Summary
전후 난포 생성에 대한 연구를 발전시키기 위해서는 단일 난소에서 난포를 분리하는 효율적인 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 조직 초퍼와 균질화를 사용하여 소 난소에서 난포를 분리하기위한 간소화 된 기계적 프로토콜입니다. 이 방법은 단일 난소에서 많은 수의 생존 가능한 전방 난포를 수집 할 수있게합니다.
Abstract
포유류 모낭 생성의 전체 과정을 이해하는 것은 가축, 인간 및 멸종 위기에 처한 종의 보조 생식 기술을 개선하는 데 중요합니다. 연구는 특히 소 종과 같은 대형 포유류에서 더 작은 전방 모낭의 분리가 어렵 기 때문에 대부분 전방 및 큰 전방 모낭으로 제한되었습니다. 이 연구는 단일 소 난소에서 많은 수의 작은 전방 난포를 회수하는 효율적인 접근 방식을 제시합니다. 개별 소 난소의 피질을 조직 초퍼를 사용하여 500μm 입방체로 절단하고 10mm 프로브를 사용하여 9,000-11,000rpm에서 6분 동안 균질화했습니다. 큰 파편은 치즈 천을 사용하여 균질액으로부터 분리하고, 이어서 300 μm 및 40 μm 세포 스트레이너를 통한 연속 여과하였다. 40μm 스트레이너에 남아있는 내용물을 검색 접시로 헹구어 모낭을 식별하고 배지 한 방울로 수집했습니다. 수집된 모낭의 생존력은 트리판 블루 염색을 통해 시험하였다. 이 방법은 약 90 분 안에 단일 소 난소에서 많은 수의 생존 가능한 작은 preantral 난포를 분리 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법은 완전히 기계적이며 모낭을 손상시킬 수있는 조직을 해리하기 위해 효소를 사용하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 난포는 RT-qPCR을 위한 RNA 분리, 특정 단백질의 면역 국소화 및 시험관 내 배양과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
Introduction
난소 난포는 난소의 기능 단위로, 배우자 (난 모세포)의 생산뿐만 아니라 생식 기능과 전반적인 건강에 중요한 호르몬을 담당합니다. 원시 난포는 태아 발달 중 또는 종1에 따라 신생아기에 난소에서 형성되며 여성의 난소 예비를 구성합니다. 여포 성장은 휴식 풀을 떠나 성장 단계로 들어가는 원시 모낭의 활성화로 시작됩니다. 전두엽 발달 이전의 모든 난포 단계를 포함하는 전안구 모낭 생성은 이 두 세포 유형 2,3 간의 긴밀한 통신에 의해 구동되는 난모세포와 주변 과립막 세포에서 동기식 형태학적 및 대사적 변화를 필요로 하는 매우 역동적인 과정입니다. Preantral 난포는 주어진 시간에 난소에서 발견되는 난포 단위의 대부분을 구성합니다4. 난포 발달 전 단계를 통한 발달은 전방 발달5,6보다 몇 주 더 긴 것으로 추정되며, 이 시기는 난모세포와 체세포가 발달의 최종 단계(즉, 항문 단계)에 진입하고 배란, 수정 및 배아 발달을 준비하기에 충분한 성숙을 얻는 데 필요합니다7,8,9.
난소 전 난포 형성에 대한 현재 지식의 대부분은 마우스 모델10,11,12,13에서 비롯되며, 이는 부분적으로 더 작고 섬유질이 적은 난소에서 많은 수의 난포를 쉽게 회복 할 수 있기 때문입니다. 소 난소에서 많은 수의 전방 난포를 분리했다는 보고는 약 30년 전으로 거슬러 올라갑니다.14, 이러한 초기 단계의 난포의 발달을 조절하는 과정에 대한 보다 완전한 이해는 실현되지 않은 상태로 남아 있습니다., 특히 발달 초기 단계에서 충분한 수의 생존 가능한 전두엽 난포를 회수할 수 있는 최적화되고 효율적이며 반복 가능한 방법이 부족하기 때문입니다. 인간의 보조 생식에 대한 미래의 사용을 위해 난소 예비력을 보존하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라, 소는 더 유사한 난소 구조15로 인해 매력적인 모델이됩니다. 그러나, 소 난소는 마우스 난소16에 비해 콜라겐이 현저히 풍부하여, 마우스에 대해 기술된 방법을 사용한 기계적 분리를 매우 비효율적으로 만든다. 생식력 보존 기술을 확장하기 위한 노력에는 전안구 난포의 완전한 시험관 내 성장, 밀폐된 난모세포의 시험관 내 성숙(IVM), 체외 수정(IVF), 배아 생산 및 이식이 포함됩니다17. 지금까지, 이 전체 과정은 마우스18에서만 달성되었다. 소에서, 시험관 내에서 난포 성장을 향한 진전은 배양 시작시 가변 난포 단계와 프로토콜17,19 사이의 다양한 배양 기간을 갖는 몇 가지 보고서로 제한됩니다.
소 난소에서 preantral 난포의 수확을위한 문헌에 설명 된 방법은 대부분 분리 또는 조합된 기계적 및 효소 기술을 사용했습니다 2,14,17,20. 소 전신난포 분리를 위한 프로토콜의 첫 번째 보고는 전체 난소를 처리하기 위해 조직 균질화기 및 직렬 여과를 사용하였다20. 이 연구는 콜라게나제14를 활용한 기계적 및 효소적 절차를 결합한 보고로 이어졌습니다. 난소 조직을 소화하기 위해 콜라게나제를 사용할 때 반복되는 주제는 난포 생존력을 손상시킬 수 있는 난포 기저막의 손상에 대한 잠재적 위험입니다 14,21,22,23. 따라서, 조직 초퍼의 사용 및 반복 피펫팅 또는 균질화20,24,25,26과 결합된 조직 초퍼의 사용과 같은 기계적 방법의 상이한 조합이 사용되었다. 설명된 또 다른 기계적 기술은 바늘을 사용하여 난소 조직에서 직접 전안구 난포를 해부하는데, 이는 더 큰(>200μm) 2차 난포를 분리하는 데 특히 유용합니다. 그러나 이 과정은 시간이 많이 걸리고 더 작은 전엽 난포를 분리하는 데 비효율적이며 소 난소에서 시도할 때 스킬셋에 의존합니다 19,27,28.
문헌에 설명된 다양한 기술을 활용하여 이 프로토콜은 효소 용액에서 배양을 피하는 간단하고 일관되며 효율적인 방식으로 단일 소 난소에서 전후 난포의 분리를 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 전방 모낭을 분리하는 방법을 개선하면 이 모낭 형성 단계에 대한 이해를 높이고 전방 난포를 항문 단계로 발전시키는 효과적인 배양 시스템을 개발할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 소 종과 같은 대형 포유동물로부터 전치모낭의 단리를 위해 본원에 기재된 상세한 절차는 인간에게 번역될 수 있는 비뮤린 종에서 초기 모낭 발생을 연구하고자 하는 연구자에게 필수적일 것이다.
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Protocol
소(Bos taurus) 난소는 지역 도축장에서 공급되어 수집 후 6시간 이내에 실험실로 이송되었습니다. 시설에서 처리되는 동물의 수가 많기 때문에 동물의 나이, 품종 및 발정주기의 단계를 알 수 없습니다. 이 실험에는 살아있는 동물이 사용되지 않았기 때문에 승인 된 동물 관리 및 사용 프로토콜이 필요하지 않았습니다.
1. 장비 및 시약 준비
- 실험실 벤치의 2피트 너비 부분을 벤치 페이퍼로 덮습니다.
- 메스 손잡이, 멸균 메스 블레이드, 지혈제, 해부 겸자 한 쌍, 20mL 루어 잠금 주사기, 18G 바늘, 200mL 비커 2개, 500mL 삼각 플라스크, 104mm 직경의 플라스틱 깔때기, 플라스틱 도마, 처리 중인 난소당 22cm2 겹의 치즈클로스(치즈천은 사용 전에 오토클레이빙으로 멸균할 수 있음) 1개, 300 μm 세포 스트레이너 및 40 μm 세포 스트레이너 ( 재료 표 참조).
- 모든 장비를 벤치 용지로 옮깁니다.
- 지혈제를 사용하여 메스 칼날을 메스 손잡이에 끼웁니다. 블레이드의 각진 베이스를 핸들의 각진 표시기에 맞춘 다음 블레이드를 핸들의 홈에 밀어 넣습니다.
- 깔때기를 삼각 플라스크에 넣고 깔때기 입구를 치즈 천으로 덮습니다.
- 처리할 난소당 하나의 50mL 원뿔형 튜브를 38.5°C로 설정된 물 또는 비드 배스에 놓습니다.
- 처리중인 난소 당 하나의 100mm x 15mm 정사각형 페트리 접시를 38.5 ° C로 설정된 슬라이드 워머에 놓습니다.
- 10mL의 페니실린-스트렙토마이신(PenStrep; 10,000U/mL 페니실린 및 10,000μg/mL 스트렙토마이신)을 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 1L에 추가합니다. PBS + PenStrep을 난소 처리 최소 2시간 전에 38.5°C로 설정된 물 또는 비드 배스에서 따뜻하게 합니다.
참고: PBS + PenStrep 용액은 분리된 난포를 배양할 때 난소를 세척하는 데 필수적이며 미생물 오염을 완화하기 위한 다운스트림 실험에도 여전히 권장됩니다. - 처리된 난소 여과액을 수집하려면 3mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 25mM HEPES 완충액, 100UI 페니실린/100μg/mL 스트렙토마이신, 1mM 나트륨 피루브산염(NaPyr) 및 100nM 비필수 아미노산(NEAA)을 포함하는 행크스 염( 재료 표 참조)과 함께 TCM199로 구성된 난포 세척 배지(FWM)를 사용하십시오.
- 멸균 TCM199, 250mL 병 및 100mL 눈금이 매겨진 실린더를 생물안전 캐비닛(BSC)으로 옮깁니다. 194mL의 TCM199를 병으로 옮깁니다.
- BSC에서 TCM199의 비커를 제거하고 교반 플레이트로 가져옵니다. 600mg의 BSA, 1.19g의 HEPES 버퍼 및 오토클레이브 교반 막대를 병에 넣고 녹을 때까지 저어줍니다.
- BSA와 HEPES 버퍼가 완전히 용해되면 pH 측정기로 측정한 pH 7.6-7.8에 도달할 때까지 1N 수산화나트륨(NaOH)을 배지에 추가합니다.
- BSC로 옮기기 전에 배지 병, 진공 여과 장치, 50mL 원뿔형 튜브 4개, PenStrep, NaPyr 및 NEAA 병을 70% 에탄올로 닦습니다.
- PenStrep (10,000 U / mL 페니실린 및 10,000 μg / mL 스트렙토 마이신), 100 mM NaPyr 및 100x NEAA를 TCM199 + 3 mg / mL BSA + 25 mM hepes 병에 각각 2mL 첨가하십시오. 최종 배지를 멸균 여과하고 50mL 코니컬 튜브에 분취합니다. 배지를 4°C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
- 난소 처리 최소 1시간 전에 38.5°C로 설정된 비드 배스에서 난소 2개당 배지의 50mL 원뿔형 튜브 1개를 따뜻하게 합니다.
2. 티슈 초퍼 설정
- 티슈 초퍼( 재료 표 참조)가 연결되어 있고 켜져 있는지 확인하십시오.
- 제조업체의 사양에 따라 슬라이스 두께를 500μm로, 블레이드 힘 제어 손잡이를 20°로, 속도 제어 손잡이를 90°로 설정합니다.
- 60mm 플라스틱 페트리 접시를 플레이트 홀더에 삽입하고 플레이트 홀더를 스테이지에 삽입합니다.
- 수동 작동 손잡이를 시계 방향으로 돌려 도마를 최대한 높이 올립니다.
- 집게를 사용하여 양날 면도날( 재료 표 참조)을 도마에 삽입된 나사에 놓습니다. 블레이드 걸쇠를 블레이드 위에 놓고 와셔와 너트로 고정합니다. 너트를 1/4 바퀴 느슨하게 두십시오.
- 도마 암이 칼날을 페트리 접시에 평평하게 끼울 때까지 수동 작동 손잡이를 돌립니다. 너트드라이버로 너트를 조입니다.
- 수동 작동 손잡이를 사용하여 도마 암을 최대한 높이 올립니다. 테이블 분리 손잡이가 제자리에 고정될 때까지 왼쪽 끝까지 움직입니다.
3. 난소 준비
- 실험실에서 난소를 따뜻한 (38.5 ° C) 멸균 PBS + PenStrep으로 옮깁니다.
참고 : 동물에서 제거한 후 가능한 한 빨리 난포 분리를 위해 난소를 처리하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서 난소는 수확 후 6 시간 이내에 처리되었습니다. 난소는 대략 38.5°C에서 멸균된 0.9% 식염수를 함유하는 보온병으로 도축장에서 실험실로 운반되었다. - 가능하면 작은(3-5mm) 제트랄 난포, 큰(≥8mm) 제트랄 난포가 없는 작은 난소(≤ 4cm x 3cm x 3cm) 난소, 두드러진 황체가 없는 난소를 선택하십시오(그림 1). 이러한 기준은 간질 세포 및 세포 외 기질과 같은 최소량의 비 난포 파편이 분리 된 모낭을 포함하는 결과 사각형 접시에 포함되도록하기 위해 권장됩니다.
참고: Antral 난포는 난소 표면에 액체로 채워진 구형의 소포 구조로 식별될 수 있습니다. Corpora lutea는 난소 표면에서 튀어 나온 빨간색, 주황색 또는 노란색 뻣뻣한 구조로 식별 할 수 있습니다. - 가위를 사용하여 난소에서 과도한 결합 조직과 지방을 제거하십시오.
- 비커에서 70 % 에탄올로 난소를 30 초 동안 씻으십시오.
- 따뜻한 (38.5 ° C) PBS + PenStrep의 비커에서 난소를 각각 2 분 동안 3 회 세척하고, 각 세척에 대해 신선한 PBS + PenStrep을 사용합니다.
- 처리 준비가 될 때까지 난소를 따뜻한(38.5°C) PBS + PenStrep에 보관하십시오.
알림: 실험실과 난소 공급원 사이의 거리는 가변적일 수 있습니다. 따라서 난포 생존력의 유지를 보장하기 위해 적시에 프로토콜을 완료하는 것이 중요합니다.
그림 1 : 소 난소의 해부학. 소 난소는 상피층으로 둘러싸인 두 개의 주요 영역으로 구성됩니다. 점선의 왼쪽 조직으로 구성된 피질은 원시 단계부터 대뇌 단계까지의 난소 난포를 포함합니다. Preantral 모낭은 너무 작아서 육안으로 볼 수 없습니다. antral 모낭은 별표로 표시됩니다. 점선의 오른쪽 조직으로 구성된 수질에는 혈관, 림프관 및 신경이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 절단 절차
참고: 한 번에 하나의 난소만 처리하십시오. 난포 생존력에 영향을 줄 수 있는 온도 감소를 피하기 위해 난소를 빠르게 처리합니다.
- 하나의 난소를 벤치 페이퍼의 도마 (그림 2A)로 옮기고 티슈 초퍼 (그림 2B)를 준비합니다.
- 집게와 메스를 사용하여 난소를 반으로 자르고 각 반쪽에서 수질을 제거하고 그림 1C와 같이 약 2mm 두께의 피질 만 남깁니다.
- 한 인대 부착 부위에서 반대쪽 부착 부위까지 세로로 난소를 반으로 자릅니다.
- 난소의 절반을 처리 할 도마에 놓고 난소의 나머지 절반을 따뜻한 (38.5 ° C) PBS + PenStrep에 다시 놓습니다.
- 노출 된 수질이 위쪽을 향하게하여 피질을 절단하지 않고 난소 표면에서 약 2mm 떨어진 난소의 곡률을 따라 자릅니다.
- 난소의 곡률을 따라 슬라이스를 사용하여 슬라이스를 깊게하고 여전히 난소의 곡률을 따라 피질을 수질에서 분리하십시오.
- 황체의 경계를 따라 절단하여 난소에서 모든 시체 루테아를 해부하고 버립니다.
- 상피가 위쪽을 향하도록 난소를 반으로 뒤집고 메스를 사용하여 피질에서 수질을 자르십시오. 인대에 연결된 난소 조각 가장자리 주위에 남아있는 흰색 결합 조직을 잘라냅니다.
- 수질의 대부분이 제거되면 메스를 사용하여 피질을 약 1mm 두께로 자릅니다. 수질의 나머지 부분을 면도하기 위해 앞뒤로 작은 동작으로 메스를 조작하십시오.
참고: 수질은 큰 혈관을 포함하는 난소의 내부 부분입니다. 피질은 난소의 바깥 부분이며 가장 바깥 쪽 표면 상피 바로 아래에 있습니다. 피질은 소 난소에서 약 1mm 두께이므로 난소를 1mm 두께로 자르면 수질이 제거됩니다.
- 피질을 2.5cm x 2.5cm 이하의 조각으로 자릅니다. 자를 준비가 될 때까지 피질 조각을 따뜻한 (38.5 ° C) PBS + PenStrep에 보관하십시오.
- 비커에 최소 50mL의 따뜻한(38.5°C) PBS + PenStrep을 채우고 플라스틱 이송 피펫을 얻습니다.
- 피질 한 조각을 티슈 초퍼의 페트리 접시에 옮기고 따뜻한 (38.5 ° C) PBS + PenStrep 서너 방울로 티슈를 적시십시오.
- 한 쌍의 집게로 티슈 조각을 안정적으로 잡고 재설정 버튼을 한 번 눌러 티슈 초퍼를 시작합니다. 집게로 조직을 계속 안정화하면서 한 손으로 페트리 접시를 안정화시킵니다. 칼날이 집게에 부딪히지 않도록 필요에 따라 집게를 조직을 따라 왼쪽으로 움직입니다. 결과 스트립의 길이는 약 500μm입니다.
- 전체 피질 조각이 스트립으로 절단되면 블레이드 홀더 손잡이를 사용하여 페트리 접시에서 블레이드를 들어 올리고 집게를 사용하여 블레이드에서 조직을 제거합니다.
- 플레이트 홀더를 90° 돌립니다.
- 재설정 버튼을 한 번 누릅니다. 집게를 사용하여 티슈 스트립을 블레이드의 경로로 밀어 넣는 동안 한 손으로 페트리 접시를 안정화합니다.
- 칼날을 티슈 스트립에 완전히 통과시킵니다. 칼날 홀더 손잡이를 사용하여 페트리 접시에서 칼날을 들어 올리고 집게를 사용하여 칼날에서 티슈를 제거합니다.
- 전사 피펫을 사용하고 따뜻한(38.5°C) PBS + PenStrep을 사용하여 잘게 잘린 조직(조직의 최종 크기: 500μm x 500μm x 1mm 큐브)을 예열된(38.5°C) 50mL 원뿔형 튜브로 세척합니다. 원뿔형 튜브를 물 또는 비드 배스로 되돌려 잘게 잘린 조직을 따뜻하게 유지합니다 (38.5 ° C).
- 너트드라이버를 사용하여 도마에서 너트를 제거하고 와셔와 블레이드 걸쇠를 제거합니다. 집게를 사용하여 도마에서 칼날을 제거하고 사용하지 않은 가장자리가 페트리 접시를 향하도록 뒤집은 다음 다시 도마 위에 놓습니다. 블레이드 걸쇠, 와셔 및 너트를 교체하고 2.5-2.7단계에 설명된 대로 테이블 분리 손잡이를 재설정합니다.
- 난소에서 나머지 모든 피질 조각에 대해 4.5-4.12 단계를 반복하고 각 절삭 날을 사용한 후 블레이드를 새 것으로 교체하십시오.
- 사용한 모든 칼날은 벽이 단단한 플라스틱 날카로운 물건 용기에 폐기하십시오.
5. 균질화 절차
- 균질화기 장치( 재료 표 참조)가 연결되어 있고 속도가 두 번째 막대(9,000-11,000rpm)로 설정되어 있는지 확인하십시오. 제조업체의 사양에 따라 10mm 발전기 프로브를 장치에 삽입합니다.
- 1분 동안 타이머를 설정하고 프로브를 한쪽 난소(단계 4.11)에서 잘게 잘린 피질 조직을 포함하는 50mL 원뿔형 튜브에 삽입하고 튜브를 25mL 라인까지 채우기에 충분한 PBS + PenStrep을 삽입합니다. 프로브가 삽입되는 깊이는 챔버 바닥에서 측정 한 액체 높이의 1/3이어야합니다. 소용돌이를 최소화하기 위해 프로브를 중앙에서 약간 벗어난 위치에 놓습니다.
- 타이머를 시작하고 균질화기를 켭니다. 프로브의 바닥이 튜브에 닿지 않는지 확인하고 균질화기가 켜져 있는 동안 튜브를 계속 유지하십시오.
- 균질화 1 분 후, 튜브에서 프로브를 제거한다. 집게를 사용하여 통풍구를 막고 있는 결합 조직과 로터 나이프와 로터 튜브 사이의 공간을 제거합니다. 피질 조각이 프로브에 붙어 있으면 집게로 제거하고 튜브에 다시 넣으십시오.
- 총 6분의 균질화를 위해 5.2-5.4단계를 추가로 5배 반복합니다.
- 균질화된 조직이 있는 튜브를 물 또는 비드 배스에 넣어 조직을 따뜻하게 유지합니다(38.5°C). 마지막 난소를 처리 한 후 즉시 제조업체의 사양에 따라 발전기 프로브를 분해, 청소 및 건조하십시오.
6. 여과 절차
- 흩어진 조직을 삼각 플라스크에 삽입된 무명천으로 덮인 깔때기에 붓습니다. 튜브에 조직 조각이 남지 않을 때까지 따뜻한(38.5°C) PBS + PenStrep을 사용하여 튜브의 내용물을 깔때기에 헹굽니다.
- 조직 조각 주위에 치즈 천을 비틀고 모든 과도한 액체와 조직이 치즈 천에서 제거 될 때까지 짜서 조직 조각이 천의 구멍을 통과하도록합니다.
- 깔때기 위의 치즈 천을 다시 열고 전사 피펫을 사용하여 PBS + PenStrep으로 치즈 천을 헹구고 천을 통해 잔류 조직 조각을 다시 짜냅니다.
- 지혈제를 사용하여 300mL 비이커 위에 200μm 세포 여과기를 고정합니다. 세포 여과기를 통해 삼각 플라스크에 여과액을 붓습니다. 조직 조각이 남지 않을 때까지 따뜻한 (38.5°C) PBS + PenStrep을 사용하여 플라스크의 내용물을 세포 여과기로 헹굽니다.
- 셀 스트레이너가 티슈로 막히면 셀 스트레이너를 비커에 대고 부드럽게 두드려 모든 액체가 비커로 여과되었는지 확인한 다음 셀 스트레이너를 거꾸로 뒤집고 큰 티슈 파편을 벤치 페이퍼에 두드립니다. 셀 스트레이너를 비커 위로 되돌리고 여과액을 계속 붓습니다. 삼각 플라스크의 모든 여과액이 여과될 때까지 필요에 따라 반복합니다.
- 지혈제를 사용하여 두 번째 200mL 비커에 40μm 세포 여과기를 고정합니다. 세포 여과기를 통해 처음 200mL 비커에 여액을 붓습니다. 조직 조각이 남지 않을 때까지 따뜻한 (38.5 ° C) PBS + PenStrep을 사용하여 비커의 내용물을 셀 스트레이너로 헹굽니다. 40μm 셀 스트레이너의 내용물을 버리지 마십시오.
- 18G 바늘을 20mL 주사기에 맞춥니다. 주사기에 FWM을 채 웁니다. 40μm 세포 여과기를 정사각형 페트리 접시 위에 거꾸로 뒤집고 주사기를 사용하여 세포 여과기의 내용물을 접시로 씻어냅니다. 주사기를 다시 채우고 조직 조각이 남지 않을 때까지 필요에 따라 세포 여과기를 헹굽니다.
참고: 일반적으로 25mL의 FWM은 40μm 세포 여과기의 내용물을 완전히 헹구기에 충분합니다.
그림 2: 난소 처리 및 프로토콜 워크플로를 위한 작업 공간 설정. (A) 절단하기 전에 난소를 절단하고 난소 균질액을 여과하기 위한 벤치 설정. (B) 티슈 초퍼 및 균질화기 설정, 균질화기 단계의 진동을 줄이기 위해 스티로폼 지지대. (C) 하나의 전체 난소의 처리를 위한 워크플로우를 보여주는 개략도. 난소는 과도한 결합 조직을 다듬은 다음 반으로 자르고 ~ 1mm 두께의 피질 조각이 남을 때까지 수질을 제거합니다. 피질은 2.5cm x 2.5cm 조각으로 절단되고 500μm의 절단 간격으로 설정된 조직 초퍼에서 절단됩니다. 이어서, 조각을 균질화하고, 균질액을 치즈클로스를 통해 여과한 다음, 300 μm 및 40 μm 세포 스트레이너를 통해 여과한다. 40μm 세포 여과기의 내용물을 정사각형 페트리 접시로 헹구고 실체 현미경을 사용하여 모낭을 검색합니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
7. 모낭 검색 및 수집
- 사각 페트리 접시(단계 6.6)를 38.5°C로 설정된 예열된 스테이지가 있는 입체경으로 옮깁니다. 스테레오스코프 배율은 검색자의 선호도에 따라 1.25x에서 3.2x 사이로 설정해야 합니다.
- FWM 10μL를 60mm 페트리 접시에 떨어뜨리고 건조를 방지하기 위해 방울을 미네랄 오일로 덮습니다. 배지 방울이 있는 페트리 접시를 38.5°C로 설정된 온열 플레이트에 놓습니다.
알림: 4웰 플레이트를 사용하여 모낭을 수집할 수 있습니다. 500μL의 세척 매체를 하나 또는 두 개의 웰에 추가합니다. 38.5°C로 설정된 온난화 플레이트에 놓습니다. - 마이크로피펫 플런저와 팁을 얻는다.
참고: 유리 1-5 μL 마이크로피펫( 재료 표 참조)은 모낭이 유리 피펫에 부착될 가능성이 적고 용액 간에 이동할 때 손실될 가능성이 적기 때문에 권장됩니다. 또한 모낭을보다 쉽고 정확하게 미세 조작 할 수있을만큼 작은 도구입니다. - 사각 페트리 접시에서 모낭을 식별하고 마이크로피펫을 사용하여 배지(FWM) 방울로 옮깁니다. 많은 모낭이 조직 파편에 매립될 가능성이 있으며 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 회수할 수 있습니다.
참고: 모낭은 완벽한 구체가 아닌 직사각형이며 일반적으로 난포의 중심을 향해 어두운 대조에서 단색의 흰색 원으로 나타나는 난모세포가 있습니다(그림 3A-C). 난포와 탈질된 난모세포를 혼동하지 않도록 주의하십시오. 난 모세포는 완벽한 구체 인 경향이 있으며 두껍고 투명한 막 (zona pellucida)으로 둘러싸여 있습니다. 배율이 10배 이상인 도립 현미경을 사용하여 모낭을 면밀히 검사할 수 있습니다(그림 3D).- 마이크로 피펫 끝이나 미세한 (27G) 바늘을 사용하여 모낭을 파편에서 조심스럽게 분리하십시오.
- 또는 고무 전구가 달린 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시의 파편을 여러 번 집어 내고 분출하여 파편에서 모낭을 제거합니다.
- 30 분 이상 걸리지 않고 신속하게 작업하여 페트리 접시를 검색하여 난포 생존력을 보존하십시오.
- 밀도가 높을수록 모낭이 서로 달라붙을 가능성이 높아질 수 있으므로 10μL 방울당 최대 5개의 모낭만 배치하십시오.
8. 트리판 블루 배제 생존력 시험
알림: 모낭이 실제 접시의 플라스틱보다 뚜껑의 플라스틱에 덜 달라붙기 때문에 다음 모든 단계에서 페트리 접시 또는 4웰 접시의 뚜껑을 사용하십시오.
- 100 mg PVP를 50 mL의 PBS에 용해시켜 PBS + 0.2 % 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP)을 제조한다.
알림: PVP는 모낭이 접시에 부착 될 가능성을 줄이기 위해 여기에 사용됩니다. - 마이크로피펫을 사용하여 배지 방울의 모든 모낭(평균 40개)을 50μL 방울의 PBS + 0.2% PVP로 옮깁니다.
- 모낭을 PBS + 0.2 % PVP의 신선한 50 μL 방울로 순차적으로 옮겨 2 배 세척하십시오.
- 모낭을 285 μL 방울의 PBS + 0.2 % PVP로 옮깁니다.
- 285μL PBS + 0.2% PVP(최종 농도 0.05% 트리판 블루)에 트리판 블루 15μL를 추가하고 100μL로 설정된 200μL 피펫 팁을 사용하여 드롭을 조심스럽게 혼합합니다.
참고: 트립판 생존력 테스트에 4웰 플레이트를 사용하는 경우 475μL의 PBS + 0.2% PVP 및 25μL의 트리판 블루를 한 웰에 추가합니다. - 모낭을 트립판 블루 방울에서 1분 동안 배양한 다음, 모낭을 PBS + 0.2% PVP의 50μL 방울(또는 500μL 웰)로 옮깁니다.
- 8.3 단계에 따라 모낭을 PBS + 0.2 % PVP의 신선한 50 μL 방울 (또는 웰 당 500 μL)로 3 회 세척하십시오.
- PBS + 0.2 % PVP로 세 번 씻은 후에도 여전히 파란색으로 나타나는 모낭은 생존 할 수 없으므로 폐기하십시오. 세 번의 세척 후에도 청색 착색을 유지하지 않는 모낭은 실행 가능하며 면역 형광, 배양 또는 기타 절차에 사용할 수 있습니다 (그림 3E). 모낭을 액체 질소에서 스냅 동결하고 필요한 경우 추가 사용이 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
- 단계 9 및 10에 설명된 바와 같이 모낭의 RT-qPCR 분석 및 면역형광 염색을 수행한다.
그림 3: 분리된 모낭 및 트리판 블루 배제 테스트. (A-C) 분리된 모낭은 실체현미경을 통해 여러 배율로 이미지화되었습니다. (A) 초기 검색 접시 내의 파편 중에서 분리 된 모낭. 개별 모낭은 빨간색 원으로 표시됩니다. 스케일 바 = 2,000 μm. (B) 미네랄 오일로 덮인 여포 세척 배지 방울 내에서 분리 된 모낭 및 파편. 스케일 바 = 1,000 μm. (C) 더 높은 배율에서 파편이없는 분리 된 모낭. 스케일 바 = 1,000 μm. (D) 도립 명시야 현미경을 사용하여 이미징 된 분리 된 모낭. 스케일 바 = 100 μm. (E) 도립 명시야 현미경과 20x 대물렌즈를 사용하여 이미징한 생존 가능한(염색되지 않은) 및 실행 불가능한(파란색 얼룩) 모낭의 대표 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
9. RT-qPCR 분석
- RNA 분리 시약을 사용하여 생존 가능한 모낭에서 RNA를 분리합니다 (8.8 단계 에서). RNA를 정제하고 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 클린업 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 DNase로 처리합니다.
- RNase가 없는 물 14μL로 RNA를 용리하고 분광 광도계를 사용하여 정량합니다. RNA는 cDNA 합성까지 -80°C에서 저장될 수 있다.
- 제조업체의 지침에 따라 시판되는 cDNA 합성 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 1차 및 초기 2차 모낭에서 추출한 동일한 양의 RNA에서 cDNA 합성을 수행합니다. 반응 혼합물을 25°C에서 5분 동안 인큐베이션한 후 42°C에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 70°C에서 5분 동안 가열하여 반응을 종료한다.
- 시판되는 반응 혼합물을 사용하여 합성된 cDNA(반응당 5ng)와 프라이머(표 1)로 RT-qPCR을 수행합니다( 재료 표 참조). 열 사이클링 조건 사용: 중합효소 활성화를 위해 95°C에서 30초, 증폭 40회, 각 사이클에는 변성을 위해 95°C에서 15초, 어닐링/확장을 위해 60°C에서 30초가 포함됩니다. 주기 역치(Ct) 값을 정량화하여 RT-qPCR을 분석하고/하거나 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 PCR 산물을 봅니다.
참고: 과립막 세포 마커 FSHR 및 생식 세포 마커 DAZL 의 전사체 발현을 본 연구에서 평가하였다. 참조 유전자는 H2A 및 ACTB였다. - 온도가 65°C에서 95°C에 도달할 때까지 5초마다 0.5°C 단위로 온도를 증가시켜 용융 곡선 해석을 실행합니다.
10. 면역형광 분석
- 실온(RT)에서 4%(v/v) 파라포름알데히드(PFA) 100μL 방울에 생존 가능한 모낭(8.8단계에서)을 15분 동안 고정한 다음 PBS + 0.1% BSA + 0.1% 트윈 20 100μL 방울로 3회 세척합니다.
- 1x PBS + 5%(v/v) 일반 당나귀 혈청(NDS)으로 구성된 차단 완충액에서 RT에서 1시간 동안 모낭을 차단합니다. 차단 후, 블로킹 완충액에 희석된 4μg/mL 토끼 항인간 CX37 항체 또는 4μg/mL 토끼 이소형 IgG(음성 대조군)의 100μL 방울에 모낭을 4°C에서 밤새 배양합니다.
- PBS + 0.1% BSA + 0.1% 트윈 20 100μL 방울로 모낭을 3배 세척한 다음, 블로킹 버퍼에 희석한 2μg/mL 당나귀 항토끼 AlexaFluor 488 2차 항체 100μL 방울에 담아 어둠 속에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- DNA를 표지하기 위해 블로킹 완충액에 희석 된 1 μg / mL Hoechst 33342의 100 μL 방울에 어둠 속에서 RT에서 5 분 동안 모낭을 배양합니다.
- 모낭을 유리 현미경 슬라이드의 장착 매체( 재료 표 참조)의 5μL 방울에 옮기고 커버 슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 RT에서 밤새 경화시킨 다음 매니큐어로 밀봉하십시오. 이미징이 나타날 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
- 덮개가 미끄러진 후 48시간 이내에 모든 슬라이드를 이미지화합니다. DAPI (여기 380nm 및 방출 450nm) 및 FITC (여기 470nm 및 방출 525nm) 필터에서 도립 에피 형광 현미경 ( 재료 표 참조)을 사용하여 이미징을 수행합니다.
- 두 채널의 노출 시간을 고정합니다. 토끼 이소형형 음성 대조군에 기초하여 FITC (CX37) 노출 시간을 조정한다. 20x 대물렌즈와 50ms 노출 시간으로 설정된 DAPI 채널을 사용하여 토끼 이소형형 표지 난포를 식별합니다.
- FITC 채널 아래에서 이러한 모낭을 이미지화하고 모든 배경 녹색 신호가 사라질 때까지 노출 시간을 줄입니다. 이 노출 시간에 유의하십시오.
- 이소타입 FITC 채널에 설정된 노출 시간 및 DAPI 채널에 대해 50ms 노출 시간을 사용하여 모든 CX37 항체 표지된 난포를 이미지화합니다.
- 임계 후 평균 회색 영역에 의해 측정된 신호 세기를 컴퓨터 이미지 처리 프로그램(29)을 사용하여 처리한다( 재료 표 참조).
- 전체 여포의 윤곽이 표시되도록 각 여포에 대한 DAPI 이미지의 tiff 파일을 조정합니다. 프로그램의 입자 분석 기능을 사용하여 전체 모낭을 관심 영역(ROI)으로 선택합니다.
- 해당 여포에 대한 FITC 이미지의 tiff 파일을 열고 DAPI 이미지에서 생성된 ROI를 FITC 이미지 위에 오버레이합니다. 프로그램의 측정 함수를 사용하여 신호 강도를 나타내는 FITC 영상의 평균 회색 영역을 정량화합니다.
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Representative Results
개요 및 중요 단계
이 프로토콜을 사용하면 작은 소 preantral 난포를 실험적으로 관련된 숫자로 단일 난소에서 안정적으로 분리 할 수 있습니다. 총 30 번의 반복에서 복제 당 평균 41 개의 난포가 얻어졌으며 범위는 11-135 개입니다 (그림 4A). 14번의 반복에서, 모낭은 실체현미경 하에 1 μm 현미경 보정 슬라이드를 사용하여 난포 직경을 측정함으로써 앞서26 과 같은 발달 단계를 특성화하였다. 이 방법을 사용하여 총 476개의 난포를 1차(40-79μm 크기의 난포), 초기 2차(80-119μm) 또는 2차(≥120μm) 난포(그림 4B)로 분류했습니다. 원시 모낭은 40 μm 여과 단계로 인해 제외되었다. 난포 생존율은 앞서30에 기재된 바와 같이 트리판 블루 배제 시험을 사용하여 평가하였다. 단리된 난포를 0.2% PVP를 함유하는 PBS 중 0.05%(v/v) 트리판 블루에서 1분 동안 간단히 배양한 후, PBS+PVP로 3회 세척하고 입체경 하에서 검사하였다. 설명 된 절차를 사용하여 분리 된 난포의 100 %가 모든 반복에서 생존 할 수있었습니다. 전반적으로 난소 수집에서 페트리 접시를 검색하기 직전까지 기계적 분리 과정은 약 30-45분이 걸립니다. 난포를 검색하고 식별하는 데 소요되는 시간은 30 분을 넘지 않으므로 난소 당 총 1-1.25 시간이 걸립니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 난소 조직이 적절하게 균질화되도록 하는 것입니다. 균질화 시간을 5분에서 6분으로 증가시키면 분리된 모낭의 수가 증가했습니다(P < 0.05). 6분 균질화를 사용한 30건의 시험에서 난소당 평균 41개의 난포가 분리되었으며, 이는 균질화 시간이 5분인 22건의 시험에서 얻은 난소당 평균 13.8개의 난포보다 거의 3배 증가한 것입니다(그림 5). 또 다른 중요한 단계는 균질화 속도이며, 이는 9,000-11,000 rpm 내에서 유지되어야합니다. 속도가 빠르면 과도한 손상 및/또는 모낭 파열로 인해 수확량이 감소합니다. 모낭 분리는 여과 단계 후에 검색 접시의 내용물을 고무 전구가 있는 유리 파스퇴르 피펫을 여러 번 통과시킴으로써 더욱 개선될 수 있다. 파스퇴르 피펫을 사용하면 모낭이 파편에서 제거되고 접시에서 더 많은 모낭을 볼 수 있습니다.
분리 후 모낭을 배양해야 하는 경우 미생물 오염을 완화하는 것이 중요합니다. 오염은 전체 난소에서 과도한 결합 조직과 지방을 트리밍 한 다음 일련의 세척 단계를 수행하여 예방할 수 있습니다. 트리밍 된 난소는 미생물 부하를 줄이기 위해 70 % 에탄올로 간단히 세척 한 다음 따뜻한 (38.5 ° C) PBS + PenStrep 용액으로 여러 번 세척하여 70 % 에탄올을 씻어 내고 잠재적 인 미생물을 추가로 제거해야합니다. 이러한 세척은 난포 생존력을 손상시키지 않고 수행 할 수 있습니다. 오염을 더욱 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛 또는 멸균 장비가있는 클린 벤치 내부에서 전체 격리 프로토콜을 수행 할 수 있습니다.
RNA 분리 및 RT-qPCR
동일한 단계 및 분리된 분리로부터의 난포를 풀링하고, mRNA 발현의 분석을 위해 총 46개의 1차 및 34개의 초기 2차 난포를 사용하였다. RNA를 풀링된 모낭(1차 난포 = 총 RNA 259ng 및 초기 2차 난포 = 총 RNA 91ng)에서 분리하여 cDNA 합성에 사용했습니다. 이어서, 모낭에서 과립막 세포 마커 FSHR19 및 생식세포 마커 DAZL 의 발현을 RT-qPCR을 이용하여 평가하였다. 예상대로, 1차 및 초기 2차 난포 모두 FSHR 및 DAZL 전사체를 발현하여 인간 모낭31에서 이전 보고를 확인하고 FSHR 이 발달 1차 단계(32 )에서 소 모낭에서 발현됨을 입증했습니다(그림 6A, B).
Connexin 37의 면역형광 국소화
단백질의 면역 형광 국소화는 전체 난포에서 수행 될 수 있습니다. 여기서이 기술은 1 차 및 초기 2 차 단계 모두에서 분리 된 preantral 모낭에서 갭 접합 단백질 Connexin 37 (CX37)을 국소화하는 데 사용되었습니다. CX37은 난포의 난모세포와 과립막 세포 사이의 통신에 중요하며 조직학적 분석에서 소 종의 난포 발달의 모든 단계에서 두 세포 유형 모두에서 확인되었습니다33. 트립판 블루 배제 시험 후, 생존 가능한 난포를 PFA에 고정시키고, 토끼 항-인간 CX37 항체 또는 토끼 이소형 IgG (음성 대조군)와 함께 배양한 후, 당나귀-항-토끼 AlexaFluor 488 2차 항체와 함께 배양하였다. Hoechst 33342는 DNA를 표지하는 데 사용되었습니다. 소낭은 DAPI 및 FITC 필터 하에서 도립 에피 형광 현미경을 사용하여 이미지화되었고, 신호 강도는 정량화되었다. CX37은 난모세포 핵과 과립막 세포의 막에는 현저하게 없지만 난형질에 국한하는 것으로 밝혀졌습니다(그림 7). 이들 결과는 과립막 세포33의 난자 및 막에 대한 CX37의 공지된 국재화와 일치한다. CX37(여기에 표시됨) 및 FSHR32 와 같이 세포 통신 및 난포 성장에 중요한 것으로 알려진 단백질의 면역 국소화는 전방 난포의 발달, 난포 성장, 구조 및 품질에 대한 중재의 효과를 연구하고 생체 내 획득 및 체외 배양 난포를 비교하여 배양 효과를 평가하는 데 중요한 도구입니다.
| 유전자 | 순방향 시퀀스(5'-3') | 역방향 시퀀스(5'-3') | 제품 크기 (bp) | ||||
| 증권 시세 표시기 | CCC AAC TCG ATG AGC TGA ATC T | CAT AGC TAG GCA GGG AAC GG | 132 | ||||
| 다즐 | GCC CAC AAA AGA AAT CTG TGG A | ACT TAA GCA CTG CCC GAC TT | 156 | ||||
| H2A | GAG GAG CTG AAC AAG CTG TTG | TTG TGG TGG CTC TCA GTC TTC | 104 | ||||
| 액트비 | 증권 시세 표시기 증권 시세 표시기 | GGG CAG TGA TCT CTT TCT GC | 178 | ||||
표 1: RT-qPCR에 사용된 프라이머 목록.
그림 4: 분리된 전안구 난포의 수와 발달 단계. (A) 6분 조직 균질화를 사용하여 복제당 분리된 전안구 난포의 총 수(n = 30회 반복). 모낭의 평균 수는 막대를 가로 지르는 빨간색 선으로 표시됩니다. (B) 14 번의 반복에서 분리 된 난포의 발달 단계가 기록되었습니다. 원형 차트는 분리 된 총 난포의 비율로 발달 단계의 분포를 보여줍니다 (n = 476). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 5분 균질화와 6분 균질화의 비교. 6 분 동안 난소 피질의 균질화는 5 분 동안 동일한 속도로 균질화하는 것에 비해 더 많은 수의 전엽 난포를 산출했다 (n = 5 분 동안 22 회 반복 및 6 분 동안 30 회 반복; P < 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 분리된 전안구 난포에서 발현된 전사체의 역전사 정량적 PCR. 1차 및 초기 2차 전후엽 난포는 과립막 세포(FSHR), 생식 세포(DAZL) 및 참조 유전자(H2A 및 ACTB)의 마커에 대한 mRNA 전사체를 발현했습니다. (A) 각각의 염기쌍 (bp) 생성물 크기를 갖는 각 유전자에 대한 PCR 산물의 아가로스 겔. (b) FSHR 및 DAZL 전사체의 발현을 기준 유전자 ACTB의 것과 비교하여 정량화하였다. NTC = 비 템플릿 제어, CT = 사이클 임계 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 분리된 전후 난포에서 CX37의 면역형광 국소화. 1차(A) 및 초기 2차(B) 소 전안엽 난포에서 CX37 면역국소화의 대표 이미지. (c) 초기 2차 소 전엽 난포에서 음성 대조군 토끼 이소형 표지의 대표 이미지. 왼쪽 패널: DNA 라벨링(DAPI). 중간 패널: 1차 항체 토끼 항-인간 CX37 표지 (FITC). 오른쪽 패널: DAPI와 FITC가 병합되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. (D) 난포 발달 단계에 따른 평균 CX37 신호 강도 (n = 2 회 반복에서 21 차 및 11 차 초기 2 차 난포). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 프로토콜은 소 난소로부터 초기 단계의 preantral 난포, 특히 1 차 및 초기 2 차 단계에서 회수하는 재현 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 이전 보고서 20,25,30,34,35,36을 기반으로 하며 개별 난소에서 의미 있는 수의 난포를 분리하는 최적화를 제공합니다. 이 방법을 사용하여 분리된 전안구 난포는 실행 가능하며 단백질의 면역국소화 및 유전자 발현 분석을 위한 RNA 추출과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 분리된 모낭의 배양은 본 연구에서 시도되지 않았다. 그러나 현재 작은 소 전방 난포의 성공적인 장기 배양을 달성하기 위한 노력이 진행 중이며, 이는 난소 난포 형성에 대한 이해를 높이고 독성 테스트를 수행하며 생식력 보존을 위해 난포를 성공적으로 조작하는 방법을 고안하는 데 도움이 될 이 프로토콜의 중요한 다운스트림 적용이 될 것입니다.
이러한 실험의 데이터는 6분 균질화가 난소 피질 조직의 적절한 분산 및 난포 방출에 중요하다는 것을 보여줍니다(그림 4). 조직의 철저한 균질화에 기여하는 추가 단계는 수질에서 피질을 초기 해부하여 피질의 적절한 두께 (~ 1mm)를 보장하고, 과도한 결합 조직을 잘라내고, 피질을 작은 조각으로 자르는 것입니다. 이 단계는 균질화기 프로브의 막힘과 검색 플레이트의 불필요한 파편을 방지합니다. 세포 스트레이너 기공 크기는 원하지 않는 크기 및 단계의 파편 및 모낭을 배제하는 데 중요합니다. 이 프로토콜의 경우, 최종 단계는 소26에서 전형적으로 직경이 <40 μm인 원시 난포를 배제하기 위해 40 μm 세포 여과기의 내용물을 수집하는 것이다. 마지막으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 검색 접시의 파편에서 모낭을 제거하는 것은 후자의 기술이 더 많은 기술이 필요하고 부적절하게 수행되면 모낭을 손상시킬 수 있으므로 파편에서 모낭을 수동으로 해부하는 것보다 권장됩니다.
이 프로토콜은 기존 방법에 비해 개선 사항을 제공하지만 고려해야 할 제한 사항이 있습니다. 첫째, 난소 난포 집단15 의 이질적인 특성과 난소가 회수된 동물의 알려지지 않은 병력으로 인해 이 프로토콜을 수행한 후 분리된 난포의 수는 매우 다양했습니다. 고려해야 할 한 가지 요소는 난소 예비력이37세에 따라 감소하는 것으로 알려져 있기 때문에 동물의 나이입니다.
소 난소에서 작은 전방 난포를 분리하면 단일 표본 수준에서 기본적인 과학적 질문을 조사할 수 있는 기회가 제공되는데, 이는 이전에는 수행하기 어려웠던 접근 방식입니다. 예를 들어, 여기에서 평가된 모든 전안구 난포 단계는 난모세포-과립막 세포 통신에 중요한 단백질인 CX37의 발현을 보여주었습니다. 유사하게, FSH 수용체의 발현은 개별적으로 단리된 전안구 난포32에서 이전에 입증되었다. 스테로이드 생성 효소 CYP17 및 CYP1938과 같은 과립막 세포의 다른 특정 마커는 전엽 난포의 유전자/단백질 발현 패널에 관련 추가가 될 것이며 향후 프로젝트의 주제가 될 것입니다. 정기 또는 컨포칼 현미경 검사를 통한 전체 모낭 구조의 시각화는 한 번에 난포의 한 부분만 분석할 수 있는 조직학적 검사에 비해 더 포괄적입니다. 이는 발현의 상세한 공간 국소화가 필요한 면역염색 또는 현장 혼성화를 활용하고자 하는 연구에서 특히 유리합니다. 추가로, 단리된 전안구 난포는 RT-qPCR30에 대한 민감한 키트를 사용하여 단일-난포 유전자 발현을 조사하는데 사용될 수 있다. 난소 환경의 영향없이 개별적으로 난포를 분석하는 능력은 전방 난포 형성의 복잡성을 이해하는 데 중요한 단계입니다.
난소 피질 조직의 냉동 보존은 여성(40)을 포함한 여성 포유류(39)에서 생식력을 보호하기 위한 유망한 기술이 되었다. preantral 난포를 사용한 생식력의 보존 및 회복은 매력적인 보조 생식 기술뿐만 아니라 모낭 생성을 연구하기위한 유망한 방법을 제시합니다41. 동결 및 해동 후, 조직은 생존 가능한 전후 난포의 회수를 위해 이러한 분리 프로토콜의 대상이 될 수 있습니다. 이전에 동결보존된 조직으로부터 모낭을 회수하는 이 프로토콜의 잠재적 능력은 구체적으로 평가되지 않았지만, 다른 것들은 성공을 입증하고 시험관내 배양42,43,44,45를 위해 동결-해동된 조직으로부터 분리된 생존 가능한 작은 전엽 난포를 사용하였다. 또한, 새로 단리된 전후 난포는 유리화를 통해 개별적으로 동결보존될 수 있고 구조적 완전성을 유지할 수 있다(36).
소와 같은 대형 포유류 종에서 전방 모낭을 효율적으로 분리하기위한 세부 사항에 대한 업데이트가 문헌에서 누락되었습니다. 또한, 재현성의 부족이 현장에서 병목 현상이었기 때문에 소 전방 난포를 분리하는 방법에 대한 시각적이고 명시적인 가이드가 많이 필요합니다. 최근에, Bus et al.36 은 난소 당 6.1 개의 1 차 난포의 계산 된 평균 수율로 기계적 방법을 사용하여 소 preantral 난포의 분리를 설명했다. 여기에 설명된 기계적 분리 방법은 난소당 평균 41개의 전두엽 난포를 분리하는 결과를 가져오며, 대부분은 1차 단계에 있습니다. 따라서이 기술은 일차 난포 생리학 및 발달에 초점을 맞춘 연구에 특히 유용합니다. 1 차 난포는 성장하는 풀의 첫 번째 단계를 나타내며 난소 피질에 풍부합니다. 따라서, 이러한 발달 단계를 수확하도록 최적화된 기술된 기술의 사용은 신규하며, 원시 난포의 보다 어려운 조작을 피하면서 난소 예비력을 이용하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 1차 난포를 분리하는 또 다른 이점은 원시 난포의 초기 활성화를 위한 난소 조직 배양을 추가 배양을 위한 1차 난포의 후속 분리와 연관시키는 것입니다. 더 풍부한 1차 단계에서 모낭을 배양하는 것에 대한 관심을 감안할 때, 여기에 제시된 방법은 연구자들이 1차 난포를 분리하는 문제로 인해 이전에 피했을 수 있는 방법을 추구하도록 장려할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 USDA 다중 상태 프로젝트 W4112와 UC Davis Jastro Shields 상을 SM에 의해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.
저자는 모든 실험에 사용 된 소 난소를 제공 한 Central Valley Meat, Inc.에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 또한 난소 처리 및 난포 분리에 대한 도움을 준 Olivia Silvera에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope - Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope - Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope - Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
References
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the 'holy grail' for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
