Выделение малых преантральных фолликулов из бычьего яичника с использованием комбинации фрагментации, гомогенизации и последовательной фильтрации
Summary
Продвижение исследования преантрального фолликулогенеза требует эффективных методов выделения фолликулов из одиночных яичников. Здесь представлен упрощенный механический протокол выделения фолликулов из яичников крупного рогатого скота с использованием измельчителя тканей и гомогенизатора. Этот метод позволяет собрать большое количество жизнеспособных преантральных фолликулов из одного яичника.
Abstract
Понимание полного процесса фолликулогенеза млекопитающих имеет решающее значение для улучшения вспомогательных репродуктивных технологий у домашнего скота, людей и исчезающих видов. Исследования были в основном ограничены антральными и крупными преантральными фолликулами из-за трудностей с выделением более мелких преантральных фолликулов, особенно у крупных млекопитающих, таких как виды крупного рогатого скота. Эта работа представляет собой эффективный подход к извлечению большого количества небольших преантральных фолликулов из одного бычьего яичника. Кору отдельных бычьих яичников разрезали на 500 мкм кубиков с помощью измельчителя тканей и гомогенизировали в течение 6 мин при 9000-11000 об/мин с помощью 10-мм зонда. Крупный мусор отделяли от гомогената с помощью сырной ткани с последующей последовательной фильтрацией через клеточные сетчатые фильтры 300 мкм и 40 мкм. Содержимое, оставшееся в 40-мкм ситечке, промывали в поисковую посуду, где фолликулы были идентифицированы и собраны в каплю среды. Жизнеспособность собранных фолликулов была проверена с помощью окрашивания в синий цвет трипана. Этот метод позволяет выделить большое количество жизнеспособных мелких преантральных фолликулов из одного бычьего яичника примерно за 90 мин. Важно отметить, что этот метод является полностью механическим и позволяет избежать использования ферментов для диссоциации ткани, что может повредить фолликулы. Фолликулы, полученные с использованием этого протокола, могут быть использованы для последующих применений, таких как выделение РНК для RT-qPCR, иммунолокализация специфических белков и культура in vitro .
Introduction
Фолликулы яичников являются функциональными единицами яичника, ответственными за выработку гаметы (ооцита), а также гормонов, критически важных для репродуктивной функции и общего состояния здоровья. Примордиальные фолликулы образуются в яичнике во время внутриутробного развития или в неонатальном периоде в зависимости от вида1, и они составляют женский овариальный резерв. Рост фолликулов начинается с активации первичных фолликулов, которые покидают бассейн покоя и входят в фазу роста. Преантральный фолликулогенез, охватывающий все стадии фолликула до развития антрального нерва, представляет собой высокодинамичный процесс, требующий синхронных морфологических и метаболических изменений в ооците и окружающих клетках гранулезы, обусловленных тесной связью между этими двумя типами клеток 2,3. Преантральные фолликулы составляют большинство фолликулярных единиц, обнаруженных в яичнике в любой момент времени4. Развитие через преантральные стадии фолликулогенеза оценивается на несколько недель дольше, чем антральное развитие 5,6, и это время необходимо для того, чтобы яйцеклетки и соматические клетки приобрели достаточную зрелость, чтобы войти в заключительную стадию развития (т. е. антральную стадию), и подготовиться к овуляции, оплодотворению и эмбриональному развитию 7,8,9.
Большая часть текущих знаний о преантральном фолликулогенезе яичников поступает из мышиных моделей 10,11,12,13, отчасти из-за легкости восстановления большого количества этих фолликулов из меньшего и менее волокнистого яичника. Хотя сообщения об выделении большого количества преантральных фолликулов из бычьих яичников датируются примерно 30 годами14, более полное понимание процессов, регулирующих развитие этих фолликулов на ранней стадии, остается нереализованным, в основном из-за отсутствия оптимизированных, эффективных и повторяемых методов для извлечения достаточного количества жизнеспособных преантральных фолликулов, особенно на ранних стадиях развития. С ростом интереса к сохранению овариального резерва для будущего использования в вспомогательной репродукции у людей, коровы становятся привлекательной моделью из-за их более похожей структуры яичников15. Однако бычий яичник заметно богаче коллагеном по сравнению с мышиным яичником16, что делает механическую изоляцию с использованием методов, описанных для мыши, очень неэффективной. Усилия по расширению методов сохранения фертильности включают полный рост преантральных фолликулов in vitro до антральной стадии, за которым следует созревание in vitro (IVM) заключенных ооцитов, экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), а также производство и перенос эмбрионов17. До сих пор весь этот процесс был достигнут только у мышей18. У крупного рогатого скота прогресс в направлении роста фолликулов in vitro ограничен несколькими сообщениями с переменными стадиями фолликула в начале культуры, а также переменной длиной культивирования между протоколами17,19.
Методы, описанные в литературе для сбора преантральных фолликулов из бычьего яичника, в основном использовали механические и ферментативные методы, либо изолированные, либо в комбинации 2,14,17,20. В первом отчете о протоколе выделения преантрального фолликула крупного рогатого скота использовался гомогенизатор ткани и последовательная фильтрация для обработки целых яичников20. За этим исследованием последовали отчеты, сочетающие механические и ферментативные процедуры, в которых использовалась коллагеназа14. Повторяющейся темой при использовании коллагеназы для переваривания ткани яичников является потенциальный риск повреждения фолликулярной базальной мембраны, что может поставить под угрозу жизнеспособность фолликула 14,21,22,23. Поэтому были использованы различные комбинации механических методов, такие как использование измельчителя ткани и повторного пипетки или измельчителятканей в сочетании с гомогенизацией 20,24,25,26. Другой механический метод, который был описан, использует иглы для рассечения преантральных фолликулов непосредственно из ткани яичников, что особенно полезно для выделения более крупных (>200 мкм) вторичных фолликулов. Однако этот процесс занимает много времени, неэффективен для выделения меньших преантральных фолликулов и зависит от набора навыков при попытке в бычьих яичниках 19,27,28.
Используя преимущества различных методов, описанных в литературе, этот протокол был направлен на оптимизацию выделения преантральных фолликулов из одиночных бычьих яичников простым, последовательным и эффективным способом, который позволяет избежать инкубации в ферментативных растворах. Совершенствование методов выделения преантральных фолликулов даст возможность углубить понимание этой стадии фолликулогенеза и позволит разработать эффективные культуральные системы для развития преантральных фолликулов до антральной стадии. Подробные процедуры, описанные в настоящем описании для выделения преантральных фолликулов от крупного млекопитающего, такого как бычий вид, будут иметь жизненно важное значение для исследователей, стремящихся изучить ранний фолликулогенез у немышечных видов, которые могут быть переведены на людей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем протоколе подробно описывается воспроизводимый метод извлечения преантральных фолликулов на ранней стадии, особенно на первичных и ранних вторичных стадиях, из бычьего яичника. Этот протокол основан на предыдущих отчетах 20,25,30,34,35,36 и обеспечивает оптимизацию, которая при?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был частично профинансирован многогосударственным проектом USDA W4112 и наградой UC Davis Jastro Shields для SM.
Авторы хотели бы выразить свою признательность Central Valley Meat, Inc. за предоставление бычьих яичников, используемых во всех экспериментах. Авторы также благодарят Оливию Сильвера за помощь в обработке яичников и выделении фолликулов.
Materials
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
References
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the ‘holy grail’ for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
