Eine Elektroporationsmethode zur Transformation von Rickettsien spp. mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Shuttle-Vektor in Zeckenzelllinien
Summary
Die Elektroporation ist eine schnelle, weit verbreitete Methode zur Einführung exogener DNA in die Gattung Rickettsia. Dieses Protokoll bietet eine nützliche Elektroporationsmethode für die Umwandlung von obligaten intrazellulären Bakterien in der Gattung Rickettsia.
Abstract
Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien der Gattung Rickettsia verursacht, die durch den Biss infizierter Arthropodenvektoren auf Wirbeltierwirte übertragen werden können. Bis heute bleiben neu auftretende oder wieder auftretende epidemische Rickettsiosen aufgrund der Schwierigkeit bei der Diagnose ein Risiko für die öffentliche Gesundheit, da diagnostische Methoden begrenzt und nicht standardisiert oder allgemein zugänglich sind. Fehldiagnosen, die aus einer mangelnden Erkennung der Anzeichen und Symptome resultieren, können zu einer verzögerten Antibiotikabehandlung und schlechten Gesundheitsergebnissen führen. Ein umfassendes Verständnis der Rickettsienmerkmale würde letztendlich die klinische Diagnose, Bewertung und Behandlung mit verbesserter Kontrolle und Prävention der Krankheit verbessern.
Funktionelle Studien von Rickettsialgenen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in der Pathogenese. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des Rickettsia parkeri Stammes Tate’s Hell mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA und die Selektion von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellkultur mit Antibiotika (Spectinomycin und Streptomycin). Es wird auch eine Methode zur Lokalisation von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellen unter Verwendung der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie beschrieben, einer nützlichen Technik zur Überprüfung der Transformation in Vektorzelllinien. Ähnliche Ansätze eignen sich auch für die Transformation anderer Rickettsien.
Introduction
Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien verursacht, die zur Gattung Rickettsia (Familie Rickettsiaceae, Ordnung Rickettsiales) gehören. Die Gattung Rickettsia wird anhand phylogenetischer Merkmale in vier Hauptgruppen eingeteilt1,2: die Fleckfiebergruppe (SFG), die diejenigen Rickettsien enthält, die die schwersten und tödlichsten durch Zecken übertragenen Rickettsiosen verursachen (z. B. Rickettsia rickettsii, der Erreger des Rocky-Mountain-Fleckfiebers), die Typhusgruppe (TG, z. B. Rickettsia prowazekii, der Erreger des epidemischen Typhus), die Übergangsgruppe (TRG, z. B. Rickettsia felis, der Erreger des durch Flöhe übertragenen Fleckfiebers) und die Ahnengruppe (AG, z. B. Rickettsia bellii).
Unter den ältesten bekannten vektorübertragenen Krankheiten werden Rickettsiosen hauptsächlich nach Übertragung der Erreger durch die Bisse infizierter Arthropodenvektoren, einschließlich Zecken, Flöhe, Läuse und Milben erworben 3,4. Obwohl die Entdeckung wirksamer Antibiotika die Behandlungsergebnisse verbesserte, stellen neu auftretende und wieder auftretende epidemische Rickettsiosen weiterhin traditionelle Präventions- und Kontrollstrategien in Frage. Daher würde ein umfassendes Verständnis der Rickettsien/Wirt/Vektor-Interaktionen letztendlich eine solide Grundlage für die Entwicklung neuer Ansätze zur Vorbeugung und Heilung dieser alten Krankheiten schaffen.
In der Natur erfolgt der horizontale Gentransfer (HGT) in Bakterien durch Konjugation, Transduktion und Transformation5. Die bakterielle In-vitro-Transformation nutzt diese HGT-Konzepte, obwohl die intrazelluläre Natur von Rickettsien einige Herausforderungen darstellt. Die eingeschränkten Wachstumsbedingungen und schlecht verstandenen Konjugations- und Transduktionssysteme bei verschiedenen Arten von Rickettsien haben die Anwendung von Konjugations- und Transduktionsmethoden bei Rickettsien 6,7,8 verhindert. Im Vergleich zu anderen obligaten intrazellulären Bakteriengattungen (z.B. Chlamydien, Coxiella, Anaplasma und Ehrlichia) unterscheidet sich die Gattung Rickettsia hinsichtlich der Wachstums- und Replikationsstrategien innerhalb des Zellzytoplasmas, was die genetische Veränderung von Rickettsien aufgrund ihrer einzigartigen Lebensweise vor besondere Herausforderungen stellt9.
Die erste Hürde, die es beim Versuch der genetischen Veränderung von Rickettsien zu überwinden gilt, ist eine erfolgreiche Transformation. Daher wäre die Entwicklung eines praktikablen Ansatzes mit hoher Transformationseffizienz äußerst wertvoll für die Entwicklung genetischer Werkzeuge für Rickettsien. Hier konzentrieren wir uns auf die Elektroporation, eine weithin anerkannte Transformationsmethode, die verwendet wurde, um exogene DNA erfolgreich in mehrere Arten von Rickettsien einzuführen, darunter Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii und Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des R. parkeri-Stammes Tate’s Hell (Akzession: GCA_000965145.1) mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA, der vom Rickettsia-Amblyommatis-Stamm AaR/SC-Plasmid pRAM18 abgeleitet ist und entwickelt wurde, um mKATE, ein weit rot fluoreszierendes Protein, und aadA zu kodieren, wodurch Spectinomycin- und Streptomycin-Resistenz13,15,20 verliehen wird. Transformierte R. parkeri sind lebensfähig und werden unter Antibiotikaselektion in Zeckenzelllinien stabil gehalten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Lokalisation von transformiertem R. parkeri in lebenden Zeckenzellen mittels konfokaler Mikroskopie genutzt werden kann, um die Qualität von Transformationsraten in Vektorzelllinien zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier demonstrieren wir eine Methode zur Einführung exogener DNA, die auf dem Shuttle-Plasmid pRAM18dSFA kodiert, in Rickettsien mittels Elektroporation. Bei diesem Verfahren wurden zellfreie Rickettsien von Wirtszellen gereinigt, mit einem Rickettsial-Shuttle-Vektor transformiert und zur Infektion auf Zeckenzellen freigesetzt. Ebenfalls beschrieben ist ein konfokales Immunfluoreszenzverfahren zum Nachweis von rotem Fluoreszenzprotein-exprimierendem R. parkeri in Zeckenzellen. Ähnliche Methoden sind auf andere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Timothy J. Kurtti und Benjamin Cull für ihre aufschlussreichen Diskussionen und Anregungen. Diese Studie wurde finanziell durch einen Zuschuss an U.G.M. vom NIH (2R01AI049424) und einen Zuschuss an U.G.M. von der Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078) unterstützt.
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
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