Isolement de vecteurs de thérapie génique de nouvelle génération par l’ingénierie, le codage à barres et le criblage de variantes de capside du virus adéno-associé (AAV)

Summary

Génération de bibliothèque d’affichage de peptides AAV et validation ultérieure par le codage à barres de candidats ayant de nouvelles propriétés pour la création d’AAV de nouvelle génération.

Abstract

Les vecteurs de livraison de gènes dérivés du virus adéno-associé (AAV) sont l’un des outils les plus prometteurs pour le traitement des maladies génétiques, comme en témoignent les données cliniques encourageantes et l’approbation de plusieurs thérapies géniques AAV. Deux raisons majeures du succès des vecteurs AAV sont (i) l’isolement préalable de divers sérotypes viraux naturels ayant des propriétés distinctes, et (ii) la mise en place ultérieure de technologies puissantes pour leur ingénierie moléculaire et leur réutilisation à haut débit. Le potentiel de ces techniques est récemment mis en œuvre pour coder à barres des capsides AAV sélectionnées au niveau de l’ADN et de l’ARN, permettant leur stratification in vivo complète et parallèle dans tous les principaux organes et types de cellules d’un seul animal. Ici, nous présentons un pipeline de base englobant cet ensemble de voies complémentaires, en utilisant l’affichage peptidique AAV pour représenter l’arsenal diversifié de technologies d’ingénierie de capside disponibles. En conséquence, nous décrivons d’abord les étapes cruciales de la génération d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV pour la sélection in vivo de candidats ayant les propriétés souhaitées, suivie d’une démonstration de la façon de coder à barres les variantes de capside les plus intéressantes pour le criblage secondaire in vivo. Ensuite, nous illustrons la méthodologie de création de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris l’amplification de codes-barres et la ligature d’adaptateurs, avant de conclure par un aperçu des étapes les plus critiques de l’analyse des données NGS. Comme les protocoles rapportés ici sont polyvalents et adaptables, les chercheurs peuvent facilement les exploiter pour enrichir les variantes optimales de capside AAV dans leur modèle de maladie préféré et pour des applications de thérapie génique.

Introduction

La thérapie par transfert de gènes est l’introduction de matériel génétique dans les cellules pour réparer, remplacer ou modifier le matériel génétique cellulaire afin de prévenir, traiter, guérir ou améliorer la maladie. Le transfert de gènes, à la fois in vivo et ex vivo, repose sur différents systèmes d’administration, non viraux et viraux. Les virus ont évolué naturellement pour transduire efficacement leurs cellules cibles et peuvent être utilisés comme vecteurs de livraison. Parmi les différents types de vecteurs viraux utilisés en thérapie génique, les virus adéno-associés ont été de plus en plus utilisés, en raison de leur absence de pathogénicité, de leur innocuité, de leur faible immunogénicité et, surtout, de leur capacité à maintenir une expression non intégratrice à long terme ^1,2,3. La thérapie génique AAV a donné lieu à des réalisations considérables au cours de la dernière décennie; trois thérapies ont été approuvées par l’Agence européenne des médicaments et la Food and Drug Administration des États-Unis pour une utilisation chez l’homme ^3,4. Plusieurs essais cliniques sont également en cours pour traiter diverses maladies, comme l’hémophilie, les maladies musculaires, cardiaques et neurologiques, comme on l’a vu ailleurs³. Malgré des décennies de progrès, le domaine de la thérapie génique a connu une série de revers ces dernières années⁴, surtout des décès dans les essais cliniques⁵ qui ont été suspendus en raison de toxicités limitant la dose, en particulier pour les tissus massifs, tels que les muscles, ou difficiles à atteindre, tels que le cerveau⁶.

Les vecteurs AAV actuellement utilisés dans les essais cliniques appartiennent aux sérotypes naturels à quelques exceptions^{près 1}. L’ingénierie AAV offre la possibilité de développer des vecteurs avec une spécificité et une efficacité supérieures pour les organes ou les cellules. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs approches ont été appliquées avec succès, telles que l’affichage peptidique, l’échange de boucles, le brassage de l’ADN de la capside, la PCR sujette aux erreurs et la conception ciblée, pour générer des variantes AAV individuelles ou des bibliothèques de celles-ci avec diverses propriétés⁷. Ceux-ci sont ensuite soumis à de multiples cycles d’évolution dirigée pour sélectionner les variantes en leur sein avec les propriétés souhaitées, comme examiné ailleurs ^1,3. De toutes les stratégies d’évolution de la capside, les bibliothèques AAV d’affichage peptidique ont été les plus largement utilisées, en raison de certaines propriétés uniques: elles sont relativement faciles à générer et peuvent atteindre une grande diversité et un séquençage à haut débit, ce qui permet de suivre leur évolution.

Les premières bibliothèques AAV d’insertion de peptides réussies ont été décrites il y a près de 20 ans. Dans l’un des premiers, Perabo et ^al.8 ont construit une bibliothèque de capsides AAV2 modifiées, dans laquelle un pool d’oligonucléotides générés aléatoirement a été inséré dans un plasmide à une position qui correspond à l’acide aminé 587 de la protéine de capside VP1, dans le triple axe dépassant de la capside. En utilisant la co-infection par l’adénovirus, la bibliothèque AAV a été développée à travers plusieurs cycles de sélection, et les variantes finales reciblées se sont révélées capables de transduire des lignées cellulaires réfractaires à l’AAV2^{parental 8}. Peu de temps après, Müller et ^al.9 ont introduit le système en deux étapes pour la production en bibliothèque, une amélioration significative du protocole. Initialement, la bibliothèque plasmidique, ainsi qu’un plasmide auxiliaire adénoviral, sont utilisés pour produire une bibliothèque AAV qui contient des capsides chimériques. Cette bibliothèque de navettes AAV est utilisée pour infecter des cellules à faible multiplicité d’infection (MOI), dans le but d’introduire un génome viral par cellule. La co-infection par l’adénovirus assure la production d’AAV avec un génome et une capside⁹ correspondants. Environ une décennie plus tard, Dalkara¹⁰ a utilisé l’évolution dirigée in vivo pour créer la variante 7m8. Cette variante a une insertion de 10 acides aminés (LALGETTRPA), dont trois agissent comme des agents de liaison, et cible efficacement la rétine externe après injection intravitréenne¹⁰. Cette capside artificielle est une réussite exceptionnelle, car c’est l’une des rares capsides modifiées à se rendre à la clinique jusqu’à^présent11.

Le domaine a connu un deuxième coup de pouce avec l’introduction de techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS). Deux publications d’Adachi et al.12 en 2014 et de Marsic et ^al.13 en 2015, ont montré la puissance du NGS pour suivre la distribution des bibliothèques de capsides AAV à code-barres avec une grande précision. Quelques années plus tard, le NGS des régions à code-barres a été adapté à la région d’insertion peptidique pour suivre l’évolution de la capside. Körbelin et ^coll.14 ont effectué un dépistage guidé par NGS pour identifier une capside pulmonaire ciblée basée sur AAV2. L’analyse NGS a permis de calculer trois scores de notation : le score d’enrichissement entre les tours de sélection, le score de spécificité générale pour déterminer la spécificité tissulaire, et enfin le score combiné¹⁴. Le laboratoire Gradinaru¹⁵ a publié le système d’évolution ciblée AAV basé sur la recombinaison Cre (CREATE) la même année, qui facilite une sélection spécifique au type cellulaire. Dans ce système, la bibliothèque de capsides porte un commutateur Cre-inversible, car le signal polyA est flanqué de deux sites loxP. La bibliothèque AAV est ensuite injectée chez les souris Cre, où le signal polyA est inversé uniquement dans les cellules Cre+, fournissant le modèle pour la liaison d’une amorce de PCR inverse avec l’amorce directe dans le gène de la capside. Ce sauvetage PCR très spécifique a permis l’identification de l’AAV-PHP. Variante B qui peut traverser la barrière hémato-encéphalique¹⁵. Ce système a ensuite évolué pour devenir M-CREATE (Multiplexed-CREATE), dans lequel NGS et la génération de bibliothèques synthétiques ont été intégrées dans le pipeline¹⁶.

Une version améliorée à base d’ARN de ce système du laboratoire Maguire¹⁷, iTransduce, permet de sélectionner au niveau de l’ADN des capsides qui transduisent fonctionnellement les cellules et expriment leurs génomes. Le génome viral de la bibliothèque d’affichage peptidique comprend un gène Cre sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire et le gène de la capside sous le contrôle du promoteur p41. La bibliothèque est injectée chez des souris qui ont une cassette loxP-STOP-loxP en amont de tdTomato. Les cellules transduites avec des variantes AAV qui expriment le génome viral et donc Cre expriment tdTomato et, en combinaison avec des marqueurs cellulaires, peuvent être triées et sélectionnées¹⁷. De même, Nonnenmacher et al.18 et Tabebordbar et ^al.19 ont placé la bibliothèque de gènes de la capside sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux tissus. Après injection dans différents modèles animaux, l’ARN viral a été utilisé pour isoler les variantes de capside.

Une autre approche consiste à utiliser le code-barres pour baliser les bibliothèques de capsides. Le laboratoire Björklund²⁰ a utilisé cette approche pour les bibliothèques de capsides d’insertion de peptides à code-barres et a développé l’évolution rationnelle du vecteur AAV à code-barres (BRAVE). Dans un plasmide, la cassette Rep2Cap est clonée à côté d’un transgène à code-barres à répétitions terminales inversées (ITR) exprimant une protéine fluorescente jaune (YFP). En utilisant des sites loxP entre la fin du bouchon et le début du code-barres, une recombinaison Cre in vitro génère un fragment suffisamment petit pour le NGS, permettant ainsi l’association de l’insertion peptidique avec le code-barres unique (table de consultation, LUT). La production d’AAV est réalisée à l’aide de la bibliothèque plasmidique et les codes-barres exprimés dans l’ARNm sont criblés après application in vivo , toujours avec NGS²⁰. Lorsque les bibliothèques de capsides comprennent des variantes de l’ensemble du gène de la capside (c.-à-d. bibliothèques mélangées), le séquençage à lecture longue doit être utilisé. Plusieurs groupes ont utilisé des codes-barres pour étiqueter ces diverses bibliothèques, ce qui permet à NGS d’avoir une profondeur de lecture plus élevée. Le laboratoire Kay²¹ a étiqueté des bibliothèques mélangées de capsides très diverses avec des codes-barres en aval du signal polyA du capuchon . Dans un premier temps, une bibliothèque de plasmides à code-barres a été générée et la bibliothèque de gènes de capside mélangée y a été clonée. Ensuite, une combinaison de MiSeq (lecture courte, profondeur de lecture plus élevée) et PacBio (lecture longue, profondeur de lecture inférieure) NGS ainsi que le séquençage Sanger a été utilisée pour générer leur LUT²¹. En 2019, Ogden et ses collègues du laboratoire^{Church 22} ont délimité l’aptitude de la capside AAV2 à plusieurs fonctions à l’aide de bibliothèques comportant des mutations, des insertions et des suppressions ponctuelles dans chaque position, ce qui a finalement permis une conception guidée par machine. Pour la génération de la bibliothèque, des fragments plus petits du gène de la capside ont été synthétisés, marqués avec un code-barres, séquencés de nouvelle génération, puis clonés dans le gène complet de la capside. Les données NGS ont été utilisées pour générer une LUT. La bibliothèque a ensuite été examinée à l’aide uniquement des codes-barres et du séquençage de lecture courte, ce qui permet une profondeur de lecture plus élevée²².

Les bibliothèques à code-barres ont été principalement utilisées pour examiner un pool de variantes connues, naturelles et artificielles après plusieurs cycles de sélection de bibliothèques de capsides ou indépendamment d’une étude de l’évolution de la capside. L’avantage de ces bibliothèques est la possibilité de cribler plusieurs capsides, tout en réduisant le nombre d’animaux et en minimisant les variations entre les animaux. Les premières études qui ont introduit cette technologie dans le domaine de l’AAV ont été publiées il y a près de dix ans. Le laboratoire Nakai 12 a marqué 191 mutants doubles alanine couvrant les acides aminés 356 à 736 sur le VP1 de AAV9 avec une paire de codes-barres¹² nucléotides. À l’aide de NGS, la bibliothèque a été examinée in vivo pour la liaison au galactose et d’autres propriétés¹². Marsic et ses collègues ont délimité la biodistribution des variantes AAV en utilisant également une analyse à double barcordée 1 an plus tard¹³. Une étude plus récente chez des primates non humains a comparé la biodistribution dans le système nerveux central de 29 capsides en utilisant différentes voies d’administration²³. Notre laboratoire a récemment publié des criblages de bibliothèque AAV à code-barres de 183 variantes comprenant des AAV naturels et artificiels. Ces criblages au niveau de l’ADN et de l’ARN ont conduit à l’identification d’une variante AAV²⁴ hautement myotrope chez la souris ainsi que d’autres présentant une spécificité de type cellulaire élevée dans le cerveau de souris²⁵.

Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée dans ce travail et l’élargissons pour inclure le criblage des bibliothèques d’affichage de peptides AAV. Cela comprend la génération de bibliothèques d’affichage de peptides AAV2, une méthode de PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) pour la quantification, et enfin un pipeline NGS pour analyser les variantes AAV, basé en partie sur les travaux de Weinmann et ses collègues²⁴. Enfin, une description de la génération de bibliothèques AAV à code-barres et du pipeline NGS utilisé dans la même publication est fournie.

Protocol

1. Préparation de la bibliothèque d’affichage de peptides 7-mer aléatoires AAV2

REMARQUE: Pour la préparation d’une bibliothèque d’affichage peptidique aléatoire AAV2, synthétisez les oligonucléotides dégénérés sous forme d’ADN simple brin, convertissez-le en ADN double brin, digérez, ligaturez le plasmide accepteur et électroporate.

1. Conception d’oligonucléotides dégénérés
   1. Ordonner les oligonucléotides dégénérés et éviter le biais de codon. Dans l’oligonucléotide 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 correspond à 20 codons, chacun codant pour l’un des 20 acides aminés. Le W peut être A ou T, produisant les codons AGA ou AGT, qui codent pour les acides aminés arginine (R) ou sérine (S).
   2. Commandez l’amorce d’amplification : 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (voir la figure 1 pour plus de détails). Cela produit l’insert protéique suivant: R / S G X₇. La diversité théorique est calculée comme suit : 1 x 2 x 20⁷ = 2,56 x 10⁹ variantes uniques.
      REMARQUE : Il convient de noter que cette diversité peut être limitée par l’efficacité de la transformation.
2. Synthèse du second brin
   1. Resuspendre les deux oligonucléotides (oligonucléotides dégénérés et amorce d’amplification) à une concentration finale de 100 μM avec un tampon TE.
      1. Pour la réaction de PCR, mettre en place une réaction de 50 μL avec 1 μL de chaque amorce, 10 μL du tampon, 1,5 μL de DMSO, 0,5 μL de dNTP (10 mM), 0,5 μL de polymérase II à démarrage à chaud haute fidélité et 35,5 μL d’eau sans nucléase.
      2. Transférer la réaction dans un thermocycleur et exécuter une étape de pré-incubation pendant 10 s à 98 °C, suivie de trois cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 59 °C et 10 s à 72 °C, puis 5 min à 72 °C et une dernière étape de refroidissement.
   2. Purifier la réaction à l’aide d’un kit d’élimination des nucléotides et éluer dans 100 μL d’eau sans nucléase.
   3. Confirmer l’efficacité de la synthèse du second brin par analyse sur un bioanalyseur (voir Figure 2). Analyser la taille et la pureté de l’insert double brin en chargeant 1 μL de la réaction sur une puce microfluidique à partir d’un kit de réactifs DNA 1000 selon les instructions du fabricant. Ce kit est optimisé pour mesurer la taille et la concentration de fragments d’ADN double brin de 25 à 1 000 bps.
3. Digestion de l’insert et du vecteur plasmidique
   1. Digérer 85 μL de l’insert purifié avec 10 μL de tampon 10x et 5 μL d’enzyme BglI dans un volume de réaction final de 100 μL (voir la figure 1 pour plus de détails). Incuber à 37 °C pendant une nuit. Purifier à l’aide d’un kit d’élimination des nucléotides, éluer dans 50 μL d’eau sans nucléase et quantifier en utilisant le type « Oligo DNA » dans un spectrophotomètre.
   2. Digérer 10 μg d’un plasmide AAV (pRep2Cap2_PIS)²⁶ (génome viral flanqué ITR) avec 20 μL de tampon 10x et 10 μL d’enzyme SfiI dans un volume de réaction final de 200 μL (voir la figure 1 pour plus de détails). Incuber à 50 °C pendant la nuit. Purifier le vecteur sur un gel d’agarose à 1% à l’aide du kit d’extraction de gel suivi d’une étape de purification supplémentaire à l’aide d’un kit de purification de l’ADN. Quantifier la concentration dans un spectrophotomètre.
4. Ligature de l’insert au vecteur
   1. Ligate 955 ng de vecteur plasmidique avec 45 ng d’insert avec 2 μL de tampon et 2 μL de ligase dans une réaction de ligature de 20 μL. Incuber à 16 °C pendant la nuit, suivi de 10 min à 70 °C pour inactiver la ligase à la chaleur.
5. Transformation, calcul de complexité et préparation de la bibliothèque plasmidique
   1. Purifier la réaction avec un kit de purification de l’ADN en suivant les instructions du fabricant. Éluer la réaction dans environ 80% du volume de départ d’eau exempte de nucléases et stocker sur de la glace pour une transformation ultérieure.
   2. Transformer les cellules électrocompétentes : décongeler un flacon de cellules électrocompétentes sur de la glace pendant 10 min. Ajoutez ensuite 1 à 2 μL de la réaction de ligature purifiée à 30 μL (un flacon) de cellules électrocompétentes et mélangez en tapotant doucement. Ensuite, pipeter soigneusement le mélange cellule/ADN dans une cuvette d’électroporation à intervalle pré-refroidi de 1 mm sans introduire de bulles d’air.
   3. Électroporate en utilisant les réglages suivants : 1800 V, 600 Ω et 10 μF. Dans les 10 s suivant l’impulsion d’électroporation, ajouter 970 μL de fluide de récupération préchauffé (muni des cellules électrocompétentes) à la cuvette et mélanger par pipetage. Enfin, transférer les cellules dans un tube microcentrifuge et incuber pendant 1 h à 37 °C à 250 tr/min. Pour obtenir la diversité souhaitée, effectuez 10 à 100 réactions et, après l’incubation, regroupez toutes les réactions dans un seul tube.
   4. Calculer la diversité en diluant 10 μL des transformations groupées 10, 100 ou 1 000 fois dans le PBS et étaler 100 μL sur des plaques de gélose nutritive contenant l’antibiotique approprié (75 mg/mL d’ampicilline). Incuber les plaques de gélose pendant une nuit à 37 °C, puis compter les colonies sur les plaques de gélose.
   5. Calculez la diversité théorique comme suit :
      Diversité maximale théorique = 10 x facteur de dilution x nombre de colonies x nombre de réactions d’électroporation.
      Remarque : Pour confirmer la qualité de la bibliothèque, séquencez au moins 20 colonies par séquençage de Sanger. La plupart des clones doivent contenir un insert, et tous doivent être uniques.
   6. Inoculer 400 à 1 000 mL de milieu LB contenant l’antibiotique approprié avec le reste des transformations regroupées et incuber pendant une nuit à 37 °C, 180 tr/min.
6. Préparation de la bibliothèque plasmidique
   1. À partir de la culture de nuit, préparer un bouillon de glycérol (mélanger des volumes égaux de culture bactérienne et une solution de glycérol à 50% dans de l’eau sans nucléase et congeler à -80 °C) et purifier la bibliothèque plasmidique à l’aide d’un kit maxi plasmidique.
7. Production de la bibliothèque virale AAV
   1. Préparez la bibliothèque virale comme décrit précédemment²⁷. Transfecter la bibliothèque plasmidique (pRep2Cap2_PI, insert peptidique) avec un plasmide adéno-auxiliaire aux cellules HEK293T à l’aide d’un réactif de transfection tel que la polyéthylène (PEI).
   2. Recueillir les cellules après 3 jours et les soumettre à trois cycles de gel-décongélation. Purifier le lysat viral par ultracentrifugation à gradient de chlorure de césium, suivie d’un échange tampon au PBS, et enfin concentrer les particules virales.
8. Titrage vectoriel AAV par dd-PCR
   1. Diluer en série 2 μL du stock de vecteurs AAV dans 198 μL d’eau exempte de nucléases pour obtenir une dilution finale de 1:10⁶ . Bien mélanger à chaque fois à l’aide d’une pipette de 200 μL. Ajoutez un contrôle sans modèle (NTC) en tant que contrôle négatif.
      NOTA: Des dilutions supplémentaires plus faibles ou supérieures peuvent être dosées (1:10^5-1:10⁷).
   2. Préparez un mélange amorce-sonde 20x. Ajouter 3,6 μL de chacune des amorces de 100 μM (avant et arrière, Rep2 et ITR), 1 μL chacune des sondes dd-PCR de 100 μM (Rep2 et ITR) et 3,6 μL d’eau sans nucléase dans un tube centrifuge de 1,5 mL.
      REMARQUE: La bibliothèque AAV est mesurée à l’aide d’un ensemble d’amorces-sondes ciblant les transgènes (Rep2) détectées avec une sonde marquée FAM, et d’un ensemble d’amorces-sondes ciblant ITR détecté avec une sonde marquée HEX.
   3. Préparer une réaction PCR de 22 μL en ajoutant 5,5 μL d’échantillon, 1,1 μL de mélange amorce-sonde 20x, 11 μL de supermix dd-PCR pour sondes (pas de dUTP) et 4,4 μL d’eau sans nucléase. Cela donne des concentrations de 900 nM et 250 nM pour les amorces et la sonde, respectivement.
   4. Générer les gouttelettes à l’aide d’un générateur de gouttelettes, transférer la réaction sur une plaque de 96 puits, placer la plaque dans un thermocycleur et exécuter une étape de dénaturation pendant 10 min à 94 °C, suivie de 40 cycles de 30 s à 94 °C et de 1 min à 58 °C. Ensuite, inactivez la polymérase à la chaleur pendant 10 min à 98 °C et ajoutez une dernière étape de refroidissement. Lire les réactions dans un lecteur de gouttelettes et procéder à l’analyse²⁸.
   5. Ouvrez le fichier de plaque dd-PCR enregistré à l’aide du logiciel d’analyse. Utilisez l’outil de seuil dans l’onglet Amplitude 1D (amplitude de fluorescence par rapport au numéro d’événement) pour séparer les gouttelettes négatives et positives pour chaque canal, en utilisant le NTC comme guide, et exportez les données dans un fichier csv.
   6. Pour calculer la concentration du vecteur, calculez d’abord le facteur de correction CF à l’aide de la formule:
      
