يتطلب التقدم في دراسة تكوين الجريب قبل الكثبان طرقا فعالة لعزل الجريب عن المبايض المفردة. يظهر هنا بروتوكول ميكانيكي مبسط لعزل الجريب عن المبايض البقري باستخدام مروحية الأنسجة والخالط. تسمح هذه الطريقة بجمع عدد كبير من بصيلات preantral القابلة للحياة من مبيض واحد.
يعد فهم العملية الكاملة لتكوين الجريب في الثدييات أمرا بالغ الأهمية لتحسين تقنيات الإنجاب المساعدة في الماشية والبشر والأنواع المهددة بالانقراض. اقتصرت الأبحاث في الغالب على الجريبات الغارية والكبيرة بسبب صعوبة عزل البصيلات قبل الغريبة الأصغر ، خاصة في الثدييات الكبيرة مثل أنواع الأبقار. يقدم هذا العمل نهجا فعالا لاسترداد أعداد كبيرة من الجريبات الصغيرة من مبيض بقري واحد. تم تقطيع قشرة المبيضين البقري الفردي إلى مكعبات 500 ميكرومتر باستخدام مفرمة الأنسجة ومتجانسة لمدة 6 دقائق عند 9000-11000 دورة في الدقيقة باستخدام مسبار 10 مم. تم فصل الحطام الكبير عن التجانس باستخدام قطعة قماش جبن ، يليه ترشيح تسلسلي من خلال مصافي خلايا 300 ميكرومتر و 40 ميكرومتر. تم شطف المحتويات المحتفظ بها في مصفاة 40 ميكرومتر في طبق بحث ، حيث تم تحديد البصيلات وجمعها في قطرة من المتوسط. تم اختبار صلاحية البصيلات التي تم جمعها عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق. تتيح هذه الطريقة عزل عدد كبير من البصيلات الصغيرة القابلة للحياة من مبيض بقري واحد في حوالي 90 دقيقة. الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة ميكانيكية بالكامل وتتجنب استخدام الإنزيمات لفصل الأنسجة ، مما قد يؤدي إلى تلف البصيلات. يمكن استخدام البصيلات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول للتطبيقات النهائية مثل عزل الحمض النووي الريبي ل RT-qPCR ، والتموضع المناعي لبروتينات معينة ، والثقافة في المختبر .
جريبات المبيض هي الوحدات الوظيفية للمبيض ، المسؤولة عن إنتاج الأمشاج (البويضة) وكذلك الهرمونات الضرورية للوظيفة الإنجابية والصحة العامة. تتشكل بصيلات بدائية في المبيض أثناء نمو الجنين أو في فترة حديثي الولادة اعتمادا على الأنواع1 ، وتشكل احتياطي مبيض الأنثى. يبدأ النمو المسامي بتنشيط البصيلات البدائية التي تغادر بركة الراحة وتدخل مرحلة النمو. تكوين الجريبات قبل الغار ، الذي يشمل جميع مراحل الجريب قبل تطور الغار ، هو عملية ديناميكية للغاية تتطلب تغييرات مورفولوجية واستقلابية متزامنة في البويضة والخلايا الحبيبية المحيطة بها ، مدفوعة باتصال وثيق بين هذين النوعين من الخلايا 2,3. تشكل الجريبات قبل النطرية غالبية الوحدات المسامية الموجودة في المبيض فيأي وقت 4. يقدر التطور خلال المراحل السابقة لتكوين الجريبات بعدة أسابيع أطول من التطور الغاري 5,6 ، وهذه المرة ضرورية للخلايا البيضية والجسدية لاكتساب النضج الكافي لدخول المرحلة النهائية من التطور (أي المرحلة الغارية) ، والاستعداد للإباضة والإخصاب والتطور الجنيني 7,8,9.
يأتي الكثير من المعرفة الحالية حول تكوين جريبات المبيض قبل الحلق من نماذج الفئران10،11،12،13 ، ويرجع ذلك جزئيا إلى سهولة استعادة عدد كبير من هذه البصيلات من مبيض أصغر وأقل ليفية. على الرغم من أن التقارير عن عزل أعداد كبيرة من الجريبات قبل الجريبات من المبيضين البقري تعود إلى ما يقرب من 30 عاما14 ، إلا أن الفهم الأكثر اكتمالا حول العمليات التي تنظم تطور هذه البصيلات في المراحل المبكرة ظل غير محقق ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى عدم وجود طرق محسنة وفعالة وقابلة للتكرار لاسترداد أعداد كافية من بصيلات ما قبل البكرات القابلة للحياة ، خاصة في المراحل المبكرة من التطور. مع الاهتمام المتزايد بالحفاظ على احتياطي المبيض للاستخدام المستقبلي في المساعدة على الإنجاب في البشر ، تصبح الأبقار نموذجا جذابا بسبب بنية المبيض الأكثر تشابها15. ومع ذلك ، فإن المبيض البقري أكثر ثراء بشكل ملحوظ في الكولاجين مقارنة بمبيض الفأر16 ، مما يجعل العزل الميكانيكي باستخدام الطرق الموصوفة للفأر غير فعال للغاية. تشمل الجهود المبذولة لتوسيع تقنيات الحفاظ على الخصوبة النمو الكامل في المختبر للجريبات قبل الغريبة إلى المرحلة الغارية ، يليها النضج في المختبر (IVM) للبويضات المغلقة ، والتخصيب في المختبر (IVF) ، وإنتاج الأجنة ونقلها17. حتى الآن ، تم تحقيق هذه العملية برمتها فقط في الفئران18. في الماشية ، يقتصر التقدم نحو نمو الجريب في المختبر على عدد قليل من التقارير مع مراحل جريب متغيرة في بداية الاستزراع ، بالإضافة إلى طول متغير للثقافة بين البروتوكولات17،19.
استخدمت الطرق الموضحة في الأدبيات لحصاد بصيلات ما قبل البقر من المبيض البقري في الغالب تقنيات ميكانيكية وإنزيمية ، إما معزولة أو مجتمعة2،14،17،20. استخدم التقرير الأول لبروتوكول عزل الجريب البقري خالط الأنسجة والترشيح التسلسلي لمعالجة المبايض الكاملة20. تبعت هذه الدراسة تقارير تجمع بين الإجراءات الميكانيكية والأنزيمية التي استخدمت كولاجيناز14. الموضوع المتكرر عند استخدام كولاجيناز لهضم أنسجة المبيض هو الخطر المحتمل لتلف الغشاء القاعدي المسامي ، مما قد يضر بصلاحية الجريب14،21،22،23. لذلك ، تم استخدام مجموعات مختلفة من الطرق الميكانيكية ، مثل استخدام مفرمة الأنسجة والماصات المتكررة أو مفرمة الأنسجة جنبا إلى جنب مع التجانس20،24،25،26. هناك تقنية ميكانيكية أخرى تم وصفها تستخدم الإبر لتشريح بصيلات ما قبل الجريبات مباشرة من أنسجة المبيض ، وهي مفيدة بشكل خاص لعزل بصيلات ثانوية أكبر (>200 ميكرومتر). ومع ذلك ، فإن هذه العملية تستغرق وقتا طويلا ، وغير فعالة لعزل بصيلات ما قبل البكرات الأصغر ، وتعتمد على مجموعة المهارات عند تجربتها في المبايض البقري19،27،28.
بالاستفادة من التقنيات المختلفة الموضحة في الأدبيات ، يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين عزل بصيلات ما قبل البقران من المبايض المفردة بطريقة بسيطة ومتسقة وفعالة تتجنب الحضانة في المحاليل الأنزيمية. سيوفر تحسين طرق عزل الجريبات قبل الجريبية فرصة لتعزيز فهم هذه المرحلة من تكوين الجريب وتمكين تطوير أنظمة استزراع فعالة لتطوير بصيلات ما قبل الجريبات إلى المرحلة الغارية. ستكون الإجراءات التفصيلية الموضحة هنا لعزل البصيلات قبل الجريبة من الثدييات الكبيرة مثل الأنواع البقرية حيوية للباحثين الذين يهدفون إلى دراسة تكوين الجريبات المبكر في الأنواع غير الفئران التي يمكن ترجمتها إلى البشر.
يفصل البروتوكول الحالي طريقة قابلة للتكرار لاسترداد الجريبات قبل الحمراء في المرحلة المبكرة ، وتحديدا في المراحل الأولية والثانوية المبكرة ، من المبيض البقري. يعتمد هذا البروتوكول على التقارير السابقة20،25،30،34،35،</…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا المشروع جزئيا من قبل مشروع وزارة الزراعة الأمريكية متعدد الولايات W4112 وجائزة UC Davis Jastro Shields إلى SM.
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم لشركة Central Valley Meat، Inc. لتوفير المبايض البقري المستخدمة في جميع التجارب. يشكر المؤلفون أيضا أوليفيا سيلفيرا للمساعدة في معالجة المبيض وعزل الجريب.
5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
#21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |