Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering af næste generations genterapivektorer gennem teknik, stregkodning og screening af adeno-associeret virus (AAV) capsidvarianter

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64389
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Infectious Diseases/Virology, Section Viral Vector Technologies, Medical Faculty, University of Heidelberg, 2BioQuant Center, BQ0030, University of Heidelberg, 3Cluster of Excellence CellNetworks, 4German Center for Infection Research (DZIF), 5German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

Generering af AAV-peptiddisplaybibliotek og efterfølgende validering gennem stregkode af kandidater med nye egenskaber til oprettelse af næste generations AAV'er.

Abstract

Genleveringsvektorer afledt af adenoassocieret virus (AAV) er et af de mest lovende værktøjer til behandling af genetiske sygdomme, hvilket fremgår af tilskyndelse til kliniske data og godkendelse af flere AAV-genterapier. To hovedårsager til AAV-vektorers succes er (i) den forudgående isolering af forskellige naturligt forekommende virale serotyper med forskellige egenskaber og (ii) den efterfølgende etablering af kraftfulde teknologier til deres molekylære teknik og genanvendelse i høj gennemstrømning. Yderligere styrkelse af potentialet i disse teknikker er nyligt implementerede strategier til stregkodning af udvalgte AAV-kapsider på DNA- og RNA-niveau, hvilket muliggør deres omfattende og parallelle in vivo-stratificering i alle større organer og celletyper i et enkelt dyr. Her præsenterer vi en grundlæggende pipeline, der omfatter dette sæt komplementære veje, ved hjælp af AAV-peptiddisplay til at repræsentere det mangfoldige arsenal af tilgængelige capsid-tekniske teknologier. Derfor beskriver vi først de afgørende trin for genereringen af et AAV-peptiddisplaybibliotek til in vivo-udvælgelse af kandidater med ønskede egenskaber, efterfulgt af en demonstration af, hvordan man stregkoder de mest interessante capsid-varianter til sekundær in vivo-screening. Dernæst eksemplificerer vi metoden til oprettelse af biblioteker til næste generations sekventering (NGS), herunder stregkodeforstærkning og adapterligering, inden vi slutter med en oversigt over de mest kritiske trin under NGS-dataanalyse. Da de protokoller, der rapporteres her, er alsidige og tilpasningsdygtige, kan forskere let udnytte dem til at berige de optimale AAV-capsidvarianter i deres foretrukne sygdomsmodel og til genterapiapplikationer.

Introduction

Genoverførselsterapi er introduktion af genetisk materiale i celler for at reparere, erstatte eller ændre det cellulære genetiske materiale for at forebygge, behandle, helbrede eller forbedre sygdom. Genoverførsel, både in vivo og ex vivo, er afhængig af forskellige leveringssystemer, ikke-virale og virale. Virus har udviklet sig naturligt til effektivt at transducere deres målceller og kan bruges som leveringsvektorer. Blandt de forskellige typer virale vektorer, der anvendes i genterapi, er adenoassocierede vira i stigende grad blevet anvendt på grund af deres manglende patogenicitet, sikkerhed, lave immunogenicitet og vigtigst af alt deres evne til at opretholde langsigtet, ikke-integrerende ekspression 1,2,3. AAV-genterapi har givet betydelige resultater i løbet af det sidste årti; tre behandlinger er blevet godkendt af Det Europæiske Lægemiddelagentur og US Food and Drug Administration til brug hos mennesker 3,4. Flere kliniske forsøg er også i gang til behandling af en række sygdomme, såsom hæmofili, muskel-, hjerte- og neurologiske sygdomme, som gennemgået andetsteds3. På trods af årtiers fremskridt har området for genterapi oplevet en række tilbageslag i de senere år4, vigtigst dødsfald i kliniske forsøg5, der er blevet sat i bero på grund af dosisbegrænsende toksiciteter, især for væv, der er massive, såsom muskler eller vanskelige at nå, såsom hjerne6.

AAV-vektorerne, der i øjeblikket anvendes i kliniske forsøg, tilhører de naturlige serotyper med nogle få undtagelser: 1. AAV-teknik giver mulighed for at udvikle vektorer med overlegen organ- eller cellespecificitet og effektivitet. I de sidste to årtier er flere tilgange blevet anvendt med succes, såsom peptidvisning, loop-swap, capsid-DNA-blanding, fejlbehæftet PCR og målrettet design til at generere individuelle AAV-varianter eller biblioteker deraf med forskellige egenskaber7. Disse udsættes derefter for flere runder af rettet evolution for at vælge varianterne i dem med de ønskede egenskaber, som gennemgået andetsteds 1,3. Af alle capsid-evolutionsstrategierne har peptiddisplay AAV-biblioteker været de mest anvendte på grund af nogle unikke egenskaber: de er relativt lette at generere, og de kan opnå høj mangfoldighed og high-throughput sekventering, hvilket gør det muligt at spore deres udvikling.

De første vellykkede AAV-biblioteker til peptidindsættelse blev beskrevet for næsten 20 år siden. I en af de første konstruerede Perabo et al.8 et bibliotek af modificerede AAV2-kapsider, hvor en pulje af tilfældigt genererede oligonukleotider blev indsat i et plasmid i en position, der svarer til aminosyre 587 af VP1-capsidproteinet i den tredobbelte akse, der stikker ud fra kapsiden. Ved hjælp af adenovirus-co-infektion blev AAV-biblioteket udviklet gennem flere udvælgelsesrunder, og de endelige re-målrettede varianter viste sig at være i stand til at transducere cellelinjer, der var ildfaste over for forældrenes AAV28. Kort tid efter introducerede Müller et al.9 totrinssystemet til biblioteksproduktion, en betydelig forbedring af protokollen. Indledningsvis bruges plasmidbiblioteket sammen med et adenoviralt hjælperplasmid til at producere et AAV-bibliotek, der indeholder kimære kapsider. Dette AAV-shuttlebibliotek bruges til at inficere celler ved lav infektionsmultiplicitet (MOI) med det formål at introducere et viralt genom pr. Celle. Co-infektion med adenovirus sikrer produktion af AAV'er med et matchende genom og kapsid9. Omkring et årti senere brugte Dalkara10 in vivo-styret evolution til at skabe 7m8-varianten. Denne variant har en 10 aminosyreindsættelse (LALGETTRPA), hvoraf tre fungerer som linkere, og effektivt retter sig mod den ydre nethinden efter intravitreal injektion10. Dette konstruerede capsid er en enestående succeshistorie, da det er en af de få konstruerede kapsider, der hidtil har nået klinikken11.

Feltet oplevede et andet løft med introduktionen af næste generations sekventeringsteknikker (NGS). To publikationer fra Adachi et al.12 i 2014 og fra Marsic et al.13 i 2015 viste NGS's magt til at spore distributionen af stregkodede AAV capsid-biblioteker med høj nøjagtighed. Et par år senere blev NGS af stregkodede regioner tilpasset peptidindsættelsesregionen for at følge kapsidudviklingen. Körbelin et al.14 udførte en NGS-guidet screening for at identificere et lungemålrettet AAV2-baseret kapsid. NGS-analysen hjalp med at beregne tre ratingscorer: berigelsesscoren mellem udvælgelsesrunder, den generelle specificitetsscore for at bestemme vævsspecificitet og endelig den kombinerede score14. Gradinaru lab15 offentliggjorde det Cre-rekombinationsbaserede AAV målrettede evolution (CREATE) system i samme år, hvilket letter en celletype-specifik udvælgelse. I dette system bærer capsidbiblioteket en Cre-invertibel switch, da polyA-signalet flankeres af to loxP-steder. AAV-biblioteket injiceres derefter i Cre-mus, hvor polyA-signalet kun inverteres i Cre+-celler, hvilket giver skabelonen til binding af en omvendt PCR-primer med den fremadgående primer i capsid-genet. Denne meget specifikke PCR-redning gjorde det muligt at identificere AAV-PHP. B-variant, der kan krydse blod-hjerne-barrieren15. Dette system blev videreudviklet til M-CREATE (Multiplexed-CREATE), hvor NGS og syntetisk biblioteksgenerering blev integreret i pipelinen16.

En forbedret RNA-baseret version af dette system fra Maguire lab17, iTransduce, tillader selektion på DNA-niveau af kapsider, der funktionelt transducerer celler og udtrykker deres genomer. Det virale genom i peptiddisplaybiblioteket omfatter et Cre-gen under kontrol af en allestedsnærværende promotor og capsid-genet under kontrol af p41-promotoren. Biblioteket injiceres i mus, der har en loxP-STOP-loxP-kassette opstrøms for tdTomato. Celler transduceret med AAV-varianter, der udtrykker det virale genom og derfor Cre udtrykker tdTomat og i kombination med cellemarkører kan sorteres og vælges17. Tilsvarende placerede Nonnenmacher et al.18 og Tabebordbar et al.19 capsid-genbiblioteket under kontrol af vævsspecifikke promotorer. Efter injektion i forskellige dyremodeller blev viralt RNA anvendt til at isolere kapsidvarianterne.

