms werden seriell in 198 μl nukleasefreiem Wasser verdünnt, um eine Endverdünnung von 1:10⁶ zu erhalten. Mischen Sie jedes Mal gründlich mit einer 200-μl-Pipette. Fügen Sie ein No-Template-Steuerelement (NTC) als Negativkontrolle hinzu.
      ANMERKUNG: Es können zusätzliche niedrigere oder höhere Verdünnungen ermittelt werden (1:10^5-1:10⁷).
   2. Bereiten Sie eine 20-fache Primer-Sonden-Mischung vor. Geben Sie 3,6 μl von jedem der 100-μM-Primer (vorwärts und rückwärts, Rep2 und ITR), jeweils 1 μl der 100-μM-dd-PCR-Sonden (Rep2 und ITR) und 3,6 μl nukleasefreies Wasser in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Die AAV-Bibliothek wird mit einem transgen-gezielten Primer-Sonden-Set (Rep2) gemessen, das mit einer FAM-markierten Sonde detektiert wurde, und einem ITR-gezielten Primer-Sonden-Set, das mit einer HEX-markierten Sonde detektiert wurde.
   3. Bereiten Sie eine 22-μl-PCR-Reaktion vor, indem Sie 5,5 μl Probe, 1,1 μl 20-fache Primer-Sonden-Mischung, 11 μl dd-PCR-Supermix für Sonden (kein dUTP) und 4,4 μl nukleasefreies Wasser hinzufügen. Dies führt zu Konzentrationen von 900 nM bzw. 250 nM für die Primer bzw. die Sonde.
   4. Erzeugen Sie die Tröpfchen mit einem Tröpfchengenerator, übertragen Sie die Reaktion auf eine 96-Well-Platte, legen Sie die Platte in einen Thermocycler und führen Sie einen Denaturierungsschritt für 10 min bei 94 °C durch, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 94 °C und 1 min bei 58 °C. Anschließend wird die Polymerase für 10 min bei 98 °C hitzeinaktiviert und ein letzter Kühlschritt hinzugefügt. Lesen Sie die Reaktionen in einem Tröpfchenleser ab und fahren Sie mit der Analyse^{fort 28}.
   5. Öffnen Sie die gespeicherte dd-PCR-Plattendatei mit der Analysesoftware. Verwenden Sie das Schwellenwertwerkzeug auf der Registerkarte 1D-Amplitude (Fluoreszenzamplitude vs. Ereignisnummer), um die negativen und positiven Tröpfchen für jeden Kanal zu trennen, wobei Sie den NTC als Leitfaden verwenden, und exportieren Sie die Daten in eine CSV-Datei.
   6. Um die Vektorkonzentration zu berechnen, berechnen Sie zunächst den Korrekturfaktor CF mit der Formel:
      
      Mukoviszidose bestimmt den Anteil der Tröpfchen, die positiv für das Transgen sind [Positive], die sowohl für das Transgen als auch für das ITR [Ch1+ Ch2⁺] positiv sind, um den Nachweis funktioneller Vektorpartikel zu gewährleisten. Die endgültige Vektorkonzentration c kann nun mit der folgenden Gleichung berechnet werden:
      
      DF ist der Verdünnungsfaktor (1:10,^5-1:10,⁷ , wie zuvor bestimmt). Die Kopien pro 20 μl/Well-Reaktion entsprechen 5 μl der verdünnten Probe. Der Faktor 1.000 korrigiert die Skala auf VG/ml (virales Genom/ml). Ein beispielhaftes Titrationsergebnis ist in Tabelle 1 und Abbildung 3 dargestellt.
9. Analyse der AAV-Virusbibliothek durch NGS
   1. Amplifizieren Sie das 96-Nukleotid-Peptid-Insertionsfragment, indem Sie eine 20-μl-PCR-Reaktion unter Verwendung eines Korrekturlese-Polymerase-Kits einrichten (2x; siehe Abbildung 4). 1 μl AAV-Brühe, die 1 x 10⁸ vg, 0,5 μl je 100 μM Primer (NGS_forward und NGS_reverse) enthält, und 10 μl der Enzymmischung zur Reaktion geben. Stellen Sie das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 20 μl ein.
   2. Übertragen Sie die Reaktion auf einen Thermocycler und führen Sie einen Denaturierungsschritt für 3 min bei 98 °C durch, gefolgt von 30-35 Zyklen von 10 s bei 98 °C, 10 s bei 59 °C und 20 s bei 72 °C, gefolgt von 5 min bei 72 °C und einem abschließenden Abkühlschritt.
   3. Reinigen Sie die Proben mit einem PCR-Aufreinigungskit. Quantifizieren Sie die Konzentration in einem Spektralphotometer und führen Sie ein 3%iges Agarosegel durch, um die Reinheit und Fragmentgröße zu überprüfen.
   4. Verarbeiten Sie die PCR-Fragmente mit dem Bibliothekssystem für Proben mit geringer Komplexität gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Erstellung einer NGS-Bibliothek. Führen Sie die Endreparaturreaktion mit 30 ng PCR-Fragment durch, gefolgt von einer Adapterligation und PCR-Amplifikation für 10 Zyklen. Verwenden Sie das PCR-Aufreinigungskit für die Aufreinigung der Reaktionen.
   5. Verarbeiten Sie die Endprodukte auf einem Bioanalysator, um die Größe und Reinheit zu überprüfen, indem Sie ein DNA-Reagenzien-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden.
   6. Quantifizieren Sie die Amplikons mit einem Fluorometer und fassen Sie sie zusammen. Quantifizieren Sie die endgültige gepoolte NGS-Bibliothek erneut auf einem Fluorometer (gemäß den Anweisungen des Herstellers) und überprüfen Sie die Qualität auf einem Bioanalysator.
   7. Sequenzieren Sie die NGS-Bibliotheken in einem Single-End-Modus (SE) mit einem 75-Takt-High-Output-Kit mit einer Leselänge von 84 und einem Index 1 von 8.
      HINWEIS: Die Sequenzierung der Beispiele in diesem Artikel wurde in der GeneCore-Einrichtung des EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/) durchgeführt.
   8. Analysieren Sie die NGS-Sequenzierungsdaten mit Python 3 und Biopython. Die Dateien finden Sie unter https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternativ unter https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). Die NGS-Analyse besteht aus zwei Schritten.
      1. Im ersten Schritt durchsuchen Sie die Sequenzdateien nach Sequenzen, die bestimmte Kriterien erfüllen (Vorhandensein von Erkennungssequenzen flankiert die Einfügestelle) (siehe Abbildung 4, Schritt 1.9.8.5.). Dies geschieht mithilfe eines Skripts (Script#1) und einer Konfigurationsdatei, die die erforderlichen Informationen bereitstellt. Sobald die richtige Sequenz identifiziert ist, extrahiert und speichert das Programm die Sequenz in der Ausgabedatei, bei der es sich um eine txt-Datei mit demselben Namen wie die Sequenzierungsdatei handelt.
      2. Der zweite Schritt ist die Analyse der Ausgabedateien. Die Sequenzen in der Bibliothek beginnen mit einem von sechs Nukleotiden (AGWggc, W = A/T) im Insert mit neun Aminosäuren. Basierend auf dieser Startsequenz wird das Peptid übersetzt. Dadurch werden die Ausgabedateien generiert, die die Peptidvarianten (PVs) enthalten.
      3. Bereiten Sie zwei Ordner vor: Skript und Daten. Kopieren Sie die gzip-komprimierten Dateien, die sich aus der Sequenzierung ergeben, in den Ordner Daten. Kopieren Sie in den Skriptordner die folgenden Dateien, Python-Datei: Skript#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Python-Datei: Skript#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Konfigurationsdatei: Barcode_Script_JoVE.conf; und Look-up-Tabelle (LUT) Datei: Zuordnung.txt.
      4. Bearbeiten Sie vor dem Ausführen der Skripts die folgenden Dateien im Skriptordner. Öffnen Sie die Datei "Zuordnung.txt" und fügen Sie in zwei tabulatorgetrennten Spalten die Namen der gzip-Dateien (Spalte 1) und den gewünschten endgültigen Namen (Spalte 2; tabulatorgetrennte Werte) hinzu.
         HINWEIS: Beispiel-TXT-Dateien befinden sich im GitHub-Ordner "PV_analysis_script". Die im GitHub-Ordner bereitgestellten Dateien sind für die Analyse von drei Beispieldaten aus der obigen Bibliothek vorbereitet: xaa.txt.gz, xab.txt.gz und xac.txt.gz. Die Ausgabedateien werden ebenfalls bereitgestellt.
      5. Ändern Sie die folgenden Variablen in der Konfigurationsdatei "Barcode_Script_JoVE.conf":
         my_dir = "~/Daten/"
         filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
         Die sequenzspezifischen Variablen: BCV_size = 27, BCV_links = TCCAGGGCCAG, BCV_rechts = GCCCAGG, BCV_loc = 30, BCV_margin = 8, BCV_{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC und BCV_{loc_revcomp} = 41 (siehe Abbildung 4 für Details).
      6. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um die Variantensequenzerkennung und -extraktion aufzurufen:
         >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
         HINWEIS: Die Ausgabe sind txt-Dateien mit den extrahierten DNA-Sequenzen und deren Anzahl der Lesevorgänge. Der Header dieser Datei enthält statistische Daten (d.h. die Gesamtzahl der Lesevorgänge und die extrahierten Lesevorgänge). Diese Daten werden in die nächsten Dateien übertragen. Diese txt-Daten sind die Eingabedateien für Script#2, in denen die DNA-Sequenzen übersetzt, eingestuft und analysiert werden.
      7. Führen Sie die PV-Extraktion und -Analyse mit dem folgenden Befehl durch:
         >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analysieren Sie die Textausgabedateien von Script#2. Die Ausgabedateien von Script#2 werden über die zweite Spalte der LUT in "Zuordnung.txt" mit Erweiterungen basierend auf der Art der Analyse benannt.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die drei Ausgabedateien statistische Daten in den ersten Zeilen ("# der gültigen PV-Lesevorgänge", "# der ungültigen PV-Lesevorgänge" und "# der eindeutigen PV-Lesevorgänge"), einer ersten Spalte mit dem Index jeder DNA-Sequenz aus den Eingabe-TXT-Dateien (Ausgabe von Skript #1) und den folgenden Spalten enthalten: (1) "... analyzed_all.csv": "Probe:" (DNA-Sequenz), "#" (Anzahl der Lesevorgänge), "Frw oder Rev" (Vorwärts- oder Rückwärtslesen) und "PVs" (übersetzte Peptidsequenz). Die ungültigen Sequenzen haben "NA" und "nicht gültig" in den letzten beiden Spalten. (2) "... analyzed_validSeq.csv": identisch mit der vorherigen Datei, gefiltert nach gültigen Sequenzen. (3) "... analyzed_PV.csv": "PVs" (übersetzte Peptidsequenz), "#" (Anzahl der Lesevorgänge) und "count" (die FRW- und Rev-Zählungen in den vorherigen Dateien werden zusammengeführt und die Anzahl wird mit 1 oder 2 angegeben).
      9. Visualisieren Sie die Ausgabedateien mit verfügbarer Software basierend auf den Bedürfnissen des Benutzers.