      La mucoviscidose détermine la proportion de gouttelettes positives pour le transgène [positifs] qui sont positives pour le transgène et l’ITR [Ch1+ Ch2⁺], afin d’assurer la détection des particules vectorielles fonctionnelles. La concentration finale du vecteur c peut maintenant être calculée à l’aide de l’équation suivante:
      
      DF est le facteur de dilution (1:10^5-1:10⁷ tel que déterminé précédemment). Les copies par réaction de 20 μL/puits correspondent à 5 μL de l’échantillon dilué. Le facteur 1 000 corrige l’échelle à VG/mL (génome viral/mL). Un exemple de résultat de titrage est présenté dans le tableau 1 et la figure 3.
9. Analyse de la banque virale AAV par NGS
   1. Amplifier le fragment d’insertion du peptide 96 nucléotidiques en mettant en place une réaction PCR de 20 μL à l’aide d’un kit de relecture de la polymérase (2x; voir Figure 4). Ajouter 1 μL de stock AAV contenant 1 x 10⁸ vg, 0,5 μL de chacun des 100 μM d’amorce (NGS_forward et NGS_reverse) et 10 μL du mélange d’enzymes à la réaction. Régler le volume final à 20 μL avec de l’eau sans nucléase.
   2. Transférer la réaction dans un thermocycleur et exécuter une étape de dénaturation pendant 3 min à 98 °C, suivie de 30 à 35 cycles de 10 s à 98 °C, 10 s à 59 °C et 20 s à 72 °C, suivis de 5 min à 72 °C et d’une dernière étape de refroidissement.
   3. Purifier les échantillons à l’aide d’un kit de purification PCR. Quantifier la concentration dans un spectrophotomètre et utiliser un gel d’agarose à 3% pour vérifier la pureté et la taille du fragment.
   4. Traiter les fragments PCR à l’aide du système de bibliothèque pour le kit d’échantillons de faible complexité conformément aux instructions du fabricant pour la préparation d’une bibliothèque NGS. Effectuer la réaction de réparation finale avec 30 ng de fragment de PCR, suivie de la ligature de l’adaptateur et de l’amplification de la PCR pendant 10 cycles. Utilisez le kit de purification PCR pour la purification des réactions.
   5. Traiter les produits finaux sur un bioanalyseur pour vérifier la taille et la pureté, en utilisant un kit de réactifs ADN selon les instructions du fabricant.
   6. Quantifier les amplicons à l’aide d’un fluoromètre et les mettre en commun. Quantifier à nouveau la bibliothèque NGS finale regroupée sur un fluoromètre (selon les instructions du fabricant) et vérifier la qualité sur un bioanalyseur.
   7. Séquencez les bibliothèques NGS en mode mono-extrémité (SE), à l’aide d’un kit de sortie élevée de 75 cycles, avec une longueur de lecture de 84 et un index 1 sur 8.
      REMARQUE : Le séquençage des exemples de cet article a été effectué dans les installations GeneCore de l’EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
   8. Analysez les données de séquençage NGS avec Python 3 et biopython. Les fichiers peuvent être trouvés à https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternativement à https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). L’analyse NGS est composée de deux étapes.
      1. Dans un premier temps, recherchez dans les fichiers de séquences les séquences qui répondent à certains critères (présence de séquences de reconnaissance flanquant le site d’insertion) (voir Figure 4, étape 1.9.8.5.). Cela se fait à l’aide d’un script (Script#1) et d’un fichier de configuration qui fournit les informations nécessaires. Une fois la séquence correcte identifiée, le programme extrait et stocke la séquence dans le fichier de sortie, qui est un fichier txt portant le même nom que le fichier de séquençage.
      2. La deuxième étape est l’analyse des fichiers de sortie. Les séquences de la bibliothèque commencent par l’un des six nucléotides (AGWggc, W = A / T) dans l’insert de neuf acides aminés. Sur la base de cette séquence de départ, le peptide est traduit. Cela génère les fichiers de sortie qui contiennent les variantes peptidiques (PV).
      3. Préparez deux dossiers : Script et Data. Dans le dossier Données, copiez les fichiers compressés au format gzip résultant du séquencement. Dans le dossier Script, copiez les fichiers Python suivants : Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Fichier Python : Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Fichier de configuration : Barcode_Script_JoVE.conf ; et fichier de table de correspondance (LUT) : Zuordnung.txt.
      4. Avant d’exécuter les scripts, modifiez les fichiers suivants dans le dossier Script. Ouvrez le fichier « Zuordnung.txt » et ajoutez deux colonnes séparées par des tabulations, les noms des fichiers gzip (colonne 1) et le nom final souhaité (colonne 2; valeurs séparées par des tabulations).
         Remarque : exemples de fichiers txt se trouvent dans le dossier GitHub « PV_analysis_script ». Les fichiers fournis dans le dossier GitHub sont préparés pour l’analyse de trois exemples de données de la bibliothèque ci-dessus : xaa.txt.gz, xab.txt.gz et xac.txt.gz. Les fichiers de sortie sont également fournis.
      5. Modifiez les variables suivantes dans le fichier de configuration « Barcode_Script_JoVE.conf » :
         my_dir = « ~/données/ »
         filename_sample_file = « ~/Script/Zuordnung.txt »
         Les variables spécifiques à la séquence : BCV_size = 27, BCV_gauche = TCCAGGGCCAG, BCV_droite = GCCCAGG, BCV_loc = 30,_marge BCV = 8, BCV_{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC et BCV_{loc_revcomp} = 41 (voir Figure 4 pour plus de détails).
      6. Utilisez la commande suivante pour appeler la détection et l’extraction de séquence de variantes :
         >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
         REMARQUE: Les résultats sont des fichiers txt avec les séquences d’ADN extraites et leur nombre de lectures. L’en-tête de ce fichier contient des données statistiques (c’est-à-dire le nombre total de lectures et les lectures extraites). Ces données sont transférées vers les fichiers suivants. Ces données txt sont les fichiers d’entrée pour Script # 2, dans lequel les séquences d’ADN sont traduites, classées et analysées.
      7. Effectuez l’extraction et l’analyse PV à l’aide de la commande suivante:
         >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analysez les fichiers de sortie texte de Script#2. Les fichiers de sortie de Script#2 sont nommés en utilisant la deuxième colonne de la LUT dans « Zuordnung.txt » avec des extensions basées sur le type d’analyse.
         REMARQUE: Assurez-vous que les trois fichiers de sortie contiennent des données statistiques dans les premières lignes (« # de lectures PV valides », « # de lectures PV non valides » et « # de lectures PV uniques »), une première colonne avec l’index de chaque séquence d’ADN des fichiers txt d’entrée (sortie du script # 1) et les colonnes suivantes: (1) « ... analyzed_all.csv »: « Échantillon: » (séquence d’ADN), « # » (nombre de lectures), « Frw ou Rev » (lecture directe ou inverse) et « PVs » (séquence peptidique traduite). Les séquences non valides ont « NA » et « non valide » dans les deux dernières colonnes. (2) "... analyzed_validSeq.csv »: identique au fichier précédent, filtré pour les séquences valides. (3) "... analyzed_PV.csv »: « PVs » (séquence peptidique traduite), « # » (nombre de lectures) et « count » (les comptes frw et rev dans les fichiers précédents sont fusionnés et le nombre est donné 1 ou 2).
      9. Visualisez les fichiers de sortie à l’aide des logiciels disponibles en fonction des besoins de l’utilisateur.

2. Sélection de la bibliothèque d’affichage aléatoire de peptides 7-mer AAV2

1. Utiliser la bibliothèque AAV après quantification et contrôle de la qualité (section 1) pour l’évolution dirigée dans un modèle de choix afin de sélectionner de manière itérative les candidats ayant les propriétés souhaitées (voir Figure 5)^16,18,21.
   REMARQUE : Ces candidats sont ensuite utilisés pour la génération d’une bibliothèque de codes à barres comme décrit ci-dessous dans la section 3.

3. Préparation et analyse de la bibliothèque de capsides AAV à code-barres

REMARQUE: Après l’identification d’un ensemble de capsides AAV potentiellement spécifiques et efficaces dans l’écran d’affichage peptidique, vérifiez la fonctionnalité des séquences peptidiques identifiées et comparez-les avec un ensemble de variantes de capside AAV de référence couramment utilisées ou bien décrites. Pour ce faire, la séquence de capside est insérée dans une construction d’assistance Rep/Cap sans RTI.

1. Production d’une bibliothèque AAV à code-barres
   1. Effectuer la production d’AAV recombinants pour chaque variante de capside en utilisant le système à trois plasmides, comme décrit précédemment²⁴.
      REMARQUE: Pour distinguer les différentes variantes de capside, le plasmide transgène rapporteur flanqué d’ITR abrite un code-barres unique de 15 nucléotides de longueur. Le code-barres est situé à 3' UTR (région non traduite) entre la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) et le signal polyA (voir Figure 6A). L’expression de l’EYFP est déterminée par un puissant promoteur du cytomégalovirus ubiquitaire (CMV) qui fournit des niveaux suffisants de transcrits d’ARN.
   2. Concevoir des codes-barres de 15 nucléotides de longueur avec des homopolymères de moins de trois nucléotides, une teneur en GC de <65%²⁹ et une distance de Hamming supérieure à quatre nucléotides²⁴.
   3. Produire chaque capside séparément en combinaison avec un plasmide transgénique portant un code-barres unique. De cette façon, chaque variante de capside est étiquetée avec un code-barres distinct qui permet son suivi spécifique (voir Figure 6B).
2. Titrage vectoriel AAV par dd-PCR
   1. Effectuez le titrage AAV comme décrit précédemment dans la section 1.8, en remplaçant la paire d’amorces Rep2 par la paire d’amorces YFP.
   2. Quantifier les productions AAV individuelles et mettre en commun des quantités égales de chaque production pour générer la bibliothèque finale à code-barres.
   3. Quantifier à nouveau la bibliothèque finale pour vérifier la concentration finale et la qualité (voir la figure 7).
3. Bibliothèque AAV à code-barres application in vivo
   1. Appliquer systématiquement la bibliothèque AAV à code-barres au système modèle de votre choix (par exemple, systématiquement chez la souris²⁴).
   2. Prélever des tissus ON et OFF cibles (foie, poumon, cœur, diaphragme, muscle lisse, duodénum, pancréas, côlon, biceps, ovaires, estomac, oreille interne, rein, aorte abdominale, aorte thoracique, cerveau, graisse brune et blanche et rate) ou des types de cellules en fonction de l’expérience. Congelez-les à -80 °C, extrayez l’ADN/ARN et appliquez l’analyse de quantification NGS, comme décrit dans la section suivante.
4. Extraction d’ADN/ARN
   1. Extrayez l’ADN et l’ARN des tissus d’intérêt à l’aide du mini kit ADN/ARN.
   2. Placer un petit morceau du tissu d’intérêt (1 mm³, environ 5 mg) dans un tube de réaction de 2 mL.
   3. Ajouter 350 μL de tampon de lyse mélangé avec du β-mercaptoéthanol (1 %) et des billes d’acier de 5 mm dans le tissu (manipuler les échantillons avec du β-mercaptoéthanol sous une hotte).
   4. Homogénéiser le tissu dans un tissuLyser pendant 45 s à 40 Hz.
   5. Ajouter 10 μL de protéinase K (10 mg/mL) et incuber pendant 15 min à 55 °C tout en agitant à 400 rpm.
   6. Centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min à température ambiante, recueillir le surnageant et procéder au protocole du fabricant du kit ADN/ARN.
   7. Divisez l’étape de lavage en deux étapes avec 350 μL de tampon de lavage à chaque étape. Entre ces étapes de lavage, digérer l’ADN restant sur la colonne avec la DNase I sans RNase. Ajouter 80 μL de la solution de DNase I, préparée selon les instructions du fabricant, sur la colonne et incuber à température ambiante pendant 15 min.
   8. Élute ARN/ADN de la colonne avec de l’eau sans nucléase. Stocker l’ARN isolé à -80 °C et l’ADNg à -20 °C.
5. Synthèse de l’ADNc
   1. Soumettre les échantillons d’ARN à une autre série de traitement par la DNase I de 15 à 30 minutes (pour l’élimination complète de l’ADN contaminant des échantillons d’ARN) avant la réaction de transcription inverse. Ajouter 1 μL de la solution de DNase I, 4 μL de tampon (fourni avec le kit) et de l’eau sans nucléase à un volume final de 40 μL à 212 ng d’ARN. Incuber pendant 30 min à température ambiante et inactiver la chaleur à 70 °C pendant 10 min.
   2. Synthétiser l’ADNc, en utilisant 150 ng d’ARN à l’aide d’un kit selon les instructions du fabricant. Inclure des contrôles sans transcriptase inverse, pour s’assurer de l’absence d’ADN viral contaminant de l’échantillon. L’ADNc est stocké à -20 °C.
      REMARQUE: La quantité d’ARN d’entrée pour une transcription inverse optimale peut varier en fonction du type de tissu et de l’efficacité de transduction attendue dans le tissu respectif.
6. Analyse de la bibliothèque virale AAV (in-vivo) par NGS
   1. Pour obtenir une profondeur de séquençage élevée à faible coût, effectuez le NGS via le séquençage Illumina comme décrit précédemment (section 1.9). Amplifiez la séquence de codes-barres, puis ligaturez les adaptateurs de séquençage sur l’amplicon.
   2. En raison de la courte longueur de lecture et de la ligature des adaptateurs de séquençage des deux côtés de l’amplicon, lors de la conception, vérifiez que l’amplicon est suffisamment petit pour assurer la présence de la séquence de codes-barres dans la lecture NGS. Pour le séquençage des codes-barres dans les génomes viraux et les transcrits viraux, l’amplicon PCR est conçu pour avoir une longueur de 113 pb (voir Figure 8).
   3. Amplifiez la région à code-barres avec les amorces BC-seq avant et BC-seq inverse. Préparer la réaction PCR suivante : 0,5 μL d’ADN polymérase haute fidélité, 10 μL de tampon 5x, 0,25 μL de chaque amorce 100 μM (BC-seq fw/BC-seq rv) et 1 μl de 10 mM dNTP. Utilisez 25 ng d’ADNc ou d’ADN/réaction comme matrice et ajustez le volume final à 50 μL avec de l’eau sans nucléase.
   4. Préparez le mélange-maître PCR sous une hotte PCR propre pour éviter toute contamination. Utilisez les conditions de cycle suivantes: 30 s à 98 °C, suivi de 40 cycles à 98 °C pendant 10 s et 72 °C pendant 20 s, et un pas final de 5 minutes à 72 °C.
   5. Inclure des contrôles PCR pour confirmer l’absence d’ADN contaminant dans le mélange maître de PCR. Pour les échantillons d’ADNc, inclure les témoins sans transcriptase inverse. Enfin, incluez un exemple avec la bibliothèque d’entrées AAV. Ces informations seront utilisées pour générer le fichier Normalization_Variant.txt utilisé dans l’analyse.
   6. Vérifier la taille du fragment PCR de chaque échantillon par électrophorèse sur gel avant purification par PCR. Ce dernier est réalisé en utilisant soit des billes magnétiques disponibles dans le commerce, soit des systèmes de purification de l’ADN à base de colonnes (voir le tableau des matériaux).
   7. Préparer la bibliothèque NGS à l’aide du système de bibliothèque pour les échantillons de faible complexité conformément aux instructions du fabricant, comme décrit précédemment à la section 1.9.
   8. Déterminer la concentration d’ADN via le kit dsDNA HS et analyser la qualité de la bibliothèque comme décrit précédemment (section 1.9.6), suivi d’une mise en commun. Quantifier la bibliothèque regroupée sur un fluoromètre et évaluer la qualité sur un bioanalyseur.
   9. Effectuer le séquençage NGS comme indiqué à la section 1.9.7.
   10. Quantifier par qPCR le nombre de copies du transgène (génomes viraux) et du gène d’entretien pour évaluer la distribution de la bibliothèque mise en commun entre les tissus ou les organes de l’ADN.
   11. Mettre en place une réaction qPCR de 30 μL comme suit, pour déterminer le nombre de copies de EYFP (transgène) et GAPDH (glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, gène d’entretien ménager):
       1. Préparer un mélange amorce/sonde 60x pour le FEP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv et 0,6 μM YFP_probe; voir le tableau des matériaux). Utiliser le mélange amorce/sonde GAPDH (voir le tableau des matières) pour déterminer le numéro de copie du gène de la gouvernante. Mettez en place la réaction sur la glace.
       2. Préparez un mélange principal PCR (15 μL, voir le tableau des matériaux) et ajoutez 60x mélange amorce/sonde (0,5 μL) pour tous les échantillons et étalons (pour calculer le nombre d’exemplaires pour les étalons, utilisez le lien suivant : http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Mettez en place la réaction sur la glace.
       3. Transférer 15,5 μL du mélange maître dans une plaque de 96 puits et ajouter 14,5 μL d’échantillon (75 ng de concentration d’ADN total) ou d’étalon au puits respectif. Scellez la plaque de 96 puits avec du papier d’aluminium, du vortex et faites tourner brièvement.
       4. Transférer 10 μL de chaque échantillon dans une plaque de 384 puits en doubles. Sceller la plaque avec du papier d’aluminium et faire tourner à 800 x g pendant 5 min à 4 °C.
       5. Incuber le mélange réactionnel dans un thermocycleur à une température initiale de 50 °C pendant 2 min, suivie d’une étape d’activation initiale de 10 min à 95 °C. Effectuer 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s et de recuit/extension à 60 °C pendant 1 min²⁴.
       6. Pour obtenir le nombre de génomes diploïdes (dg), utilisez le nombre de copies GAPDH et divisez par deux. Ensuite, prenez la valeur du nombre de copies du PEJ et divisez-la par le nombre de dg, ce qui donne des génomes vectoriels par génome diploïde (vg/dg). Utilisez cette valeur pour générer le fichier Normalization_Organ.txt pour l’analyse bioinformatique.
   12. Effectuer l’analyse des données de séquençage NGS comme Weinmann et al.²⁴, en utilisant du code personnalisé dans Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Le flux de travail comprend la détection de séquences de codes-barres guidées par des séquences flanquantes, leur longueur et leur emplacement (Script#1_BarcodeDetection.py), ainsi que l’analyse de l’enrichissement et de la distribution des codes-barres sur l’ensemble des tissus (Script#2_BarcodeAnalysis.py).
       1. Détectez les codes-barres et attribuez-les aux variantes AAV. Placez les données de séquençage sous forme de fichiers fastq archivés dans un répertoire (par exemple, « Data_to_analyze »). Le fichier de données de séquençage de la bibliothèque d’entrée est inclus dans ce répertoire et utilisé uniquement pour calculer les proportions de capside dans la bibliothèque d’entrée.
       2. Avant d’exécuter le script, créez deux fichiers texte délimités par des tabulations : le fichier de variantes de capside (voir le fichier d’exemple « Variantes.txt ») avec les séquences de codes-barres attribuées aux noms de variantes de capside AAV, et le fichier de contamination (voir « Contaminations.txt ») avec des séquences de codes-barres provenant d’une contamination possible (autres codes à barres disponibles en laboratoire, contribuant à la contamination).
       3. Enfin, modifiez le fichier de configuration « Barcode_Script.conf » pour inclure les informations suivantes : chemin d’accès au dossier avec les données de séquençage (par exemple, « Data_to_analyze »), séquence des régions flanquantes des codes-barres, leur position et la taille de la fenêtre pour la détection des codes-barres (similaire à 1.9.8.5, voir la figure 8).
       4. Utilisez la commande suivante pour appeler la détection de code-barres avec les chemins d’accès fournis à Script#1_BarcodeDetection.py et aux fichiers de configuration :
          >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
          REMARQUE: La sortie de l’exécution du script # 1_BarcodeDetection.py est constituée de fichiers texte avec le nombre de lectures par variante de capside ainsi que le nombre total de lectures récupérées à partir des données brutes.
       5. Évaluez la distribution des capsides AAV à code-barres parmi les tissus ou les organes, en exécutant Script#2_BarcodeAnalysis.py avec les fichiers txt suivants :
          1. Dans le fichier « Zuordnung.txt », attribuez le nom à chaque fichier txt obtenu à partir de l’exécution de détection de code-barres à un nom de tissu/organe : noms des fichiers txt dans la première colonne et noms de tissus/organes correspondants dans l’affectation délimitée par des tabulations.
             REMARQUE: Pour un exemple, vérifiez dans le dossier « Exemple » (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Il convient de noter que le nom du tissu ou de l’organe peut inclure des caractères définissant la mesure de l’ADNc ou de l’ADNg et le nombre de réplications biologiques (M1, M2, etc.).
          2. Créez un fichier texte « organes.txt » avec la liste des noms des organes cibles ON et OFF, qui correspondent aux noms donnés dans le fichier d’affectation « Zuordnung.txt » (voir dossier « Exemple »: https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Créez des fichiers texte délimités par des tabulations « Normalization_Organ.txt » et « Normalization_Variant.txt » avec des valeurs normalisées pour toutes les variantes de capside et tous les organes/tissus. Dans la première colonne du fichier « Normalization_Organ.txt », écrivez les noms donnés pour chaque organe (comme dans le fichier d’affectation « Zuordnung.txt ») et dans la deuxième colonne les valeurs de normalisation pour les tissus correspondants, générées dans la section 3.6.11.
          4. Remplissez la première colonne du fichier « Normalization_Variant.txt » avec la liste des noms de capside et la deuxième colonne avec les valeurs normalisées du nombre de lectures pour chaque capside dans la bibliothèque regroupée (la normalisation peut être calculée sur la base du fichier de sortie txt pour la bibliothèque d’entrée résultant du premier script).
          5. Modifiez le fichier de configuration en spécifiant les chemins d’accès complets à tous les fichiers supplémentaires mentionnés ci-dessus. Exécuter le script#2_BarcodeAnalysis.py en tant que :
             >python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
             REMARQUE: Le script d’analyse de code-barres génère plusieurs fichiers: des fichiers texte avec des valeurs de concentration relative (RC) de la distribution de la capside dans différents tissus en fonction de plusieurs étapes de normalisation décrites précédemment, et le fichier de feuille de calcul qui combine les données de fichier texte dans les données de matrice fusionnées. Ce dernier peut être utilisé pour l’analyse et la visualisation de clusters.
          6. Visualisez les données et effectuez une analyse par grappes des données matricielles afin de distinguer les propriétés de la capside et d’évaluer leurs similitudes en fonction des profils RC entre les tissus. Utilisez le script supplémentaire PCA_heatmap_plot. R placé dans le référentiel :
             >Rscript --vanille ~/PCA. R ~/concentration relative.xls
             Remarque : Le script prend la concentration relative.xls fichiers comme entrée et génère deux tracés de carte thermique de cluster hiérarchique et d’analyse en composantes principales (ACP).
          7. Pour modifier des tracés (axes de carte thermique, composantes principales de PCA) ou des paramètres png (couleur, taille, étiquetage), ouvrez le script R et suivez les instructions fournies dans les sections commentées.

Representative Results

Génération d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV2. Comme première étape vers la sélection d’AAV techniques, la génération d’une bibliothèque de plasmides est décrite. L’insert peptidique est produit à l’aide d’amorces dégénérées. Réduire la combinaison de codons chez ceux de 64 à 20 a l’avantage d’éliminer les codons stop et de faciliter l’analyse NGS, en réduisant la diversité des bibliothèques sur l’ADN mais pas au niveau de la protéine. L’insert d’oligonucléotide est acheté sous forme d’ADN simple brin (Figure 1), qui est converti en ADN double brin à l’aide d’une réaction PCR. La qualité de cette réaction est contrôlée dans un bioanalyseur. Comme le montre la figure 2, trois cycles ont produit une bande plus forte, comparativement à 10 ou 30 cycles. L’insert est ensuite digéré avec du BglI pour générer des surplombs à trois nucléotides. Le nucléotide à côté de la séquence en surplomb de l’insert double brin peut être un A ou un T (W est le code d’ambiguïté pour A ou T), qui est en troisième position d’un codon codant pour l’arginine (R) ou la sérine (S). Le vecteur (pRep2Cap2_PIS) a une mutation de décalage de cadre dans le site d’insertion peptidique qui empêche la production de la capside en l’absence d’insertion, en raison de la création d’un codon stop peu de temps après le site d’insertion. La digestion SfiI de ce plasmide génère des surplombs à trois nucléotides qui correspondent aux surplombs générés dans l’insert d’oligonucléotide codant pour un peptide. La ligature doit être effectuée dans des conditions optimales pour maximiser la complexité de la plasmide. À cette fin, pour la transformation, l’électroporation a été réalisée en utilisant des bactéries disponibles dans le commerce avec une efficacité élevée.

La diversité de la bibliothèque plasmidique est calculée en fonction du nombre de colonies, qui est généralement d’environ 1 x 10⁸ pour ce type de bibliothèque. Le nombre total de colonies correspond à la diversité potentielle maximale de la bibliothèque lors de l’analyse NGS, comme nous le verrons plus loin. La bibliothèque plasmidique est ensuite utilisée pour générer la bibliothèque AAV, qui n’est pas décrite en détail ici mais ailleurs²⁷.

La quantification de cette bibliothèque a été réalisée à l’aide de la dd-PCR. En règle générale, deux régions sont quantifiées, le gène AAV2 rep dans le génome viral et l’ITR (voir Figure 3 et Tableau 1). Comme le montre le tableau 1, parmi les gouttelettes positives pour le génome viral, 99,2% sont également positives pour ITR (Ch1+ Ch2⁺), ce qui est un contrôle de qualité pour la bibliothèque AAV et suggère que les capsides AAV contiennent des génomes viraux complets. Pour obtenir une concentration en vg/mL, la proportion de gouttelettes doublement positives par rapport aux positifs est calculée et utilisée pour obtenir le nombre correct de copies avant amplification par le facteur de dilution.

La qualité de la bibliothèque AAV est ensuite évaluée par analyse NGS, en commençant par une PCR utilisant des amorces appropriées. Ensuite, le produit PCR est traité à l’aide d’un kit disponible dans le commerce, qui ajoute des adaptateurs contenant un indice au produit PCR. Les produits NGS sont séquencés et les fichiers sont analysés à l’aide de Python. Trois exemples de données provenant d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV2 sont fournis. Chaque séquence du fichier d’entrée Script#1 (liste des séquences de toutes les copies PCR du segment d’ADN amplifié dans l’échantillon) est recherchée bio-informatique pour les séquences_gauche et_droite BCV, ou les séquences_{BCV left_comp} et BCV_{right_comp} . Si l’une ou l’autre combinaison est identifiée, la séquence contenue est extraite et ajoutée au fichier de sortie (voir la figure 4). La sortie des deux scripts fournit des données statistiques concernant la préparation de la bibliothèque NGS. Dans les trois ensembles, les lectures extraites, basées sur des séquences de signatures spécifiques à la bibliothèque, représentaient environ 94% du total des lectures, ce qui suggère une bonne qualité. La sortie du script # 2 fournit des données statistiques supplémentaires, et la traduction de la séquence d’ADN extraite fournit des données de contrôle de qualité supplémentaires. Le « # de lectures PV invalides » (c’est-à-dire des séquences dépourvues des six nucléotides utilisés pour initier la traduction in silico et coder les résidus RG ou SG) est inférieur à 1% des lectures récupérées, ce qui confirme une bonne qualité de séquençage. Les résultats du deuxième script (c’est-à-dire la traduction et le classement des séquences d’ADN extraites) fournissent des informations supplémentaires, telles que le nombre de lectures par variante peptidique ou le nombre de séquences d’ADN donnant lieu à chaque variante peptidique. Parmi les fichiers, ceux qui se terminent par « analyzed_PVs » ne contiennent que des lectures ADN valides, et l’analyse est effectuée au niveau de la séquence peptidique. Parmi les lectures valides, plus de 99% sont uniques, ce qui suggère que la bibliothèque est équilibrée et que la diversité interne est élevée.

Sélection d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV2. Cette bibliothèque peut ensuite être utilisée pour la sélection in vivo ou in vitro . Cela n’est pas inclus dans ce protocole, mais un aperçu est fourni à la figure 5. Brièvement, pour la sélection in vivo , les tissus sont prélevés 1 semaine après l’injection systémique de 1 x 10¹² vg/souris et l’ADN est isolé. Une PCR de sauvetage sur un fragment plus grand du gène de la coiffe est effectuée, et le produit est cloné dans le vecteur plasmidique en utilisant différents sites de restriction, mais un protocole similaire à ce qui est décrit ici, et des bibliothèques AAV de ronde 1 sont préparées. Pour l’analyse NGS, la PCR est réalisée sur l’ADN isolé ou les bibliothèques AAV. Après la sélection, le pourcentage de PV uniques dans la bibliothèque diminue généralement en fonction de la pression de sélection. Selon le projet, la sélection peut être conclue une fois que suffisamment de PV dominants sont identifiés par NGS.

Sélection et analyse de bibliothèques à code-barres. Les données d’une bibliothèque AAV à code-barres comprenant 82 capsides ont été décrites précédemment²⁴. La quantification dd-PCR des particules AAV (voir Figure 7 et Tableau 1) montre que 94% des capsides positives pour le transgène contiennent également un ITR, révélateur d’un génome complet. Ceci est inférieur à la bibliothèque de type sauvage décrite ci-dessus, mais suggère toujours une bonne qualité pour les AAV recombinants, étant donné qu’ils se regroupent généralement moins efficacement. Après injection de la bibliothèque mise en commun chez les animaux, les tissus sont collectés et l’ADN et l’ARN sont isolés. La PCR pour NGS ainsi que la préparation et le séquençage de la bibliothèque NGS sont ensuite effectués comme décrit ci-dessus et précédemment²⁴. Pour calculer vg/dg, la qPCR est effectuée et, dans les données de l’échantillon fournies, les valeurs vont de 0,1 à 4. Comme il est typique pour l’administration systémique d’AAV, le foie a plus de 10 vg / dg.

Dans le cadre du pipeline d’analyse, les étapes de normalisation sont effectuées à différents niveaux. Dans la bibliothèque d’entrée regroupée, les variantes de capside ne sont généralement pas représentées de manière égale. Par conséquent, l’analyse NGS de la bibliothèque d’entrée est utilisée pour générer un fichier de normalisation, qui corrige l’abondance de chaque variante de capside dans le tissu / organe final en fonction de l’abondance de cette variante de capside dans la bibliothèque d’entrée. La biodistribution des membres de la bibliothèque mise en commun par NGS est réalisée au niveau de l’ADN et de l’ARN. Cette normalisation de la bibliothèque d’entrées donne le quotient (P*αβ) de proportion dans le tissu/organe (P_αβ) par rapport à la proportion dans la bibliothèque d’entrées (L_a). Ces calculs se trouvent dans le fichier « variant_comparison.txt ». Ce quotient est ensuite multiplié par les valeurs vg/dg du fichier « Normalization_organ.txt » pour obtenir la valeur_Β αβ, et les proportions des valeurs_{β αβ} sont calculées pour un seul tissu ou pour tous. La proportion de la valeur_Β αβ pour chaque variante dans un tissu (V_αβ) reflète la dissémination de cette variante dans ce tissu (« organ_comparison.txt »). En revanche, la proportion de la valeur_β αβ pour chaque variant dans tous les tissus (T_αβ) indique la dissémination de ce variant dans l’ensemble du corps (« relativeconcetrations.xls »). Ces deux proportions reflètent la biodistribution intra et intertissulaire de chaque variant. Tous ces fichiers peuvent être utilisés pour différentes visualisations de l’efficacité et de la spécificité de la capside²⁴. À titre d’exemple, à l’aide du tableau final (qui se trouve dans « relativeconcetrations .xls »), l’analyse en composantes principales et le regroupement hiérarchique sont présentés à la figure 9.

La normalisation de la bibliothèque mise en commun à partir du séquençage NGS montre que chaque capside a une proportion moyenne de 0,012, ce qui correspond également à la proportion théorique de chacune des 82 capsides et suggère une bibliothèque groupée bien équilibrée de 0,012 (1/82). Le fichier « concentration relative .xls » généré par le pipeline bioinformatique reflète la biodistribution de la capside intertissulaire, comme l’illustre la figure 9. La carte thermique montre les valeurs de concentration relatives sur une échelle log2 pour chaque capside de la bibliothèque regroupée hiérarchiquement regroupée en fonction du profil de biodistribution tissulaire. L’analyse en composantes principales permet de distinguer les grappes de variantes de capside AAV ayant des propriétés de biodistribution similaires et met également en évidence les capsides périphériques avec des modèles uniques de biodistribution intertissulaire. Les deux principales branches de la hiérarchie de la carte thermique reflètent la différence d’efficacité de transduction des variantes de capside. La branche gauche avec la majorité des variantes de capside comprend toutes les capsides, qui montrent une valeur élevée de concentration relative dans la majorité des tissus. Outre une spécificité hépatique étonnamment élevée, trois autres capsides (Var60, Var13 et Var63) présentaient une spécificité dans le diaphragme (Di), le muscle squelettique (SM), les biceps (BlC) et le cerveau (B). La branche droite du regroupement hiérarchique comprend les variantes de capside avec une efficacité de transduction globale inférieure, qui est prononcée dans le duodénum (Du) et le pancréas (P). L’ACP pour le sous-ensemble original forme le groupe de variantes de capside avec une spécificité hépatique élevée (Var 64, 78, 65, 55, 56) et décrit la capside Var60 avec un tropisme musculaire exceptionnel.

Figure 1 : Vue d’ensemble de la stratégie de clonage pour la bibliothèque d’affichage de peptides 7-mer aléatoires AAV2.
L’oligonucléotide avec la séquence aléatoire d’insertion peptidique 7-mer est flanqué de séquences qui contiennent le site de digestion BglI et un site de liaison pour la réaction d’amplification. Le vecteur pRep2Cap2_PIS contient des sites SfiI. Les surplombs générés par la digestion BglI et SflI sont complémentaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Contrôle de la qualité du bioanalyseur de la synthèse du second brin d’oligonucléotides.
La synthèse sur second brin d’oligonucléotides dégénérés est confirmée par analyse sur bioanalyseur. Les réactions de PCR avec trois, 10 et 30 cycles d’amplification sont comparées, montrant que les plus efficaces sont les trois cycles d’amplification. (A) Données du bioanalyseur représentées sous forme d’image de gel. (B-D) Longueurs de fragments tracées (en bp, axe x) par rapport aux unités de fluorescence (axe FU, y), par rapport aux pics standard, visibles à 15 et 1500 pb. Les flèches rouges indiquent des oligonucléotides double brin. Notez que la valeur FU la plus élevée, représentant la concentration d’ADN la plus élevée, des oligonucléotides double brin est observée après trois cycles d’amplification (flèches rouges). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Titrage d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV2 à l’aide de la dd-PCR.
(A) Détection de gouttelettes rép2-positives dans le canal 1 (FAM, canal 1) pour un contrôle de l’eau sans gabarit et un échantillon de virus dilué 1:10⁶ . (B) Détection de gouttelettes ITR-positives dans le canal 2 (HEX, canal 2). (C) Détection de gouttelettes positives à la fois pour rep2 et ITR (surlignées en orange). Les lignes violettes indiquent les seuils de détection des gouttelettes positives par rapport aux gouttelettes négatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Vue d’ensemble du fragment d’ADN utilisé pour NGS et paramètres pour l’analyse python.
La PCR NGS amplifie une région de 96 nucléotides. Le fragment PCR est utilisé pour générer la bibliothèque NGS. Pour l’analyse bioinformatique, les séquences de reconnaissance à droite et à gauche du site d’insertion doivent être données pour les deux brins, ainsi que la distance du début du fragment d’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Sélection itérative des bibliothèques AAV in vivo.
Les souris sont injectées avec la bibliothèque AAV. Les tissus ON et OFF cibles sont prélevés 1 semaine plus tard et soumis à un NGS et à une analyse. Le tissu ON-target est utilisé pour sauver le gène de la capside, qui est cloné dans le vecteur parent. La bibliothèque AAV sélectionnée est produite et utilisée pour répéter le cycle de sélection susmentionné. Cette figure a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Vue d’ensemble de la génération de la bibliothèque AAV à code-barres.
(A) Représentation graphique d’un génome AAV autocomplémentaire portant un transgène eyfp piloté par promoteur CMV flanqué de RTI. Le 3' UTR contient un code-barres (BC) de 15 nucléotides situés au 3' UTR entre l’eyfp et le signal de polyadénylation de l’hormone de croissance bovine (BGH). Le BC permet le traçage de la capside au niveau de l’ADN et de l’ARNm. (B) Au cours de la production d’AAV, un génome unique à code-barres est emballé par une seule variante du gène cap , ce qui facilite l’identification de la capside. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Titrage d’une bibliothèque AAV à code-barres à l’aide de la dd-PCR.
(A) Détection de gouttelettes YFP-positives dans le canal 1 (FAM, canal 1) pour un contrôle de l’eau non matrice et un échantillon vectoriel dilué 1:10⁶ . (B) Détection de gouttelettes ITR-positives dans le canal 2 (HEX, canal 2). (C) Détection de gouttelettes positives à la fois pour rep2 et ITR (surlignées en orange). Les lignes violettes indiquent les seuils de détection des gouttelettes positives par rapport aux gouttelettes négatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8: Vue d’ensemble du fragment d’ADN utilisé pour NGS et paramètres pour l’analyse Python.
La PCR NGS amplifie une région de 113 nucléotides. Pour l’analyse bioinformatique, les séquences de reconnaissance à droite et à gauche du code-barres doivent être données pour les deux brins, ainsi que la distance entre le début du fragment d’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Analyse en composantes principales (ACP) et analyse hiérarchique par grappes.
(A) L’ACP des valeurs de concentration relative pour 82 capsides dans tous les tissus permet de définir des groupes de variantes de capside ayant des propriétés similaires et des variantes avec des modèles de transduction uniques. (B) Afin de mieux séparer la grappe très peuplée, les enregistrements des variantes uniques périphériques ont été exclus de la matrice et l’analyse de l’ACP a été répétée. (C) L’analyse hiérarchique en grappes permet d’évaluer visuellement les profils de transduction variants à travers les tissus sous la forme d’un diagramme de carte thermique (Li = foie, Lu = poumon, FatB = graisse brune, H = cœur, Di = diaphragme, SM = muscle lisse, Du = duodénum, P = pancréas, C = côlon, BIC = biceps, O = ovaires, St = estomac, I = oreille interne, K = rein, Aa = aorte abdominale, At = aorte thoracique, B = cerveau, FatW = graisse blanche, et S = rate). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Échantillon	Cible	Copies/puits de 20 μL	Positifs	Ch1+ Ch2+	CF	copies corrigées	DF	VG/mL
H2O	rép2	28	2	0	0	0	1.00E+06	5.60E+09
AAV2lib	rép2	90600	16396	16266	0.99	89882	1.00E+06	1.80E+13
H2O	YFP	4	3	2	0.67	3	1.00E+06	8.00E+08
BCAAVlib	YFP	34680	13229	12452	0.94	32643	1.00E+06	6.53E+12

Tableau 1 : Résultats du titrage d’une bibliothèque d’affichage peptidique AAV2 (« AAV2lib ») et de la bibliothèque vectorielle EYFP à code-barres (« BCAAVlib »).

Discussion

Dans ce protocole, les étapes nécessaires à l’ingénierie de la capside AAV d’affichage peptidique et au criblage de bibliothèques AAV à code-barres, ainsi qu’à l’analyse bioinformatique de la composition de la bibliothèque et des performances de la capside, sont décrites. Ce protocole se concentre sur les étapes qui facilitent l’analyse bioinformatique de ces types de bibliothèques, car la plupart des laboratoires de virologie accusent un retard dans les compétences en programmation correspondant à leurs compétences en techniques de biologie moléculaire. Les deux types de bibliothèques ont été largement décrits dans la littérature, comme indiqué dans l’introduction, et peuvent être reproduits avec une relative facilité.

Dans un premier temps, la conception d’une bibliothèque d’affichage peptidique en position 588 dans la région variable VIII de AAV2 est décrite. Ce modèle (AAV2_Peptide(ii) dans la publication précédente 26) et la méthode de clonage décrite peuvent être facilement adaptés à d’autres sérotypes sur la base des informations fournies dans une publication récente²⁶. Une étape critique dans le pipeline de clonage est l’efficacité de la ligature / transformation (en utilisant le seuil ~1 x 10⁸ colonies). Il est recommandé d’ajouter une réaction de ligature avec seulement le vecteur. Cela aide à identifier le pourcentage de colonies bactériennes avec insert, qui devrait être supérieur à 80%. Une efficacité inférieure aux prévisions, c’est-à-dire un nombre de colonies bactériennes (calcul du pourcentage avec insert) inférieur à la diversité théorique des inserts d’oligonucléotides, aurait un impact négatif sur les variantes de faible abondance. Plusieurs améliorations comprennent des temps de digestion plus longs et des étapes de nettoyage pour la réaction de vecteur ou de ligature, à l’aide de kits commerciaux.

L’étape suivante est le contrôle de la qualité de la bibliothèque de variantes à l’aide de NGS d’un fragment de PCR qui englobe le site d’insertion des oligonucléotides. Le NGS est réalisé à l’aide d’un système de séquençage Illumina. Il existe plusieurs alternatives, dans lesquelles les produits PCR peuvent être soumis directement sans préparation préalable de la bibliothèque NGS. Ceci est plus approprié pour les expériences à petite échelle ou lorsqu’une profondeur de lecture élevée n’est pas requise. Le protocole rapporté ici comprend la préparation de la bibliothèque NGS, y compris l’ajout d’adaptateurs avec des index Illumina aux produits PCR, à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Une limitation commune en ce qui concerne le NGS est que ces fragments de PCR ont une faible diversité, car les séquences flanquant le site d’insertion à grande diversité sont identiques dans toutes les variantes, ce qui réduit l’efficacité du séquençage. Pour résoudre ce problème, ce kit ajoute un nombre quelconque de deux à huit nucléotides aléatoires entre le fragment de PCR et l’adaptateur. Alternativement, l’échantillon doit être enrichi avec PhiX. Le pipeline Python détaillé est décrit pour analyser les bibliothèques d’affichage de peptides AAV2. En tant que modèle, des fichiers d’exemple extraits du fichier NGS d’origine de la bibliothèque d’affichage de peptides AAV2 sont fournis. Cela peut être adapté à d’autres sérotypes avec les instructions données. Les fichiers de sortie de cette analyse peuvent être utilisés dans l’analyse en aval, telle que la comparaison du plasmide et de la bibliothèque AAV 30, la composition en acides aminés dans chaque position³⁰, le calcul du score d’enrichissement entre les bibliothèques après les tours de sélection 14, ou la génération de logos ou de graphiques de séquence ¹⁹. En ce qui concerne la bibliothèque d’entrée, la présence d’un pourcentage élevé de variantes uniques est souhaitée. Cependant, certaines variantes ne produisent pas aussi bien que d’autres, ce qui pourrait conduire à des distributions faussées après la production. Une faible diversité de variants, c’est-à-dire la présence de variantes dominantes, pourrait être attribuée à une faible qualité d’insertion d’oligonucléotides ou à un nombre élevé de cycles de synthèse de second brin (étape 1.2). En outre, la composition en acides aminés pourrait être affectée par la production. Chaque acide aminé doit avoir une fréquence de 5,00%. Si la distribution diffère grandement de cette valeur, il est suggéré d’effectuer la même analyse sur la bibliothèque plasmidique pour identifier les biais potentiels³⁰.

Comme les protocoles pour la génération de bibliothèques AAV et les cycles de sélection ultérieurs dans différents modèles animaux et in vitro ont été largement décrits dans de multiples publications et protocoles 27,30,31,32^, seule l’analyse des bibliothèques de codes-barres de variantes techniques et de repères sélectionnés est décrite ici. Il est à noter que le clonage de la bibliothèque après chaque cycle de sélection peut être effectué par isolement PCR du gène cap, comme mentionné dans les sections protocole et résultats. De vastes cycles de sélection et d’amplification par PCR peuvent conduire à l’accumulation de mutations ou de codons stop, qui peuvent être observés par NGS. Alternativement, des variantes enrichies peuvent être sélectionnées à partir des données NGS, et les oligonucléotides ordonnés et clonés de la façon dont ils ont été décrits pour la génération d’une bibliothèque d’affichage peptidique^16,18. Enfin, le protocole contient une brève description de la sélection des banques au niveau de l’ADN, 1 semaine après l’injection systémique. Les sélections basées sur l’ARN sont plus strictes, car elles sélectionnent également des variantes qui transitent par des voies d’entrée infectieuses, bien qu’elles soient techniquement plus difficiles. Il convient de noter que les sélections basées sur l’ARN ou les transgènes (c.-à-d. Cre) nécessitent une durée in vivo plus longue d’environ 3-4 semaines 15,16,17,18,19,33. Pour les sélections basées sur l’ADN en particulier, il est essentiel de valider les variantes sélectionnées par rapport aux sérotypes naturels et modifiés connus au niveau de l’ADN et de l’ARN à l’aide d’une bibliothèque AAV à code-barres.

La deuxième partie du protocole décrit la génération et le criblage de bibliothèques AAV à code-barres à l’aide du pipeline^{précédemment développé 24}. Chaque capside AAV dans le pool contient le même transgène (eyfp sous le contrôle d’un promoteur CMV) avec un code-barres distinct entre eyfp et le signal polyA. Les codes-barres utilisés dans cette bibliothèque se trouvent dans la publication précédente²⁴. La conception était basée sur le principe de base de la distance de Hamming (c’est-à-dire que les séquences de codes à barres doivent être suffisamment différentes), de sorte que les erreurs de séquençage ne conduisent pas à des affectations de codes à barres erronées. Comme décrit dans Lyons et al²⁶, le risque que deux erreurs se produisent dans les lectures entre 25 et 100 nucléotides est très faible. Une distance de Hamming de 4 signifie que deux erreurs de séquençage seraient nécessaires pour attribuer une lecture comme le mauvais code-barres. Les lectures avec une erreur seront ignorées lors de l’analyse et, dans ce cas, seront classées comme « lectures avec des variantes inconnues ». Dans une publication pertinente, des lignes directrices et un script Python sont fournis pour générer des codes-barres²⁹ qui peuvent être utilisés dans le pipeline. Pour l’identification des codes-barres utiles, un autre code correcteur d’erreur populaire peut être utilisé comme indiqué dans la publication de Buschmann et Bystrykh³⁴, à savoir la distance de Levenshtein. Ce groupe fournit également un progiciel pour le langage de programmation R³⁵.

Après la production d’AAV, la bibliothèque AAV à code-barres groupée peut être utilisée pour des études de biodistribution dans différents modèles. Cette étude décrit le pipeline en utilisant la bibliothèque de 82 variantes de la publication précédente²⁴ et fournit des exemples de données pour la pratique. Ce protocole peut également être adapté en fonction des besoins de chaque utilisateur. L’analyse de biodistribution est basée sur la collecte de différents tissus ou cellules ON- et OFF-target, l’extraction de l’ADN et de l’ARN à partir de ceux-ci, l’amplification PCR de la région du code-barres pour le séquençage NGS et la mesure de vg / dg au niveau de l’ADN. Pour l’ARN, il serait préférable de calculer le rapport au nombre de copies d’ARNm d’un gène de référence. Le gène de référence de choix doit être exprimé de manière similaire dans différents tissus 36, tels que RPP30 (ribonuclease P/MRP Subunit P30)³⁷ ou Hprt (hypoxanthine phosphoribosyltransférase 1)³⁶. Cependant, cela est ardu, de sorte que l’on peut avoir besoin d’utiliser plusieurs gènes de référence en même temps pour normaliser les données d’ARN. Pour cette raison, la normalisation à dg au niveau de l’ADN peut être complétée, ce qui correspond à peu près au nombre de cellules. Cela souligne également l’utilisation de la qPCR pour ce calcul, comme décrit précédemment²⁴, bien que la dd-PCR soit plus précise et soit donc préférée pour une utilisation future, en particulier compte tenu des progrès réalisés dans ce domaine³⁷. Enfin, les optimisations de base de la biologie moléculaire sont extrêmement critiques pour la méthodologie décrite ici. Les réactions PCR doivent être optimisées pour éviter d’introduire des biais dans la distribution des bibliothèques. Les sondes dd-PCR doivent être conçues pour inclure des régions introniques pour l’ADN et des régions inter-exoniques pour l’ARN. Les bonnes pratiques de laboratoire, telles que la compartimentation physique des étapes, en particulier la production d’ADN et d’AAV à partir de la préparation de la bibliothèque, et une désinfection appropriée sont d’une importance primordiale pour éviter une amplification erronée et des contaminations de bibliothèques.

Notamment, l’utilisation de bibliothèques d’affichage peptidiques et de codes à barres vectoriels ADN/ARN pour sélectionner des capsides modifiées avec de nouveaux tropismes ou d’autres propriétés cliniquement pertinentes ne représente que deux exemples de technologies d’évolution dirigée de la capside AAV. Ils ont tous en commun qu’ils viennent avec des limites et nécessitent une optimisation supplémentaire pour réaliser leur plein potentiel. Par exemple, la simple insertion d’un peptide laisse une grande partie (~99%) de la séquence de capside sous-jacente inchangée, dont les propriétés, y compris l’interaction avec les anticorps anti-AAV neutralisants, pourraient devoir être modifiées avant l’application humaine³⁸. En outre, la diversité réelle de l’affichage peptidique ou d’autres bibliothèques est généralement inférieure à la diversité théorique, en raison, par exemple, de limitations techniques lors du clonage ou de la transformation bactérienne³¹. En général, il y a aussi un débat actif sur la pertinence translationnelle de l’évolution dirigée dans des modèles animaux ou in vitro , favorisé par des preuves croissantes d’une performance possible spécifique à l’espèce ou même à la souche des capsides synthétiques^{AAV 38}. Néanmoins, il y a beaucoup d’espoir que bon nombre ou toutes ces limites seront surmontées et que l’arsenal actuel de technologies sera étendu à une plus grande variété de modèles de maladies et deviendra encore plus accessible à la plupart des groupes de recherche. À cet égard, un développement récent particulièrement encourageant est l’utilisation de bibliothèques AAV à code-barres telles que celles rapportées ici pour valider des capsides sélectionnées non seulement sur l’organe, mais maintenant aussi au niveau cellulaire, ce qui peut être réalisé avec de nouvelles technologies telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire (sc)³⁹. Les protocoles présentés ici faciliteront la mise en place plus large de techniques d’évolution AAV et accéléreront ainsi le développement de nouvelles capsides adaptées aux besoins d’une pléthore de groupes de recherche et de patients humains.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification primer	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	80204	DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	NGS Library preparation
BC-seq fw:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	ATCACTCTCGGCATGGACGAGC	NGS Library preparation
BC-seq rv:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	GGCTGGCAACTAGAAGGCACA	NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	44-420-3250ML	DNA/RNA extraction
BglI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0143	Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1851196	dd-PCR cycler
dNTPS	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	N0447S	NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863024	dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863005	dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864008	dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863051	dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863009	dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	12001925	dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells	Lucigen (Middleton, WI, USA)	60081-1	Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm	Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)	748050	Electroporation
GAPDH primer/probe mix	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Mm00186825_cn	Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1652660	Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)	4368814	cDNA reverse transcription
ITR_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	SY-415-1001	NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*	Roche AG (Basel, Switzerland)	KK2600 07958919001	NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	V8151	Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	ND-2000	Digestion of double-stranded insert
NGS_frw	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC	NGS primer
NGS_rev	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	CGC CTT GTG TGT TGA CAT C	NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	FC-404-2005	NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit	NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)	9092-256	NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814000	dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814040	dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F530S	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)	24765-1G	AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	NG2002	Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F549L	NGS Library preparation
Proteinase K	Roche AG (Basel, Switzerland)	5963117103	DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS			ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864002	dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864003	dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28306	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28704	Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	12162	Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28104	Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer	Invitrogen (Waltham, MA, USA)	Q32857	NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Q32851	NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix	Qiagen (Venlo, Netherlands)	1044234	Taqman qPCR
rep_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC	dd-PCR primer
rep_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CAATCACGGCGCACATGT	dd-PCR primer
rep_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1	dd-PCR probe
RNase-free DNase	Qiagen (Venlo, Netherlands)	79254	DNA/RNA extraction
SfiI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0123	Digestion of vector
5 mm, steel Beads	Qiagen (Venlo, Netherlands)	69989	DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	M0202L	Plasmid library ligation
TissueLyserLT	Qiagen (Venlo, Netherlands)	85600	DNA/RNA extraction
YFP_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GAGCGCACCATCTTCTTCAAG	dd-PCR primer
YFP_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	TGTCGCCCTCGAACTTCAC	dd-PCR primer
YFP_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1	dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)	Zymo research (Irvine, CA, USA)	D4013	Vector and Ligation purification