En alternativ tilgang er at bruge stregkoder til at mærke capsidbiblioteker. Björklund lab20 brugte denne tilgang til stregkodepeptidindsættelseskapsidbiblioteker og udviklede den stregkodede rationelle AAV-vektorevolution (BRAVE). I et plasmid klones Rep2Cap-kassetten ved siden af et inverteret terminalgentagelser (ITR) -flankeret, gult fluorescerende protein (YFP) -udtrykkende, stregkodemærket transgen. Ved hjælp af loxP-steder mellem enden af hætten og begyndelsen af stregkoden genererer en in vitro Cre-rekombination et fragment, der er lille nok til NGS, hvilket muliggør associering af peptidindsættelse med den unikke stregkode (opslagstabel, LUT). AAV-produktion udføres ved hjælp af plasmidbiblioteket, og stregkoderne udtrykt i mRNA'et screenes efter in vivo-applikation , igen med NGS20. Når capsidbibliotekerne omfatter varianter af hele capsid-genet (dvs. blandede biblioteker), skal der anvendes langlæst sekventering. Flere grupper har brugt stregkoder til at tagge disse forskellige biblioteker, hvilket muliggør NGS med højere læsedybde. Kay-laboratoriet21 mærkede meget forskellige capsid-blandede biblioteker med stregkoder nedstrøms for cap polyA-signalet. I et første trin blev der genereret et stregkodet plasmidbibliotek, og det blandede capsid-genbibliotek blev klonet ind i det. Derefter blev en kombination af MiSeq (kort læsning, højere læsedybde) og PacBio (lang læsning, lavere læsedybde) NGS samt Sanger-sekventering brugt til at generere deres LUT21. I 2019 afgrænsede Ogden og kolleger fra Kirkens laboratorium22 AAV2-kapsidegnetheden til flere funktioner ved hjælp af biblioteker, der havde enkeltpunktsmutationer, indsættelser og sletninger i hver position, hvilket i sidste ende muliggjorde maskinstyret design. Til generering af biblioteket blev mindre fragmenter af capsid-genet syntetiseret, mærket med en stregkode, næste generations sekventeret og derefter klonet ind i det fulde capsid-gen. NGS-dataene blev brugt til at generere en LUT. Biblioteket blev derefter screenet ved hjælp af kun stregkoder og kortlæsningsekventering, hvilket igen tillader højere læsedybde22.

Stregkodede biblioteker er overvejende blevet brugt til at screene en pulje af kendte, naturlige og konstruerede varianter efter flere runder med udvælgelse af capsidbiblioteker eller uafhængigt af en capsid-evolutionsundersøgelse. Fordelen ved sådanne biblioteker er muligheden for at screene flere kapsider, samtidig med at antallet af dyr reduceres og variationen mellem dyr minimeres. De første undersøgelser, der introducerede denne teknologi til AAV-feltet, blev offentliggjort for næsten et årti siden. Nakai lab 12 mærkede 191 dobbelte alaninmutanter, der dækker aminosyrerne 356 til 736 på VP1 fra AAV9 med et par 12-nukleotidstregkoder. Ved hjælp af NGS blev biblioteket screenet in vivo for galactosebinding og andre egenskaber12. Marsic og kolleger afgrænsede biodistributionen af AAV-varianter ved hjælp af også en dobbelt-barcorded analyse 1 år senere13. En nyere undersøgelse af ikke-menneskelige primater sammenlignede biofordelingen i centralnervesystemet af 29 kapsider ved hjælp af forskellige leveringsveje23. Vores laboratorium har for nylig offentliggjort stregkodede AAV-biblioteksskærme med 183 varianter, der omfattede naturlige og konstruerede AAV'er. Disse screeninger på DNA- og RNA-niveau førte til identifikation af en meget myotrop AAV-variant24 hos mus såvel som andre, der viste en høj celletypespecificitet i musehjernen25.

Her beskriver vi den metode, der anvendes i dette arbejde, og udvider den til at omfatte screening af AAV-peptiddisplaybiblioteker. Dette omfatter generering af AAV2-peptiddisplaybiblioteker, en digital dråbe-PCR (dd-PCR) metode til kvantificering og endelig en NGS-pipeline til analyse af AAV-varianterne, delvist baseret på Weinmanns og kollegers arbejde24. Endelig gives en beskrivelse af genereringen af stregkodede AAV-biblioteker og NGS-pipelinen, der anvendes i samme publikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. AAV2 tilfældig 7-mer peptid display bibliotek forberedelse

BEMÆRK: Til fremstilling af et AAV2 tilfældigt peptiddisplaybibliotek syntetiseres de degenererede oligonukleotider som enkeltstrenget DNA, konverteres til dobbeltstrenget DNA, fordøjes, ligeres til acceptorplasmidet og elektroporat.

  1. Design af degenererede oligonukleotider
    1. Bestil de degenererede oligonukleotider og undgå codonbias. I oligonukleotid 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3' svarer X01 til 20 kodoner, der hver koder for en af de 20 aminosyrer. W kan være A eller T, der producerer kodonerne AGA eller AGT, som koder for aminosyrerne arginin (R) eller serin (S).
    2. Bestil forstærkningsprimeren: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (se figur 1 for detaljer). Dette giver følgende proteinindsats: R/S G X7. Den teoretiske mangfoldighed beregnes som følger: 1 x 2 x 207 = 2, 56 x 109 unikke varianter.
      BEMÆRK: Det skal bemærkes, at denne mangfoldighed kan være begrænset af transformationseffektiviteten.
  2. Syntese af anden streng
    1. Begge oligonukleotider (degenererede oligonukleotider og amplifikationsprimer) resuspenderes til en slutkoncentration på 100 μM med TE-buffer.
      1. Til PCR-reaktionen indstilles en 50 μL reaktion med 1 μL af hver primer, 10 μL af bufferen, 1,5 μL DMSO, 0,5 μL dNTP'er (10 mM), 0,5 μL Hi-fidelity Hot Start Polymerase II og 35,5 μL nukleasefrit vand.
      2. Reaktionen overføres til en termocyklist og der gennemføres et præinkubationstrin i 10 s ved 98 °C, efterfulgt af tre cyklusser på 10 s ved 98 °C, 30 s ved 59 °C og 10 s ved 72 °C, derefter 5 minutter ved 72 °C og et sidste afkølingstrin.
    2. Rens reaktionen ved hjælp af et nukleotidfjernelsessæt og eluer i 100 μL nukleasefrit vand.
    3. Effektiviteten af andenstrengssyntesen bekræftes ved analyse på en bioanalysator (se figur 2). Størrelsen og renheden af den dobbeltstrengede indsats analyseres ved at indlæse 1 μL af reaktionen på en mikrofluidisk chip fra et DNA 1000-reagenssæt i henhold til producentens anvisninger. Dette sæt er optimeret til at måle størrelsen og koncentrationen af dobbeltstrengede DNA-fragmenter fra 25-1.000 bps.
  3. Fordøjelse af insert- og plasmidvektor
    1. 85 μL af det rensede skær fordøjes med 10 μL 10x buffer og 5 μL BglI enzym i et endeligt 100 μL reaktionsvolumen (se figur 1 for detaljer). Der inkuberes ved 37 °C natten over. Purify ved hjælp af et nukleotidfjernelsessæt, eluer i 50 μL nukleasefrit vand og kvantificer ved hjælp af typen "Oligo DNA" i et spektrofotometer.
    2. Der fordøjes 10 μg af et replikationskompetent AAV-plasmid (pRep2Cap2_)26 (ITR-flankeret viralt genom) med 20 μL 10x buffer og 10 μL SfiI-enzym i et endeligt 200 μL reaktionsvolumen (se figur 1 for detaljer). Der inkuberes ved 50 °C natten over. Rens vektoren på en 1% agarosegel ved hjælp af gelekstraktionssættet efterfulgt af et yderligere oprensningstrin ved hjælp af et DNA-rensningssæt. Kvantificer koncentrationen i et spektrofotometer.
  4. Ligering af insertet til vektor
    1. Ligate 955 ng plasmidvektor med 45 ng insert, med 2 μL buffer og 2 μL ligase i en 20 μL ligeringsreaktion. Der inkuberes ved 16 °C natten over, efterfulgt af 10 minutter ved 70 °C for at varmeinaktivere ligasen.
  5. Transformation, kompleksitetsberegning og plasmidbiblioteksforberedelse
    1. Rens reaktionen med et DNA-rensningssæt efter producentens anvisninger. Eluer reaktionen i ca. 80% af startvolumenet af nukleasefrit vand og opbevares på is til efterfølgende transformation.
    2. Transformér elektrokompetente celler: Optø et hætteglas med elektrokompetente celler på is i 10 minutter. Derefter tilsættes 1-2 μL af den rensede ligeringsreaktion til 30 μL (et hætteglas) elektrokompetente celler og blandes ved forsigtigt at banke. Derefter pipetteres cellen/DNA-blandingen forsigtigt til en forkølet elektroporationskuvette med 1 mm mellemrum uden at indføre luftbobler.
    3. Elektroporat ved hjælp af følgende indstillinger: 1800 V, 600 Ω og 10 μF. Inden for 10 s fra elektroporationspulsen tilsættes 970 μL forvarmet genvindingsmedie (forsynet med de elektrokompetente celler) til kuvetten og blandes ved pipettering. Til sidst overføres cellerne til et mikrocentrifugeglas og inkuberes i 1 time ved 37 °C ved 250 omdr./min. For at opnå en ønsket mangfoldighed skal du udføre 10-100 reaktioner, og efter inkubation samles alle reaktioner i et rør.
    4. Beregn mangfoldigheden ved at fortynde 10 μL af de poolede transformationer 10, 100 eller 1.000 gange i PBS og spred 100 μL på næringsagarplader indeholdende det passende antibiotikum (75 mg / ml ampicillin). Agarpladerne inkuberes natten over ved 37 °C, og kolonierne tælles derefter på agarpladerne.
    5. Beregn den teoretiske mangfoldighed som følger:
      Teoretisk maksimal diversitet = 10 x fortyndingsfaktor x antal kolonier x antal elektroporationsreaktioner.
      BEMÆRK: For at bekræfte bibliotekets kvalitet skal du sekvensere mindst 20 kolonier ved hjælp af Sanger-sekventering. De fleste kloner skal indeholde en indsats, og alle skal være unikke.
    6. 400-1.000 ml LB-substrat indeholdende det passende antibiotikum podes med resten af de poolede transformationer og inkuberes natten over ved 37 °C, 180 omdr./min.
  6. Fremstilling af plasmidbibliotek
    1. Fra kulturen natten over fremstilles en glycerolbestand (bland lige store mængder bakteriekultur og 50% glycerolopløsning i nukleasefrit vand og frys ved -80 °C) og rens plasmidbiblioteket ved hjælp af et plasmidmaxisæt.
  7. Produktion af AAV viralt bibliotek
    1. Forbered det virale bibliotek som tidligere beskrevet27. Transfekter plasmidbiblioteket (pRep2Cap2_PI, peptidindsats) sammen med et adenohjælperplasmid til HEK293T-celler ved anvendelse af et transfektionsreagens, såsom polyethylenimin (PEI).
    2. Saml cellerne efter 3 dage og udsæt dem for tre cyklusser af fryse-optøning. Rens det virale lysat ved hjælp af cæsiumchloridgradient ultracentrifugering efterfulgt af bufferudveksling til PBS, og koncentrer til sidst de virale partikler.
  8. AAV-vektortitrering ved hjælp af dd-PCR
    1. 2 μL af AAV-vektorstammen fortyndes serielt i 198 μL nukleasefrit vand for at opnå en slutfortynding på 1:106 . Bland grundigt hver gang med en 200 μL pipette. Tilføj ét kontrolelement uden skabelon (NTC) som et negativt kontrolelement.
      BEMÆRK: Yderligere lavere eller højere fortyndinger kan analyseres (1:105-1:107).
    2. Forbered en 20x primer-sondeblanding. Der tilsættes 3,6 μL af hver af de 100 μM-primere (fremadgående og bagud, Rep2 og ITR), 1 μL hver af de 100 μM dd-PCR-sonder (Rep2 og ITR) og 3,6 μL nukleasefrit vand til et 1,5 ml centrifugerør.
      BEMÆRK: AAV-biblioteket måles ved hjælp af et transgenmålrettet primersondesæt (Rep2) detekteret med en FAM-mærket sonde og et ITR-målrettet primersondesæt detekteret med en HEX-mærket sonde.
    3. Der fremstilles en 22 μL PCR-reaktion ved tilsætning af 5,5 μL prøve, 1,1 μL 20x primer-sondeblanding, 11 μL dd-PCR-superblanding til sonder (ingen dUTP) og 4,4 μL nukleasefrit vand. Dette giver koncentrationer på 900 nM og 250 nM for henholdsvis primerne og sonden.
    4. Generer dråberne ved hjælp af en dråbegenerator, overfør reaktionen til en plade med 96 brønde, læg pladen i en termocykler, og kør et denatureringstrin i 10 minutter ved 94 °C efterfulgt af 40 cyklusser på 30 s ved 94 °C og 1 min ved 58 °C. Derefter varmeinaktiveres polymerasen i 10 minutter ved 98 °C og tilsættes et sidste afkølingstrin. Læs reaktionerne i en dråbelæser og fortsæt til analysen28.
    5. Åbn den gemte dd-PCR-pladefil ved hjælp af analysesoftwaren. Brug tærskelværktøjet under fanen 1D-amplitude (fluorescensamplitude vs. hændelsesnummer) til at adskille de negative og positive dråber for hver kanal ved hjælp af NTC som vejledning og eksportere dataene til en csv-fil.
    6. For at beregne vektorkoncentrationen skal du først beregne korrektionsfaktoren CF ved hjælp af formlen:
      Equation 1
      CF bestemmer andelen af dråber, der er positive for transgenet [Positive], der er positive for både transgen og ITR [Ch1+ Ch2+], for at sikre påvisning af funktionelle vektorpartikler. Den endelige vektorkoncentration c kan nu beregnes ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 2
      DF er fortyndingsfaktoren (1:105-1:107 som bestemt tidligere). Kopierne pr. 20 μL/brøndreaktion svarer til 5 μL af den fortyndede prøve. Faktoren 1.000 korrigerer skalaen til VG/ml (viralt genom/ml). Et eksemplarisk titreringsresultat er vist i tabel 1 og figur 3.
  9. Analyse af AAV-virusbiblioteket af NGS
    1. Forstærkning af 96-nukleotidpeptidindsættelsesfragmentet ved at oprette en 20 μL PCR-reaktion ved hjælp af et korrekturlæsningspolymerasesæt (2x; se figur 4). Til reaktionen tilsættes 1 μL AAV-materiale indeholdende 1 x 108 vg, 0,5 μL af hver af 100 μM primer (NGS_forward og NGS_reverse) og 10 μL enzymblanding. Det endelige volumen indstilles til 20 μL med nukleasefrit vand.
    2. Reaktionen overføres til en termocyklist og udføres et denatureringstrin i 3 minutter ved 98 °C, efterfulgt af 30-35 cyklusser på 10 s ved 98 °C, 10 s ved 59 °C og 20 s ved 72 °C, efterfulgt af 5 minutter ved 72 °C og et sidste afkølingstrin.
    3. Rens prøverne ved hjælp af et PCR-rensningssæt. Kvantificer koncentrationen i et spektrofotometer og kør en 3% agarosegel for at verificere renhed og fragmentstørrelse.
    4. Behandl PCR-fragmenterne ved hjælp af bibliotekssystemet til prøvesæt med lav kompleksitet i henhold til producentens instruktioner til forberedelse af et NGS-bibliotek. Udfør slutreparationsreaktionen med 30 ng PCR-fragment efterfulgt af adaptorligering og PCR-amplifikation i 10 cyklusser. Brug PCR-rensningssættet til rensning af reaktionerne.
    5. Behandl de endelige produkter på en bioanalysator for at verificere størrelsen og renheden ved hjælp af et DNA-reagenssæt i henhold til producentens instruktioner.
    6. Kvantificer amplikonerne ved hjælp af et fluorometer og saml dem. Kvantificer det endelige samlede NGS-bibliotek igen på et fluorometer (i henhold til producentens anvisninger), og kontroller kvaliteten på en bioanalysator.
    7. Sekvensér NGS-bibliotekerne i en single-end (SE) tilstand ved hjælp af et 75-cyklus højt outputsæt med en læselængde på 84 og et indeks 1 på 8.
      BEMÆRK: Sekventering af eksemplerne i denne artikel blev udført på GeneCore-anlægget i EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
    8. Analyser NGS-sekventeringsdataene med Python 3 og biopython. Filerne kan findes på https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternativt på https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). NGS-analysen består af to trin.
      1. I det første trin skal du søge i sekvensfilerne efter sekvenser, der opfylder visse kriterier (tilstedeværelse af genkendelsessekvenser, der flankerer indsættelsesstedet) (se figur 4, trin 1.9.8.5.). Dette gøres ved hjælp af et script (Script # 1) og en konfigurationsfil, der giver de nødvendige oplysninger. Når den korrekte sekvens er identificeret, udtrækker og gemmer programmet sekvensen i outputfilen, som er en txt-fil med samme navn som sekventeringsfilen.
      2. Det andet trin er analysen af outputfilerne. Sekvenserne i biblioteket starter med et af seks nukleotider (AGWggc, W = A / T) i de ni aminosyreindsatser. Baseret på denne startsekvens oversættes peptidet. Dette genererer outputfilerne, der indeholder peptidvarianterne (PV'er).
      3. Forbered to mapper: Script og Data. Kopier de gzip-komprimerede filer, der er resultatet af sekventeringen, til mappen Data. Til scriptmappen skal du kopiere følgende filer, Python-fil: Script # 1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Python-fil: Script # 2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Konfigurationsfil: Barcode_Script_JoVE.conf; og LUT-fil (opslagstabel): Zuordnung.txt.
      4. Før du kører scripts, skal du redigere følgende filer i mappen Script. Åbn filen "Zuordnung.txt", og tilføj i to tabulatorseparerede kolonner navnene på gzip-filerne (kolonne 1) og det ønskede endelige navn (kolonne 2; tabulatorseparerede værdier).
        BEMÆRK: Eksempler på txt-filer findes i GitHub-mappen "PV_analysis_script". Filerne i GitHub-mappen er forberedt til analyse af tre eksempeldata fra ovenstående bibliotek: xaa.txt.gz, xab.txt.gz og xac.txt.gz. Outputfilerne leveres også.
      5. Skift følgende variabler i konfigurationsfilen "Barcode_Script_JoVE.conf":
        my_dir = "~/Data/"
        filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
        De sekvensspecifikke variabler: BCV_size = 27, BCVvenstre = TCCAGGGCCAG, BCVhøjre = GCCCAGG, BCVloc = 30, BCVmargin = 8, BCVleft_revcomp = GCCGCCTGGGC, BCVright_revcomp = CTGGCCC og BCVloc_revcomp = 41 (se figur 4 for detaljer).
      6. Brug følgende kommando til at kalde variantsekvensregistrering og -udtrækning:
        >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
        BEMÆRK: Outputtet er txt-filer med de ekstraherede DNA-sekvenser og deres antal læsninger. Overskriften på denne fil indeholder statistiske data (dvs. det samlede antal læsninger og de ekstraherede læsninger). Disse data overføres til de næste filer. Disse txt-data er inputfilerne til Script # 2, hvor DNA-sekvenserne oversættes, rangeres og analyseres.
      7. Udfør PV-ekstraktion og analyse ved hjælp af følgende kommando:
        >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analyser tekstoutputfilerne i Script # 2. Outputfilerne i Script # 2 navngives ved hjælp af den anden kolonne i LUT i "Zuordnung.txt" med udvidelser baseret på analysetypen.
        BEMÆRK: Sørg for, at de tre outputfiler indeholder statistiske data i de første rækker ("# af gyldige PV-læsninger", "# af ugyldige PV-læsninger" og "# af unikke PV-læsninger"), en første kolonne med indekset for hver DNA-sekvens fra input txt-filerne (output af script # 1) og følgende kolonner: (1) "... analyzed_all.csv": "Prøve:" (DNA-sekvens), "#" (antal læsninger), "Frw eller Rev" (fremadgående eller omvendt læsning) og "PV'er" (oversat peptidsekvens). De ugyldige sekvenser har "NA" og "not valid" i de sidste to kolonner. (2) "... analyzed_validSeq.csv": samme som den forrige fil, filtreret efter gyldige sekvenser. (3) "... analyzed_PV.csv": "PV'er" (oversat peptidsekvens), "#" (antal læsninger) og "antal" (frw- og rev-tællingerne i de foregående filer flettes, og antallet gives 1 eller 2).
      9. Visualiser outputfilerne ved hjælp af tilgængelig software baseret på brugerens behov.

2. AAV2 tilfældigt 7-mer peptid display bibliotek valg

  1. Brug AAV-biblioteket efter kvantificering og kvalitetskontrol (afsnit 1) til målrettet udvikling i en valgt model til iterativt at vælge kandidater med ønskede egenskaber (se figur 5)16,18,21.
    BEMÆRK: Disse kandidater bruges derefter til generering af et stregkodebibliotek som beskrevet nedenfor i afsnit 3.

3. Stregkodet AAV capsid bibliotek forberedelse og analyse

BEMÆRK: Efter identifikation af et sæt potentielt specifikke og effektive AAV-kapsider på peptidskærmen skal du kontrollere funktionaliteten af de identificerede peptidsekvenser og sammenligne dem med et sæt almindeligt anvendte eller velbeskrevne reference-AAV-capsidvarianter. For at gøre dette indsættes capsid-sekvensen i en Rep / Cap-hjælpekonstruktion uden ITR'er.

  1. Produktion af stregkodet AAV bibliotek
    1. Udfør rekombinant AAV-produktion for hver capsidvariant ved hjælp af tre-plasmidsystemet, som tidligere beskrevet24.
      BEMÆRK: For at skelne mellem de forskellige capsidvarianter har den ITR-flankeret reportertransgene plasmid en unik stregkode på 15 nukleotider i længden. Stregkoden er placeret ved 3' UTR (uoversat område) mellem det forbedrede gule fluorescerende protein (EYFP) og polyA-signalet (se figur 6A). EYFP-ekspression drives af en stærk allestedsnærværende cytomegalovirus (CMV) promotor, der giver tilstrækkelige niveauer af RNA-transkripter.
    2. Design stregkoder med 15 nukleotider i længden med homopolymerer på mindre end tre nukleotider, GC-indhold på <65%29 og en Hamming-afstand større end fire nukleotider24.
    3. Fremstil hvert kapsid separat i kombination med et transgenplasmid, der bærer en unik stregkode. På denne måde mærkes hver capsidvariant med en særskilt stregkode, der muliggør dens specifikke sporing (se figur 6B).
  2. AAV-vektortitrering ved hjælp af dd-PCR
    1. Udfør AAV-titreringen som tidligere beskrevet i afsnit 1.8 ved at udskifte Rep2-primerparret med YFP-primerparret.
    2. Kvantificer de enkelte AAV-produktioner, og saml lige store mængder af hver produktion for at generere det endelige stregkodebibliotek.
    3. Kvantificer det endelige bibliotek igen for at kontrollere den endelige koncentration og kvalitet (se figur 7).
  3. Stregkodet AAV-bibliotek in vivo-applikation
    1. Anvend det stregkodede AAV-bibliotek systematisk på det valgte modelsystem (f.eks. systemisk i mus24).
    2. Indsamle ON- og OFF-target væv (dvs. lever, lunge, hjerte, membran, glat muskel, tolvfingertarm, bugspytkirtel, tyktarm, biceps, æggestokke, mave, indre øre, nyre, abdominal aorta, thorax aorta, hjerne, brunt og hvidt fedt og milt) eller celletyper baseret på eksperimentet. De fryses ved -80 °C, ekstraherer DNA/RNA'et, og der anvendes NGS-kvantificeringsanalyse som beskrevet i næste afsnit.
  4. DNA/RNA-ekstraktion
    1. Uddrag DNA og RNA fra væv af interesse ved hjælp af DNA / RNA Mini Kit.
    2. Anbring et lille stykke af det pågældende væv (1 mm3, ca. 5 mg) i et 2 ml reaktionsrør.
    3. Der tilsættes 350 μL lysisbuffer blandet med β-mercaptoethanol (1%) og 5 mm stålperler til vævet (håndter prøver med β-mercaptoethanol under en stinkhætte).
    4. Homogeniser vævet i en tissueLyser i 45 s ved 40 Hz.
    5. Der tilsættes 10 μL proteinase K (10 mg/ml) og inkuberes i 15 minutter ved 55 °C under omrystning ved 400 omdr./min.
    6. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, supernatanten opsamles, og fremstillerens protokol for DNA/RNA-sættet fortsættes.
    7. Opdel vasketrinnet i to trin med 350 μL vaskebuffer i hvert trin. Mellem disse vasketrin fordøjes rest-DNA'et på søjlen med RNasefri DNase I. Der tilsættes 80 μL DNase I-opløsningen, fremstillet efter producentens anvisninger, på kolonnen og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
    8. Eluer RNA/DNA fra søjlen med nukleasefrit vand. Det isolerede RNA opbevares ved -80 °C og gDNA'et ved -20 °C.
  5. cDNA-syntese
    1. Udsæt RNA-prøverne for endnu en runde DNase I-behandling på 15-30 minutter (for fuldstændig fjernelse af kontaminerende DNA fra RNA-prøverne) før den omvendte transkriptionsreaktion. Der tilsættes 1 μL DNase I-opløsning, 4 μL buffer (forsynet med sættet) og nukleasefrit vand til et slutvolumen på 40 μL til 212 ng RNA. Inkuber i 30 min ved stuetemperatur og varme inaktiver ved 70 °C i 10 min.
    2. Syntetiser cDNA ved hjælp af 150 ng RNA ved hjælp af et sæt i henhold til producentens anvisninger. Inkluder kontroller uden revers transkriptase for at sikre fraværet af kontaminerende viralt DNA fra prøven. cDNA'et opbevares ved -20 °C.
      BEMÆRK: Mængden af input-RNA til optimal revers transkription kan variere afhængigt af vævstypen og den forventede transduktionseffektivitet i det respektive væv.
  6. Analyse af AAV viralt bibliotek (in-vivo) af NGS
    1. For at opnå høj sekventeringsdybde til lave omkostninger skal du udføre NGS via Illumina-sekventering som tidligere beskrevet (afsnit 1.9). Forstærk stregkodesekvensen, og juster derefter sekventeringsadapterne til ampliconen.
    2. På grund af den korte læselængde og ligeringen af sekventeringsadapterne på begge sider af amplikonen skal du ved design kontrollere, at amplikonen er tilstrækkelig lille til at sikre tilstedeværelsen af stregkodesekvensen i NGS-læsningen. Til sekventering af stregkoderne inden for de virale genomer og de virale transkripter er PCR-amplikonen designet til at være 113 bp lang (se figur 8).
    3. Forstærk det stregkodede område med primerne BC-seq fremad og BC-seq omvendt. Forbered følgende PCR-reaktion: 0,5 μL Hi-fidelity DNA-polymerase, 10 μL 5x buffer, 0,25 μL af hver 100 μM primer (BC-seq fw/BC-seq rv) og 1 μl 10 mM dNTP'er. Brug 25 ng af cDNA eller DNA / reaktion som skabelon og juster det endelige volumen til 50 μL med nukleasefrit vand.
    4. Forbered PCR-masterblandingen under en ren PCR-hætte for at undgå kontaminering. Brug følgende cykelbetingelser: 30 s ved 98 °C, efterfulgt af 40 cyklusser ved 98 °C i 10 s og 72 °C i 20 sekunder og et sidste trin på 5 minutter ved 72 °C.
    5. Inkluder PCR-kontroller for at bekræfte fraværet af kontaminerende DNA i PCR-masterblandingen. For cDNA-prøverne skal du inkludere kontrollerne uden revers transkriptase. Til sidst skal du medtage et eksempel med AAV-inputbiblioteket. Disse oplysninger vil blive brugt til at generere den Normalization_Variant.txt fil, der bruges i analysen.
    6. Kontroller størrelsen af PCR-fragmentet af hver prøve ved gelelektroforese før PCR-oprensning. Sidstnævnte opnås ved at anvende enten kommercielt tilgængelige magnetiske perler eller søjlebaserede DNA-rensningssystemer (se materialetabel).
    7. Forbered NGS-biblioteket ved hjælp af bibliotekssystemet til prøver med lav kompleksitet i henhold til producentens anvisninger, som tidligere beskrevet i afsnit 1.9.
    8. Bestem DNA-koncentrationen via dsDNA HS Kit, og analyser kvaliteten af biblioteket som tidligere beskrevet (afsnit 1.9.6), efterfulgt af pooling. Kvantificer det samlede bibliotek på et fluorometer og vurder kvaliteten på en bioanalysator.
    9. Udfør NGS-sekventering som beskrevet i afsnit 1.9.7.
    10. Kvantificer ved qPCR kopinummeret af transgenet (virale genomer) og husholdningsgenet for at vurdere fordelingen af det samlede bibliotek mellem væv eller organer på DNA'et.
    11. Opsæt en 30 μL qPCR-reaktion som følger for at bestemme kopinummeret af EYFP (transgen) og GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, husholdningsgen):
      1. Forbered en 60x primer/sondeblanding til EYFP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv og 0,6 μM YFP_probe; se materialetabel). Brug GAPDH primer / sondeblanding (se materialetabel) til at bestemme kopinummeret på husholderskegenet. Indstil reaktionen på is.
      2. Forbered en PCR-masterblanding (15 μL, se materialetabel) og tilsæt 60x primer/sondeblanding (0,5 μL) for alle prøver og standarder (for at beregne kopinumre for standarderne, brug følgende link: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Indstil reaktionen på is.
      3. Der overføres 15,5 μL af masterblandingen til en plade med 96 huller, og der tilsættes 14,5 μL prøve (75 ng total DNA-koncentration) eller standard til det respektive hul. Forsegl 96-brøndpladen med folie, hvirvel og drej kort.
      4. 10 μL af hver prøve overføres til en plade med 384 brønde i to eksemplarer. Pladen forsegles med folie og centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      5. Reaktionsblandingen inkuberes i en termocyklist ved hjælp af en starttemperatur på 50 °C i 2 minutter efterfulgt af et indledende aktiveringstrin på 10 minutter ved 95 °C. Udfør 40 cyklusser med denaturering ved 95 °C i 15 sekunder og udglødning/forlængelse ved 60 °C i 1 min24.
      6. For at opnå antallet af diploide genomer (dg) skal du bruge GAPDH-kopinummeret og dividere med to. Tag derefter værdien af EYFP-kopinummeret og divider med antallet af dg, hvilket resulterer i vektorgenomer pr. Diploid genom (vg / dg). Brug denne værdi til at generere Normalization_Organ.txt filen til bioinformatisk analyse.
    12. Udfør analysen af NGS-sekventeringsdata som Weinmann et al.24ved hjælp af brugerdefineret kode i Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Arbejdsprocessen omfatter detektion af stregkodesekvenser styret af flankerende sekvenser, deres længde og placering (Script # 1_BarcodeDetection.py) samt analyse af stregkodeberigelse og distribution over vævssættet (Script # 2_BarcodeAnalysis.py).
      1. Registrer stregkode, og tildel dem til AAV-varianter. Placer sekventeringsdataene som arkiverede fastq-filer i en mappe (f.eks. "Data_to_analyze"). Sekvenseringsdatafilen til inputbiblioteket er inkluderet i denne mappe og bruges kun til at beregne capsidproportionerne i inputbiblioteket.
      2. Før du udfører scriptet, skal du oprette to tabulatorseparerede tekstfiler: capsid-variantfilen (se eksempelfilen "Varianter.txt") med stregkodesekvenserne tildelt AAV-capsidvariantnavne og kontamineringsfilen (se "Forureninger.txt") med stregkodesekvenser, der kommer fra mulig kontaminering (andre stregkoder, der er tilgængelige i laboratoriet, hvilket bidrager til kontaminering).
      3. Til sidst skal du redigere konfigurationsfilen "Barcode_Script.conf" for at inkludere følgende oplysninger: sti til mappe med sekventeringsdata (f.eks. "Data_to_analyze"), sekvens af flankerende områder af stregkoderne, deres position og vinduesstørrelse til stregkodedetektion (svarende til 1.9.8.5, se figur 8).
      4. Brug følgende kommando til at kalde stregkoderegistrering med angivne stier til Script#1_BarcodeDetection.py og konfigurationsfiler:
        >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
        BEMÆRK: Outputtet af Script # 1_BarcodeDetection.py-udførelse er tekstfiler med læsetællinger pr. capsid-variant samt det samlede antal læsninger, der gendannes fra rådataene.
      5. Evaluer fordelingen af stregkodede AAV-kapsider blandt væv eller organer ved at udføre Script # 2_BarcodeAnalysis.py sammen med følgende txt-filer:
        1. I filen "Zuordnung.txt" skal du tildele navnet til hver txt-fil, der er opnået fra stregkodedetekteringen, til et vævs-/organnavn: navne på txt-filer i den første kolonne og tilsvarende vævs-/organnavne i tabulatorsepareret tildeling.
          BEMÆRK: For et eksempel, tjek i mappen "Eksempel" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Bemærk, at vævs-/organnavnet kan indeholde tegn, der definerer cDNA- eller gDNA-måling og biologisk replikat nummer (M1, M2 osv.).
        2. Opret en "organer.txt" tekstfil med listen over navne på ON- og OFF-target organer, som svarer til navnene i tildelingen "Zuordnung.txt" -filen (se "Eksempel" -mappen: https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
        3. Opret "Normalization_Organ.txt" og "Normalization_Variant.txt" tabulatorseparerede tekstfiler med normaliserede værdier for alle capsidvarianter og alle organer/væv. I den første kolonne i "Normalization_Organ.txt" -filen skal du skrive navnene på hvert organ (som i opgavefilen "Zuordnung.txt") og i anden kolonne normaliseringsværdierne for de tilsvarende væv, der genereres i afsnit 3.6.11.
        4. Udfyld den første kolonne i filen "Normalization_Variant.txt" med listen over capsidnavne og den anden kolonne med de normaliserede værdier for læsetællingerne for hvert kapsid i det samlede bibliotek (normalisering kan beregnes ud fra txt-outputfilen for inputbiblioteket som følge af det første script).
        5. Rediger konfigurationsfilen ved at angive de fulde stier til alle yderligere filer, der er nævnt ovenfor. Udfør script#2_BarcodeAnalysis.py som:
          >python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
          BEMÆRK: Stregkodeanalysescriptet udsender flere filer: tekstfiler med relative koncentrationsværdier (RC) for capsidfordeling i forskellige væv baseret på flere normaliseringstrin beskrevet tidligere og regnearksfilen, der kombinerer tekstfildata i flettede matrixdata. Sidstnævnte kan bruges til klyngeanalyse og visualisering.
        6. Visualiser dataene og udfør klyngeanalyse af matrixdataene for at skelne capsidegenskaber og evaluere deres ligheder baseret på RC-profiler på tværs af væv. Brug det ekstra script PCA_heatmap_plot. R placeret i depotet:
          >Rscript --vanilje ~/PCA. R ~/relativ koncentration.xls
          BEMÆRK: Scriptet tager relativkoncentrations.xls filer som input og genererer to plots af hierarkisk klyngevarmekort og hovedkomponentanalyse (PCA).
        7. For at ændre plots (heatmap-akser, hovedkomponenter i PCA) eller png-parametre (farve, størrelse, mærkning) skal du åbne R-scriptet og følge instruktionerne i de kommenterede afsnit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering af et AAV2-peptiddisplaybibliotek. Som et første skridt mod udvælgelsen af konstruerede AAV'er beskrives genereringen af et plasmidbibliotek. Peptidindsatsen fremstilles ved anvendelse af degenererede primere. At reducere kombinationen af kodoner i dem fra 64 til 20 har fordelene ved at eliminere stopkodoner og lette NGS-analyse ved at reducere biblioteksdiversiteten på DNA'et, men ikke proteinniveauet. Oligonukleotidindsatsen købes som enkeltstrenget DNA (figur 1), som omdannes til dobbeltstrenget DNA ved hjælp af en PCR-reaktion. Kvaliteten af denne reaktion styres i en bioanalysator. Som vist i figur 2 gav tre cyklusser et stærkere bånd sammenlignet med 10 eller 30 cyklusser. Indsatsen fordøjes derefter med BglI for at generere tre-nukleotidudhæng. Nukleotidet ved siden af overhængssekvensen af den dobbeltstrengede indsats kan være en A eller en T (W er tvetydighedskoden for A eller T), som er i den tredje position af et kodon, der koder for arginin (R) eller serin (S). Vektoren (pRep2Cap2_) har en frameshift-mutation i peptidindsættelsesstedet, der forhindrer produktion af kapsidet i fravær af en indsats på grund af oprettelsen af et stopkodon kort efter indsættelsesstedet. SfiI-fordøjelsen af dette plasmid genererer tre-nukleotidoverhæng, der matcher de overhæng, der genereres i den peptidkodende oligonukleotidindsats. Ligering skal udføres under optimale forhold for at maksimere kompleksiteten af plasmidbiblioteket. Til dette formål blev elektroporation udført ved anvendelse af kommercielt tilgængelige bakterier med høj effektivitet til transformationen.

Mangfoldigheden af plasmidbiblioteket beregnes ud fra koloniantallet, som typisk er omkring 1 x 108 for denne type bibliotek. Det samlede antal kolonier svarer til bibliotekets maksimale potentielle mangfoldighed ved NGS-analysen, som det diskuteres senere. Plasmidbiblioteket bruges derefter til at generere AAV-biblioteket, som ikke er beskrevet detaljeret her, men andetsteds27.

Kvantificeringen af dette bibliotek blev udført ved hjælp af dd-PCR. Typisk kvantificeres to regioner, AAV2 rep-genet inden for det virale genom og ITR (se figur 3 og tabel 1). Som vist i tabel 1 er 99,2% fra dråberne, der er positive for det virale genom, også positive for ITR (Ch1 + Ch2+), som er en kvalitetskontrol for AAV-biblioteket og antyder, at AAV-kapsiderne indeholder fulde virale genomer. For at opnå en koncentration i vg/ml beregnes andelen af dobbeltpositive dråber til positive dråber, som bruges til at få det korrekte antal kopier før forstærkning med fortyndingsfaktoren.

Kvaliteten af AAV-biblioteket vurderes derefter ved NGS-analyse, begyndende med en PCR ved hjælp af passende primere. Dernæst behandles PCR-produktet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit, der tilføjer indeksholdige adaptere til PCR-produktet. NGS-produkterne sekventeres, og filerne analyseres ved hjælp af Python. Der leveres tre prøvedata fra et AAV2-peptiddisplaybibliotek. Hver sekvens i Script # 1-inputfilen (liste over sekvenser af alle PCR-kopier af det amplificerede DNA-segment i prøven) søges bioinformatisk efterBCV venstre og BCVhøjre sekvenser eller BCVleft_comp og BCVright_comp sekvenser. Hvis en af kombinationerne identificeres, ekstraheres den indeholdte sekvens og føjes til outputfilen (se figur 4). Resultatet af begge scripts giver statistiske data vedrørende NGS-bibliotekets forberedelse. I alle tre sæt repræsenterede de udtrukne læsninger, baseret på signatursekvenser, der var specifikke for biblioteket, ca. 94% af de samlede læsninger, hvilket tyder på en god kvalitet. Outputtet af Script # 2 giver yderligere statistiske data, og oversættelsen af den ekstraherede DNA-sekvens giver yderligere kvalitetskontroldata. "# af ugyldige PV-læsninger" (dvs. sekvenser, der mangler de seks nukleotider, der bruges til at initiere in-silico-oversættelsen og kode rester RG eller SG) er mindre end 1% af de genvundne læsninger, hvilket bekræfter en god sekventeringskvalitet. Outputtene fra det andet script (dvs. oversættelsen og rangordningen af de ekstraherede DNA-sekvenser) giver yderligere information, såsom antallet af aflæsninger pr. peptidvariant eller antallet af DNA-sekvenser, der giver anledning til hver peptidvariant. Af filerne indeholder de, der ender på "analyzed_PVs", kun gyldige DNA-læsninger, og analysen udføres på peptidsekvensniveauet. Af de gyldige læsninger er mere end 99% unikke, hvilket tyder på, at biblioteket er afbalanceret, og den interne mangfoldighed er høj.

Valg af et AAV2-peptiddisplaybibliotek. Dette bibliotek kan derefter bruges til in vivo eller in vitro udvælgelse. Dette er ikke medtaget i denne protokol, men en oversigt findes i figur 5. Kort fortalt indsamles vævene 1 uge efter systemisk injektion af 1 x10 12 vg/mus til in vivo-selektion, og DNA isoleres. En rednings-PCR på et større fragment af cap-genet udføres, og produktet klones ind i plasmidvektoren ved hjælp af forskellige restriktionssteder, men en lignende protokol til det, der er beskrevet her, og runde 1 AAV-biblioteker fremstilles. Til NGS-analysen udføres PCR på det isolerede DNA eller AAV-bibliotekerne. Efter udvælgelsen falder procentdelen af unikke solceller i biblioteket typisk i henhold til udvælgelsestrykket. Afhængigt af projektet kan udvælgelsen afsluttes, når NGS har identificeret tilstrækkeligt mange dominerende solceller.

Stregkodet biblioteksvalg og analyse. Data fra et stregkodet AAV-bibliotek bestående af 82 kapsider er tidligere beskrevet24. dd-PCR-kvantificeringen af AAV-partiklerne (se figur 7 og tabel 1) viser, at 94% af de kapsider, der er positive for transgenet, også indeholder en ITR, der indikerer et komplet genom. Dette er lavere end vildtypebiblioteket beskrevet ovenfor, men antyder stadig en god kvalitet for rekombinante AAV'er, i betragtning af at de normalt pakker mindre effektivt. Efter injektion af det poolede bibliotek hos dyr opsamles vævene, og DNA og RNA isoleres. PCR for NGS samt NGS-biblioteksforberedelse og sekventering udføres derefter som beskrevet ovenfor og tidligere24. For at beregne vg / dg udføres qPCR, og i de leverede prøvedata varierer værdierne fra 0,1-4. Som det er typisk for systemisk AAV-levering, har leveren over 10 vg / dg.

Som en del af analyserørledningen udføres normaliseringstrin på forskellige niveauer. I det inputpuljede bibliotek er capsidvarianterne typisk ikke ligeligt repræsenteret. Derfor bruges NGS-analysen af inputbiblioteket til at generere en normaliseringsfil, som korrigerer forekomsten af hver capsidvariant i det endelige væv / organ baseret på overflod af denne capsidvariant i inputbiblioteket. Fordelingen af de samlede biblioteksmedlemmer af NGS udføres på DNA- og RNA-niveau. Denne normalisering for inputbiblioteket giver kvotienten (P*αβ) af proportionen i vævet/organet (P αβ) til andelen i inputbiblioteket (La). Disse beregninger findes i filen "variant_comparison.txt". Denne kvotient multipliceres derefter med vg/dg-værdierne fra filen "Normalization_organ.txt" for at opnå værdien Β αβ, og andelene af Βαβ-værdier beregnes for et enkelt væv eller for alle. Andelen af βαβ-værdien for hver variant inden for et væv (Vαβ) afspejler spredningen af denne variant i dette væv ("organ_comparison.txt"). I modsætning hertil indikerer andelen af Β αβ-værdien for hver variant i alle væv (Tαβ) spredningen af denne variant i hele kroppen ("relativeconcetrations.xls"). Disse to andele afspejler biofordelingen mellem væv og væv af hver variant. Alle disse filer kan bruges til forskellige visualiseringer af capsid effektivitet og specificitet24. Som et eksempel vises hovedkomponentanalysen og hierarkisk klyngedannelse ved hjælp af sluttabellen (fundet i "relativeconcetrations.xls") i figur 9.

Normaliseringen af det samlede bibliotek fra NGS-sekventeringen viser, at hvert kapsid har en gennemsnitlig andel på 0,012, hvilket også matcher den teoretiske andel af hver af de 82 kapsider og antyder et velafbalanceret poolet bibliotek på 0,012 (1/82). Filen "relativ koncentration.xls", der genereres af den bioinformatiske pipeline, afspejler den intervævskapsidbiofordeling, som illustreret i figur 9. Varmekortet viser relative koncentrationsværdier på en log2-skala for hvert kapsid i det samlede bibliotek hierarkisk grupperet i henhold til vævets biofordelingsprofil. Hovedkomponentanalysen gør det muligt at skelne klynger af AAV capsidvarianter med lignende biodistributionsegenskaber og fremhæver også de fjerntliggende kapsider med unikke mønstre for biodistribution mellem væv. De to hovedgrene af heatmap-hierarkiet afspejler forskellen i transduktionseffektiviteten af capsidvarianter. Den venstre gren med størstedelen af capsidvarianterne omfatter alle kapsiderne, som viser en høj værdi af relativ koncentration på tværs af størstedelen af vævene. Bortset fra slående høj leverspecificitet udviste tre andre kapsider (Var60, Var13 og Var63) specificitet i membranen (Di), skeletmuskulaturen (SM), biceps (BlC) og i hjernen (B). Den højre gren af den hierarkiske klyngedannelse omfatter kapsidvarianterne med samlet lavere transduktionseffektivitet, hvilket udtales i tolvfingertarmen (Du) og bugspytkirtlen (P). PCA for den oprindelige delmængde danner klyngen af capsidvarianter med høj leverspecificitet (Var 64, 78, 65, 55, 56) og skitserer Var60-kapsiden med fremragende muskeltropisme.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over kloningsstrategien for AAV2 tilfældigt 7-mer peptiddisplaybibliotek.
Oligonukleotidet med den tilfældige 7-mer peptidindsættelsessekvens flankeres af sekvenser, der indeholder BglI fordøjelsesstedet og et bindingssted for amplifikationsreaktionen. Vektoren indeholder pRep2Cap2_SfiI-websteder. De udhæng, der genereres af BglI og SflI fordøjelsen, er komplementære. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Bioanalysator kvalitetskontrol af oligonukleotid andenstrengssyntese.
Anden strengsyntese af degenererede oligonukleotider bekræftes ved analyse på en bioanalysator. PCR-reaktioner med tre, 10 og 30 amplifikationscyklusser sammenlignes, hvilket viser, at den mest effektive er de tre amplifikationscyklusser. (A) Bioanalysatordata repræsenteret som gelbillede. (B-D) Afbildede fragmentlængder (i bp, x-aksen) versus fluorescensenheder (FU, y-aksen) sammenlignet med standardtoppe, synlige ved 15 og 1500 bp. Røde pile angiver dobbeltstrengede oligonukleotider. Bemærk, at den højeste FU-værdi, der repræsenterer den højeste DNA-koncentration, af dobbeltstrengede oligonukleotider observeres efter tre amplifikationscyklusser (røde pile). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Titrering af et AAV2-peptiddisplaybibliotek ved hjælp af dd-PCR.
(A) Påvisning af rep2-positive dråber i kanal 1 (FAM, kanal 1) til en ikke-skabelon vandkontrol og en 1:106 fortyndet virusprøve. (B) Påvisning af ITR-positive dråber i kanal 2 (HEX, kanal 2). (C) Påvisning af dråber, der er positive for både rep2 og ITR (fremhævet med orange). Lilla linjer angiver tærskler til påvisning af positive versus negative dråber. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Oversigt over DNA-fragmentet, der anvendes til NGS, og indstillinger til pythonanalysen.
NGS PCR forstærker en 96-nukleotidregion. PCR-fragmentet bruges til at generere NGS-biblioteket. Til bioinformatisk analyse skal genkendelsessekvenser til højre og venstre for indsættelsesstedet angives for begge tråde samt afstanden fra begyndelsen af DNA-fragmentet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Iterativ udvælgelse af AAV-biblioteker in vivo.
Mus injiceres med AAV-biblioteket. Target ON- og OFF-væv indsamles 1 uge senere og underkastes NGS og analyse. ON-target-vævet bruges til at redde capsid-genet, som klones ind i modervektoren. Det valgte AAV-bibliotek produceres og bruges til at gentage den førnævnte valgcyklus. Denne figur blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Oversigt over generering af stregkodede AAV-biblioteker.
A) Grafisk gengivelse af et selvkomplementært AAV-gen, der bærer et CMV-promotordrevet eyfp-transgen flankeret af ITR'er. 3' UTR indeholder en 15 nukleotidlang stregkode (BC) placeret ved 3' UTR mellem eyfp og bovin væksthormon (BGH) polyadenyleringssignal. BC muliggør capsidsporing på DNA- og mRNA-niveau. (B) Under AAV-produktion pakkes et unikt stregkodet genom af en eneste variant af cap-genet, hvilket letter capsididentifikation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Titrering af et stregkodet AAV-bibliotek ved hjælp af dd-PCR.
(A) Påvisning af YFP-positive dråber i kanal 1 (FAM, kanal 1) til en ikke-skabelon vandkontrol og en 1:106 fortyndet vektorprøve. (B) Påvisning af ITR-positive dråber i kanal 2 (HEX, kanal 2). (C) Påvisning af dråber, der er positive for både rep2 og ITR (fremhævet med orange). Lilla linjer angiver tærskler til påvisning af positive versus negative dråber. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Oversigt over DNA-fragmentet anvendt til NGS og indstillinger for Python-analysen.
NGS PCR forstærker en 113-nukleotidregion. Til bioinformatisk analyse skal genkendelsessekvenser til højre og venstre for stregkoden gives for begge tråde samt afstanden fra begyndelsen af DNA-fragmentet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Principal component analysis (PCA) og hierarkisk klyngeanalyse.
(A) PCA med relative koncentrationsværdier for 82 kapsider på tværs af alle væv gør det muligt at definere klynger af capsidvarianter med lignende egenskaber og varianter med unikke transduktionsmønstre. (B) For bedre at adskille den stærkt befolkede klynge blev registreringerne af fjerntliggende unikke varianter udelukket fra matrixen, og PCA-analysen blev gentaget. (C) Hierarkisk klyngeanalyse gør det muligt visuelt at evaluere varianttransduktionsprofiler på tværs af væv som et varmekortplot (Li = lever, Lu = lunge, FatB = brunt fedt, H = hjerte, Di = membran, SM = glat muskel, Du = tolvfingertarmen, P = bugspytkirtlen, C = tyktarm, BIC = biceps, O = æggestokke, St = mave, I = indre øre, K = nyre, Aa = abdominal aorta, At = thorax aorta, B = hjerne, FatW = hvidt fedt og S = milt). Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøve Mål Kopier/20 μL brønd Positiver Ch1+ Ch2+ CF Kopier rettet DF VG/ml
H2O Rep2 28 2 0 0 0 1.00E+06 5.60E+09
AAV2lib Rep2 90600 16396 16266 0.99 89882 1.00E+06 1.80E+13
H2O YFP 4 3 2 0.67 3 1.00E+06 8.00E+08
BCAAVlib YFP 34680 13229 12452 0.94 32643 1.00E+06 6.53E+12

Tabel 1: Titreringsresultater af et AAV2-peptiddisplaybibliotek ("AAV2lib") og det stregkodede EYFP-vektorbibliotek ("BCAAVlib").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol er de trin, der er nødvendige for peptidvisning AAV capsid engineering og for stregkodet AAV bibliotek screening, samt for bioinformatisk analyse af bibliotekets sammensætning og capsid ydeevne, skitseres. Denne protokol fokuserer på de trin, der letter bioinformatisk analyse af disse typer biblioteker, fordi de fleste virologilaboratorier halter i programmeringsfærdigheder for at matche deres færdigheder i molekylærbiologiske teknikker. Begge typer biblioteker er blevet grundigt beskrevet i litteraturen, som skitseret i indledningen, og kan gengives relativt let.

Som et første skridt skitseres designet af et peptiddisplaybibliotek i position 588 i variabel region VIII i AAV2. Dette design (AAV2_Peptide ii) i tidligere publikation 26) og den beskrevne kloningsmetode kan let tilpasses andre serotyper på grundlag af oplysningerne i en nylig publikation26. Et kritisk trin i kloningsrørledningen er ligerings- / transformationseffektiviteten (ved hjælp af ~ 1 x 108 kolonier cut-off). Det anbefales at tilføje en ligationsreaktion med bare vektor. Dette hjælper med at identificere procentdelen af bakteriekolonier med indsats, som skal være højere end 80%. En lavere end forventet effektivitet, det vil sige et antal bakteriekolonier (beregning af procentdelen med insert), der er lavere end den teoretiske mangfoldighed af oligonukleotidindsatserne, ville påvirke varianter med lav overflod negativt. Flere forbedringer omfatter længere fordøjelsestider og oprydningstrin for vektor- eller ligeringsreaktionen ved hjælp af kommercielle sæt.

Det næste trin er kvalitetskontrol af variantbiblioteket ved hjælp af NGS af et PCR-fragment, der omfatter oligonukleotidindsættelsesstedet. NGS udføres ved hjælp af et Illumina-sekventeringssystem. Der er flere alternativer, hvor PCR-produkter kan indsendes direkte uden forudgående NGS-biblioteksforberedelse. Dette er mere velegnet til små eksperimenter, eller når der ikke kræves en høj læsedybde. Den protokol, der rapporteres her, omfatter NGS-biblioteksforberedelse, herunder tilføjelse af adaptere med Illumina-indekser til PCR-produkterne ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt. En almindelig begrænsning med hensyn til NGS er, at disse PCR-fragmenter har en lav mangfoldighed, fordi sekvenserne, der flankerer indsættelsesstedet med høj diversitet, er identiske i alle varianter, hvilket igen reducerer sekventeringseffektiviteten. For at løse dette tilføjer dette kit et vilkårligt antal to til otte tilfældige nukleotider mellem PCR-fragmentet og adapteren. Alternativt skal prøven spikes med PhiX. Den detaljerede Python-pipeline er beskrevet for at analysere AAV2-peptiddisplaybiblioteker. Som skabelon leveres eksempelfiler ekstraheret fra den originale NGS-fil i AAV2-peptiddisplaybiblioteket. Dette kan tilpasses andre serotyper med de givne instruktioner. Outputfilerne fra denne analyse kan bruges i downstream-analyse, såsom sammenligning af plasmid og AAV-bibliotek 30, aminosyresammensætning i hver position30, beregning af berigelsesscore mellem biblioteker efter udvælgelsesrunde 14 eller generering af sekvenslogoer eller grafer19. Hvad angår inputbiblioteket, ønskes tilstedeværelsen af en høj procentdel af unikke varianter. Nogle varianter producerer dog ikke så godt som andre, hvilket kan føre til skæve fordelinger efter produktion. En lav variantdiversitet, eller med andre ord tilstedeværelsen af dominerende varianter, kan tilskrives lav oligonukleotidindsatskvalitet eller et stort antal andenstrengssyntesecyklusser (trin 1.2). Desuden kan aminosyresammensætningen påvirkes af produktionen. Hver aminosyre skal have en frekvens på 5, 00%. Hvis fordelingen varierer meget fra denne værdi, foreslås det at udføre den samme analyse på plasmidbiblioteket for at identificere potentielle forstyrrelser30.

Da protokollerne for AAV-biblioteksgenerering og de efterfølgende selektionsrunder i forskellige dyre- og in vitro-modeller er blevet grundigt beskrevet i flere publikationer og protokoller 27,30,31,32, beskrives her kun analysen af stregkodebiblioteker af udvalgte konstruerede varianter og benchmarks. Bemærk, at bibliotekskloning efter hver udvælgelsesrunde kan udføres ved PCR-isolering af cap-genet, som nævnt i protokol- og resultatafsnittene. Omfattende udvælgelsesrunder og PCR-amplifikation kan føre til tilegnelse af mutationer eller stopkodoner, der kan observeres af NGS. Alternativt kan berigede varianter vælges fra NGS-dataene, og oligonukleotiderne bestilles og klones på den måde, det er blevet beskrevet til generering af et peptiddisplaybibliotek16,18. Endelig indeholder protokollen en kort beskrivelse for udvælgelsen af biblioteker på DNA-niveau, 1 uge efter systemisk injektion. RNA-baserede valg er strengere, da de også vælger varianter, der bevæger sig gennem infektiøse indgangsveje, omend er teknisk mere udfordrende. Det skal bemærkes, at RNA- eller transgenbaserede valg (dvs. Cre) kræver en længere in vivo-varighed på ca. 3-4 uger 15,16,17,18,19,33. Især for DNA-baserede selektioner er det afgørende at validere de udvalgte varianter mod kendte naturlige og konstruerede serotyper på både DNA- og RNA-niveau ved hjælp af et stregkodet AAV-bibliotek.

Den anden del af protokollen beskriver generering og screening af stregkodede AAV-biblioteker ved hjælp af den pipeline, der tidligere er udviklet24. Hvert AAV-kapsid i puljen indeholder det samme transgen (eyfp under kontrol af en CMV-promotor) med en tydelig stregkode mellem eyfp og polyA-signalet. De stregkoder, der anvendes i dette bibliotek, findes i den tidligere publikation24. Designet var baseret på det grundlæggende princip om Hamming-afstand (dvs. stregkodesekvenserne skal være tilstrækkeligt forskellige), så sekventeringsfejl ikke fører til fejlagtige stregkodetildelinger. Som beskrevet i Lyons et al26 er chancen for, at der opstår to fejl i læsninger mellem 25-100 nukleotider, meget lav. En Hamming-afstand på 4 betyder, at der kræves to sekventeringsfejl for at tildele en læsning som den forkerte stregkode. Læsninger med en fejl ignoreres under analysen og kategoriseres i dette tilfælde som "læser med ukendte varianter". I en relevant publikation gives retningslinjer og et Python-script til at generere stregkoder29 , der kan bruges i pipelinen. Til identifikation af nyttige stregkoder kan en anden populær fejlkorrigerende kode bruges som beskrevet i publikationen af Buschmann og Bystrykh34, nemlig Levenshtein-afstanden. Denne gruppe leverer også en softwarepakke til programmeringssproget R35.

Efter AAV-produktion kan det samlede stregkodede AAV-bibliotek bruges til biodistributionsstudier i forskellige modeller. Denne undersøgelse skitserer pipelinen ved hjælp af 82-variantbiblioteket fra den tidligere publikation24 og giver eksempeldata til praksis. Denne protokol kan også tilpasses ud fra hver brugers behov. Biodistributionsanalysen er baseret på indsamling af forskellige ON- og OFF-target væv eller celler, ekstraktion af DNA og RNA fra dem, PCR-amplifikation af stregkoderegionen til NGS-sekventering og måling af vg / dg på DNA-niveau. For RNA'et ville det være bedst at beregne forholdet til mRNA-kopinummeret for et referencegen. Det valgte referencegen bør udtrykkes på samme måde på tværs af forskellige væv 36, såsom RPP30 (ribonuklease P/MRP-underenhed P30)37 eller Hprt (hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1)36. Dette er dog vanskeligt, så man kan være nødt til at bruge flere referencegener på samme tid for at normalisere RNA-dataene. Af denne grund kan normaliseringen til dg på DNA-niveau afsluttes, hvilket korrelerer groft med antallet af celler. Dette påpeger også brugen af qPCR til denne beregning, som tidligere beskrevet24, selv om dd-PCR er mere præcis og derfor foretrækkes til fremtidig brug, navnlig i betragtning af fremskridtene på dette område37. Sidst men ikke mindst er grundlæggende molekylærbiologiske optimeringer ekstremt kritiske for den metode, der er beskrevet her. PCR-reaktionerne skal optimeres for at undgå at introducere bias i distributionen af bibliotekerne. dd-PCR-sonderne skal designes til at omfatte introniske regioner for DNA og inter-exoniske regioner for RNA. God laboratoriepraksis, såsom fysisk opdeling af trinene, især DNA- og AAV-produktion fra biblioteksforberedelse, og korrekt desinfektion er af afgørende betydning for at undgå fejlagtig amplifikation og biblioteksforurening.

Især repræsenterer brugen af peptiddisplaybiblioteker og vektor-DNA / RNA-stregkode til udvælgelse af konstruerede kapsider med nye tropismer eller andre klinisk relevante egenskaber kun to eksempler på rettede AAV capsid-evolutionsteknologier. De har alle det til fælles, at de kommer med begrænsninger og kræver yderligere optimering for at realisere deres fulde potentiale. For eksempel efterlader den blotte indsættelse af et peptid en stor andel (~ 99%) af den underliggende capsidsekvens uændret, hvis egenskaber, herunder interaktion med neutraliserende anti-AAV-antistoffer, muligvis skal ændres yderligere inden human anvendelse38. Desuden er den faktiske mangfoldighed af peptiddisplay eller andre biblioteker typisk lavere end den teoretiske, for eksempel på grund af tekniske begrænsninger under kloning eller bakteriel transformation31. Generelt er der også en aktiv debat om den translationelle relevans af rettet evolution i dyre- eller in vitro-modeller , fremmet af stigende beviser for en mulig arts- eller endda stammespecifik ydeevne af syntetiske AAV-kapsider38. Ikke desto mindre er der et stort håb om, at mange eller alle disse begrænsninger vil blive overvundet, og at det nuværende arsenal af teknologier vil blive udvidet til et endnu større udvalg af sygdomsmodeller og blive endnu mere tilgængeligt for de fleste forskergrupper. I denne henseende er en særlig opmuntrende nylig udvikling brugen af stregkodede AAV-biblioteker som dem, der er rapporteret her, til at validere udvalgte kapsider ikke længere kun på orgelet, men nu også på celleniveau, hvilket kan opnås med nye teknologier såsom enkeltcelle (sc) RNA-sekventering39. De protokoller, der præsenteres her, vil lette den bredere etablering af AAV-evolutionsteknikker og dermed fremskynde udviklingen af nye kapsider, der er skræddersyet til behovene hos en overflod af forskningsgrupper og menneskelige patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.G. er medstifter af AaviGen GmbH. D.G. og K.R. er opfindere på en verserende patentansøgning relateret til generering af immununddragende AAV capsidvarianter. Resten af forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

D.G. sætter stor pris på støtte fra German Research Foundation (DFG) gennem DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) og TRR179 (Projektnummer 272983813) samt fra det tyske center for infektionsforskning (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplification primer ELLA Biotech (Munich, Germany) - Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit  Qiagen (Venlo, Netherlands) 80204 DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 5067-1504 NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) G2938C NGS Library preparation
BC-seq fw:  IDT (San Joce, CA, CA, USA) ATCACTCTCGGCATGGACGAGC  NGS Library preparation
BC-seq rv:   IDT (San Joce, CA, CA, USA) GGCTGGCAACTAGAAGGCACA  NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) 44-420-3250ML DNA/RNA extraction
BglI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0143 Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1851196 dd-PCR cycler
dNTPS  New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) N0447S NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863024 dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863005 dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864008 dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863051 dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1863009 dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 12001925 dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells Lucigen (Middleton, WI, USA) 60081-1 Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) 748050 Electroporation
GAPDH primer/probe mix Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Mm00186825_cn Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1652660 Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) 4368814 cDNA reverse transcription
ITR_fw IDT (San Joce, CA, USA) GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_rv IDT (San Joce, CA, USA) CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR primer
ITR_probe IDT (San Joce, CA, USA) HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system Illumina Inc (San Diego, CA, USA) SY-415-1001 NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* Roche AG (Basel, Switzerland) KK2600 07958919001 NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device Promega GmbH (Madison, WI, USA) V8151 Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) ND-2000 Digestion of double-stranded insert
NGS_frw Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC NGS primer
NGS_rev Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) CGC CTT GTG TGT TGA CAT C NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina Inc (San Diego, CA, USA) FC-404-2005 NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit  NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) 9092-256 NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer  Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814000 dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1814040 dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F530S Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) 24765-1G AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System Promega GmbH (Madison, WI, USA) NG2002 Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase  Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) F549L NGS Library preparation
Proteinase K Roche AG (Basel, Switzerland) 5963117103 DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab 
QX200 Droplet Generator Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864002 dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader Bio-Rad (Hercules, CA, USA) 1864003 dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28306 Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28704 Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 12162 Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 28104 Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer Invitrogen (Waltham, MA, USA) Q32857 NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) Q32851 NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix Qiagen (Venlo, Netherlands) 1044234 Taqman qPCR
rep_fw IDT (San Joce, CA, USA) AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC dd-PCR primer
rep_rv IDT (San Joce, CA, USA) CAATCACGGCGCACATGT dd-PCR primer
rep_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 dd-PCR probe
RNase-free DNase Qiagen (Venlo, Netherlands) 79254 DNA/RNA extraction
SfiI New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) R0123 Digestion of vector
5 mm, steel Beads Qiagen (Venlo, Netherlands) 69989 DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides ELLA Biotech (Munich, Germany) - Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) M0202L Plasmid library ligation
TissueLyserLT Qiagen (Venlo, Netherlands) 85600 DNA/RNA extraction
YFP_fw IDT (San Joce, CA, USA) GAGCGCACCATCTTCTTCAAG dd-PCR primer
YFP_rv IDT (San Joce, CA, USA) TGTCGCCCTCGAACTTCAC dd-PCR primer
YFP_probe IDT (San Joce, CA, USA) FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) Zymo research (Irvine, CA, USA) D4013 Vector and Ligation purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
  3. Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
  6. Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).
  7. Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756 (2022).
  8. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
  9. Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
  10. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
  11. Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
  12. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075 (2014).
  13. Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041 (2015).
  14. Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
  15. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  16. Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
  17. Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
  18. Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
  19. Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
  20. Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
  21. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
  22. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
  23. Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
  24. Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).
  25. Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
  26. Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  27. Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).
  28. Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
  29. Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).
  30. Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
  31. Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
  32. Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
  33. Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
  34. Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).
  35. Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
  36. Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).
  37. Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
  38. Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
  39. Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).

Tags

Bioengineering udgave 188 AAV AAV biblioteker capsid engineering genterapi high-throughput screening NGS stregkodede biblioteker
Isolering af næste generations genterapivektorer gennem teknik, stregkodning og screening af adeno-associeret virus (AAV) capsidvarianter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rapti, K., Maiakovska, O., Becker,… More

Rapti, K., Maiakovska, O., Becker, J., Szumska, J., Zayas, M., Bubeck, F., Liu, J., Gerstmann, E., Krämer, C., Wiedtke, E., Grimm, D. Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants. J. Vis. Exp. (188), e64389, doi:10.3791/64389 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter