Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Karakterisering av en patogen Escherichia coli-stam härledd från Oreochromis spp. Gårdar som använder helgenomsekvensering

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

Genomförbarheten av strategier för helgenomsekvensering (WGS) med hjälp av bänkinstrument har förenklat genomförhöret av varje mikrob av folkhälsorelevans i en laboratoriemiljö. En metodologisk anpassning av arbetsflödet för bakteriell WGS beskrivs och en bioinformatisk pipeline för analys presenteras också.

Abstract

Vattenbruk är en av de snabbast växande livsmedelsproducerande sektorerna i världen och odling av tilapia (Oreochromis spp.) utgör den största sötvattensfisksorten som odlas. Eftersom vattenbruksmetoder är mottagliga för mikrobiell kontaminering som härrör från antropogena källor behövs omfattande användning av antibiotika, vilket leder till att vattenbrukssystem blir en viktig källa till antibiotikaresistenta och patogena bakterier av klinisk relevans, såsom Escherichia coli (E. coli). Här belystes den antimikrobiella resistensen, virulensen och mobilomegenskaperna hos en patogen E. coli-stam , som återhämtats från inlandsodlad Oreochromis spp., genom helgenomsekvensering (WGS) och i silicoanalys . Antimikrobiell resistensbestämning (AST) och WGS utfördes. Dessutom bestämdes fylogenetisk grupp, serotyp, multilocus sequence typing (MLST), förvärvad antimikrobiell resistens, virulens, plasmid och prophageinnehåll med hjälp av olika tillgängliga webbverktyg. E. coli-isolatet uppvisade endast mellanliggande mottaglighet för ampicillin och karakteriserades som ONT: H21-B1-ST40-stam genom WGS-baserad typning . Även om endast en enda antimikrobiell resistensrelaterad gen detekterades [mdf(A)], identifierades flera virulensassocierade gener (VAG) från den atypiska enteropatogena E. coli (aEPEC) patotypen. Dessutom detekterades lasten av plasmidrepliker från stora plasmidgrupper och 18 prophage-associerade regioner. Sammanfattningsvis möjliggör WGS-karakteriseringen av ett aEPEC-isolat, återhämtat från en fiskodling i Sinaloa, Mexiko, insikter om dess patogena potential och den möjliga risken för människors hälsa att konsumera råa vattenbruksprodukter. Det är nödvändigt att utnyttja nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) för att studera miljömikroorganismer och att anta en hälsoram för att lära sig hur hälsoproblem uppstår.

Introduction

Vattenbruk är en av de snabbast växande livsmedelsproducerande sektorerna i världen, och dess produktionsmetoder är avsedda att tillgodose den ökande efterfrågan på livsmedel för mänsklig konsumtion. Den globala vattenbruksproduktionen har tredubblats från 34 miljoner ton (Mt) 1997 till 112 miljoner ton 20171. De viktigaste artgrupperna, som bidrog till nästan 75% av produktionen, var tång, karpar, musslor, havskatt och tilapia (Oreochromis spp.) 1. Uppkomsten av sjukdomar som orsakas av mikrobiella enheter är dock oundviklig på grund av intensiv fiskodling, vilket leder till potentiella ekonomiska förluster2.

Antibiotikaanvändning i fiskodlingsmetoder är välkänd för att förebygga och behandla bakterieinfektioner, den viktigaste begränsande faktorn i produktivitet 3,4. Icke desto mindre ackumuleras kvarvarande antibiotika i vattenbrukssediment och vatten, utövar selektivt tryck och modifierar de fiskassocierade och de bosatta bakteriesamhällena 5,6,7,8. Följaktligen fungerar vattenbruksmiljön som en reservoar för gener för antimikrobiell resistens (ARG) och ytterligare uppkomst och spridning av antibiotikaresistenta bakterier (ARB) i den omgivande miljön9. Förutom de bakteriella patogener som vanligtvis observeras som påverkar fiskodlingsmetoder påträffas ofta medlemmar av familjen Enterobacteriaceae, inklusive mänskliga patogenstammar av Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., och Salmonella spp.10. E. coli är den vanligaste mikroorganismen isolerad från fiskmjöl och vatten i fiskodling 11,12,13,14,15.