2. Auswahl der zufälligen 7-meren Peptid-Display-Bibliothek für AAV2

1. Verwenden Sie die AAV-Bibliothek nach der Quantifizierung und Qualitätskontrolle (Abschnitt 1) für die gerichtete Entwicklung in einem Modell Ihrer Wahl, um iterativ Kandidaten mit den gewünschten Eigenschaften auszuwählen (siehe Abbildung 5)^16,18,21.
   HINWEIS: Diese Kandidaten werden dann für die Generierung einer Barcode-Bibliothek verwendet, wie unten in Abschnitt 3 beschrieben.

3. Vorbereitung und Analyse der AAV-Kapsidbibliothek mit Barcode

HINWEIS: Überprüfen Sie nach der Identifizierung einer Reihe potenziell spezifischer und effizienter AAV-Kapside auf dem Peptidbildschirm die Funktionalität der identifizierten Peptidsequenzen und vergleichen Sie sie mit einer Reihe häufig verwendeter oder gut beschriebener Referenz-AAV-Kapsidvarianten. Dazu wird die Kapsidsequenz in ein Rep/Cap-Hilfskonstrukt ohne ITRs eingefügt.

1. Herstellung einer AAV-Bibliothek mit Barcode
   1. Führen Sie eine rekombinante AAV-Produktion für jede Kapsidvariante unter Verwendung des Drei-Plasmid-Systems durch, wie zuvor beschrieben²⁴.
      HINWEIS: Zur Unterscheidung der verschiedenen Kapsidvarianten enthält das ITR-flankierte Reporter-Transgen-Plasmid einen eindeutigen Barcode mit einer Länge von 15 Nukleotiden. Der Barcode befindet sich in der 3'-UTR (untranslatierte Region) zwischen dem verstärkten gelb fluoreszierenden Protein (EYFP) und dem polyA-Signal (siehe Abbildung 6A). Die EYFP-Expression wird durch einen starken ubiquitären Cytomegalievirus (CMV)-Promotor gesteuert, der ausreichende Mengen an RNA-Transkripten bereitstellt.
   2. Entwerfen Sie Barcodes mit einer Länge von 15 Nukleotiden mit Homopolymeren von weniger als drei Nukleotiden, einem GC-Gehalt von <65 %²⁹ und einem Hamming-Abstand von mehr als vier Nukleotiden²⁴.
   3. Stellen Sie jedes Kapsid separat in Kombination mit einem Transgenplasmid her, das einen eindeutigen Barcode trägt. Auf diese Weise wird jede Kapsidvariante mit einem eindeutigen Barcode versehen, der eine spezifische Nachverfolgung ermöglicht (siehe Abbildung 6B).
2. AAV-Vektortitration mittels dd-PCR
   1. Führen Sie die AAV-Titration wie zuvor in Abschnitt 1.8 beschrieben durch, indem Sie das Rep2-Primerpaar durch das YFP-Primerpaar ersetzen.
   2. Quantifizieren Sie die einzelnen AAV-Produktionen und fassen Sie gleiche Mengen jeder Produktion zusammen, um die endgültige Barcode-Bibliothek zu generieren.
   3. Quantifizieren Sie die endgültige Bibliothek erneut, um die endgültige Konzentration und Qualität zu überprüfen (siehe Abbildung 7).
3. In-vivo-Anwendung der Barcode-AAV-Bibliothek
   1. Wenden Sie die barcodierte AAV-Bibliothek systemisch auf das Modellsystem Ihrer Wahl an (z. B. systemisch in Mäusen²⁴).
   2. Sammeln Sie ON- und OFF-Zielgewebe (z. B. Leber, Lunge, Herz, Zwerchfell, glatte Muskulatur, Zwölffingerdarm, Bauchspeicheldrüse, Dickdarm, Bizeps, Eierstöcke, Magen, Innenohr, Niere, Bauchaorta, thorakale Aorta, Gehirn, braunes und weißes Fett und Milz) oder Zelltypen basierend auf dem Experiment. Frieren Sie sie bei -80 °C ein, extrahieren Sie die DNA/RNA und wenden Sie die NGS-Quantifizierungsanalyse an, wie im nächsten Abschnitt beschrieben.
4. DNA/RNA-Extraktion
   1. Extrahieren Sie die DNA und RNA aus den interessierenden Geweben mit dem DNA/RNA Mini Kit.
   2. Legen Sie ein kleines Stück des interessierenden Gewebes (1 mm³, ca. 5 mg) in ein 2 ml Reaktionsröhrchen.
   3. 350 μl Lysepuffer, gemischt mit β-Mercaptoethanol (1%) und 5 mm Stahlkügelchen, in das Gewebe geben (Proben mit β-Mercaptoethanol unter einem Abzug behandeln).
   4. Homogenisieren Sie das Gewebe in einem TissueLyser für 45 s bei 40 Hz.
   5. 10 μl Proteinase K (10 mg/ml) zugeben und 15 min bei 55 °C unter Schütteln bei 400 U/min inkubieren.
   6. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur, sammeln Sie den Überstand und fahren Sie mit dem Protokoll des Herstellers des DNA/RNA-Kits fort.
   7. Teilen Sie den Waschschritt in zwei Schritte mit 350 μl Waschpuffer in jedem Schritt auf. Zwischen diesen Waschschritten wird die restliche DNA auf der Säule mit RNase-freier DNase I aufgeschlossen. 80 μl der DNase I-Lösung, die gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurde, auf die Säule geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   8. Eluieren Sie RNA/DNA aus der Säule mit nukleasefreiem Wasser. Lagern Sie die isolierte RNA bei -80 °C und die gDNA bei -20 °C.
5. cDNA-Synthese
   1. Unterziehen Sie die RNA-Proben vor der Reverse-Transkriptionsreaktion einer weiteren DNase I-Behandlung von 15-30 Minuten (zur vollständigen Entfernung der kontaminierenden DNA aus den RNA-Proben). Fügen Sie 1 μl der DNase I-Lösung, 4 μl Puffer (im Lieferumfang des Kits enthalten) und nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 40 μl bis 212 ng RNA hinzu. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren und bei 70 °C 10 min inaktivieren.
   2. Synthetisieren Sie cDNA unter Verwendung von 150 ng RNA unter Verwendung eines Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Fügen Sie Kontrollen ohne die reverse Transkriptase hinzu, um sicherzustellen, dass keine kontaminierende virale DNA aus der Probe stammt. Die cDNA wird bei -20 °C gelagert.
      HINWEIS: Die Menge der Eingangs-RNA für eine optimale reverse Transkription kann je nach Gewebetyp und der erwarteten Transduktionseffizienz im jeweiligen Gewebe variieren.
6. Analyse der AAV-Virusbibliothek (in-vivo) von NGS
   1. Um eine hohe Sequenzierungstiefe zu geringen Kosten zu erreichen, führen Sie die NGS-Sequenzierung über Illumina durch, wie zuvor beschrieben (Abschnitt 1.9). Verstärken Sie die Barcode-Sequenz und verbinden Sie dann die Sequenzieradapter mit dem Amplikon.
   2. Aufgrund der kurzen Leselänge und der Ligatur der Sequenzierungsadapter auf beiden Seiten des Amplikons ist beim Entwerfen darauf zu achten, dass das Amplikon ausreichend klein ist, um das Vorhandensein der Barcode-Sequenz innerhalb des gelesenen NGS sicherzustellen. Für die Sequenzierung der Barcodes innerhalb der viralen Genome und der viralen Transkripte ist das PCR-Amplikon auf eine Länge von 113 bp ausgelegt (siehe Abbildung 8).
   3. Verstärken Sie den Barcode-Bereich mit den Primern BC-seq vorwärts und BC-seq rückwärts. Bereiten Sie die folgende PCR-Reaktion vor: 0,5 μl Hi-Fidelity-DNA-Polymerase, 10 μl 5x Puffer, 0,25 μl jedes 100-μM-Primers (BC-seq fw/BC-seq rv) und 1 μl 10 mM dNTPs. Verwenden Sie 25 ng der cDNA oder DNA/Reaktion als Vorlage und stellen Sie das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 50 μl ein.
   4. Bereiten Sie den PCR-Mastermix unter einer sauberen PCR-Haube vor, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen: 30 s bei 98 °C, gefolgt von 40 Zyklen bei 98 °C für 10 s und 72 °C für 20 s und einem letzten 5-Minuten-Schritt bei 72 °C.
   5. Fügen Sie PCR-Kontrollen hinzu, um das Fehlen kontaminierender DNA im PCR-Mastermix zu bestätigen. Für die cDNA-Proben sind die Kontrollen ohne reverse Transkriptase einzuschließen. Fügen Sie schließlich ein Beispiel mit der AAV-Eingabebibliothek hinzu. Diese Informationen werden verwendet, um die Normalization_Variant.txt Datei zu generieren, die in der Analyse verwendet wird.
   6. Überprüfen Sie die Größe des PCR-Fragments jeder Probe durch Gelelektrophorese vor der PCR-Aufreinigung. Letzteres wird entweder durch die Verwendung von kommerziell erhältlichen Magnetkügelchen oder säulenbasierten DNA-Aufreinigungssystemen erreicht (siehe Materialtabelle).
   7. Bereiten Sie die NGS-Bibliothek mit dem Bibliothekssystem für Stichproben geringer Komplexität gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, wie zuvor in Abschnitt 1.9 beschrieben.
