Summary
Fremme af undersøgelsen af præantral folliculogenese kræver effektive metoder til follikelisolering fra enkelt æggestokke. Præsenteret her er en strømlinet, mekanisk protokol til follikelisolering fra kvæg æggestokke ved hjælp af en vævshakker og homogenisator. Denne metode tillader indsamling af et stort antal levedygtige præantrale follikler fra en enkelt æggestok.
Abstract
Forståelse af den fulde proces med pattedyrs folliculogenese er afgørende for at forbedre assisterede reproduktionsteknologier hos husdyr, mennesker og truede arter. Forskningen har for det meste været begrænset til antrale og store præantrale follikler på grund af vanskeligheder med isolering af mindre præantrale follikler, især hos store pattedyr såsom kvæg. Dette arbejde præsenterer en effektiv tilgang til at hente et stort antal små præantrale follikler fra en enkelt kvæg æggestok. Cortex af individuelle kvæg æggestokke blev skåret i 500 μm terninger ved hjælp af en vævskhopper og homogeniseret i 6 minutter ved 9.000-11.000 o / min ved hjælp af en 10 mm sonde. Stort affald blev adskilt fra homogenatet ved hjælp af en osteklud efterfulgt af seriel filtrering gennem 300 μm og 40 μm cellesi. Indholdet i 40 μm silen blev skyllet i en søgeskål, hvor follikler blev identificeret og opsamlet i en dråbe medium. Levedygtigheden af de indsamlede follikler blev testet via trypanblå farvning. Denne metode muliggør isolering af et stort antal levedygtige små præantrale follikler fra en enkelt kvæg æggestok på ca. 90 min. Det er vigtigt, at denne metode er helt mekanisk og undgår brugen af enzymer til at adskille vævet, hvilket kan beskadige folliklerne. Folliklerne opnået ved anvendelse af denne protokol kan anvendes til downstream-applikationer såsom isolering af RNA til RT-qPCR, immunolokalisering af specifikke proteiner og in vitro-kultur .
Introduction
Ovariefollikler er de funktionelle enheder i æggestokken, der er ansvarlige for produktionen af gamete (oocyt) samt hormoner, der er kritiske for reproduktiv funktion og generel sundhed. Primordiale follikler dannes i æggestokken under fosterudvikling eller i neonatalperioden afhængigt af arten1, og de udgør en kvindes ovariereservat. Follikulær vækst begynder med aktivering af primordiale follikler, der forlader hvilebassinet og går ind i vækstfasen. Præantral folliculogenese, der omfatter alle follikelstadier før antrumudvikling, er en meget dynamisk proces, der kræver synkrone morfologiske og metaboliske ændringer i oocytten og de omgivende granulosaceller, drevet af tæt kommunikation mellem disse to celletyper 2,3. Præantrale follikler udgør størstedelen af de follikulære enheder, der findes i æggestokken på et givet tidspunkt4. Udvikling gennem de præantrale stadier af folliculogenese anslås at være flere uger længere end antral udvikling5,6, og denne tid er nødvendig for, at oocyt- og somatiske celler får tilstrækkelig modenhed til at komme ind i det sidste udviklingsstadium (dvs. antralstadiet) og forberede sig på ægløsning, befrugtning og embryonal udvikling 7,8,9.
Meget af den nuværende viden om ovarie præantral folliculogenese kommer fra musemodeller10,11,12,13, delvis på grund af letheden ved at genvinde et stort antal af disse follikler fra en mindre og mindre fibrøs æggestok. Selvom rapporter om isolering af et stort antal præantrale follikler fra kvæg æggestokke går ca. 30 år14 tilbage, er en mere fuldstændig forståelse af de processer, der regulerer udviklingen af disse tidlige follikler, forblevet urealiseret, hovedsageligt på grund af manglen på optimerede, effektive og gentagelige metoder til at hente et tilstrækkeligt antal levedygtige præantrale follikler, især i tidlige udviklingsstadier. Med den stigende interesse for at bevare ovariereservatet til fremtidig brug i assisteret reproduktion hos mennesker bliver køer en attraktiv model på grund af deres mere lignende ovariestruktur15. Imidlertid er kvægets æggestok markant rigere på kollagen sammenlignet med musens æggestok16, hvilket gør mekanisk isolering ved hjælp af metoder beskrevet for musen meget ineffektiv. Bestræbelser på at udvide fertilitetsbevarelsesteknikker omfatter fuldstændig in vitro-vækst af præantrale follikler til antralstadiet efterfulgt af in vitro-modning (IVM) af de lukkede oocytter, in vitro-befrugtning (IVF) og embryoproduktion og -overførsel 17. Indtil videre er hele denne proces kun opnået hos mus18. Hos kvæg er fremskridtene mod follikelvækst in vitro begrænset til nogle få rapporter med variable follikelstadier i starten af kulturen samt variabel kulturlængde mellem protokollerne17,19.
De metoder, der er beskrevet i litteraturen til høst af præantrale follikler fra kvægets æggestok, har hovedsagelig anvendt mekaniske og enzymatiske teknikker, enten isoleret eller i kombination 2,14,17,20. Den første rapport om en protokol for præantral follikelisolering fra kvæg anvendte en vævshomogenisator og seriel filtrering til behandling af hele æggestokke20. Denne undersøgelse blev efterfulgt af rapporter, der kombinerede mekaniske og enzymatiske procedurer, der anvendte collagenase14. Et tilbagevendende tema ved anvendelse af collagenase til at fordøje æggestokkene er den potentielle risiko for beskadigelse af follikulær kældermembran, hvilket kan kompromittere follikellevedygtigheden 14,21,22,23. Derfor er der anvendt forskellige kombinationer af mekaniske metoder, såsom brugen af en vævshakker og gentagen pipettering eller en vævshakker kombineret med homogenisering20,24,25,26. En anden mekanisk teknik, der er beskrevet, bruger nåle til at dissekere præantrale follikler direkte fra æggestokkene, hvilket er særligt nyttigt til isolering af større (>200 μm) sekundære follikler. Denne proces er imidlertid tidskrævende, ineffektiv til isolering af mindre præantrale follikler og er færdighedsafhængig, når den forsøges i kvæg æggestokke 19,27,28.
Ved at udnytte de forskellige teknikker, der er beskrevet i litteraturen, havde denne protokol til formål at optimere isoleringen af præantrale follikler fra enkeltkvæg æggestokke på en enkel, konsistent og effektiv måde, der undgår inkubation i enzymatiske opløsninger. Forbedring af metoderne til isolering af præantrale follikler vil give mulighed for at forbedre forståelsen af dette stadium af folliculogenese og muliggøre udvikling af effektive kultursystemer til udvikling af præantrale follikler til antralstadiet. De detaljerede procedurer, der er beskrevet heri for isolering af præantrale follikler fra et stort pattedyr som kvægarten, vil være afgørende for forskere, der sigter mod at studere tidlig folliculogenese i en ikke-murinart, der kan oversættes til mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kvæg (Bos taurus) æggestokke blev hentet fra et lokalt slagteri og transporteret til laboratoriet inden for 6 timer efter indsamling. På grund af det store antal dyr, der behandles i anlægget, er dyrenes alder, race og stadium af østruscyklus ukendt. Da der ikke blev anvendt levende dyr i disse forsøg, var en godkendt dyrepleje- og brugsprotokol ikke påkrævet.
1. Klargøring af udstyr og reagenser
- Dæk en 2 ft bred sektion af en laboratoriebænk med bænkpapir.
- Få et skalpelhåndtag, sterilt skalpelblad, hæmostat, par dissektionstang, 20 ml luerlåssprøjte, 18 G nål, to 200 ml bægerglas, 500 ml Erlenmeyer-kolbe, plasttragt med en diameter på 104 mm, plastskærebræt, et 22 cm2 lag osteklæde (osteklædet kan steriliseres ved autoklavering inden brug) pr. æggestok, der behandles, en 300 μm cellesi og en 40 μm cellesi (se Materialetabel).
- Overfør alt udstyr til bænkpapiret.
- Brug hæmostaten til at sætte skalpelbladet på skalpelhåndtaget. Juster bladets vinklede bund til den vinklede indikator på håndtaget, og skub derefter bladet ind i håndtagets rille.
- Anbring tragten i Erlenmeyer-kolben, og dæk tragtåbningen med osteklædet.
- Der anbringes et konisk rør på 50 ml pr. æggestok, der skal behandles, i et vand- eller perlebad, der er indstillet til 38,5 °C.
- Der anbringes en 100 mm x 15 mm firkantet petriskål pr. æggestok, der behandles, på en lysdiodervarmer, der er indstillet til 38,5 °C.
- Der tilsættes 10 ml penicillin-streptomycin (PenStrep; 10.000 U/ml penicillin og 10.000 μg/ml streptomycin) til 1 liter 1x fosfatbufferet saltvand (PBS). PBS + PenStrep opvarmes i et vand- eller perlebad, der er indstillet til 38,5 °C mindst 2 timer før behandling af æggestokke.
BEMÆRK: PBS + PenStrep-opløsning er afgørende for vask af æggestokke, når isolerede follikler dyrkes, og det anbefales stadig til eventuelle downstream-eksperimenter for at afbøde mikrobiel kontaminering. - Til opsamling af forarbejdet ovariefiltrat skal du bruge Follicle Wash Medium (FWM) bestående af TCM199 med Hanks salte (se materialetabel) indeholdende 3 mg/ml bovin serumalbumin (BSA), 25 mM HEPES buffer, 100 UI penicillin/100 μg/ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat (NaPyr) og 100 nM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA).
- Overfør steril TCM199, en 250 ml flaske og en 100 ml gradueret cylinder til et biosikkerhedsskab (BSC). Overfør 194 ml TCM199 til flasken.
- Bægerglasset af TCM199 fjernes fra BSC, og der omrøres et røreblad. Tilsæt 600 mg BSA, 1,19 g HEPES-buffer og en autoklaveret rørestang til flasken og rør, indtil den er opløst.
- Når BSA- og HEPES-bufferen er helt opløst, tilsættes 1 N natriumhydroxid (NaOH) til mediet, indtil det når en pH-værdi på 7,6-7,8 målt ved en pH-meter.
- Tør flasken med medium, en vakuumfiltreringsenhed, fire 50 ml koniske rør og flaskerne PenStrep, NaPyr og NEAA med 70% ethanol, inden de overføres til BSC.
- Tilsæt 2 ml hver PenStrep (10.000 U/ml penicillin og 10.000 μg/ml streptomycin), 100 mM NaPyr og 100x NEAA til flasken TCM199 + 3 mg/ml BSA + 25 mM HEPES. Sterilt filtrer det endelige medium og aliquot ind i de 50 ml koniske rør. Mediet opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Varm et 50 ml konisk rør af medium pr. to æggestokke i et perlebad indstillet til 38,5 °C mindst 1 time før behandling af æggestokke.
2. Opsætning af vævshakker
- Sørg for, at vævshakkeren (se Materialetabel) er tilsluttet og tændt.
- Indstil skivetykkelsen til 500 μm, knivkraftkontrolknappen til 20 ° og hastighedskontrolknappen til 90 ° i henhold til producentens specifikationer.
- Sæt en 60 mm petriskål i plast i pladeholderen, og sæt pladeholderen på scenen.
- Løft huggearmen så højt, som den vil gå, ved at dreje den manuelle betjeningsknap med uret.
- Brug tang til at placere et tveægget barberblad (se Materialetabel) på skruen, der er indsat i huggearmen. Placer klingelåsen over klingen og fastgør med skiven og møtrikken. Lad møtrikken stå et kvarter løs.
- Drej på den manuelle betjeningsknap, indtil huggearmen klikker bladet fladt på petriskålen. Spænd møtrikken resten af vejen med nøddedriveren.
- Løft huggearmen så højt, som den vil gå, ved hjælp af den manuelle betjeningsknap. Flyt udløserknappen helt til venstre, indtil den hakker på plads.
3. Forberedelse af æggestokke
- Overfør æggestokke i laboratoriet til varme (38,5 °C) sterile PBS + PenStrep.
BEMÆRK: Det anbefales at behandle æggestokkene til follikelisolering, så snart det er muligt efter fjernelse fra dyret. I denne protokol blev æggestokke behandlet inden for 6 timer efter høst. Æggestokkene blev transporteret fra slagteriet til laboratoriet i termoser indeholdende steril 0,9% saltopløsning ved ca. 38,5 °C. - Hvis det er muligt, skal du vælge små (≤ 4 cm x 3 cm x 3 cm) æggestokke, der indeholder små (3-5 mm) antrale follikler, ingen store (≥8 mm) antrale follikler og ingen fremtrædende corpus luteum (figur 1). Disse kriterier anbefales for at sikre, at en minimal mængde ikke-follikelaffald, såsom stromale celler og ekstracellulær matrix, er inkluderet i den resulterende firkantede skål indeholdende isolerede follikler.
BEMÆRK: Antrale follikler kan identificeres som sfæriske, væskefyldte vesikulære strukturer på overfladen af æggestokken. Corpora lutea kan identificeres som røde, orange eller gule stive strukturer, der stikker ud fra æggestokkens overflade. - Brug saks til at fjerne overskydende bindevæv og fedt fra æggestokkene.
- Æggestokkene vaskes i 30 s i 70% ethanol i et bægerglas.
- Æggestokkene vaskes 3x i 2 minutter hver i bægerglas med varmt (38,5 °C) PBS + PenStrep med frisk PBS + PenStrep til hver vask.
- Hold æggestokkene i varme (38,5 °C) PBS + PenStrep, indtil de er klar til behandling.
BEMÆRK: Afstanden mellem laboratoriet og æggestokkilden kan variere. Derfor er det vigtigt at færdiggøre protokollen rettidigt for at sikre opretholdelse af follikulær levedygtighed.
Figur 1: Anatomi af kvæg æggestok. Kvægets æggestok består af to hovedregioner indesluttet i et epitellag. Cortex, der består af vævet til venstre for den stiplede linje, indeholder ovariefollikler fra det oprindelige stadium til antralstadiet. Præantrale follikler er for små til at se med det blotte øje; antrale follikler er markeret med stjerner. Medulla, der består af vævet til højre for den stiplede linje, indeholder blodkar, lymfekar og nerver. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Hak procedure
BEMÆRK: Behandl kun en æggestok ad gangen. Behandl æggestokke hurtigt for at undgå temperaturfald, hvilket kan påvirke follikelens levedygtighed.
- Overfør en æggestok til skærebrættet på bænkepapiret (figur 2A), og klargør vævshakkeren (figur 2B).
- Brug tang og en skalpel til at skære æggestokken i halve og fjerne medulla fra hver halvdel, så kun cortex efterlades med en tykkelse på ca. 1 mm som vist i figur 2C.
- Skær æggestokken i halve i længderetningen fra et ledbåndsfastgørelsessted til det modsatte fastgørelsessted.
- Hold den ene halvdel af æggestokken på skærebrættet, der skal behandles, og læg den anden halvdel af æggestokken tilbage i varm (38,5 °C) PBS + PenStrep.
- Med den udsatte medulla vendt opad, skær langs æggestokkens krumning ca. 2 mm væk fra overfladen af æggestokken uden at skære gennem cortex.
- Brug skiven langs æggestokkens krumning som en guide til at uddybe skiven, stadig efter æggestokkens krumning for at adskille cortex fra medulla.
- Disseker og kassér enhver corpora lutea fra æggestokken ved at skære langs grænsen til corpus luteum.
- Vend æggestokken halvt over, så epitelet vender opad, og brug skalpellen til at afslutte skæringen af medulla væk fra cortex. Trim eventuelt resterende hvidt bindevæv væk omkring kanten af æggestokstykket, der var forbundet med ledbåndene.
- Når størstedelen af medulla er fjernet, skal du bruge skalpellen til at skære cortex til ca. 1 mm tykkelse. Manipuler skalpellen med små bevægelser frem og tilbage for at barbere resten af medullaen væk.
BEMÆRK: Medulla er den indre del af æggestokken, der indeholder store blodkar. Cortex er den ydre del af æggestokken, der ligger direkte under det yderste overfladeepitel. Cortex er ca. 1 mm tyk i kvægets æggestok, og dermed vil skæring af æggestokken til en tykkelse på 1 mm fjerne medulla.
- Skær cortex i stykker, der ikke er større end 2,5 cm x 2,5 cm. Hold cortex stykkerne i varme (38,5 °C) PBS + PenStrep, indtil de er klar til at hugge.
- Fyld et bægerglas med mindst 50 ml varmt (38,5 °C) PBS + PenStrep, og få en plastoverførselspipette.
- Overfør et enkelt stykke cortex til petriskålen på vævshakkeren og våd vævet med tre eller fire dråber varm (38,5 °C) PBS + PenStrep.
- Hold vævsstykket stabilt med et par tang, og tryk én gang på nulstillingsknappen for at starte vævshakkeren. Stabiliser petriskålen med den ene hånd, mens du fortsætter med at stabilisere vævet med tangen. Flyt tangen tilbage langs vævet efter behov for at undgå, at bladet rammer tangen. De resulterende strimler vil være ca. 500 μm lange.
- Når hele barkhornsstykket er skåret i strimler, skal du bruge knivholderknappen til at løfte bladet af petriskålen og tangen til at fjerne væv fra bladet.
- Drej pladeholderen 90°.
- Tryk én gang på nulstillingsknappen. Stabiliser petriskålen med den ene hånd, mens du bruger tangen til at skubbe vævsstrimlerne ind i bladets bane.
- Før bladet helt gennem vævsstrimlerne. Brug knivholderknappen til at løfte bladet af petriskålen og tangen til at fjerne væv fra bladet.
- Brug overførselspipetten og det varme (38,5 °C) PBS + PenStrep til at vaske det hakkede væv (vævets endelige størrelse: 500 μm x 500 μm x 1 mm terninger) i et forvarmet (38,5 °C) 50 ml konisk rør. Sæt det koniske rør tilbage i vand- eller perlebadet for at holde det hakkede væv varmt (38,5 °C).
- Brug nøddedriveren til at fjerne møtrikken fra huggearmen, og fjern skiven og klingelåsen. Brug tang til at fjerne bladet fra huggearmen, vende det om, så den ubrugte kant vender mod petriskålen, og læg det tilbage på huggearmen. Udskift klingelåsen, skiven og møtrikken, og nulstil udløserknappen som beskrevet i trin 2.5-2.7.
- Gentag trin 4.5-4.12 for alle resterende stykker cortex fra æggestokken, og udskift knive med nye, efter at hver skærekant er blevet brugt.
- Bortskaf alle brugte knive i en hårdvægget beholder med skarpe plastmaterialer.
5. Homogeniseringsprocedure
- Sørg for, at homogenisatorenheden (se Materialetabel) er tilsluttet, og at hastigheden er indstillet til den anden stang (9.000-11.000 o / min). Indsæt 10 mm generatorsonden i enheden i henhold til producentens specifikationer.
- Indstil en timer i 1 min., og indsæt sonden i det 50 ml koniske rør, der indeholder det hakkede cortexvæv fra en æggestok (trin 4.11) og nok PBS + PenStrep til at fylde røret til 25 ml linjen. Dybden, som sonden indsættes i, skal være 1/3 af væskens højde målt fra bunden af kammeret. Placer sonden lidt væk fra midten for at minimere hvirvelstrøm.
- Start timeren og tænd homogenisatoren. Sørg for, at bunden af sonden ikke rører røret, og hold røret stille, mens homogenisatoren er tændt.
- Efter 1 minuts homogenisering fjernes sonden fra røret. Brug tang til at fjerne bindevæv, der tilstopper udluftningshullerne og mellemrummet mellem rotorkniven og rotorrøret. Hvis nogen stykker cortex sidder fast i sonden, skal du fjerne dem med tang og placere dem tilbage i røret.
- Gentag trin 5.2-5.4 yderligere 5x for i alt 6 minutters homogenisering.
- Anbring røret med homogeniseret væv i vandet eller perlebadet for at holde vævet varmt (38,5 °C). Efter behandling af den sidste æggestok skal du straks adskille, rengøre og tørre generatorsonden i henhold til producentens specifikationer.
6. Filtreringsprocedure
- Hæld det spredte væv i den osteklædedækkede tragt, der er indsat i Erlenmeyer-kolben. Indholdet af røret skylles ind i tragten ved hjælp af varme (38,5 °C) PBS + PenStrep, indtil der ikke er nogen vævsfragmenter tilbage i røret.
- Tving vævsfragmenterne til at passere gennem kludens huller ved at dreje osteklædet rundt om vævsfragmenterne og klemme, indtil alt overskydende væske og væv er fjernet fra osteklædet.
- Åbn osteklædet igen over tragten, skyl osteklædet med PBS + PenStrep ved hjælp af en overførselspipette, og pres igen eventuelle resterende vævsfragmenter gennem kluden.
- Brug en hæmostat til at holde 300 μm cellesilen over et 200 ml bægerglas. Hæld filtratet i Erlenmeyer-kolben gennem cellesilen. Kolbens indhold skylles ind i cellesien med varm PBS + PenStrep (38,5 °C), indtil der ikke er vævsfragmenter tilbage.
- Hvis cellesien bliver tilstoppet med væv, skal du forsigtigt banke cellesien mod bægerglasset for at sikre, at al væske er filtreret ind i bægeret, og derefter vende cellesien på hovedet og banke det store vævsaffald ud på bænkpapiret. Cellesien føres tilbage over bægerglasset, og filtratet hældes gennem det. Gentag efter behov, indtil alt filtrat fra Erlenmeyer-kolben er filtreret igennem.
- Brug en hæmostat til at holde 40 μm cellesien over et andet 200 ml bægerglas. Filtratet hældes i det første 200 ml bægerglas gennem cellesilen. Bægerglassets indhold skylles ind i cellesien ved hjælp af varm PBS + PenStrep (38,5 °C), indtil der ikke er nogen vævsfragmenter tilbage. Indholdet af cellesien på 40 μm må ikke kasseres.
- Sæt 18 G-nålen på 20 ml sprøjten. Fyld sprøjten med FWM. Vend 40 μm cellesien på hovedet over en firkantet petriskål, og brug sprøjten til at vaske indholdet af cellesilen ud i fadet. Genopfyld sprøjten, og skyl cellesien efter behov, indtil der ikke er nogen vævsfragmenter tilbage.
BEMÆRK: Typisk er 25 ml FWM tilstrækkeligt til fuldt ud at skylle indholdet af 40 μm cellesilen helt ud.
Figur 2: Opsætning af arbejdsområde til behandling af æggestokke og protokolarbejdsgang. (A) Bænkopsætning til skæring af æggestokke inden hakning og til filtrering af æggestokhomogenatet. (B) Opsætning af vævshakker og homogenisator med isoporstøtte for at reducere vibrationer i homogenisatorstadiet. (C) Skematisk illustration af arbejdsgangen til behandling af en hel æggestok. Æggestokke trimmes af overskydende bindevæv og skæres derefter i halvdelen, og medulla fjernes, indtil der er en ~ 1 mm tyk skive cortex tilbage. Cortex skæres i stykker på 2,5 cm x 2,5 cm og hakkes i en vævshakker indstillet til et snitinterval på 500 μm. Stykkerne homogeniseres derefter, og homogenatet filtreres gennem ostekloth efterfulgt af filtrering gennem 300 μm og 40 μm cellesi. Indholdet af 40 μm cellesilen skylles ind i en firkantet petriskål, som søges efter follikler ved hjælp af et stereomikroskop. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
7. Søgning og indsamling af follikler
- Den firkantede petriskål (trin 6.6) overføres til et stereoskop med et opvarmet trin indstillet til 38,5 °C. Stereoskopforstørrelsen skal indstilles mellem 1,25x og 3,2x afhængigt af søgerens præference.
- Pipetter 10 μL dråber FWM i en 60 mm petriskål og dæk dråberne med mineralolie for at forhindre udtørring. Læg petriskålen med mediedråber på en varmeplade, der er indstillet til 38,5 °C.
BEMÆRK: En 4-brønds plade kan bruges til at samle follikler. Tilsæt 500 μL vaskemedier til en eller to brønde. På varmepladen anbringes 38,5 °C. - Få et mikropipettestempel og en spids.
BEMÆRK: En glas 1-5 μL mikropipette (se Materialetabel) anbefales, fordi folliklerne er mindre tilbøjelige til at klæbe til glaspipetten og gå tabt, når de overføres mellem opløsninger. Det er også et lille nok instrument til at muliggøre lettere og mere præcise mikromanipulationer af folliklerne. - Identificer follikler fra den firkantede petriskål og overfør til medier (FWM) dråber ved hjælp af mikropipetten. Mange follikler vil sandsynligvis være indlejret i vævsaffald og kan hentes ved hjælp af en af to metoder som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Follikler er aflange, snarere end perfekte kugler, og har typisk en oocyt, der præsenterer sig som en solid hvid cirkel i mørkere kontraster, mod midten af folliklen (figur 3A-C). Pas på at undgå at forveksle follikler med denuderede oocytter. Oocytter har tendens til at være perfekte kugler og er omgivet af en tyk, klar membran (zona pellucida). Et omvendt mikroskop med en forstørrelse på 10x (eller større) kan bruges til nærmere undersøgelse af follikler (figur 3D).- Adskil forsigtigt folliklerne fra snavs ved hjælp af spidsen af mikropipetten eller fine (27 G) nåle.
- Alternativt kan du bruge en pasteurpipette i glas med en gummipære til at tage op og sprøjte affaldet ud i fadet flere gange for at løsne follikler fra affaldet.
- Arbejd hurtigt, og tag ikke mere end 30 minutter, for at søge i petriskålen for at hjælpe med at bevare folliklens levedygtighed.
- Placer maksimalt kun fem follikler pr. 10 μL dråbe, da en højere densitet kan øge sandsynligheden for, at follikler klæber sammen.
8. Test af trypanblå udelukkelseslevedygtighed
BEMÆRK: Brug låget på en petriskål eller en 4-brønds tallerken til alle de følgende trin, da folliklerne klæber mindre til lågets plastik, end de gør til plasten i selve skålen.
- Der fremstilles PBS + 0,2% polyvinylpyrrolidon (PVP) ved at opløse 100 mg PVP i 50 ml PBS.
BEMÆRK: PVP bruges her til at reducere sandsynligheden for, at follikler fastgøres til skålen. - Brug mikropipetten til at overføre alle follikler (gennemsnit 40) fra mediedråberne til en 50 μL dråbe PBS + 0,2% PVP.
- Folliklerne vaskes 2x ved at overføre dem sekventielt til friske 50 μL dråber PBS + 0,2% PVP.
- Overfør folliklerne til en 285 μL dråbe PBS + 0,2% PVP.
- Der tilsættes 15 μL trypanblå til 285 μL dråbe PBS + 0,2 % PVP (slutkoncentration på 0,05 % trypanblå), og dråben blandes forsigtigt ved hjælp af en 200 μL pipettespids indstillet til 100 μL.
BEMÆRK: Hvis du bruger 4-brøndspladen til trypan-levedygtighedstesten, tilsættes 475 μL PBS + 0,2% PVP og 25 μL trypanblå til en brønd. - Inkuber folliklerne i 1 min i trypanblå dråbe, og overfør derefter folliklerne til en 50 μL dråbe (eller 500 μL brønd) PBS + 0,2% PVP.
- Folliklerne vaskes 3x i henhold til trin 8.3 med friske 50 μL dråber (eller 500 μL pr. hul) PBS + 0,2% PVP.
- Kassér eventuelle follikler, der stadig ser blå ud efter tre vaske i PBS + 0,2% PVP, da disse ikke er levedygtige. Eventuelle follikler, der ikke bevarer blå farve efter tre vaske, er levedygtige og kan bruges til immunfluorescens, kultur eller andre procedurer (figur 3E). Snap-frys folliklerne i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C indtil yderligere brug, hvis det er nødvendigt.
- Udfør RT-qPCR-analyse og immunfluorescensfarvning af folliklerne som beskrevet i trin 9 og 10.
Figur 3: Isolerede follikler og trypanblå udelukkelsestest. (A-C) Isolerede follikler blev afbildet gennem et stereomikroskop ved flere forstørrelser. (A) Isolerede follikler blandt affald i den indledende søgeskål. Individuelle follikler er cirklet i rødt. Skalabar = 2.000 μm. (B) Isolerede follikler og snavs i en dråbe follikelvaskemedium dækket med mineralolie. Skala bar = 1.000 μm. (C) Isolerede follikler uden snavs ved en højere forstørrelse. Skalabjælke = 1.000 μm. (D) Isolerede follikler afbildet ved hjælp af et omvendt lysfeltmikroskop. Skalabjælke = 100 μm. (E) Repræsentative billeder af levedygtige (ufarvede) og ikke-levedygtige (blå plet) follikler afbildet ved hjælp af et omvendt lysfeltmikroskop og et 20x mål. Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
9. RT-qPCR-analyse
- Isoler RNA fra levedygtige follikler (fra trin 8.8) ved hjælp af et RNA-isolationsreagens (se Materialetabel). Rens RNA'et, og behandl med DNase ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt oprydningssæt (se Materialetabel) i henhold til producentens anvisninger.
- Elute RNA'et med 14 μL RNase-frit vand og kvantificere ved hjælp af et spektrofotometer. RNA'et kan opbevares ved -80 °C indtil cDNA-syntese.
- Udfør cDNA-syntese fra lige store mængder RNA ekstraheret fra primære og tidlige sekundære follikler ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt cDNA-syntesesæt (se Materialetabel) i henhold til producentens anvisninger. Reaktionsblandingen inkuberes i 5 minutter ved 25 °C efterfulgt af 60 minutter ved 42 °C, og reaktionen afsluttes derefter ved opvarmning ved 70 °C i 5 min.
- Udfør RT-qPCR med det syntetiserede cDNA (5 ng pr. reaktion) og primere (tabel 1) ved hjælp af en kommercielt tilgængelig reaktionsblanding (se Materialetabel). Brug termiske cyklusbetingelser: 30 s ved 95 °C til polymeraseaktivering efterfulgt af 40 amplifikationscyklusser, hvor hver cyklus omfattede 15 s ved 95 °C for denaturering og 30 s ved 60 °C for udglødning/forlængelse. Analyser RT-qPCR ved at kvantificere cyklustærskelværdier (Ct) og / eller se PCR-produkter ved hjælp af agarosegelelektroforese.
BEMÆRK: Transkriptionsekspression af granulosacellemarkøren FSHR og kimcellemarkøren DAZL blev evalueret i denne undersøgelse. Referencegener var H2A og ACTB. - Der foretages en smeltekurveanalyse ved at øge temperaturen fra 65 °C i trin på 0,5 °C hver 5. s, indtil den når 95 °C.
10. Immunofluorescens analyse
- Fastgør levedygtige follikler (fra trin 8.8) i 15 minutter i et 100 μL fald på 4% (v / v) paraformaldehyd (PFA) ved stuetemperatur (RT) efterfulgt af vask 3x i 100 μL dråber PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20.
- Folliklerne blokeres i 1 time ved RT i en blokerende buffer bestående af 1x PBS + 5% (v/v) normalt æselserum (NDS). Efter blokering inkuberes folliklerne natten over ved 4 °C i en 100 μL dråbe 4 μg/ml kaninantihumant CX37-antistof eller 4 μg/ml kaninisotype IgG (negativ kontrol) fortyndet i blokerende buffer.
- Folliklerne vaskes 3x i 100 μL dråber PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20, og inkuberes derefter i 1 time ved RT i mørke i en 100 μL dråbe 2 μg/ml æsel-anti-kanin AlexaFluor 488 sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer.
- Inkuber folliklerne i 5 minutter ved RT i mørke i en 100 μL dråbe på 1 μg/ml Hoechst 33342 fortyndet i blokerende buffer for at mærke DNA.
- Overfør folliklerne til en 5 μL dråbe monteringsmedier (se Materialetabel) på et glasmikroskopglas og dæk med en dækselseddel. Lad lysbillederne hærde ved RT natten over, efterfulgt af forsegling med neglelak. Opbevar dem ved 4 °C indtil billeddannelse.
- Billede alle dias inden for 48 timer efter, at omslaget glider. Udfør billeddannelse ved hjælp af et omvendt epifluorescensmikroskop (se Materialetabel) under DAPI (excitation 380 nm og emission 450 nm) og FITC (excitation 470 nm og emission 525 nm) filtre.
- Ret eksponeringstiden for begge kanaler. Juster eksponeringstiden for FITC (CX37) baseret på kaninisotypen negativ kontrol. Brug et 20x mål og DAPI-kanalen indstillet til 50 ms eksponeringstid til at identificere kaninisotypemærkede follikler.
- Forestil dig disse follikler under FITC-kanalen, og reducer eksponeringstiden, indtil alt grønt baggrundssignal er afskaffet. Bemærk denne eksponeringstid.
- Billede alle CX37-antistofmærkede follikler ved hjælp af eksponeringstiden for isotype FITC-kanalen og 50 ms eksponeringstid for DAPI-kanalen.
- Behandle signalintensiteten, målt ved gennemsnitlig gråzone efter tærskelværdi, ved hjælp af et computerbilledbehandlingsprogram29 (se Materialetabel).
- Juster tiff-filen i DAPI-billedet for hver follikel, så hele folliklen er skitseret. Brug funktionen Analysér partikler i programmet til at vælge hele folliklen som et interesseområde (ROI).
- Åbn tiff-filen for FITC-billedet for den tilsvarende follikel, og overlejr ROI, der genereres fra DAPI-billedet oven på FITC-billedet. Brug programmets målingsfunktion til at kvantificere det gennemsnitlige gråområde i FITC-billedet, som repræsenterer signalintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overblik og kritiske trin
Ved hjælp af denne protokol kan små kvægpræantrale follikler pålideligt isoleres fra enkelte æggestokke i eksperimentelt relevante tal. Fra i alt 30 replikater blev der i gennemsnit opnået 41 follikler pr. replikat med et interval på 11 til 135 follikler (figur 4A). I 14 replikater blev folliklerne karakteriseret til udviklingsstadiet som tidligere beskrevet26 ved at måle follikeldiameteren ved hjælp af et 1 μm mikroskopkalibreringsglas under stereomikroskopet. Ved hjælp af denne metode blev i alt 476 follikler klassificeret som enten primære (follikler, der måler 40-79 μm), tidlige sekundære (80-119 μm) eller sekundære (≥120 μm) follikler (figur 4B). Primordiale follikler blev udelukket på grund af filtreringstrinnet på 40 μm. Follikellevedygtigheden blev evalueret ved hjælp af trypanblå udelukkelsestest som beskrevet tidligere30. Isolerede follikler blev kortvarigt inkuberet i 1 min i 0,05% (v/v) trypanblå i PBS indeholdende 0,2% PVP, efterfulgt af tre vaske med PBS + PVP og undersøgelse under et stereoskop. Ved hjælp af den beskrevne procedure var 100% af isolerede follikler levedygtige i alle replikater. Samlet set tager den mekaniske isoleringsproces, fra opsamling af æggestokke til umiddelbart før søgning i petriskålen, ca. 30-45 minutter. Den tid, der bruges til at søge og identificere follikler, tager ikke længere end 30 minutter, hvilket resulterer i en proces, der tager i alt 1-1,25 timer pr. æggestok.
Det mest kritiske trin i denne protokol er at sikre, at æggestokkene er korrekt homogeniseret. Forøgelse af homogeniseringstiden fra 5 min til 6 min førte til en stigning i antallet af isolerede follikler (P < 0,05). Et gennemsnit på 41 follikler blev isoleret pr. æggestok fra 30 forsøg ved hjælp af en 6 minutters homogenisering, hvilket er en næsten tredobling i forhold til gennemsnittet på 13,8 follikler pr. æggestok opnået fra 22 forsøg med en homogeniseringstid på 5 minutter (figur 5). Et andet vigtigt skridt er homogeniseringshastigheden, som skal forblive inden for 9.000-11.000 o / min. Højere hastigheder fører til nedsat udbytte, formodentlig på grund af overdreven skade og / eller brud på follikler. Follikelisolering kan forbedres yderligere efter filtreringstrinnene ved at føre indholdet af søgeskålen gennem en glas Pasteur-pipette med en gummipære flere gange. Ved at bruge Pasteur-pipetten løsnes follikler fra snavs, og flere follikler kan ses i skålen.
Hvis folliklerne skal dyrkes efter isolering, er det vigtigt at afbøde mikrobiel kontaminering. Forurening kan forhindres ved at trimme overskydende bindevæv og fedt fra hele æggestokken og derefter udføre en række vasketrin. De trimmede æggestokke skal kortvarigt vaskes i 70% ethanol for at reducere den mikrobielle belastning efterfulgt af flere vaske i varm (38,5 °C) PBS + PenStrep-opløsning for at vaske 70% ethanol væk og yderligere fjerne eventuelle mikroorganismer. Disse vaske kan udføres uden at gå på kompromis med follikellevedygtigheden. For yderligere at forhindre forurening er det muligt at udføre hele isolationsprotokollen inde i et biosikkerhedsskab eller en ren bænk med steriliseret udstyr.
RNA-isolering og RT-qPCR
Follikler af samme trin og fra separate isolationer blev samlet, og i alt 46 primære og 34 tidlige sekundære follikler blev anvendt til analyse af mRNA-ekspression. RNA blev isoleret fra de samlede follikler (primære follikler = 259 ng total RNA og tidlige sekundære follikler = 91 ng total RNA) og anvendt til cDNA-syntese. Transkriptionsekspression af granulosacellemarkøren FSHR19 og kimcellemarkøren DAZL i folliklerne blev derefter evalueret ved hjælp af RT-qPCR. Som forventet udtrykte både primære og tidlige sekundære follikler FSHR- og DAZL-transkripter, hvilket bekræftede en tidligere rapport i humane follikler31 og viste, at FSHR er udtrykt i kvægfollikler på det primære udviklingsstadium32 (figur 6A, B).
Immunoflourescerende lokalisering af Connexin 37
Immunofluorescerende lokalisering af proteiner kan udføres i hele follikler. Her blev denne teknik brugt til at lokalisere gap junction-proteinet Connexin 37 (CX37) i isolerede præantrale follikler i både de primære og tidlige sekundære stadier. CX37 er kritisk for kommunikationen mellem folliklens oocyt- og granulosaceller og er blevet identificeret i begge celletyper på alle stadier af follikeludvikling hos kvæg i histologiske analyser33. Efter trypanblå udelukkelsestesten blev levedygtige follikler fikseret i PFA og inkuberet med kanin anti-humant CX37-antistof eller kaninisotype IgG (negativ kontrol) efterfulgt af inkubation med æsel-anti-kanin AlexaFluor 488 sekundært antistof. Hoechst 33342 blev brugt til at mærke DNA. Folliklerne blev afbildet ved hjælp af et omvendt epifluorescensmikroskop under DAPI- og FITC-filtre, og signalintensiteten blev kvantificeret. CX37 viste sig at lokalisere til ooplasmen, selvom den især var fraværende fra oocytkernen, og til membranen i granulosaceller (figur 7). Disse resultater er i overensstemmelse med den kendte lokalisering af CX37 til oocytten og membranen i granulosacellerne33. Immunolokalisering af proteiner, der vides at være kritiske for cellekommunikation og follikelvækst, såsom CX37 (vist her) og FSHR32 , er et vigtigt redskab til at studere udviklingen af præantrale follikler, virkninger af interventioner på follikelvækst, struktur og kvalitet samt at vurdere kultureffektivitet ved at sammenligne in vivo-opnåede og in vitro-dyrkede follikler.
| Gen | Fremadgående sekvens (5'-3') | Omvendt sekvens (5'-3') | Produktstørrelse (bp) | ||||
| FSHR | CCC AAC TCG ATG AGC TGA ATC T | CAT AGC TAG GCA GGG AAC GG | 132 | ||||
| DAZL | GCC CAC AAA AGA AAT CTG TGG A | ACT TAA GCA CTG CCC GAC TT | 156 | ||||
| H2A | GAG GAG CTG AAC AAG CTG TTG | TTG TGG TGG CTC TCA GTC TTC | 104 | ||||
| ACTB | CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT | GGG CAG TGA TCT CTT TCT GC | 178 | ||||
Tabel 1: Liste over primere, der anvendes til RT-qPCR.
Figur 4: Antal og udviklingsstadium for isolerede præantrale follikler. (A) Samlet antal isolerede præantrale follikler pr. replikat ved hjælp af 6 minutters vævshomogenisering (n = 30 replikater). Det gennemsnitlige antal follikler er repræsenteret af den røde linje på tværs af stængerne. (B) I 14 replikater blev udviklingsstadiet af de isolerede follikler registreret. Cirkeldiagrammet viser fordelingen af udviklingsstadier som en andel af de samlede isolerede follikler (n = 476). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af 5- versus 6-min homogenisering. Homogenisering af ovariebarken i 6 minutter gav et større antal præantrale follikler sammenlignet med homogenisering med samme hastighed i 5 minutter (n = 22 replikater i 5 minutter og 30 replikater i 6 minutter; P < 0,01). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Omvendt transkription kvantitativ PCR af transkripter udtrykt i isolerede præantrale follikler. Primære og tidlige sekundære præantrale follikler udtrykte mRNA-transkripter for markører for granulosaceller (FSHR), kimceller (DAZL) og referencegener (H2A og ACTB). (A) Agarosegel af PCR-produkter for hvert gen med respektive basepar (bp) produktstørrelser. (B) Ekspression af FSHR- og DAZL-transkripter blev kvantificeret i forhold til referencegenet ACTB. NTC = ikke-skabelonkontrol, CT = cyklustærskel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Immunofluorescerende lokalisering af CX37 i isolerede præantrale follikler. Repræsentative billeder af CX37 immunolokalisering i en primær (A) og tidlig sekundær (B) kvæg præantral follikel. (C) Repræsentativt billede af negativ kontrol kanin isotype mærkning i en tidlig sekundær kvæg præantral follikel. Venstre panel: DNA-mærkning (DAPI). Mellempanel: primær antistof kanin anti-human CX37 mærkning (FITC). Højre panel: DAPI og FITC fusioneret. Skalastænger = 50 μm. (D) Gennemsnitlig CX37-signalintensitet i henhold til follikeludviklingsstadiet (n = 21 primære og 11 tidlige sekundære follikler i to replikater). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en reproducerbar metode til at hente præantrale follikler i det tidlige stadium, specifikt i primære og tidlige sekundære stadier, fra kvægets æggestok. Denne protokol bygger på tidligere rapporter 20,25,30,34,35,36 og giver optimeringer, der resulterer i isolering af et meningsfuldt antal follikler fra en individuel æggestok. Præantrale follikler isoleret ved hjælp af denne metode er levedygtige og kan anvendes til downstream-applikationer såsom immunolokalisering af proteiner og RNA-ekstraktion til analyse af genekspression. Dyrkning af de isolerede follikler blev ikke forsøgt i denne undersøgelse. Imidlertid er der i øjeblikket bestræbelser i gang for at opnå en vellykket langsigtet kultur af små præantrale follikler fra kvæg, hvilket vil være en vigtig downstream-anvendelse af denne protokol, der vil bidrage til at forbedre forståelsen af ovariefolliculogenese, udføre toksikologiske tests og udtænke måder til succesfuld manipulation af follikler til fertilitetsbevarelse.
Data fra disse eksperimenter viser, at 6 minutters homogenisering er afgørende for korrekt spredning af ovariekortikalt væv og follikelfrigivelse (figur 4). Yderligere trin, der bidrager til grundig homogenisering af vævet, er den indledende dissektion af cortex fra medulla, der sikrer korrekt tykkelse af cortex (~ 1 mm), trimning af overskydende bindevæv og hakning af cortex i små fragmenter. Disse trin forhindrer tilstopning af homogenisatorsonden og unødvendigt snavs i søgepladen. Celle si pore størrelse er vigtigt for at udelukke snavs og follikler af uønsket størrelse og fase; I tilfælde af denne protokol er det sidste trin at indsamle indholdet af en 40 μm cellesi for at udelukke urfollikler, som typisk er <40 μm i diameter hos kvæg26. Endelig anbefales det at bruge en Pasteur-pipette til at løsne follikler fra snavs i søgeskålen frem for at forsøge manuelt at dissekere follikler ud af affaldet, da sidstnævnte teknik kræver mere teknisk dygtighed og, hvis det gøres forkert, kan beskadige folliklerne.
Selvom denne protokol præsenterer forbedringer i forhold til eksisterende metoder, er der begrænsninger, der skal overvejes. For det første på grund af den heterogene karakter af ovariefollikelpopulationen15 og ukendt historie af de dyr, hvorfra æggestokkene blev hentet, var antallet af follikler isoleret efter udførelse af denne protokol meget variabelt. En faktor, der skal overvejes, er dyrenes alder, da æggestokkene er kendt for at falde med37 år.
Isolering af små præantrale follikler fra kvægets æggestok giver mulighed for at undersøge grundlæggende videnskabelige spørgsmål på enkeltprøveniveau, en tilgang, der tidligere har været vanskelig at gennemføre. For eksempel viste alle præantrale follikelstadier, der blev evalueret her, ekspression af CX37, et kritisk protein til oocyt-granulosa-cellekommunikation. Tilsvarende er ekspression af FSH-receptor tidligere blevet påvist i individuelt isolerede præantrale follikler32. Andre specifikke markører for granulosaceller, såsom de steroidogene enzymer CYP17 og CYP1938, ville være relevante tilføjelser til gen-/proteinekspressionspanelet for præantrale follikler og vil blive genstand for fremtidige projekter. Visualiseringen af hele follikulær struktur via regelmæssig eller konfokal mikroskopi er mere omfattende sammenlignet med histologisk undersøgelse, hvor kun et segment af folliklen kan analyseres ad gangen. Dette er især fordelagtigt i undersøgelser, der måske ønsker at anvende immunostaining eller in situ hybridisering, hvor detaljeret rumlig lokalisering af ekspression er påkrævet. Derudover kan isolerede præantrale follikler bruges til at undersøge enkeltfollikelgenekspression ved hjælp af følsomme sæt til RT-qPCR30. Evnen til at analysere follikler individuelt og uden indflydelse af ovariemiljøet er et kritisk skridt fremad i forståelsen af kompleksiteten af præantral folliculogenese.
Kryopræservering af æggestokvævet er blevet en lovende teknik til at sikre fertiliteten hos hunpattedyr39, herunder kvinder40. Bevarelse og genoprettelse af fertilitet ved hjælp af præantrale follikler præsenterer en attraktiv assisteret reproduktionsteknologi samt en lovende metode til undersøgelse af folliculogenese41. Efter frysning og optøning kan vævet underkastes denne isolationsprotokol til hentning af levedygtige præantrale follikler. Selvom denne protokols potentielle evne til at hente follikler fra tidligere kryopræserveret væv ikke blev specifikt vurderet, har andre vist succes og brugt levedygtige små præantrale follikler isoleret fra frosset optøet væv til in vitro-kultur 42,43,44,45. Desuden kan friskisolerede præantrale follikler kryopræserveres individuelt via vitrifikation og opretholde strukturel integritet36.
En opdatering af detaljer om effektiv isolering af præantrale follikler fra en stor pattedyrart som kvæg har manglet i litteraturen. Desuden er der et stort behov for en visuel og eksplicit vejledning i, hvordan man isolerer kvægpræantrale follikler, da manglen på reproducerbarhed har været en flaskehals i marken. For nylig beskrev Bus et al.36 isoleringen af kvæg præantrale follikler ved hjælp af en mekanisk metode med et beregnet gennemsnitligt udbytte på 6,1 primære follikler pr. æggestok. Den mekaniske isoleringsmetode, der er beskrevet her, resulterer i isolering af et gennemsnit på 41 præantrale follikler pr. æggestok, hvor størstedelen er i det primære stadium. Derfor er denne teknik især nyttig til undersøgelser med fokus på primær follikelfysiologi og udvikling. Primære follikler repræsenterer den første fase af den voksende pool og er rigelige i æggestokkene cortex. Derfor er brugen af den beskrevne teknik, som er optimeret til at høste dette udviklingsstadium, ny og kan være særlig ønskelig for at drage fordel af æggestokkene og samtidig undgå den vanskeligere manipulation af primordiale follikler. En anden fordel ved at isolere primære follikler ville være at forbinde ovarievævskultur til den indledende aktivering af primordiale follikler med efterfølgende isolering af primære follikler til yderligere dyrkning. I betragtning af interessen for at dyrke follikler fra det mere rigelige primære stadium kan metoden, der præsenteres her, tilskynde forskere til at forfølge veje, de tidligere har undgået på grund af udfordringen med at isolere primære follikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev delvist finansieret af USDA Multi-state projekt W4112 og UC Davis Jastro Shields pris til SM.
Forfatterne vil gerne udvide deres påskønnelse til Central Valley Meat, Inc. for at levere kvæg æggestokke, der anvendes i alle eksperimenter. Forfatterne takker også Olivia Silvera for hjælp med behandling af æggestokke og follikelisolering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope - Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope - Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope - Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
References
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the 'holy grail' for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