E. coli är en mångsidig gramnegativ bakterie som bor i mag-tarmkanalen hos däggdjur och fåglar som en kommensal medlem av deras tarmmikrobiota. E. coli har dock en mycket anpassningsförmåga att kolonisera och kvarstå i olika miljönischer, inklusive jord, sediment, mat och vatten16. På grund av genförstärkningen och förlusten genom det horisontella genöverföringsfenomenet (HGT) har E. coli snabbt utvecklats till en väl anpassad antibiotikaresistent patogen som kan orsaka ett brett spektrum av sjukdomar hos människor och djur17,18. Baserat på isoleringens ursprung definieras patogena varianter som tarmpatogena E. coli (InPEC) eller extra-intestinala patogena E. coli (ExPEC). Dessutom är InPEC och ExPEC indelade i väldefinierade patotyper beroende på sjukdomsmanifestation, genetisk bakgrund, fenotypiska egenskaper och virulensfaktorer (VF)16,17,19.

Traditionell odling och molekylära tekniker för patogena E. coli-stammar har möjliggjort snabb upptäckt och identifiering av olika patotyper. De kan dock vara tidskrävande, mödosamma och kräver ofta hög teknisk utbildning19. Dessutom kan ingen enskild metod användas för att på ett tillförlitligt sätt studera alla patogena varianter av E. coli på grund av komplexiteten i deras genetiska bakgrund. För närvarande har dessa nackdelar övervunnits med tillkomsten av HTS-teknik (high-throughput sequencing). Helgenomsekvensering (WGS) och bioinformatiska verktyg har förbättrat utforskningen av mikrobiellt DNA överkomligt och i stor skala, vilket underlättar den djupgående karakteriseringen av mikrober i en enda körning, inklusive närbesläktade patogena varianter20,21,22. Beroende på de biologiska frågorna kan flera bioinformatiska verktyg, algoritmer och databaser användas för att utföra dataanalys. Till exempel, om huvudmålet är att bedöma förekomsten av ARGs, VFs och plasmider, kan verktyg som ResFinder, VirulenceFinder och PlasmidFinder, tillsammans med deras tillhörande databaser, vara en bra utgångspunkt. Carriço et al.22 gav en detaljerad översikt över de olika bioinformatikprogrammen och relaterade databaser som används för mikrobiell WGS-analys, från förbehandling av rådata till fylogenetisk inferens.

Flera studier har visat den breda nyttan av WGS för genomförhör angående antimikrobiella resistensattribut, patogen potential och spårning av framväxten och evolutionära relationer mellan kliniskt relevanta varianter av E. coli som kommer från olika ursprung23,24,25,26 . WGS har gjort det möjligt att identifiera molekylära mekanismer som ligger till grund för den fenotypiska resistensen mot antimikrobiella medel, inklusive de sällsynta eller komplexa resistensmekanismerna. Detta genom att detektera förvärvade ARG-varianter, nya mutationer i läkemedelsmålgener eller promotorregioner27,28. Dessutom erbjuder WGS potential att härleda antimikrobiella resistensprofiler utan att kräva förkunskaper om resistensfenotypen hos en bakteriestam29. Alternativt har WGS tillåtit karakterisering av de mobila genetiska elementen (MGE) som bär både antimikrobiell resistens och virulensegenskaper, vilket har drivit bakteriegenomutvecklingen av befintliga patogener. Till exempel resulterade tillämpningen av WGS under undersökningen av det tyska E. coli-utbrottet 2011 i att avslöja de unika genomiska egenskaperna hos en till synes ny E. coli-patotyp; Intressant nog härstammar dessa utbrottsstammar från den enteroaggregerande E. coli (EAEC) -gruppen, som förvärvade prophaget som kodar för Shiga-toxinet från den enterohemorragiska E. coli (EHEC) patotypen30.