   8. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration über das dsDNA HS Kit und analysieren Sie die Qualität der Bibliothek wie zuvor beschrieben (Abschnitt 1.9.6), gefolgt von Pooling. Quantifizieren Sie die gepoolte Bibliothek auf einem Fluorometer und bewerten Sie die Qualität auf einem Bioanalysator.
   9. Führen Sie die NGS-Sequenzierung wie in Abschnitt 1.9.7 beschrieben durch.
   10. Quantifizieren Sie mittels qPCR die Kopienzahl des Transgens (virale Genome) und des Housekeeping-Gens, um die Verteilung der gepoolten Bibliothek zwischen Geweben oder Organen auf der DNA zu beurteilen.
   11. Richten Sie eine 30 μL qPCR-Reaktion wie folgt ein, um die Kopienzahl von EYFP (Transgen) und GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Housekeeping-Gen) zu bestimmen:
       1. Bereiten Sie eine 60-fache Primer-Sonden-Mischung für EYFP vor (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv und 0,6 μM YFP_probe; siehe Materialtabelle). Verwenden Sie die GAPDH-Primer-Sonden-Mischung (siehe Materialtabelle), um die Kopienzahl des Haushälter-Gens zu bestimmen. Richten Sie die Reaktion auf Eis ein.
       2. Bereiten Sie einen PCR-Mastermix (15 μl, siehe Materialtabelle) vor und fügen Sie 60x Primer/Sonden-Mix (0,5 μl) für alle Proben und Standards hinzu (um die Kopienzahlen für die Standards zu berechnen, verwenden Sie den folgenden Link: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Richten Sie die Reaktion auf Eis ein.
       3. Übertragen Sie 15,5 μl des Mastermixes in eine 96-Well-Platte und geben Sie 14,5 μl Probe (75 ng Gesamt-DNA-Konzentration) oder Standard in die jeweilige Vertiefung. Die 96-Well-Platte mit Folie versiegeln, wirbeln und kurz schleudern.
       4. Übertragen Sie 10 μl jeder Probe in Duplikaten in eine 384-Well-Platte. Die Platte mit Folie verschließen und bei 800 x g 5 min bei 4 °C schleudern.
       5. Das Reaktionsgemisch wird in einem Thermocycler bei einer Anfangstemperatur von 50 °C für 2 min inkubiert, gefolgt von einem ersten Aktivierungsschritt von 10 min bei 95 °C. Durchführung von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 s und Glühen/Verlängern bei 60 °C für 1 min²⁴.
       6. Um die Anzahl der diploiden Genome (dg) zu erhalten, verwenden Sie die GAPDH-Kopienzahl und teilen Sie sie durch zwei. Nehmen Sie dann den Wert der EYFP-Kopienzahl und dividieren Sie ihn durch die Anzahl der dg, was zu Vektorgenomen pro diploidem Genom (vg/dg) führt. Verwenden Sie diesen Wert, um die Normalization_Organ.txt Datei für die bioinformatische Analyse zu generieren.
   12. Führen Sie die Analyse der NGS-Sequenzierungsdaten durch, wie Weinmann et al.²⁴, mit benutzerdefiniertem Code in Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Der Workflow umfasst die Erkennung von Barcode-Sequenzen, die durch flankierende Sequenzen, deren Länge und Position geführt werden (Script#1_BarcodeDetection.py), sowie die Analyse der Barcode-Anreicherung und -Verteilung über den Satz von Geweben (Script#2_BarcodeAnalysis.py).
       1. Barcodes erkennen und AAV-Varianten zuordnen. Legen Sie die Sequenzierungsdaten als archivierte fastq-Dateien in einem Verzeichnis ab (z.B. "Data_to_analyze"). Die Sequenzierungsdatendatei für die Eingabebibliothek ist in diesem Verzeichnis enthalten und wird nur zum Berechnen der Kapsidanteile in der Eingabebibliothek verwendet.
       2. Erstellen Sie vor dem Ausführen des Skripts zwei tabulatorgetrennte Textdateien: die Kapsidvariantendatei (siehe Beispieldatei "Varianten.txt) mit den Barcode-Sequenzen, die den AAV-Kapsidvariantennamen zugewiesen sind, und die Kontaminationsdatei (siehe "Kontaminationen.txt") mit Barcode-Sequenzen, die von einer möglichen Kontamination stammen (andere im Labor verfügbare Barcodes, die zur Kontamination beitragen).
       3. Bearbeiten Sie abschließend die Konfigurationsdatei "Barcode_Script.conf" so, dass sie die folgenden Informationen enthält: Pfad zum Ordner mit Sequenzierungsdaten (z. B. "Data_to_analyze"), Reihenfolge der flankierenden Bereiche der Barcodes, deren Position und Fenstergröße für die Barcode-Erkennung (ähnlich wie bei 1.9.8.5, siehe Abbildung 8).
       4. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um die Barcode-Erkennung mit den angegebenen Pfaden zu Skript#1_BarcodeDetection.py und Konfigurationsdateien aufzurufen:
          >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
          HINWEIS: Die Ausgabe der Script#1_BarcodeDetection.py Ausführung besteht aus Textdateien mit Lesezahlen pro Kapsidvariante sowie der Gesamtzahl der aus den Rohdaten wiederhergestellten Lesevorgänge.
       5. Bewerten Sie die Verteilung von barcodierten AAV-Kapsiden zwischen Geweben oder Organen, indem Sie Script#2_BarcodeAnalysis.py zusammen mit den folgenden txt-Dateien ausführen:
          1. Ordnen Sie in der Datei "Zuordnung.txt jeder txt-Datei, die aus dem Barcode-Erkennungslauf gewonnen wird, einen Gewebe-/Organnamen zu: Namen der txt-Dateien in der ersten Spalte und entsprechende Gewebe-/Organnamen in tabulatorgetrennter Zuordnung.
             HINWEIS: Ein Beispiel finden Sie im Ordner "Example" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Bemerkenswert ist, dass der Gewebe-/Organname Zeichen enthalten kann, die die cDNA- oder gDNA-Messung und die Anzahl der biologischen Replikate (M1, M2 usw.) definieren.
          2. Erstellen Sie eine "Organs.txt"-Textdatei mit der Namensliste für ON- und OFF-Zielorgane, die den Namen entsprechen, die in der Zuordnungsdatei "Zuordnung.txt" angegeben sind (siehe Ordner "Beispiel": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Erstellen Sie tabulatorgetrennte Textdateien mit "Normalization_Organ.txt" und "Normalization_Variant.txt" mit normalisierten Werten für alle Kapsidvarianten und alle Organe/Gewebe. Schreiben Sie in die erste Spalte der Datei "Normalization_Organ.txt" die Namen der einzelnen Organe (wie in der Zuordnung.txt) und in die zweite Spalte die Normalisierungswerte für die entsprechenden Gewebe, die in Abschnitt 3.6.11 generiert wurden.
          4. Füllen Sie die erste Spalte der Datei "Normalization_Variant.txt" mit der Liste der Kapsidnamen und die zweite Spalte mit den normalisierten Werten der Leseanzahl für jedes Kapsid in der gepoolten Bibliothek (die Normalisierung kann basierend auf der txt-Ausgabedatei für die Eingabebibliothek berechnet werden, die sich aus dem ersten Skript ergibt).
          5. Bearbeiten Sie die Konfigurationsdatei, indem Sie die vollständigen Pfade zu allen oben genannten zusätzlichen Dateien angeben. Führen Sie Skript#2_BarcodeAnalysis.py wie folgt aus:
             >python3 /script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
             HINWEIS: Das Barcode-Analyseskript gibt mehrere Dateien aus: Textdateien mit relativen Konzentrationswerten (RC) der Kapsidverteilung in verschiedenen Geweben basierend auf mehreren zuvor beschriebenen Normalisierungsschritten und die Tabellenkalkulationsdatei, die Textdateidaten zu zusammengeführten Matrixdaten kombiniert. Letzteres kann für die Clusteranalyse und Visualisierung verwendet werden.
          6. Visualisieren Sie die Daten und führen Sie eine Clusteranalyse der Matrixdaten durch, um Kapsideigenschaften zu unterscheiden und ihre Ähnlichkeiten basierend auf RC-Profilen über Gewebe hinweg zu bewerten. Verwenden Sie das zusätzliche Skript PCA_heatmap_plot. R im Repository abgelegt:
             >Rscript --vanilla ~/PCA. R ~/relative Konzentration.xls
             HINWEIS: Das Skript verwendet relative concentration.xls Dateien als Eingabe und generiert zwei Diagramme der hierarchischen Cluster-Heatmap und der Hauptkomponentenanalyse (PCA).
          7. Um Diagramme (Achsen der Heatmap, Hauptkomponenten von PCA) oder PNG-Parameter (Farbe, Größe, Beschriftung) zu ändern, öffnen Sie das R-Skript und befolgen Sie die Anweisungen in den kommentierten Abschnitten.

