Summary

Выделение малых преантральных фолликулов из бычьего яичника с использованием комбинации фрагментации, гомогенизации и последовательной фильтрации

Published: September 27, 2022
doi:

Summary

Продвижение исследования преантрального фолликулогенеза требует эффективных методов выделения фолликулов из одиночных яичников. Здесь представлен упрощенный механический протокол выделения фолликулов из яичников крупного рогатого скота с использованием измельчителя тканей и гомогенизатора. Этот метод позволяет собрать большое количество жизнеспособных преантральных фолликулов из одного яичника.

Abstract

Понимание полного процесса фолликулогенеза млекопитающих имеет решающее значение для улучшения вспомогательных репродуктивных технологий у домашнего скота, людей и исчезающих видов. Исследования были в основном ограничены антральными и крупными преантральными фолликулами из-за трудностей с выделением более мелких преантральных фолликулов, особенно у крупных млекопитающих, таких как виды крупного рогатого скота. Эта работа представляет собой эффективный подход к извлечению большого количества небольших преантральных фолликулов из одного бычьего яичника. Кору отдельных бычьих яичников разрезали на 500 мкм кубиков с помощью измельчителя тканей и гомогенизировали в течение 6 мин при 9000-11000 об/мин с помощью 10-мм зонда. Крупный мусор отделяли от гомогената с помощью сырной ткани с последующей последовательной фильтрацией через клеточные сетчатые фильтры 300 мкм и 40 мкм. Содержимое, оставшееся в 40-мкм ситечке, промывали в поисковую посуду, где фолликулы были идентифицированы и собраны в каплю среды. Жизнеспособность собранных фолликулов была проверена с помощью окрашивания в синий цвет трипана. Этот метод позволяет выделить большое количество жизнеспособных мелких преантральных фолликулов из одного бычьего яичника примерно за 90 мин. Важно отметить, что этот метод является полностью механическим и позволяет избежать использования ферментов для диссоциации ткани, что может повредить фолликулы. Фолликулы, полученные с использованием этого протокола, могут быть использованы для последующих применений, таких как выделение РНК для RT-qPCR, иммунолокализация специфических белков и культура in vitro .

Introduction

Фолликулы яичников являются функциональными единицами яичника, ответственными за выработку гаметы (ооцита), а также гормонов, критически важных для репродуктивной функции и общего состояния здоровья. Примордиальные фолликулы образуются в яичнике во время внутриутробного развития или в неонатальном периоде в зависимости от вида1, и они составляют женский овариальный резерв. Рост фолликулов начинается с активации первичных фолликулов, которые покидают бассейн покоя и входят в фазу роста. Преантральный фолликулогенез, охватывающий все стадии фолликула до развития антрального нерва, представляет собой высокодинамичный процесс, требующий синхронных морфологических и метаболических изменений в ооците и окружающих клетках гранулезы, обусловленных тесной связью между этими двумя типами клеток 2,3. Преантральные фолликулы составляют большинство фолликулярных единиц, обнаруженных в яичнике в любой момент времени4. Развитие через преантральные стадии фолликулогенеза оценивается на несколько недель дольше, чем антральное развитие 5,6, и это время необходимо для того, чтобы яйцеклетки и соматические клетки приобрели достаточную зрелость, чтобы войти в заключительную стадию развития (т. е. антральную стадию), и подготовиться к овуляции, оплодотворению и эмбриональному развитию 7,8,9.

Большая часть текущих знаний о преантральном фолликулогенезе яичников поступает из мышиных моделей 10,11,12,13, отчасти из-за легкости восстановления большого количества этих фолликулов из меньшего и менее волокнистого яичника. Хотя сообщения об выделении большого количества преантральных фолликулов из бычьих яичников датируются примерно 30 годами14, более полное понимание процессов, регулирующих развитие этих фолликулов на ранней стадии, остается нереализованным, в основном из-за отсутствия оптимизированных, эффективных и повторяемых методов для извлечения достаточного количества жизнеспособных преантральных фолликулов, особенно на ранних стадиях развития. С ростом интереса к сохранению овариального резерва для будущего использования в вспомогательной репродукции у людей, коровы становятся привлекательной моделью из-за их более похожей структуры яичников15. Однако бычий яичник заметно богаче коллагеном по сравнению с мышиным яичником16, что делает механическую изоляцию с использованием методов, описанных для мыши, очень неэффективной. Усилия по расширению методов сохранения фертильности включают полный рост преантральных фолликулов in vitro до антральной стадии, за которым следует созревание in vitro (IVM) заключенных ооцитов, экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), а также производство и перенос эмбрионов17. До сих пор весь этот процесс был достигнут только у мышей18. У крупного рогатого скота прогресс в направлении роста фолликулов in vitro ограничен несколькими сообщениями с переменными стадиями фолликула в начале культуры, а также переменной длиной культивирования между протоколами17,19.

Методы, описанные в литературе для сбора преантральных фолликулов из бычьего яичника, в основном использовали механические и ферментативные методы, либо изолированные, либо в комбинации 2,14,17,20. В первом отчете о протоколе выделения преантрального фолликула крупного рогатого скота использовался гомогенизатор ткани и последовательная фильтрация для обработки целых яичников20. За этим исследованием последовали отчеты, сочетающие механические и ферментативные процедуры, в которых использовалась коллагеназа14. Повторяющейся темой при использовании коллагеназы для переваривания ткани яичников является потенциальный риск повреждения фолликулярной базальной мембраны, что может поставить под угрозу жизнеспособность фолликула 14,21,22,23. Поэтому были использованы различные комбинации механических методов, такие как использование измельчителя ткани и повторного пипетки или измельчителятканей в сочетании с гомогенизацией 20,24,25,26. Другой механический метод, который был описан, использует иглы для рассечения преантральных фолликулов непосредственно из ткани яичников, что особенно полезно для выделения более крупных (>200 мкм) вторичных фолликулов. Однако этот процесс занимает много времени, неэффективен для выделения меньших преантральных фолликулов и зависит от набора навыков при попытке в бычьих яичниках 19,27,28.

Используя преимущества различных методов, описанных в литературе, этот протокол был направлен на оптимизацию выделения преантральных фолликулов из одиночных бычьих яичников простым, последовательным и эффективным способом, который позволяет избежать инкубации в ферментативных растворах. Совершенствование методов выделения преантральных фолликулов даст возможность углубить понимание этой стадии фолликулогенеза и позволит разработать эффективные культуральные системы для развития преантральных фолликулов до антральной стадии. Подробные процедуры, описанные в настоящем описании для выделения преантральных фолликулов от крупного млекопитающего, такого как бычий вид, будут иметь жизненно важное значение для исследователей, стремящихся изучить ранний фолликулогенез у немышечных видов, которые могут быть переведены на людей.

Protocol

Яичники крупного рогатого скота (Bos taurus) были получены с местной скотобойни и транспортированы в лабораторию в течение 6 часов после сбора. Из-за большого количества животных, обрабатываемых в учреждении, возраст, порода и стадия цикла течки животных неизвестны. Поскольку в этих экс…

Representative Results

Обзор и критические шагиИспользуя этот протокол, небольшие преантральные фолликулы крупного рогатого скота могут быть надежно выделены из отдельных яичников в экспериментально релевантных количествах. Из общего числа 30 реплик было получено в среднем 41 фолликул на реплика…

Discussion

В настоящем протоколе подробно описывается воспроизводимый метод извлечения преантральных фолликулов на ранней стадии, особенно на первичных и ранних вторичных стадиях, из бычьего яичника. Этот протокол основан на предыдущих отчетах 20,25,30,34,35,36 и обеспечивает оптимизацию, которая при?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект был частично профинансирован многогосударственным проектом USDA W4112 и наградой UC Davis Jastro Shields для SM.

Авторы хотели бы выразить свою признательность Central Valley Meat, Inc. за предоставление бычьих яичников, используемых во всех экспериментах. Авторы также благодарят Оливию Сильвера за помощь в обработке яичников и выделении фолликулов.

Materials

5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette Duran Wheaton Kimble 63A54 Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe Fisher Scientific Z116882-100EA Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade Fisher Scientific 50-365-023 Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer Fisher Scientific  22-363-547 Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel Fisher Scientific 10-348C Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer pluriSelect  43-50300-03 Used to filter the filtrate from the cheese cloth 
500 mL Erlenmeyer Flask Fisher Scientific FB500500 Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth 
Air-Tite Sterile Needles 18 G Thermo Fisher Scientific 14-817-151 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm Fisher Scientific 14-817-171 Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution Fisher Scientific BDB561908 Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030-100G  Component of follicle wash media
Cheese Cloth Electron Microscopy Sciences 71748-00 First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades Wilkinson Sword N/A Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Fisher Scientific A-21206 Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs Fisher Scientific S29388 Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer Sigma-Aldrich H3375 Component of follicle wash media
Homogenizer VWR 10032-336 Homogenize the ovarian tissue to release follicles 
ImageJ/Fiji NIH v2.3.1 Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper Ted Pella 10184 Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope – Stereoscope Olympus SZX2-ILLT Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope – Inverted Nikon Diaphot 300 Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope – Inverted ECHO Revolve R4 Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil Sigma-Aldrich M8410-1L Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-050 Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-001 Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF Thermo Fisher Scientific 144444 4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x Gibco 15-140-122 Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm Ted Pella 10184-04 Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP665-1 Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board Fisher Scientific 09-002-24A Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Fisher Scientific BP431-100 Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other 
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA column clean-up kit
R The R Foundation v4.1.2 Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody Abcam ab181701 Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific K1691 cDNA synthesis kit
Rstudio RStudio, PBC v2021.09.2 Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) Fisher Scientific SS266-1 Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr) Gibco 11360-070 Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm  Thermo Fisher Scientific 60872-310 Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles 
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix BioRad 1725271 Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter Sigma-Aldrich S2GPT02RE Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain Thermo Fisher Scientific S33102 Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts Gibco 12-350-039 Component of follicle wash medium
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15-250-061 Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20 Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal WTA 20931 Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets Drummond 50002-005 Glass micropipettes to manipulate follicles

References

  1. Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
  2. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
  3. Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
  4. Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
  5. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  6. Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
  7. Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279 (1), 20-30 (2005).
  8. Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
  9. Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
  10. Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  11. Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
  12. McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
  13. Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
  14. Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
  15. Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
  16. Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
  17. Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
  18. Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
  19. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  20. Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
  21. Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
  22. Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
  23. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
  24. Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
  25. Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
  26. Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
  27. vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
  28. Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
  31. Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
  32. Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
  33. Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
  34. Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
  35. Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
  36. Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
  37. Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
  38. Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
  39. Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
  40. Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
  41. Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the ‘holy grail’ for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
  42. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
  43. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
  44. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  45. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).

Play Video

Cite This Article
McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration. J. Vis. Exp. (187), e64423, doi:10.3791/64423 (2022).

View Video