Detta arbete presenterar en metodologisk anpassning av arbetsflödet för bakteriell WGS med hjälp av en bänksekvenserare. Dessutom tillhandahålls en bioinformatikpipeline med hjälp av webbaserade verktyg för att analysera de resulterande sekvenserna och ytterligare stödja forskare med begränsad eller ingen bioinformatisk expertis. De beskrivna metoderna gjorde det möjligt att belysa antimikrobiell resistens, virulens och mobilomegenskaper hos en patogen E. coli-stam ACM5, isolerad 2011 från inlandsbrukad Oreochromis spp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: E. coli-stammen ACM5 återvanns genom bearbetning och odling av fiskprovet för fekal koliform (FC) bestämning12. Under fiskprovtagningen visade fisken inga kliniska tecken på sjukdom, bakteriell eller svampinfektion, och en medeltemperatur på 22,3 °C rådde. Efter isolering utsattes E . coli-isolatet för biokemisk testning och kryokonserverades i hjärnhjärtinfusionsbuljong (BHI) med DMSO (8% v / v) som kryoskyddande medel.

1. Återaktivering av fryst E. coli ACM5-lagerkultur

  1. Från det frysta bakteriebeståndet, öppna röret och använd en steril slinga, pipettspets eller tandpetare för att skrapa ytan på den frysta bakteriekulturen.
  2. Stryk bakterierna på en Luria-Bertani (LB) agarplatta och inkubera vid 37 ± 2 °C i 24 timmar.

2. Bestämning av antibakteriell mottaglighet

OBS: Den antimikrobiella känslighetstestning som beskrivs här motsvarar diskdiffusionsmetoden baserad på riktlinjerna från Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli ATCC 25922-stam krävs för kvalitetskontrolländamål.

  1. Ympberedning med kolonisuspensionsmetod
    1. Från LB-plattan som inkuberas i steg 1.2, stryk en eller två kolonier på en Mueller-Hinton (MH) agarplatta och inkubera vid 37 ± 2 °C i 18-24 timmar.
    2. Använd en steril slinga för att plocka två eller tre kolonier från det nyligen subodlade E. coli-isolatet på MH-agarplattan och återsuspendera dem i 3 ml steril MH-buljong eller 0,85% (w / v) saltlösning, blanda noggrant genom virvel för att få en enhetlig bakteriesuspension.
    3. Använd en UV-synlig spektrofotometer (se materialtabell) och justera bakteriesuspensionen till grumlighet jämförbar med en 0,5 MacFarland-standard (motsvarande cirka 1-2 x 108 celler/ml). Om bakteriesuspensionen är för lätt eller för tung, tillsätt mer E. coli-kolonier eller MH-buljong efter behov. Använd den beredda inokulum inom 15 minuter efter beredningen.
  2. Inokulering av testagarplattorna
    1. Doppa en steril bomullspinne i den justerade bakteriesuspensionen. Vrid pinnen flera gånger och tryck den ordentligt på rörets innervägg för att ta bort överskott av vätska från pinnen.
    2. Inokulera en MH-agarplatta genom att stryka pinnen 3x över hela agarytan och rotera plattan 60 ° varje gång. Svabba också kanten på agar för att säkerställa en jämn fördelning av inokulumet.
    3. Låt petriskålslocket stå på glänt i 3-5 min så att fukten avdunstar.
  3. Applicering av den antimikrobiella skivan på inokulerade agarplattor
    1. Fördela jämnt och tryck ner varje antimikrobiell skiva (se materialförteckning) på ytan av de inokulerade agarplattorna för att säkerställa fullständig kontakt. Vänd upp och ned på plattorna inom 15 minuter efter applicering på skivan och inkubera vid 35 ± 2 °C i 16–18 timmar.
      OBS: Högst 12 och sex skivor får användas i petriskålar på 150 mm respektive 100 mm.
  4. Efter inkubation mäter du zonen för hämningsstorlekar med hjälp av ett Vernier-bromsok och tolkar de resulterande diametrarna enligt CLSI-brytpunktskriterierna (M100 - tabell 2A)32.

3. Extraktion och kvantifiering av genomiskt DNA (gDNA)

  1. Genomisk DNA-extraktion
    1. Återupphäng en slinga av nyodlade E. coli-kolonier i 5 ml LB-buljong och inkubera över natten i en skakinkubator (180 rpm) vid 37 ± 2 °C.
    2. Centrifugera bakteriesuspensionen vid 3 500 x g i 5 min och kassera försiktigt supernatanten.
    3. Extrahera gDNA enligt riktlinjerna för DNA-extraktionssats (se materialförteckning).
    4. Kontrollera gDNA:s renhet genom att mäta optisk densitet vid 260/280 nm (förhållande: >1,8) och 260/230 nm (förhållande: 2,0-2,2) med hjälp av en UV-synlig spektrofotometer. Utför 0,8% agarosgelelektrofores för att verifiera gDNA-integriteten.
  2. Genomisk DNA-kvantifiering
    OBS: Använd endast tunnväggiga, klara, 0,5 ml PCR-rör som godkänts av tillverkaren av fluorescensanalyssatsen (se materialtabell).
    1. Ställ in önskat antal rör för prover och analysstandarder. Förbered arbetsanalyslösningen genom att blanda komponent A och komponent B som tillhandahålls i satsen, enligt tillverkarens riktlinjer.
    2. Förbered analysstandarderna genom att tillsätta 190 μl av arbetslösningen och 10 μl av varje standard till lämpligt rör (två standarder krävs).
    3. Tillsätt 198 μl av arbetslösningen och 2 μl av DNA-provet till lämpligt rör. Blanda kraftigt genom att virvla alla rör i 5 s. Var försiktig så att du inte skapar bubblor.
    4. Inkubera alla rör i 2 minuter vid rumstemperatur, skyddade mot ljus. Mät fluorescensen för alla rör baserat på tillverkarens riktlinjer med hjälp av fluorometern (se materialförteckning).
    5. Justera gDNA-provkoncentrationen ordentligt för sekvenseringsförfarande.

4. Förberedelse av DNA-bibliotek

OBS: DNA-biblioteksberedning och sekvensering utfördes enligt tillverkarens riktlinjer och protokoll (se materialförteckning). Start-gDNA-koncentrationen är 4,0 ng.

  1. Tagmentation, PCR-förstärkning och indexering
    1. I ett 0,2 ml rör, tillsätt 2,5 μL tagmentationsbuffert och 2 μL ingående gDNA (2,0 ng/μl). Blanda försiktigt genom pipettering.
    2. Tillsätt 1 μl förstärkningsbuffert och blanda försiktigt genom pipettering. Snurra ner vid 280 x g i 1 min vid rumstemperatur.
    3. Placera proverna i en termocykler (se materialtabell) och kör följande PCR-program: 55 °C i 5 minuter och håll sedan vid 10 °C. När proverna når 10 °C, fortsätt omedelbart för att neutralisera reaktionen.
    4. Tillsätt 1 μl neutraliserande buffert till provrören och blanda försiktigt genom pipettering. Snurra ner vid 280 x g i 1 min och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
    5. Tillsätt 1,7 μL av varje indexadapter (dvs. indexen i7 och i5) och 3 μL av indexerings-PCR-mastermixen. Blanda försiktigt genom pipettering. Snurra ner vid 280 x g i 1 min vid rumstemperatur.
    6. Placera proverna i termocyklerna och utför en andra PCR-reaktion enligt följande: 72 °C i 3 minuter, 95 °C i 30 s, 18 cykler med 95 °C i 10 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, 72 °C i 5 minuter och håll vid 10 °C.
  2. Förstärkt biblioteksrensning
    1. Blanda genom att virvla den kommersiella magnetiska pärllösningen (se materialförteckning) baserat på tillverkarens riktlinjer.
    2. Överför det tagmenterade/indexerade gDNA-provet till ett nytt 1,5 ml rör och tillsätt 0,6 μL magnetiska pärlor för varje μL av den slutliga volymen av gDNA-provet (≈13 μL). Blanda försiktigt genom pipettering och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
    3. Placera provrören på ett magnetiskt ställ (se materialtabell) i 2 minuter tills supernatanten har rensats. Ta bort och kassera supernatanten försiktigt utan att störa pärlorna.
    4. Tillsätt 200 μl nyberedd 80% etanol utan blandning. Inkubera i 30 s tills eluatet rensas och försiktigt ta bort och kassera supernatanten utan att störa pärlorna.
    5. Utför ett andra tvättsteg. Tillsätt 200 μl 80% etanol till pärlorna och inkubera i 30 s. När eluatet har rensats, ta bort och kassera supernatanten och lufttorka pärlorna i 10 minuter.
    6. Tillsätt 15 μl 10 mM trisbuffert (pH 8) till pärlorna och blanda försiktigt genom pipettering. Inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur. Placera provrören igen på magnetstället i 2 minuter, så att supernatanten kan rensas.
    7. Överför försiktigt 14 μl av supernatanten från provröret till ett nytt 0,2 ml rör. Detta är det rensade biblioteket.
      OBS: Vid denna tidpunkt kan det rensade biblioteket lagras vid -20 ° C i upp till 7 dagar.
  3. Normalisering av bibliotek
    1. Fortsätt att kvantifiera de rensade biblioteken genom fluorescensanalys enligt beskrivningen i steg 3.2, med undantag för steg 3.2.5.
    2. Visualisera de rensade biblioteken på en 1% agarosgelelektrofores för att bestämma de genomsnittliga fragmentstorlekarna.
    3. Beräkna bibliotekets molaritetsvärde med hjälp av följande ekvation:
      Equation 1
    4. Använd molaritetsvärdet för att beräkna de korrekta volymerna av resuspensionsbuffert (RSB) och rensade bibliotek för att späda ut det enskilda biblioteket vid en startkoncentration på 10 nM.

5. Bibliotekspoolning, denaturalisering och sekvensering

  1. Tina reagenspatronen enligt tillverkarens anvisningar. Extrahera flödescellen från kylskåpet (4 °C) och bringa den till rumstemperatur före sekvensering.
  2. Pool 5 μL av varje normaliserat bibliotek (10 nM) till ett lågbindande 1,5 ml rör. Späd det poolade biblioteket vid 4 nM med rätt volym RSB.
  3. Tillsätt 5 μL av det poolade biblioteket (4 nM) och 5 μL 0,2 N NaOH i ett nytt 1,5 ml rör. Blanda kort genom att virvla, snurra ner vid 280 x g i 1 min och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur för att denaturera det poolade biblioteket i enstaka strängar.
  4. Blanda försiktigt 10 μl denaturerat poolat bibliotek och 990 μl prechilled hybridiseringsbuffert genom pipettering och lägg på is tills den slutliga utspädningen för sequencerbelastning utförs. Koncentrationen av det denaturerade poolade biblioteket är 20 pM.
  5. Tina och förbered ett kontrollbibliotek (se materialförteckning) i en koncentration av 4 nM genom att blanda 2 μl kontrollbibliotek (10 nM) och 3 μl nukleasfritt vatten.
  6. Blanda 5 μl av kontrollbiblioteket (4 nM) och 5 μl nyberedd 0,2 N NaOH. Blanda kort genom virvel, snurra ner vid 280 x g i 1 min och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur för att denaturera kontrollbiblioteket till enstaka strängar.
  7. Blanda försiktigt 10 μl denaturerat kontrollbibliotek och 990 μl prekylerad hybridiseringsbuffert genom pipettering och lägg på is tills den slutliga utspädningen för sequencerbelastning är klar. Koncentrationen av det denaturerade kontrollbiblioteket är 20 pM.
  8. I ett nytt lågbindande 1,5 ml rör, kombinera 594 μL av det denaturerade poolade biblioteket vid 20 pM och 6 μL av det denaturerade kontrollbiblioteket vid 20 pM. Blanda ordentligt.
  9. Späd den slutliga biblioteksblandningen (20 pM) till en slutlig belastningskoncentration på 1,2 pM i en volym av 600 μl med hjälp av den förkylda hybridiseringsbufferten.
  10. Innan du laddar den slutliga biblioteksblandningen på reagenspatronen, utför en ytterligare termisk förbehandling för att uppnå effektiv belastning i flödescellen. Inkubera den slutliga biblioteksblandningen i 2 minuter vid 96 °C. Vänd röret för att blanda och lägg röret på is i 5 minuter.
  11. Ladda 500 μl av den slutliga biblioteksblandningen i den designade behållaren på reagenspatronen. Initiera sekvensering enligt riktlinjerna. Ladda flödescellen och reagenspatronen och ställ in sekvenseringskörningen.

6. Analys av sekvensdata

OBS: Kontrollera tilläggsfil 1 för ytterligare beskrivning av den allmänna WGS-dataförbehandlingen, programvara, parameterinställningar och sekvensanalys av E. coli-genomet.

  1. Anslut till sekvenseringsdataservern och ladda ner FASTQ-filerna.
  2. Utvärdera den ursprungliga kvaliteten på råsekvensdata med programvara från tredje part. Ta bort återstående adaptersekvenser, baser av låg kvalitet (tilläggsfil 1).
  3. Sätt ihop de kvalitetskontrollerade sekvenseringsdata till contig- eller ställningsnivå med hjälp av programvara från tredje part (se tilläggsfil 1).
  4. Utför genomanteckning genom att skicka FASTA-filen som innehåller det sammansatta genomet till RAST-servern (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Ladda upp FASTA-filen till webbplattformarna Center for Genome Epidemiology (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) och ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) för att identifiera epidemiologiska funktioner, ARGs, VAG och plasmider (se kompletterande fil 1).
  6. Ladda upp FASTA-filen till PHASTER-servern för att identifiera prophagesekvenser (https://phaster.ca/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den antimikrobiella mottagligheten bestämdes av diskdiffusionsmetoden och tolkades av CLSI-brytpunktskriterier för 12 antibiotika som spänner över sex distinkta antimikrobiella klasser, det vill säga aminoglykosider, β-laktamer, fluorokinoloner, nitrofuraner, fenikol och folatvägsantagonister. E. coli ACM5 uppvisade känslighet för alla antibiotika utom ett β-laktamläkemedel. Fyra β-laktamläkemedel testades: ampicillin, karbenicillin, cefalothin och cefotaxim. Bland dessa mättes en 14 mm hämningshalo för ampicillin. Därför, enligt CLSI-tolkningskategorierna för ampicillin (mottaglig: ≥17 mm; mellanliggande: 14-16 mm; resistent: ≤13 mm) 32, visar E. coli ACM5 en mellanliggande mottaglighet för ampicillin.

E. coli ACM5 utsattes för WGS med hjälp av bänkskivans sequencer. Därför framställdes, multiplexerades och sekvenserades DNA-provet enligt det beskrivna protokollet. Sammantaget gav sekvenseringskörningen med mid-output-konfiguration 3,37 Gb data med en felfrekvens på 0,73% och 89,71% av baserna fick en kvalitet över Q3033. Särskilt genererade sekvenseringen av E. coli ACM5 totalt 1 490 594 parade ändläsningar (PE). Råsekvensdata från denna studie deponerades i databasen sequence read archive (SRA) vid national center for biotechnology information (NCBI) under BioProject-nummer PRJNA715781.

Efter den första kvalitetskontrollen och filtreringen sparades 96,8% av läsningarna från råsekvenseringsdata och monterades i byggnadsställningar med ett täckningsdjup på 38x. Genomsammansättningen på ställningsnivå genererade 83 ställningar (>300 bp), 5 272 433 bp i längd och med 50,61% GC-innehåll. Genomannotering avslöjade 5 633 kodade funktioner, varav 5 524 är proteinkodande gener (CDS) och 109 är RNA-relaterade sekvenser (figur 1). Dessutom grupperade genomannotering CDS i samlingar av funktionellt relaterade proteiner som kallas delsystem, särskilt de som spelar funktionella roller i kolhydrater, proteiner, aminosyror och derivatmetabolismer och membrantransport (Figur 2).

I silico förutspådde typning E. coli ACM5 som en O-icke-typbar (ONT) stam tilldelad ONT: H21-serotypen. Dessutom visade det att det tillhör fylogruppen B1 och sekvenstypen (ST) 40. En enda förvärvad antimikrobiell resistensdeterminant som kodar för en multidrug efflux-pump med brett spektrum identifierades, det vill säga mdf(A) -genen (figur 1).