Representative Results

Generierung einer AAV2-Peptid-Display-Bibliothek. Als erster Schritt zur Selektion von künstlich hergestellten AAVs wird die Generierung einer Plasmidbibliothek beschrieben. Der Peptideinsatz wird unter Verwendung von entarteten Primern hergestellt. Die Reduzierung der Kombination von Codons bei 64 auf 20 hat den Vorteil, dass Stoppcodons eliminiert und die NGS-Analyse erleichtert werden, indem die Bibliotheksvielfalt auf DNA-, aber nicht auf Proteinebene verringert wird. Das Oligonukleotid-Insert wird als einzelsträngige DNA gekauft (Abbildung 1), die mittels einer PCR-Reaktion in doppelsträngige DNA umgewandelt wird. Die Qualität dieser Reaktion wird in einem Bioanalyzer kontrolliert. Wie in Abbildung 2 gezeigt, erzeugten drei Zyklen ein stärkeres Band im Vergleich zu 10 oder 30 Zyklen. Das Insert wird dann mit BglI verdaut, um Drei-Nukleotid-Überhänge zu erzeugen. Das Nukleotid neben der Überhangsequenz des doppelsträngigen Inserts kann ein A oder ein T sein (W ist der Mehrdeutigkeitscode für A oder T), das sich in der dritten Position eines Codons befindet, das für Arginin (R) oder Serin (S) kodiert. Der Vektor (pRep2Cap2_PIS) weist eine Frameshift-Mutation in der Peptid-Insertionsstelle auf, die die Produktion des Kapsids in Abwesenheit einer Insertion verhindert, da kurz nach der Insertionsstelle ein Stoppcodon erzeugt wird. Der SfiI-Aufschluss dieses Plasmids erzeugt Drei-Nukleotid-Überhänge, die mit den Überhängen übereinstimmen, die im Peptid-kodierenden Oligonukleotid-Insert erzeugt werden. Die Ligatur muss unter optimalen Bedingungen durchgeführt werden, um die Komplexität der Plasmidbibliothek zu maximieren. Zu diesem Zweck wurde für die Umwandlung eine Elektroporation unter Verwendung kommerziell erhältlicher Bakterien mit hoher Effizienz durchgeführt.

Die Diversität der Plasmidbibliothek wird auf der Grundlage der Koloniezahl berechnet, die für diesen Bibliothekstyp typischerweise bei etwa 1 x 10⁸ liegt. Die Gesamtzahl der Kolonien entspricht der maximalen potentiellen Diversität der Bibliothek bei der NGS-Analyse, wie später erörtert wird. Die Plasmidbibliothek wird dann verwendet, um die AAV-Bibliothek zu erzeugen, die hier, aber an anderer Stelle²⁷ nicht im Detail beschrieben wird.

Die Quantifizierung dieser Bibliothek erfolgte mittels dd-PCR. Typischerweise werden zwei Regionen quantifiziert, das AAV2-Rep-Gen innerhalb des viralen Genoms und die ITR (siehe Abbildung 3 und Tabelle 1). Wie in Tabelle 1 gezeigt, sind von den Tröpfchen, die positiv für das virale Genom sind, 99,2% auch positiv für ITR (Ch1+ Ch2⁺), was eine Qualitätskontrolle für die AAV-Bibliothek darstellt und darauf hindeutet, dass die AAV-Kapside vollständige virale Genome enthalten. Um eine Konzentration in vg/ml zu erhalten, wird das Verhältnis von doppelt positiven zu positiven Tröpfchen berechnet und verwendet, um die richtige Anzahl von Kopien vor der Amplifikation durch den Verdünnungsfaktor zu erhalten.

Die Qualität der AAV-Bibliothek wird dann durch eine NGS-Analyse bewertet, beginnend mit einer PCR unter Verwendung geeigneter Primer. Als nächstes wird das PCR-Produkt unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits verarbeitet, das dem PCR-Produkt indexhaltige Adapter hinzufügt. Die NGS-Produkte werden sequenziert, und die Dateien werden mit Python analysiert. Drei Beispieldaten aus einer AAV2-Peptid-Display-Bibliothek werden bereitgestellt. Jede Sequenz in der Script#1-Eingabedatei (Liste der Sequenzen aller PCR-Kopien des amplifizierten DNA-Segments in der Probe) wird bioinformatisch nach den_{BCV-Sequenzen links} und BCV rechts oder den BCV-left_comp- und BCV-right_comp-Sequenzen durchsucht. Wenn eine der beiden Kombinationen identifiziert wird, wird die enthaltene Sequenz extrahiert und der Ausgabedatei hinzugefügt (siehe Abbildung 4). Die Ausgabe beider Skripte liefert statistische Daten zur Vorbereitung der NGS-Bibliothek. In allen drei Sätzen machten die extrahierten Lesevorgänge, basierend auf bibliotheksspezifischen Signatursequenzen, etwa 94 % der gesamten Lesevorgänge aus, was auf eine gute Qualität hindeutet. Die Ausgabe von Script#2 liefert weitere statistische Daten, und die Übersetzung der extrahierten DNA-Sequenz liefert zusätzliche Daten zur Qualitätskontrolle. Die "# der ungültigen PV-Reads" (d. h. Sequenzen, denen die sechs Nukleotide fehlen, die zur Initiierung der In-silico-Translation und zur Kodierung der Reste RG oder SG verwendet werden) beträgt weniger als 1% der wiederhergestellten Reads, was eine gute Sequenzierungsqualität bestätigt. Die Ausgaben des zweiten Skripts (d.h. die Übersetzung und das Ranking der extrahierten DNA-Sequenzen) liefern zusätzliche Informationen, wie z.B. die Anzahl der Lesevorgänge pro Peptidvariante oder die Anzahl der DNA-Sequenzen, die zu jeder Peptidvariante führen. Von den Dateien, die auf "analyzed_PVs" enden, enthalten nur gültige DNA-Reads, und die Analyse wird auf der Ebene der Peptidsequenz durchgeführt. Von den gültigen Lesevorgängen sind mehr als 99% eindeutig, was darauf hindeutet, dass die Bibliothek ausgewogen ist und die interne Vielfalt hoch ist.

Auswahl einer AAV2-Peptid-Display-Bibliothek. Diese Bibliothek kann dann für die In-vivo- oder In-vitro-Selektion verwendet werden. Dies ist in diesem Protokoll nicht enthalten, aber eine Gliederung ist in Abbildung 5 dargestellt. Kurz gesagt, für die In-vivo-Selektion werden die Gewebe 1 Woche nach der systemischen Injektion von 1 x 10¹² vg/Maus entnommen und die DNA isoliert. Eine Rettungs-PCR an einem größeren Fragment des cap-Gens wird durchgeführt, und das Produkt wird unter Verwendung verschiedener Restriktionsstellen, aber eines ähnlichen Protokolls wie hier beschrieben, in den Plasmidvektor kloniert, und es werden Runde-1-AAV-Bibliotheken hergestellt. Für die NGS-Analyse wird die PCR an der isolierten DNA oder den AAV-Bibliotheken durchgeführt. Nach der Selektion nimmt der Prozentsatz der eindeutigen PVs in der Bibliothek in der Regel entsprechend dem Selektionsdruck ab. Je nach Projekt kann die Auswahl abgeschlossen werden, sobald genügend dominante PVs von NGS identifiziert wurden.

Auswahl und Analyse von Barcode-Bibliotheken. Die Daten aus einer barcodierten AAV-Bibliothek, die 82 Kapside umfasst, wurden zuvor^{beschrieben 24}. Die dd-PCR-Quantifizierung der AAV-Partikel (siehe Abbildung 7 und Tabelle 1) zeigt, dass 94% der Kapside, die positiv für das Transgen sind, auch eine ITR enthalten, was auf ein vollständiges Genom hinweist. Dies ist niedriger als die oben beschriebene Wildtyp-Bibliothek, deutet aber dennoch auf eine gute Qualität für rekombinante AAVs hin, wenn man bedenkt, dass sie normalerweise weniger effizient verpacken. Nach der Injektion der gepoolten Bibliothek in Tiere werden die Gewebe gesammelt und DNA und RNA isoliert. Die PCR für NGS sowie die Vorbereitung und Sequenzierung der NGS-Bibliothek werden dann wie oben beschrieben und zuvor²⁴ durchgeführt. Zur Berechnung von vg/dg wird die qPCR durchgeführt und in den bereitgestellten Probendaten liegen die Werte im Bereich von 0,1-4. Wie es für die systemische AAV-Verabreichung typisch ist, hat die Leber über 10 vg/dg.

Im Rahmen der Analyse-Pipeline werden Normalisierungsschritte auf verschiedenen Ebenen durchgeführt. In der Eingabepoolbibliothek sind die Kapsidvarianten in der Regel nicht gleichmäßig vertreten. Daher wird die NGS-Analyse der Eingabebibliothek verwendet, um eine Normalisierungsdatei zu generieren, die die Häufigkeit jeder Kapsidvariante im endgültigen Gewebe/Organ basierend auf der Häufigkeit dieser Kapsidvariante in der Eingabebibliothek korrigiert. Die Bioverteilung der gepoolten Bibliotheksmitglieder durch NGS erfolgt auf DNA- und RNA-Ebene. Diese Normalisierung für die Eingangsbibliothek ergibt den Quotienten (P*_αβ) des Anteils innerhalb des Gewebes/Organs (P_αβ) zum Verhältnis in der Eingabebibliothek (L_a). Diese Berechnungen finden Sie in der Datei "variant_comparison.txt". Dieser Quotient wird dann mit den vg/dg-Werten aus der "Normalization_organ.txt"-Datei multipliziert, um den Wert Β αβ zu erhalten, und die Anteile der Β_αβ-Werte werden für ein einzelnes Gewebe oder für alle berechnet. Der Anteil des Β αβ-Wertes für jede Variante innerhalb eines Gewebes (V_αβ) spiegelt die Verbreitung dieser Variante innerhalb dieses Gewebes wider ("organ_comparison.txt"). Im Gegensatz dazu zeigt der Anteil des Β αβ-Wertes für jede Variante in allen Geweben (T_αβ) die Verbreitung dieser Variante im ganzen Körper an ("Relativekoncetrationen.xls"). Diese beiden Anteile spiegeln die Bioverteilung innerhalb und zwischen den Geweben jeder Variante wider. Alle diese Dateien können für verschiedene Visualisierungen der Kapsideffizienz und -spezifität^{verwendet werden 24}. Als Beispiel wird anhand der Abschlusstabelle (zu finden in "Relativeconcetrations.xls) die Hauptkomponentenanalyse und das hierarchische Clustering in Abbildung 9 dargestellt.

Die Normalisierung der gepoolten Bibliothek aus der NGS-Sequenzierung zeigt, dass jedes Kapsid einen durchschnittlichen Anteil von 0,012 hat, was auch mit dem theoretischen Anteil jedes der 82 Kapside übereinstimmt und auf eine ausgewogene gepoolte Bibliothek von 0,012 (1/82) hindeutet. Die von der bioinformatischen Pipeline erzeugte Datei "relative Konzentration.xls" spiegelt die Bioverteilung des Kapsids zwischen den Geweben wider, wie in Abbildung 9 dargestellt. Die Heatmap zeigt relative Konzentrationswerte auf einer log2-Skala für jedes Kapsid der gepoolten Bibliothek, die hierarchisch nach dem Gewebebioverteilungsprofil gruppiert sind. Die Hauptkomponentenanalyse ermöglicht die Unterscheidung von Clustern von AAV-Kapsidvarianten mit ähnlichen Bioverteilungseigenschaften und hebt auch die abgelegenen Kapside mit einzigartigen Mustern der Bioverteilung zwischen den Geweben hervor. Die beiden Hauptzweige der Heatmap-Hierarchie spiegeln den Unterschied in der Transduktionseffizienz von Kapsidvarianten wider. Der linke Ast mit der Mehrzahl der Kapsidvarianten umfasst alle Kapside, die einen hohen Wert der relativen Konzentration über die Mehrheit der Gewebe aufweisen. Neben einer auffallend hohen Leberspezifität zeigten drei weitere Kapside (Var60, Var13 und Var63) Spezifität im Zwerchfell (Di), im Skelettmuskel (SM), im Bizeps (BlC) und im Gehirn (B). Der rechte Zweig der hierarchischen Clusterbildung umfasst die Kapsidvarianten mit insgesamt geringerer Transduktionseffizienz, die im Zwölffingerdarm (Du) und in der Bauchspeicheldrüse (P) ausgeprägt ist. Die PCA für die ursprüngliche Untergruppe bildet den Cluster der Kapsidvarianten mit hoher Leberspezifität (Var 64, 78, 65, 55, 56) und skizziert das Var60-Kapsid mit herausragendem Muskeltropismus.

Abbildung 1: Überblick über die Klonierungsstrategie für die AAV2-Random-7-Mer-Peptid-Display-Bibliothek.
Das Oligonukleotid mit der zufälligen 7-meren Peptidinsertionssequenz wird von Sequenzen flankiert, die die BglI-Aufschlussstelle und eine Bindungsstelle für die Amplifikationsreaktion enthalten. Der Vektor pRep2Cap2_PIS enthält SfiI-Sites. Die Überhänge, die durch den BglI- und SflI-Aufschluss erzeugt werden, sind komplementär. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bioanalyzer-Qualitätskontrolle der Oligonukleotid-Zweitstrangsynthese.
Die Zweitstrangsynthese von entarteten Oligonukleotiden wird durch Analyse auf einem Bioanalysator bestätigt. PCR-Reaktionen mit drei, 10 und 30 Amplifikationszyklen werden verglichen, was zeigt, dass die drei Amplifikationszyklen am effizientesten sind. (A) Bioanalysator-Daten, dargestellt als Gelbild. (B-D) Aufgetragene Fragmentlängen (in bp, x-Achse) im Vergleich zu Fluoreszenzeinheiten (FU, y-Achse) im Vergleich zu Standardpeaks, sichtbar bei 15 und 1500 bp. Rote Pfeile zeigen doppelsträngige Oligonukleotide an. Beachten Sie, dass der höchste FU-Wert, der die höchste DNA-Konzentration darstellt, von doppelsträngigen Oligonukleotiden nach drei Amplifikationszyklen beobachtet wird (rote Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Titration einer AAV2-Peptid-Display-Bibliothek mittels dd-PCR.
(A) Nachweis von rep2-positiven Tröpfchen in Kanal 1 (FAM, Kanal 1) für eine Nicht-Template-Wasserkontrolle und eine 1:10⁶ verdünnte Virusprobe. (B) Nachweis von ITR-positiven Tröpfchen in Kanal 2 (HEX, Kanal 2). (C) Nachweis von Tröpfchen, die sowohl für rep2 als auch für ITR positiv sind (orange hervorgehoben). Lila Linien zeigen Schwellenwerte für die Detektion von positiven und negativen Tröpfchen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Übersicht über das für NGS verwendete DNA-Fragment und Einstellungen für die Python-Analyse.
Die NGS-PCR amplifiziert eine 96-Nukleotid-Region. Das PCR-Fragment wird verwendet, um die NGS-Bibliothek zu generieren. Für die bioinformatische Analyse müssen für beide Stränge Erkennungssequenzen rechts und links der Insertionsstelle sowie der Abstand vom Anfang des DNA-Fragments angegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Iterative Auswahl von AAV-Bibliotheken in vivo.
Mäusen wird die AAV-Bibliothek injiziert. Ziel-ON- und OFF-Gewebe werden 1 Woche später entnommen und einer NGS- und Analyseanalyse unterzogen. Das ON-Zielgewebe wird verwendet, um das Kapsidgen zu retten, das in den Ausgangsvektor kloniert wird. Die ausgewählte AAV-Bibliothek wird erstellt und verwendet, um den oben genannten Auswahlzyklus zu wiederholen. Diese Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Übersicht über die Generierung von AAV-Bibliotheken mit Barcodes.
(A) Graphische Darstellung eines selbstkomplementären AAV-Genoms, das ein CMV-Promotor-gesteuertes eyfp-Transgen trägt, das von ITRs flankiert wird. Die 3'-UTR enthält einen 15-Nukleotid-langen Barcode (BC), der sich an der 3'-UTR zwischen dem eyfp und dem Polyadenylierungssignal des Rinderwachstumshormons (BGH) befindet. Das BC ermöglicht die Kapsidverfolgung auf DNA- und mRNA-Ebene. (B) Während der AAV-Produktion wird ein einzigartiges barcodiertes Genom durch eine einzige Variante des Cap-Gens verpackt, was die Identifizierung des Kapsids erleichtert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Titration einer barcodierten AAV-Bibliothek mittels dd-PCR.
(A) Nachweis von YFP-positiven Tröpfchen in Kanal 1 (FAM, Kanal 1) für eine Nicht-Template-Wasserkontrolle und eine 1:10⁶ verdünnte Vektorprobe. (B) Nachweis von ITR-positiven Tröpfchen in Kanal 2 (HEX, Kanal 2). (C) Nachweis von Tröpfchen, die sowohl für rep2 als auch für ITR positiv sind (orange hervorgehoben). Lila Linien zeigen Schwellenwerte für die Detektion von positiven und negativen Tröpfchen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Übersicht über das für NGS verwendete DNA-Fragment und Einstellungen für die Python-Analyse.
Die NGS-PCR amplifiziert eine 113-Nukleotid-Region. Für die bioinformatische Analyse müssen für beide Stränge Erkennungssequenzen rechts und links des Barcodes angegeben werden, ebenso wie der Abstand vom Anfang des DNA-Fragments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: Hauptkomponentenanalyse (PCA) und hierarchische Clusteranalyse.
(A) Die PCA der relativen Konzentrationswerte für 82 Kapside in allen Geweben ermöglicht die Definition von Clustern von Kapsidvarianten mit ähnlichen Eigenschaften und Varianten mit einzigartigen Transduktionsmustern. (B) Um den dicht besiedelten Cluster besser zu trennen, wurden die Datensätze abgelegener einzigartiger Varianten aus der Matrix ausgeschlossen und die PCA-Analyse wiederholt. (C) Die hierarchische Clusteranalyse ermöglicht es, variante Transduktionsprofile über Gewebe hinweg als Heatmap-Diagramm visuell zu bewerten (Li = Leber, Lu = Lunge, FatB = braunes Fett, H = Herz, Di = Zwerchfell, SM = glatte Muskulatur, Du = Zwölffingerdarm, P = Bauchspeicheldrüse, C = Dickdarm, BIC = Bizeps, O = Eierstöcke, St = Bauch, I = Innenohr, K = Niere, Aa = Bauchaorta, At = thorakale Aorta, B = Gehirn, FatW = weißes Fett und S = Milz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Probe	Ziel	Kopien/20 μL gut	Positive	Ch1+ Ch2+	VGL	Korrigierte Kopien	DF	VG/ml
H2O	rep2	28	2	0	0	0	1.00E+06	5.60E+09
AAV2lib	rep2	90600	16396	16266	0.99	89882	1.00E+06	1.80E+13
H2O	YFP (Begriffsklärung)	4	3	2	0.67	3	1.00E+06	8.00E+08
BCAAVlib	YFP (Begriffsklärung)	34680	13229	12452	0.94	32643	1.00E+06	6.53E+12

Tabelle 1: Titrationsergebnisse einer AAV2-Peptid-Display-Bibliothek ("AAV2lib") und der barcodierten EYFP-Vektorbibliothek ("BCAAVlib").

Discussion

In diesem Protokoll werden die Schritte beschrieben, die für das AAV-Kapsid-Engineering für die Peptidanzeige und für das Screening von AAV-Bibliotheken mit Barcodes sowie für die bioinformatische Analyse der Bibliothekszusammensetzung und der Kapsidleistung erforderlich sind. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schritte, die die bioinformatische Analyse dieser Art von Bibliotheken erleichtern, da die meisten virologischen Laboratorien in ihren Programmierkenntnissen hinterherhinken, um ihren Kenntnissen in molekularbiologischen Techniken zu entsprechen. Beide Arten von Bibliotheken wurden, wie in der Einleitung beschrieben, in der Literatur ausführlich beschrieben und können relativ einfach reproduziert werden.

In einem ersten Schritt wird das Design einer Peptid-Display-Bibliothek in Position 588 im variablen Bereich VIII von AAV2 skizziert. Dieses Design (AAV2_Peptide(ii) in der früheren Veröffentlichung 26) und die beschriebene Klonierungsmethode können auf der Grundlage der in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung²⁶ enthaltenen Informationen leicht an andere Serotypen angepasst werden. Ein kritischer Schritt in der Klonierungspipeline ist die Ligations-/Transformationseffizienz (unter Verwendung des Cut-offs von ~ 1 x 10⁸ Kolonien). Es wird empfohlen, eine Ligationsreaktion nur mit einem Vektor hinzuzufügen. Dies hilft bei der Identifizierung des Prozentsatzes der Bakterienkolonien mit Insert, der höher als 80% sein sollte. Eine niedriger als erwartete Effizienz, d.h. eine Anzahl von Bakterienkolonien (Berechnung des Prozentsatzes mit Insert), die niedriger ist als die theoretische Diversität der Oligonukleotid-Inserts, würde sich negativ auf Varianten mit geringer Häufigkeit auswirken. Zu den Verbesserungen gehören längere Aufschlusszeiten und Aufreinigungsschritte für die Vektor- oder Ligationsreaktion unter Verwendung kommerzieller Kits.

Der nächste Schritt ist die Qualitätskontrolle der Variantenbibliothek mittels NGS eines PCR-Fragments, das die Oligonukleotid-Insertionsstelle umfasst. Die NGS wird mit einem Illumina-Sequenzierungssystem durchgeführt. Es gibt mehrere Alternativen, bei denen PCR-Produkte ohne vorherige NGS-Bibliotheksvorbereitung direkt eingereicht werden können. Dies eignet sich eher für kleine Experimente oder wenn keine hohe Lesetiefe erforderlich ist. Das hier beschriebene Protokoll umfasst die Vorbereitung der NGS-Bibliothek, einschließlich der Hinzufügung von Adaptern mit Illumina-Indizes zu den PCR-Produkten unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits. Eine häufige Einschränkung in Bezug auf NGS besteht darin, dass diese PCR-Fragmente eine geringe Diversität aufweisen, da die Sequenzen, die die High-Diversity-Insertionsstelle flankieren, in allen Varianten identisch sind, was wiederum die Sequenzierungseffizienz verringert. Um dies zu beheben, fügt dieses Kit eine beliebige Anzahl von zwei bis acht zufälligen Nukleotiden zwischen dem PCR-Fragment und dem Adapter hinzu. Alternativ muss die Probe mit PhiX versetzt werden. Die detaillierte Python-Pipeline wird beschrieben, um AAV2-Peptid-Display-Bibliotheken zu analysieren. Als Vorlage werden Beispieldateien bereitgestellt, die aus der ursprünglichen NGS-Datei der AAV2-Peptidanzeigebibliothek extrahiert wurden. Dies kann mit den gegebenen Anweisungen an andere Serotypen angepasst werden. Die Ausgabedateien dieser Analyse können in der nachgeschalteten Analyse verwendet werden, wie z. B. dem Vergleich von Plasmid und AAV-Bibliothek 30, der Aminosäurezusammensetzung in jeder Position³⁰, der Berechnung des Anreicherungswerts zwischen Bibliotheken nach Auswahlrunden 14 oder der Erzeugung von Sequenzlogos oder Graphen¹⁹. Was die Eingabebibliothek betrifft, so ist das Vorhandensein eines hohen Prozentsatzes an eindeutigen Varianten erwünscht. Einige Varianten produzieren jedoch nicht so gut wie andere, was nach der Produktion zu verzerrten Verteilungen führen kann. Eine geringe Variantendiversität, d.h. das Vorhandensein dominanter Varianten, könnte auf eine geringe Qualität des Oligonukleotid-Inserts oder eine hohe Anzahl von Synthesezyklen des zweiten Strangs zurückzuführen sein (Schritt 1.2). Darüber hinaus könnte die Aminosäurezusammensetzung durch die Produktion beeinflusst werden. Jede Aminosäure sollte eine Häufigkeit von 5,00% haben. Wenn die Verteilung stark von diesem Wert abweicht, wird empfohlen, die gleiche Analyse an der Plasmidbibliothek durchzuführen, um potenzielle Verzerrungen^{zu identifizieren 30}.

Da die Protokolle für die AAV-Bibliotheksgenerierung und die anschließenden Selektionsrunden in verschiedenen Tier- und In-vitro-Modellen in mehreren Veröffentlichungen und Protokollen 27,30,31,32 ausführlich beschrieben wurden^, wird hier nur die Analyse von Barcode-Bibliotheken ausgewählter technischer Varianten und Benchmarks beschrieben. Bemerkenswert ist, dass das Klonen der Bibliothek nach jeder Auswahlrunde durch PCR-Isolierung des cap-Gens durchgeführt werden kann, wie in den Abschnitten Protokoll und Ergebnisse erwähnt. Umfangreiche Selektions- und PCR-Amplifikationsrunden können zur Anhäufung von Mutationen oder Stop-Codons führen, die von NGS beobachtet werden können. Alternativ können angereicherte Varianten aus den NGS-Daten ausgewählt und die Oligonukleotide so geordnet und kloniert werden, wie es für die Generierung einer Peptid-Display-Bibliothek^16,18 beschrieben wurde. Schließlich enthält das Protokoll eine kurze Beschreibung für die Auswahl der Bibliotheken auf DNA-Ebene, 1 Woche nach der systemischen Injektion. RNA-basierte Selektionen sind strenger, da sie auch nach Varianten selektieren, die infektiöse Eintrittswege durchlaufen, obwohl sie technisch anspruchsvoller sind. Es ist zu beachten, dass RNA- oder transgenbasierte Selektionen (d.h. Cre) eine längere In-vivo-Dauer von etwa 3-4 Wochen erfordern 15,16,17,18,19,33. Insbesondere für DNA-basierte Selektionen ist es wichtig, die ausgewählten Varianten sowohl auf DNA- als auch auf RNA-Ebene anhand bekannter natürlicher und künstlich hergestellter Serotypen unter Verwendung einer barcodierten AAV-Bibliothek zu validieren.

Der zweite Teil des Protokolls beschreibt die Generierung und das Screening von barcodierten AAV-Bibliotheken unter Verwendung der zuvor entwickelten Pipeline²⁴. Jedes AAV-Kapsid im Pool enthält das gleiche Transgen (eyfp unter der Kontrolle eines CMV-Promotors) mit einem eindeutigen Barcode zwischen eyfp und dem polyA-Signal. Die in dieser Bibliothek verwendeten Barcodes finden Sie in der vorherigen Veröffentlichung²⁴. Das Design basierte auf dem Grundprinzip der Hamming-Distanz (d.h. die Barcode-Sequenzen müssen angemessen unterschiedlich sein), so dass Sequenzierungsfehler nicht zu fehlerhaften Barcode-Zuordnungen führen. Wie in Lyons et al.²⁶ beschrieben, ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Fehler bei Lesevorgängen zwischen 25 und 100 Nukleotiden auftreten, sehr gering. Ein Hamming-Abstand von 4 bedeutet, dass zwei Sequenzierungsfehler erforderlich wären, um einen Lesevorgang als falschen Barcode zuzuordnen. Lesevorgänge mit einem Fehler werden bei der Analyse ignoriert und in diesem Fall als "Lesevorgänge mit unbekannten Varianten" kategorisiert. In einer relevanten Publikation werden Richtlinien und ein Python-Skript bereitgestellt, um Barcodes²⁹ zu generieren, die in der Pipeline verwendet werden können. Für die Identifizierung nützlicher Barcodes kann ein weiterer beliebter Fehlerkorrekturcode verwendet werden, wie in der Veröffentlichung von Buschmann und Bystrykh³⁴ beschrieben, nämlich die Levenshtein-Distanz. Diese Gruppe stellt auch ein Softwarepaket für die Programmiersprache^{R 35} bereit.

Nach der AAV-Produktion kann die gepoolte barcodierte AAV-Bibliothek für Biodistributionsstudien in verschiedenen Modellen verwendet werden. Diese Studie skizziert die Pipeline unter Verwendung der 82-Varianten-Bibliothek aus der vorherigen Veröffentlichung²⁴ und liefert Beispieldaten für die Praxis. Dieses Protokoll kann auch an die Bedürfnisse jedes Benutzers angepasst werden. Die Bioverteilungsanalyse basiert auf der Entnahme verschiedener ON- und OFF-Zielgewebe oder -zellen, der Extraktion von DNA und RNA aus diesen, der PCR-Amplifikation der Barcode-Region für die NGS-Sequenzierung und der Messung von vg/dg auf DNA-Ebene. Für die RNA berechnet man am besten das Verhältnis zur mRNA-Kopienzahl eines Referenzgens. Das Referenzgen der Wahl sollte in ähnlicher Weise in verschiedenen Geweben exprimiert werden 36, wie z. B. RPP30 (Ribonuklease P/MRP-Untereinheit P30)³⁷ oder Hprt (Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1)³⁶. Dies ist jedoch mühsam, so dass man möglicherweise mehrere Referenzgene gleichzeitig verwenden muss, um die RNA-Daten zu normalisieren. Aus diesem Grund kann die Normalisierung auf dg auf DNA-Ebene abgeschlossen werden, was in etwa mit der Anzahl der Zellen korreliert. Dies weist auch auf die Verwendung der qPCR für diese Berechnung hin, wie zuvor beschrieben²⁴, obwohl die dd-PCR präziser ist und daher für die zukünftige Verwendung bevorzugt wird, insbesondere unter Berücksichtigung der Fortschritte auf diesem Gebiet³⁷. Zu guter Letzt sind grundlegende molekularbiologische Optimierungen äußerst kritisch für die hier beschriebene Methodik. Die PCR-Reaktionen müssen optimiert werden, um Verzerrungen in der Verteilung der Bibliotheken zu vermeiden. Die dd-PCR-Sonden müssen so konzipiert sein, dass sie intronische Regionen für DNA und interexonische Regionen für RNA enthalten. Eine gute Laborpraxis, wie z. B. die physische Kompartimentierung der Schritte, insbesondere die DNA- und AAV-Produktion aus der Bibliotheksvorbereitung, und die ordnungsgemäße Desinfektion sind von größter Bedeutung, um fehlerhafte Amplifikationen und Bibliothekskontaminationen zu vermeiden.

Bemerkenswert ist, dass die Verwendung von Peptid-Display-Bibliotheken und Vektor-DNA/RNA-Barcoding zur Selektion von künstlich hergestellten Kapsiden mit neuartigen Tropismen oder anderen klinisch relevanten Eigenschaften nur zwei Beispiele für gerichtete AAV-Kapsid-Evolutionstechnologien darstellt. Allen gemeinsam ist, dass sie mit Einschränkungen verbunden sind und weiter optimiert werden müssen, um ihr volles Potenzial auszuschöpfen. Zum Beispiel lässt die bloße Insertion eines Peptids einen großen Teil (~99%) der zugrunde liegenden Kapsidsequenz unverändert, deren Eigenschaften, einschließlich der Wechselwirkung mit neutralisierenden Anti-AAV-Antikörpern, möglicherweise vor der Anwendung beim Menschen weiter modifiziert werden müssen³⁸. Darüber hinaus ist die tatsächliche Diversität des Peptid-Displays oder anderer Bibliotheken typischerweise geringer als die theoretische, was beispielsweise auf technische Einschränkungen bei der Klonierung oder der bakteriellen Transformation zurückzuführen^{ist 31}. Generell gibt es auch eine aktive Debatte über die translationale Relevanz der gerichteten Evolution in Tier- oder In-vitro-Modellen , die durch zunehmende Hinweise auf eine mögliche art- oder sogar stammspezifische Leistung synthetischer AAV-Kapside gefördert^{wird 38}. Nichtsdestotrotz besteht die große Hoffnung, dass viele oder alle dieser Einschränkungen überwunden werden und dass das derzeitige Arsenal an Technologien auf eine noch größere Vielfalt von Krankheitsmodellen ausgeweitet und für die meisten Forschungsgruppen noch zugänglicher wird. Eine besonders erfreuliche neuere Entwicklung ist in dieser Hinsicht die Verwendung von barcodierten AAV-Bibliotheken, wie sie hier vorgestellt werden, um ausgewählte Kapside nicht mehr nur auf der Organ-, sondern nun auch auf zellulärer Ebene zu validieren, was mit neuartigen Technologien wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung erreicht werden kann³⁹. Die hier vorgestellten Protokolle werden die breitere Etablierung von AAV-Evolutionstechniken erleichtern und damit die Entwicklung neuartiger Kapside beschleunigen, die auf die Bedürfnisse einer Vielzahl von Forschungsgruppen und menschlichen Patienten zugeschnitten sind.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification primer	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	80204	DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	NGS Library preparation
BC-seq fw:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	ATCACTCTCGGCATGGACGAGC	NGS Library preparation
BC-seq rv:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	GGCTGGCAACTAGAAGGCACA	NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	44-420-3250ML	DNA/RNA extraction
BglI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0143	Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1851196	dd-PCR cycler
dNTPS	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	N0447S	NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863024	dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863005	dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864008	dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863051	dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863009	dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	12001925	dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells	Lucigen (Middleton, WI, USA)	60081-1	Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm	Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)	748050	Electroporation
GAPDH primer/probe mix	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Mm00186825_cn	Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1652660	Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)	4368814	cDNA reverse transcription
ITR_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	SY-415-1001	NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*	Roche AG (Basel, Switzerland)	KK2600 07958919001	NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	V8151	Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	ND-2000	Digestion of double-stranded insert
NGS_frw	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC	NGS primer
NGS_rev	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	CGC CTT GTG TGT TGA CAT C	NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	FC-404-2005	NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit	NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)	9092-256	NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814000	dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814040	dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F530S	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)	24765-1G	AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	NG2002	Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F549L	NGS Library preparation
Proteinase K	Roche AG (Basel, Switzerland)	5963117103	DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS			ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864002	dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864003	dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28306	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28704	Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	12162	Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28104	Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer	Invitrogen (Waltham, MA, USA)	Q32857	NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Q32851	NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix	Qiagen (Venlo, Netherlands)	1044234	Taqman qPCR
rep_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC	dd-PCR primer
rep_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CAATCACGGCGCACATGT	dd-PCR primer
rep_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1	dd-PCR probe
RNase-free DNase	Qiagen (Venlo, Netherlands)	79254	DNA/RNA extraction
SfiI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0123	Digestion of vector
5 mm, steel Beads	Qiagen (Venlo, Netherlands)	69989	DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	M0202L	Plasmid library ligation
TissueLyserLT	Qiagen (Venlo, Netherlands)	85600	DNA/RNA extraction
YFP_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GAGCGCACCATCTTCTTCAAG	dd-PCR primer
YFP_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	TGTCGCCCTCGAACTTCAC	dd-PCR primer
YFP_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1	dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)	Zymo research (Irvine, CA, USA)	D4013	Vector and Ligation purification