Summary
Een protocol voor de gevoelige en kwantitatieve detectie van topoisomerase 1-activiteit met behulp van de rolling circle enhanced enzyme activity detection assay wordt beschreven. De methode maakt detectie van topoisomerase 1-activiteit van gezuiverde componenten of cel/ weefselextracten mogelijk. Dit protocol heeft brede toepassingen op elk gebied met betrekking tot detectie van enzymatische activiteit.
Abstract
Op isothermische amplificatie gebaseerde technieken zoals de rolling circle amplificatie zijn met succes gebruikt voor de detectie van nucleïnezuren, eiwithoeveelheden of andere relevante moleculen. Deze methoden zijn substantiële alternatieven gebleken voor PCR of ELISA voor klinische en onderzoekstoepassingen. Bovendien is de detectie van eiwithoeveelheid (door Western blot of immunohistochemie) vaak onvoldoende om informatie te geven voor de diagnose van kanker, terwijl de meting van enzymactiviteit een waardevolle biomarker is. Meting van enzymactiviteit maakt ook de diagnose en mogelijke behandeling van door pathogenen overgedragen ziekten mogelijk. In alle eukaryoten zijn topoisomerasen de belangrijkste DNA-bindende enzymen die betrokken zijn bij de controle van de DNA-topologische toestand tijdens belangrijke cellulaire processen en behoren ze tot de belangrijke biomarkers voor de prognose en behandeling van kanker.
In de loop der jaren zijn topoisomerases substantieel onderzocht als een potentieel doelwit van antiparasitaire en antikankergeneesmiddelen met bibliotheken van natuurlijke en synthetische verbindingen met kleine moleculen die elk jaar worden onderzocht. Hier wordt de rolling circle amplification methode gepresenteerd, genaamd rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay die de kwantitatieve meting van topoisomerase 1 (TOP1) activiteit op een eenvoudige, snelle en gelvrije manier mogelijk maakt. Door een speciaal ontworpen DNA-substraat te splitsen en te binden, zet TOP1 een DNA-oligonucleotide om in een gesloten cirkel, die de sjabloon wordt voor rolling circle-amplificatie, wat ~ 103 tandem herhaalde rollende cirkelproducten oplevert. Afhankelijk van de nucleotide-opname tijdens de amplificatie, is er de mogelijkheid van verschillende uitleesmethoden, van fluorescentie tot chemiluminescentie tot colorimetrisch. Omdat elke TOP1-gemedieerde splitsing-ligatie één gesloten DNA-cirkel genereert, is de test zeer gevoelig en direct kwantitatief.
Introduction
Topoisomerases behoren tot de klasse van DNA-modificerende enzymen en veel van deze zijn nuttig gebleken als biomarkers voor menselijke ziekten 1,2,3,4,5,6. TOP1 is betrokken bij het oplossen van de topologische stress geassocieerd met cellulaire processen zoals DNA-replicatie, gentranscriptie, recombinatie en chromosomale segregatie7. TOP1 kan zowel negatieve als positieve supercoils oplossen door een mechanisme dat de vorming van een voorbijgaande enkelstrengsbreuk in het DNAinhoudt 8,9. Na binding aan DNA positioneert TOP1 de actieve plaats tyrosine (Tyr723) om een nucleofiele aanval uit te voeren op de fosfodiësterruggegraat. Een TOP1-DNA-splitsingscomplex wordt vervolgens gegenereerd met het enzym covalent bevestigd aan het 3'-uiteinde van de gebroken DNA-streng. Dit bevrijdt torsiespanning door het 5'-uiteinde van de gespleten streng rond de intacte streng te laten draaien. Ten slotte voert de hydroxylgroep van het 5'-end een nucleofiele aanval uit op de 3'-fosfotyrosylbinding. Als gevolg hiervan wordt TOP1 vrijgegeven en wordt de DNA-ruggengraat hersteld8.
Verschillende assays zijn ontwikkeld om de stappen van de TOP1 katalytische cyclus te onderzoeken, waaronder de relaxatie assay10, de electrophoretic mobility shift assay (EMSA)11,12, de DNA suicide cleavage-ligation assays13,14 en de in vivo complex of enzymes (ICE) assay15 . Deze testen hebben echter verschillende beperkingen omdat ze afhankelijk zijn van gel-elektroforese, waarvoor DNA-intercalerende middelen nodig zijn, of ze vereisen zeer gespecialiseerde training en apparatuur. Bovendien vereisen de assays grote hoeveelheden gezuiverd TOP1-enzym (variërend van 1 tot 5 ng voor de ontspanningstest en 50 tot 200 ng voor de EMSA en de splitsings-ligatietest) of extracten van ten minste 106 cellen om optimaal te presteren. Daarom is een zeer gevoelige methode ontwikkeld die de specifieke detectie van TOP1-activiteit in ruwe biologische monsters en op het niveau van de enkele katalytische gebeurtenis mogelijk maakt, de REEAD-test,16.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de detectie van TOP1-activiteit met behulp van de REEAD-test16 . Een schematische weergave van de test is weergegeven in figuur 1. Een op maat ontworpen siliconenrooster wordt bevestigd aan een gefunctionaliseerde dia om een glasschuif multiwell-opstelling te creëren, wellmaker genoemd in het volgende (figuur 1A). Dit wordt gevolgd door koppeling van een 5'-amino gemodificeerde primer aan de functionele NHS-groepen in de putten van de dia (figuur 1B). TOP1-gemedieerde splitsing en ligatiereactie zet een specifiek DNA-substraat om in een gesloten cirkel. Het TOP1-specifieke substraat (figuur 1C) vouwt zich spontaan in een haltervorm met daarin een dubbelstrengs stengel en twee enkelstrengslussen. Een van de lussen is complementair aan de oppervlakte-verankerde primer. Het stengelgebied bevat een favoriete TOP1-splitsingsplaats drie basen stroomopwaarts van het 3'-uiteinde en een 5'-hydroxyloverhang. Circularisatie van het substraat kan worden bereikt met behulp van cel- / weefselextract (figuur 1C) of recombinant, gezuiverd TOP1 (figuur 1D).
Wanneer het substraat door TOP1 wordt gesplitst, wordt het enzym tijdelijk gebonden aan het 3'-uiteinde en diffundeert het fragment met drie basissen, waardoor de 5'-overhang naar het substraat kan gloeien en TOP1-gemedieerde ligatie wordt vergemakkelijkt. De ligatie resulteert in circularisatie van het substraat en vervolgens de dissociatie van TOP1. De gesloten cirkel is gehybridiseerd naar de oppervlakte-verankerde primer (figuur 1E) en wordt gebruikt als een sjabloon voor isothermische rolling circle amplification (RCA) gemedieerd door het phi29-polymerase, dat RCA kan uitvoeren met strengverplaatsing, wat 103 tandem-herhalingsproducten oplevert. Tijdens de RCA-stap kunnen fluorescerend gelabelde (figuur 1F) of biotine-gekoppelde (figuur 1G) nucleotiden worden opgenomen17. Opname van fluorescerend gelabelde nucleotiden maakt detectie van de RCP's mogelijk met behulp van een fluorescentiemicroscoop of een fluorescentiescanner. Als alternatief kan een mierikswortelperoxidase (HRP)-gekoppeld antibiotine-antilichaam (figuur 1H) de gebiotinyleerde nucleotiden binden, waardoor de gewalste cirkelproducten (RCP's) kunnen worden gedetecteerd met behulp van verbeterde chemiluminescentie (ECL) of door de omzetting van 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) in een detecteerbare kleur. De RCA volgt een lineaire reactiekinetiek, waardoor de REEAD-test direct kwantitatief is, omdat één RCP een enkele TOP1-gemedieerde splitsing-ligatiereactie vertegenwoordigt. Hier wordt aangetoond dat deze test kan worden gebruikt om TOP1-activiteit te detecteren als een gezuiverd recombinant enzym of geëxtraheerd uit ruwe monsters en als een anti-TOP1-screeningsinstrument voor geneesmiddelen.
Protocol
OPMERKING: Zoek een lijst met buffersamenstellingen, apparatuur en andere benodigde materialen in De tabel met materialen.
1. Celkweek
- Kweek de voorkeurscellen in geschikt medium en kweek ze volgens instructies. Als voorbeeld, kweek Caco2, colorectale adenocarcinoom-afgeleide cellen, in Minimal Essential Medium (MEM) aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS), 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100 eenheden / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine. Onderhoud de celculturen in een bevochtigde incubator (5% CO2/95% luchtatmosfeer bij 37 °C). Plaats de cellen in weefselkweekkolven en splits elke 3 dagen om de cellen op 70% confluency te houden.
- Oogst de cellen uit een 70% confluentkolf door trypsinebehandeling (0,25% trypsine, 0,02% EDTA-oplossing) en was met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Resuspendeer de celpellet in PBS om de celconcentratie aan te passen aan 0,5 × 106 cellen/buis. Draai op 200 × g gedurende 5 minuten en adem het supernatant voorzichtig op.
OPMERKING: Cellen die voor REEAD worden gebruikt, moeten vers worden gebruikt en op ijs worden bewaard. De resultaten verkregen met Caco2-cellen zijn onlangs gepubliceerd17. De test is getest met een verscheidenheid aan cellijnen, waaronder colon-, borst-, long- en baarmoederhalskanker afgeleide cellen 18,19,20,21,22,23, maar het kan worden gebruikt met alle ruwe biologische monsters die TOP1 bevatten, zoals weefsels, bloed en speeksel.
2. Voorbereiding van gefunctionaliseerde dia's
- Bevestig het op maat ontworpen siliconen isolatorrooster aan de gefunctionaliseerde dia, waardoor de putmaker wordt. Druk op de siliconen om de vorming van luchtbellen te voorkomen (zie figuur 1A).
- Bereid een mengsel van 5 μM 5'-aminoprimer in 1x printbuffer. Voeg 4 μL van het mengsel toe aan elke put en plaats de wellamker in een hybridisatiekamer met verzadigde NaCl bij temperaturen tussen 15 °C en 25 °C, beschermd tegen licht.
OPMERKING: Een hybridisatiekamer kan eenvoudig worden gemaakt met behulp van een pipetpuntdoos gevuld met verzadigde NaCl. De hybridisatie duurt minimaal 16 uur en maximaal 72 uur. Zie de volgorde van de 5'-aminoprimer in figuur 1B. De dia's zijn gefunctionaliseerd met NHS-groepen om de binding van amino-gemodificeerde oligonucleotiden mogelijk te maken.
3. Generatie van gesloten circulaire substraten
- Bereiding van gesloten cirkelvormige substraten met recombinant TOP1 of celextract.
- Lyse een celkorrel van 0,5 × 106 cellen in 500 μL Lysis Buffer om een celdichtheid van 1.000 cellen/μL te bereiken. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Bereid een cirkelmengsel van 2 μL van 5 μM TOP1-specifiek substraat (de volgorde van het substraat is als volgt: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') en 2 μL recombinant TOP1-enzym of 2 μL celextract (zie stap 3.1.1) in 16 μL van 1x TOP1 Reactiebuffer.
OPMERKING: De gebruikte concentratie recombinant TOP1 is afhankelijk van de gekozen uitleesmethode (zie figuur 2, figuur 3, figuur 4 en figuur 5). Zie de volgorde van het TOP1-specifieke substraat in figuur 1C. - Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C (zie figuur 1C,D).
- Stop de reactie door 2 μL van 1% SDS toe te voegen.
- Bereiding van gesloten cirkelvormige substraten in aanwezigheid van geneesmiddelen
- Bereid een cirkelmengsel van 2 μL van 5 μM TOP1-specifiek substraat en 1 μL van 100% DMSO of 1 μL van 1,6 mM camptothecine (CPT) in 14 μL van 1x TOP1 Reactiebuffer. Voeg 2 μL 5 ng/μL recombinant TOP1 enzym toe.
OPMERKING: Andere kleine molecuulverbindingen of medicijnen kunnen worden gebruikt. In dat geval moet een titratie van de verbinding worden gemaakt. Als de verbinding is opgelost in een ander oplosmiddel dan DMSO, moet dit worden gebruikt als controlemiddel in plaats van DMSO. - Incubeer gedurende 1 min bij 37 °C.
- Stop de reactie door 2 μL van 1% SDS toe te voegen.
- Bereid een cirkelmengsel van 2 μL van 5 μM TOP1-specifiek substraat en 1 μL van 100% DMSO of 1 μL van 1,6 mM camptothecine (CPT) in 14 μL van 1x TOP1 Reactiebuffer. Voeg 2 μL 5 ng/μL recombinant TOP1 enzym toe.
OPMERKING: Stap 3 kan parallel met stap 2 worden gestart en de cirkels kunnen 's nachts bij 4 °C worden opgeslagen. Als alternatief kunnen de DNA-cirkels tegelijkertijd met stap 4 worden voorbereid en onmiddellijk worden gebruikt. Zie de volgorde van het TOP1-specifieke substraat in figuur 1C. Het substraat vouwt zich in een haltervorm met een dubbel stengelgebied met een voorkeursplaats top1-splitsing en twee enkelstrengslussen. Het open haltersubstraat wordt door TOP1-gemedieerde splitsing en ligatie omgezet in een gesloten cirkelvormig substraat en wordt hierna een cirkel genoemd. Omdat er een overmaat is aan de 5'-aminoprimer, zal er geen concurrentie zijn tussen open en gesloten TOP1-specifieke substraten.
4. Blokkeren van de putmaker
- Dompel de putmaker onder in een bak van 5 cm x 5 cm gevuld met Buffer 1 die was voorverwarmd tot 50 °C. Door een pipet te gebruiken, duwt u de vloeistof in de putjes om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen zijn. Incubeer gedurende 30 min bij 50 °C.
- Verwijder Buffer 1 en was 2 x 1 min met dH2O. Schud krachtig met de hand.
- Voeg buffer 2 toe die is voorverwarmd tot 50 °C. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de putten zitten. Incubeer gedurende 30 min bij 50 °C.
- Was 2 x 1 min met dH2O. Schud krachtig met de hand.
- Wassen met 70% EtOH gedurende 1 min. Schud krachtig met de hand.
- Laat de putmaker aan de lucht drogen.
OPMERKING: Gebruik perslucht om de putten te drogen. Als alternatief is het mogelijk om lucht te blazen met behulp van een Pasteur-pipet. Zorg ervoor dat de putten droog zijn voordat u verder gaat.
5. Hybridisatie van de cirkels naar de putmaker
- Voeg 4 μL van de cirkels (gemaakt in stap 3) toe aan elk overeenkomstig putje.
- Plaats de putmaker gedurende 1 uur in een vochtigheidskamer met dH2O bij 37 °C.
OPMERKING: Een vochtigheidskamer kan worden gemaakt door een doos te gebruiken voor pipetpunten gevuld met dH2O. Als alternatief kan de hybridisatie 's nachts bij 25 ° C in de vochtigheidskamer worden uitgevoerd.
6. Wassen
- Was de putmaker met Buffer 3.
- Verwijder Buffer 3 en vervang door Buffer 4.
- Verwijder Buffer 4 en was met 70% EtOH.
- Verwijder de EtOH en laat de putmaker drogen.
OPMERKING: Alle wasstappen worden gedurende 1 minuut uitgevoerd in een lade van 5 cm x 5 cm door de dia volledig onder te dompelen. Zorg er altijd voor dat er geen luchtbellen in de putten zitten.
7. Rolling circle versterking
- Bereid een RCA-mengsel van 1x Phi29-reactiebuffer aangevuld met 0,2 μg / μL BSA, 1 eenheid Phi29-polymerase en 0,25 mM dNTP en 0,0125 mM ATTO-488-dUTP voor fluorescentie-uitlezing, of 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP en 0,01 mM Biotine-dCTP voor colorimetrische / chemiluminescentie-uitlezing. Voeg 4 μL toe aan elk putje. Zie figuur 1E.
OPMERKING: Bereiding van het RCA-mengsel moet op ijs gebeuren. Wanneer u fluorescerende nucleotiden in de RCA opneemt, vermijd dan direct licht van deze stap om de fluoroforen te beschermen. - Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C in de vochtigheidskamer. In het geval van fluorescerende nucleotiden gebruikt, zet de vochtigheidskamer in het donker. Zie figuur 1F,G.
8. Wassen
- Voor de chemiluminescentie- of colorimetrische uitleesprotocollen wast u de putmaker zoals in stap 6 en gaat u verder met stap 11.
- Voor het fluorescentie-uitleesprotocol verwijdert u het siliconenrooster met een pincet voordat u het wast, zoals in de volgende stappen.
- Was de dia gedurende 10 minuten in Buffer 3.
- Verwijder Buffer 3 en vervang door Buffer 4. Was gedurende 5 min.
- Verwijder Buffer 4 en was gedurende 1 min in 70% EtOH.
- Verwijder de EtOH en laat de putmaker drogen.
9. Visualisatie van fluorescerende rollende cirkelproducten met behulp van een fluorescentiescanner
- Scan de dia in een fluorescentiescanner met behulp van de filters die overeenkomen met de gebruikte fluorofoor. Gebruik de maximaal mogelijke fotomultiplicator die geen verzadiging geeft.
OPMERKING: De fluorescerende scanner die in dit protocol wordt gebruikt voor beeldacquisitie is uitgerust met een 473 nm-laser en een FAM-filter-excitatie 490 nm, emissie 520 nm. - Importeer de afbeelding in ImageJ en wijzig het afbeeldingstype in 8-bits (Afbeelding | Soort | 8-bits). Als u de banden afzonderlijk wilt meten, beperkt u het gemeten gebied met het gereedschap rechthoektekenen op de werkbalk. Teken het gewenste gebied en meet de intensiteit (Analyseren | Meten). Verplaats vervolgens het oorspronkelijk getekende gebied naar de volgende band en meet.
- Plot de gegevens in de gewenste software. Representatieve afbeeldingen, inclusief kwantificering geëxtraheerd uit ImageJ, zijn weergegeven in figuur 2.
10. Visualisatie van fluorescerende rollende cirkelproducten met behulp van een fluorescentiemicroscoop
- Teken met een EtOH-resistente pen de positie van de putjes voordat u het siliconenrooster verwijdert en was de dia zoals in stap 8.2. Monteer na de wasstappen de glijbaan met 1 μL montagemedium zonder 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en voeg een afdekglas toe. Om visualisatie in de camera mogelijk te maken, lijmt u de dia op een microscoopglaasje van 76 mm x 26 mm.
- Analyseer met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 60x olie-onderdompelingsobjectief en een camera. Maak 12-15 afbeeldingen van elk monster / put.
- Importeer de foto's naar ImageJ en stapel de afbeeldingen (Afbeelding | Stapels | Afbeelding om te stapelen). Het afbeeldingstype wijzigen in 8-bits (Afbeelding | Soort | 8-bits).
- Stel de drempel in (Afbeelding | Aanpassen | Drempel).
- Stel de drempel als volgt in: stel de onderste balk in en pas de bovenste balk zo aan dat alleen de rechtersignalen rood zijn en de achtergrond zwart. Zorg ervoor dat de drempel zo laag mogelijk is voordat de echte signalen beginnen te verdwijnen.
- Veeg door de afzonderlijke afbeeldingen en zorg ervoor dat ze overeenkomen met de afbeeldingen voordat u de drempel instelt. Houd er rekening mee dat de drempel van experiment tot experiment kan veranderen.
- Tel de signalen (Analyseren | Analyseer deeltjes). Zorg ervoor dat het samengevatte veld in de ImageJ-instellingen is aangevinkt.
- Exporteer de resultaten naar een spreadsheet of andere software voor verdere gegevensverwerking. Representatieve afbeeldingen, inclusief kwantificering geëxtraheerd uit ImageJ, zijn weergegeven in figuur 3.
11. Koppeling van HRP-geconjugeerd antibiotine-antilichaam aan de met biotine geëtiketteerde rollende cirkelproducten
- Voeg 4 μL HRP-geconjugeerd anti-biotine antilichaam verdund 1:300 toe in Buffer 5 aangevuld met 5% vetvrije magere melk en 5% BSA aan elk putje.
- Incubeer gedurende 50 minuten bij 15-25 °C in de vochtigheidskamer (zie figuur 1H).
- Was 3 x 3 min met Buffer 5.
- Droog de putmaker.
12. Visualisatie van de biotine-gelabelde rollende cirkel producten
- Visualisatie met ECL
- Meng 40 μL ECL Luminol en 40 μL H2O2 vlak voor gebruik. Voeg 2 μL toe aan elk putje.
- Visualiseer de dia met een CCD-camera of op röntgenfilms.
- Visualisatie met TMB
- Verwijder na stap 11.4 het siliconenrooster. Voeg vervolgens 400 μL TMB toe aan de hele dia en plaats de glijbaan in een vochtigheidskamer. Wacht ~ 5-10 minuten voor kleurontwikkeling. Was na de kleurontwikkeling de glijbaan met 70% EtOH.
- Visualiseer de kleurontwikkeling met het blote oog. Maak een foto van de dia met een fotocamera of mobiele telefoon.
- Importeer de afbeelding in ImageJ en wijzig het afbeeldingstype in 8-bits (Afbeelding | Soort | 8-bits). Als u de banden afzonderlijk wilt meten, beperkt u het gemeten gebied met het gereedschap rechthoektekenen op de werkbalk. Teken het gewenste gebied en meet de intensiteit (Analyseren | Meten). Verplaats vervolgens het oorspronkelijk getekende gebied naar de volgende band en meet.
- Plot de gegevens in de gewenste software. Representatieve afbeeldingen, inclusief kwantificering geëxtraheerd uit ImageJ, worden weergegeven in figuur 4, figuur 5 en figuur 6.
Representative Results
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de detectie van TOP1-activiteit met behulp van de REEAD-test16. Het protocol werd gebruikt om recombinante TOP1-activiteit te detecteren met behulp van vier verschillende uitleesmethoden: fluorescentiescanner, fluorescentiemicroscoop, chemiluminescentie en colorimetrisch. Het protocol werd ook gebruikt om de activiteit van TOP1 geëxtraheerd uit Caco2-cellen te detecteren, als een voorbeeld van ruw extract, met chemiluminescentie of TMB-uitlezing. Bovendien werd het protocol gebruikt als een medicijnscreeningsinstrument, om de remming van recombinante TOP1-activiteit door CPT te detecteren, als een voorbeeld van een TOP1-specifieke remmer, met behulp van de chemiluminescentie-uitleesmethode.
De resultaten die worden verkregen bij het analyseren van de TOP1-activiteit met behulp van de fluorescentie-uitlezing zijn weergegeven in figuur 2 en figuur 3. Een representatieve scan van de fluorescerende dia en de resulterende kwantificering zijn weergegeven in figuur 2. Zoals blijkt uit de kwantificering, heeft deze uitlezing een detectielimiet van 12,5 ng top1. Representatieve beelden en de resulterende kwantificering verkregen bij gebruik van de fluorescentiemicroscoopuitlezing zijn weergegeven in figuur 3. Met behulp van deze uitleesmethode is de detectielimiet slechts 0,1 ng van TOP1. De resultaten die worden verkregen bij het analyseren van de TOP1-activiteit met behulp van de chemiluminescentie-uitlezing zijn weergegeven in figuur 4 en de resultaten van de colorimetrische uitlezing zijn weergegeven in figuur 5. De detectielimiet van deze uitleesmethoden ligt op 6 ng van TOP1 of als TOP1 geëxtraheerd uit 312 Caco2-cellen. Figuur 6 toont de metingen van de TOP1-activiteit in aanwezigheid van 80 μM CPT of DMSO als voorbeeld van toepassing van geneesmiddelenscreening. Het representatieve beeld en de resulterende kwantificering van drie onafhankelijke experimenten laten zien dat CPT top1-gemedieerde circularisatie van het substraat remt zoals verwacht24,25.
Figuur 1: Schematische weergave van het REEAD-protocol. (A,B) Voorbereiding van de gefunctionaliseerde dia's. Het siliconen rooster is bevestigd aan de gefunctionaliseerde dia. Vervolgens wordt de 5'-aminoprimer gekoppeld aan de dia, waardoor versterking van het TOP1-specifieke substraat mogelijk wordt. (C,D) Generatie van gesloten circulaire substraten. Het TOP1-specifieke substraat vouwt zich in een haltervorm met een voorkeurs-TOP1-splitsingsplaats in de dubbelstrengsstengel en een primerbindingsvolgorde in een van de twee enkelstrengslussen. (C) TOP1 komt vrij bij lysis van de cellen. Bij TOP1-gemedieerde splitsing en ligatie wordt het substraat omgezet in een gesloten cirkel; D) gezuiverde, recombinante TOP1 wordt gebruikt. (E) Versterking van de rollencirkel. De gesloten cirkelvormige substraten worden gehybridiseerd naar de oppervlakteverankerde primer en versterkt door RCA met behulp van Phi29-polymerase. De RCA kan worden bereikt door opname van fluorescerende nucleotiden zoals in F of gebiotinyleerde nucleotiden zoals in G. De fluorescerende rollencirkelproducten worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop of een fluorescentiescanner. (H) Koppeling van het HRP-geconjugeerde antibiotine-antilichaam. De gebiotinyleerde rollende cirkelproducten worden geïncubeerd met het HRP-geconjugeerde antibiotine-antilichaam. De signaalontwikkeling wordt gemedieerd door het HRP-enzym en de signalen worden gevisualiseerd door ECL en gedetecteerd met behulp van een CCD-camera of door TMB te gebruiken die een colorimetrische visualisatie genereert. Afkortingen: REEAD = rolling circle enhanced enzyme activity detection; RCA = rolling circle versterking; TOP1 = topoisomerase 1; HRP = mierikswortelperoxidase; ECL = verbeterde chemiluminescentie; TMB = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Metingen van TOP1-activiteit met behulp van de fluorescentiescanner. Het linkerdeelvenster toont een representatieve afbeelding van de dia bij het analyseren van de activiteit van 3-50 ng TOP1 met behulp van het fluorescentiescanneruitleesprotocol. Het rechterpaneel toont de resulterende kwantificering. t-test met de correctie van Welch, p = 0,0064, n = 4. Afkorting: TOP1 = topoisomerase 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Metingen van TOP1-activiteit met behulp van de fluorescentiemicroscoop. Het linkerpaneel toont representatieve afbeeldingen van de dia bij het analyseren van de activiteit van 0,1-12,5 ng TOP1 met behulp van het fluorescentiemicroscoopuitleesprotocol. Houd er rekening mee dat de afbeeldingen bijgesneden versies zijn om de stippen correct weer te geven. Om deze reden lijken ze niet op het aantal signalen in de kwantificering in het rechterpaneel. t-test met de correctie van Welch, p = 0,0136, n = 3. Afkorting: TOP1 = topoisomerase 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Metingen van TOP1-activiteit met behulp van de chemiluminescentie-uitlezing. (A) Het linkerpaneel toont een representatieve afbeelding van de dia bij het analyseren van de activiteit van 3-50 ng TOP1 met behulp van het chemiluminescentie-uitleesprotocol. Het rechterpaneel toont de resulterende kwantificering. t-test met de correctie van Welch, p < 0,0001, n = 4. (B) Het linkerpaneel toont een representatieve afbeelding van de dia bij het analyseren van de activiteit van TOP1 geëxtraheerd uit 156-40.000 Caco2-cellen met behulp van het chemiluminescentie-uitleesprotocol. Het rechterpaneel toont de resulterende kwantificering. t-test met de correctie van Welch, p = 0,0224, n = 3. Afkortingen: TOP1 = topoisomerase 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Metingen van TOP1-activiteit met behulp van de colorimetrische uitlezing. (A) Het linkerdeelvenster toont een representatieve afbeelding van de dia bij het analyseren van 3-50 ng TOP1 met behulp van het colorimetrische uitleesprotocol. Het rechterpaneel toont de resulterende kwantificering. t-test met de correctie van Welch, p = 0,0012, n = 4. (B) Het linkerdeelvenster toont een representatieve afbeelding van de dia bij het analyseren van de activiteit van TOP1 geëxtraheerd uit 156-40.000 Caco2-cellen met behulp van het colorimetrische uitleesprotocol. Het rechterpaneel toont de resulterende kwantificering. t-test met de correctie van Welch, p = 0,0117, n = 3. Afkortingen: TOP1 = topoisomerase 1; TMB = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Metingen van TOP1-activiteit na medicamenteuze behandeling met behulp van de chemiluminescentie-uitleesprotocollen. Het linkerpaneel toont een representatieve afbeelding van de dia bij het analyseren van 10 ng TOP1 in aanwezigheid van 5% DMSO of 80 μM CPT gedurende 1 minuut. Het rechterpaneel toont de resulterende kwantificering. t-test met de correctie van Welch, p = 0,0017, n = 3. Afkortingen: TOP1 = topoisomerase 1; CPT = camptothecine; DMSO = dimethylsulfoxide; Neg = negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Topoisomerases vertegenwoordigen een klasse van DNA-modificerende enzymen die veel onderzoek en klinische interesse aantrekken, omdat ze het doelwit zijn van verbindingen met kleine moleculen met potentieel effect bij de behandeling van kanker of bij de bestrijding van infectieziekten. Bovendien is de activiteit van menselijke TOP1 een effectieve biomarker gebleken voor de prognose en behandeling van kanker 18,19,23. Hoewel het de TOP1-activiteit is die de werkzaamheid van een chemotherapeutische remmer26 beïnvloedt, is het vaak de hoeveelheid DNA-RNA of de hoeveelheid TOP1 die in klinische settings wordt beoordeeld. Dit komt door het gebrek aan snelle, eenvoudige en op gel gebaseerde gratis tools die nauwkeurige en nauwkeurige kwantificering van topoisomerase-activiteit in elke laboratoriumomgeving kunnen bieden.
Hier wordt een protocol voor de REEAD-test beschreven waarmee top1-activiteit op een gelvrije manier kan worden gemeten. In dit protocol wordt gezuiverd TOP1 of ruw extract uit cellen geïncubeerd met een speciaal ontworpen DNA-haltervormig substraat dat bij splitsing / ligatie gemedieerd door TOP1 wordt omgezet in een gesloten, circulair molecuul. De cirkels worden vervolgens gehybridiseerd op een glazen oppervlak en versterkt door RCA. Om gebruiksgemak mogelijk te maken bij het uitvoeren van reacties die op de dia plaatsvinden, wordt een siliconenrooster aan het glas bevestigd, waardoor individuele putten worden gemaakt waar de reacties plaatsvinden. Op deze manier maakt het protocol gebruik van een multiwell-systeem - een siliconenrooster - genaamd wellmaker.
Het protocol werd gebruikt om de activiteit van recombinant TOP1 en TOP1 geëxtraheerd uit colorectale adenocarcinoomcellen Caco2 te detecteren, gebruikt als voorbeeld. Bovendien, als een voorbeeld van REEAD om te worden gebruikt als een drug screening tool, werd het protocol gebruikt om TOP1 activiteit remming te detecteren door de bekende TOP1-remmer CPT 24,25. De test werd gekoppeld aan verschillende uitleesmethoden - fluorescentiemicroscopie, die een hoge gevoeligheid geeft, en een fluorescentiescanner, chemiluminescentie of colorimetrisch, waarvoor minder gespecialiseerde apparatuur en training nodig is. De zeer gevoelige fluorescentiemicroscoopuitlezing heeft de beperkingen van de behoefte aan een fluorescentiemicroscoopinstelling van goede kwaliteit, bekwaam personeel en tijdrovende beeldacquisitie en -analyse.
Om deze redenen wordt de fluorescentiescanner uitlezing gepresenteerd die snellere acquisitie en analyse mogelijk maakt, zelfs als dit ten koste gaat van de gevoeligheid. In het geval van het ontbreken van een fluorescentiescanner, kunnen twee uitstekende alternatieven, chemiluminescentie en colorimetrische uitleesmethoden, worden overwogen. Beide methoden zijn snel en eenvoudig en vereisen geen dure apparatuur of gespecialiseerde training. In alle uitleesformaten heeft REEAD veel voordelen in vergelijking met de state-of-the-art assays, die tijdrovender, gelgebaseerd (met de vereisten van intercalerende middelen) en minder direct kwantitatief zijn. Er zijn echter een paar cruciale stappen in het gepresenteerde protocol. Bij het behandelen van de geneesmiddelenscreening moeten de tijdspunten, de geneesmiddelconcentratie en de verhouding van top1-hoeveelheid / DNA-substraat worden geoptimaliseerd in vergelijking met de beschreven instellingen die zijn geoptimaliseerd voor CPT. Het medicijn kan worden onderzocht door een pre-cubatie uit te voeren met het DNA-substraat of een pre-cubatie met het TOP1-enzym. Dit kan waardevolle informatie geven over het vermogen van het molecuul om TOP1 te remmen en inzicht bieden in het werkingsmechanisme van het geneesmiddel.
Bovendien, als u lage of afwezige signalen ervaart, is dit hoogstwaarschijnlijk te wijten aan een inefficiënte lysis van het ruwe monster of een afbraak van TOP1 in het extract als gevolg van onjuist gebruik van proteaseremmers. Bovendien kan dit ook te wijten zijn aan onvoldoende opslag van de belangrijke testcomponenten, zoals recombinant TOP1, phi29 polymerase, nucleotiden, substraat en primer. Ten slotte moeten herhaalde vries-dooicycli van de oligonucleotiden worden vermeden, omdat dit de testprestaties dramatisch beïnvloedt. Wanneer ruw extract wordt gebruikt, moet de extractie-efficiëntie van het specifieke biologische monster worden geoptimaliseerd en de hoeveelheid en activiteit van TOP1 kan afwijken van het hier gerapporteerde voorbeeld. Om deze reden vereist elk te testen ruw extract een titratie voor de identificatie van de detectiegrens van de test en het gevoeligheidsbereik bij het gebruik van dat specifieke monster. Het protocol is geoptimaliseerd voor de detectie van menselijke TOP1. De activiteit van andere eukaryote TOP1's kan worden gemeten, maar de NaCl-concentratie en incubatietijd moeten mogelijk worden geoptimaliseerd volgens de enzymzuiveringsmethode en optimale enzymactiviteit. Meer gecirculeerde substraten zullen het gevolg zijn van langdurige incubatie, terwijl minder gecirculeerde substraten het gevolg zullen zijn van verkorte incubatie.
Naast de gepresenteerde toepassingen maakt REEAD het mogelijk om de TOP1-activiteit te meten in ruwe extracten van kleine biopten van kankerpatiënten18, de voorspelling van het cytotoxische antikankereffect van CPT in kankercellijnen 20,21,22, en zelfs de detectie van de enzymactiviteit in afzonderlijke cellen 20,21 . Bovendien maakt de gepresenteerde REEAD-instelling met behulp van de wellmaker multiwell-gebaseerde drugsscreening van bibliotheken van synthetische of natuurlijke verbindingen mogelijk. Daarnaast is een aangepaste versie van de REEAD-test ontwikkeld, genaamd REEAD C/L. Deze opstelling maakt afzonderlijke onderzoeken van de splitsings- en ligatiestappen van de TOP1-reactie27 mogelijk. Met de REEAD C/L is het mogelijk om het werkingsmechanisme van kleine molecuulremmers te bepalen en deze te karakteriseren als TOP1 katalytische remmers met potentiële antiparasitaire effecten28 of als TOP1-vergiften voor de behandeling van kanker24,25. Ten slotte, met een specifiek herontwerp van de DNA-substraten om te voldoen aan de verschillende vereisten (voor DNA-binding of splitsing-ligatie) van andere TOP1-enzymen, is REEAD ook gebruikt voor de detectie van infectieziekten (zoals in het geval van Plasmodium falciparum, dat malaria29 veroorzaakt), of Leishmania donovani en Monkeypox-virus (gegevens niet getoond). Of het kan worden gebruikt om verbindingen met kleine moleculen met antipathogene effecten te identificeren. Het gepresenteerde protocol biedt wetenschappers in het TOP1-veld een eenvoudige methode om enzymactiviteit te detecteren met weinig tot geen optimalisatie en met de mogelijkheid om in de toekomst te worden aangepast aan nog bredere toepassingen.
Disclosures
De auteurs C.T. en K.M. zijn medewerkers van VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. en M.S. zijn aandeelhouders en/of aandeelhouders. C.T., B.R.K. en M.S. verklaren dat zij uitvinders zijn van het octrooi EP2022/057172 ingediend op naam van VPCIR biosciences ApS. De andere auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen laborant Noriko Y. Hansen, Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, bedanken voor technische assistentie met betrekking tot Phi29- en TOP1-enzymzuiveringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
References
- Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
- Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
- Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
- Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
- Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
- Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
- Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
- Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
- Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
- Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M.
- Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
- Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
- Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
- Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).
- Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
- Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
- Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
- Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
- Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
- Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R.
- Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240 (2020).
- Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
- Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
- Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398 (2019).
- Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255 (2021).
- García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
- Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