När det gäller virulensegenskaper presenterades flera VAG: er i E. coli-genomet som studeras, inklusive gener som kodar för ett värmestabilt enterotoxin (astA), ett serumresistensprotein (iss) och typ III-sekretionssystemet (T3SS) tillsammans med dess utsöndrade effektorproteiner (Figur 1). Den buntbildande pili (BFP) operon och perABC-genklustret bevisades inte. Följaktligen, enligt den förutsagda virulensprofilen, tilldelades E. coli ACM5 till aEPEC-patotypen.

WGS-analys avslöjade också två förmodade stora plasmider som tillhör olika inkompatibilitetsgrupper (Inc) i E. coli-genomet (dvs. IncF- och IncI-plasmidgrupperna). Båda saknade dock ARG och VAG. Dessutom identifierades 18 prophage-associerade regioner; Till skillnad från plasmider hyser dessa emellertid VAG, inklusive iss-genen , sitABCD-operonen som kodar för en järn/ mangantransportör och några T3SS-effektorproteiner (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Cirkulär karta över utkastet till genom av E. coli ACM5. Data från de yttersta till de innersta cirklarna deklareras och färgas enligt följande. Cirkel 1: Genomstorleksskala i baspar. Cirklar 2 och 3: Kommenterade CDS-skivor transkriberade på den främre (blå) respektive bakåt (röda) DNA-strängen. Cirklar 4 och 5: Ribosomala RNA (svart) respektive överförings-RNA (grön). Cirkel 6: 83 byggnadsställningar av draggenomet (grått). Cirkel 7: Kommenterade egenskaper: antimikrobiella resistensdeterminanter (röda), virulensassocierade gener (lila) och prophageregioner (vatten). Cirkel 8: %GC-innehåll (svart). Cirkel 9: GC-skevhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Delsystemsfördelning av aEPEC-stammen ACM5. Analysen baseras på RAST SEED-anteckning. Cirkeldiagrammet organiserar delsystemen efter cellulär process, och de proteinkodande generna som är involverade i respektive cellulär process indikeras inom parentes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1. Beskrivning av WGS-dataförbehandling, programvara, parameterinställningar och sekvensanalys av E. coli ACM5-genomet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna studie presenterar en anpassning av det bakteriella WGS-arbetsflödet med hjälp av en bänksekvenserare och en pipeline för genomisk karakterisering av en patogen E. coli-variant. Beroende på vilken sekvenseringsplattform som används kan handläggningstiderna (TATs) för våta laboratorieprocedurer (bakterieodling, gDNA-extraktion, biblioteksberedning och sekvensering) och sekvensanalys variera, särskilt om långsamt växande bakterier studeras. Efter protokollet för WGS som beskrivs ovan var TAT inom 4 dagar, vilket är jämförbart med vad litteraturen för närvarande säger (<5 dagar) 34.

Det teoretiska täckningsdjupet för genomsekvensering av E. coli ACM5 beräknades vid 30x. Ändå genererade sekvenseringen empiriska data för genommonteringen på 38x djup. Som tidigare rekommenderats35 var detta tillräckligt för att få en hel genomrepresentation och följa nedströms dataanalys avseende antimikrobiell resistens, virulens och mobilomegenskaper hos E. coli ACM5. Med respekt för antimikrobiell resistens undersöktes endast de förvärvade determinanterna. E. coli ACM5 är ett ampicillinresistent isolat, men endast MdfA-multidrug efflux-pumpen som kodar för genen observerades. Detta ger emellertid inte resistens mot β-laktamer36, och ingen annan förvärvad determinant som är involverad i β-laktamresistens identifierades. Därför är det troligt att en kombination av andra molekylära mekanismer, såsom minskad cellmembranpermeabilitet och ökat uttryck av distinkta effluxpumpsystem, ligger bakom den observerade ampicillinresistensen37.

När det gäller virulensegenskaper är den enda närvaron av den intiminkodande genen (eae) den karakteristiska genetiska markören för aEPEC-stammar. AEPEC-patotypen är en delmängd av tarmpatogen E. coli-stam som bär locus of enterocyte effacement (LEE) patogenicitetsö, där en T3SS och associerade effektor/ translokatorproteiner kodas, inklusive Cif, EspA / B / D, EspF, intimin och den translokerade intiminreceptorn (Tir). Samspelet mellan T3SS och dess effektorer är direkt involverat i förmågan att främja de fästande och utsvävande (A / E) lesionerna på tarmepitelceller av typiska enteropatogena E. coli (EPEC) och EHEC, båda patotyper som kallas mänskliga livsmedelsburna sjukdomsframkallande medel17,19. AstA-genen kodar för ett värmebeständigt enterotoxin som heter EAST1, och även om det först erkändes och associerades med EAEC-stammar, är EAST1-toxinet brett fördelat bland E. coli-patotyper38. Här visade WGS att E. coli ACM5 har astA-genen, och trots att EAST1-producerande E. coli-isolat har associerats med diarrésjukdom hos människor och djur, är dess patogena roll för att framkalla diarré fortfarande kontroversiell39.

Den viktigaste begränsningen i detta metodologiska tillvägagångssätt bör erkännas. Den ursprungliga sammansättningen på contig-nivå resulterade i ett fragmenterat utkast till genom och utsattes därför ytterligare för byggnadsställningar mot ett närmare referensgenom. Den implementerade sekvenseringskonfigurationen av läslängd (2 x 150 bp) och närvaron av stora, repetitiva element i hela genomet av E. coli är de mest förmodade förklaringarna till den fragmenterade contig-nivåenheten. Kortlästa datauppsättningar kan inte lösa korrekt och rekonstruerar därför stora repetitiva element, vilket orsakar potentiella felsammansättningar och flera brytpunkter under monteringsprocessen. Därför skulle implementeringen av långläst sekvenseringsteknik hjälpa till att övervinna dessa begränsningar och erhålla slutna genom40.

Flera kritiska steg måste beaktas i hela WGS-protokollet. GDNA av hög kvalitet är den första kontrollpunkten som krävs för att säkerställa sekvenseringsdata av hög kvalitet. För det andra, i biblioteksberedningen, måste extra försiktighet vidtas under tagmentationsprocessen, särskilt vid hantering av flera prover och tillsats av indexprimrar, för att undvika korskontaminering och vid kontroll av inkubationstiden, för att korrekt fragmentera DNA-proverna. Dessutom är kvantifierings- och normaliseringssteg viktiga för att eliminera eventuell bias som DNA-bibliotek kan införa i de slutliga sekvenseringsdata, eftersom ett felaktigt ekvimolärt förhållande i det poolade biblioteket kan gynna en väsentligt ojämn fördelning i antalet läsningar per prov. Metoden som presenteras här är enkel och representerar ett kostnadseffektivt alternativ, främst för optimal användning av reagenserna i DNA-bibliotekets beredningssatser. Protokollet för WGS som beskrivs ovan har tillämpats inte bara på E. coli-genomsekvensering utan också på andra obesläktade bakteriearter som Vibrio parahaemolyticus41. Enligt FN: s livsmedels- och jordbruksorganisation (FAO) och Världshälsoorganisationen (WHO) kan NGS-metoder spela en avgörande roll för livsmedelssäkerhet genom att tillhandahålla snabb identifiering och karakterisering av mikroorganismer och antimikrobiell resistens (AMR) med noggrannhet som tidigare inte var möjlig42. Därför utgör dessa metoder ett verktyg för övervakning och källspårning av patogener, inte bara i det kliniska sammanhanget utan också i riskbedömningen av livsmedelsburna patogener, vilket avslöjar insikter om dessa mikroorganismers ekologiska och fysiologiska egenskaper43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Till National Council of Science and Technology of Mexico (CONACyT med dess akronym på spanska) för doktorandstipendiet som tilldelats José Antonio Magaña-Lizárraga [nr 481143].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Tags

Genetik utgåva 190 helgenomsekvensering Escherichia coli aEPEC antimikrobiell resistens vattenbruk Oreochromis spp.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Karakterisering av en patogen <em>Escherichia coli-stam</em> härledd från <em>Oreochromis</em> spp. Gårdar som använder helgenomsekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter