Summary
Die Elektroporation ist eine schnelle, weit verbreitete Methode zur Einführung exogener DNA in die Gattung Rickettsia. Dieses Protokoll bietet eine nützliche Elektroporationsmethode für die Umwandlung von obligaten intrazellulären Bakterien in der Gattung Rickettsia.
Abstract
Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien der Gattung Rickettsia verursacht, die durch den Biss infizierter Arthropodenvektoren auf Wirbeltierwirte übertragen werden können. Bis heute bleiben neu auftretende oder wieder auftretende epidemische Rickettsiosen aufgrund der Schwierigkeit bei der Diagnose ein Risiko für die öffentliche Gesundheit, da diagnostische Methoden begrenzt und nicht standardisiert oder allgemein zugänglich sind. Fehldiagnosen, die aus einer mangelnden Erkennung der Anzeichen und Symptome resultieren, können zu einer verzögerten Antibiotikabehandlung und schlechten Gesundheitsergebnissen führen. Ein umfassendes Verständnis der Rickettsienmerkmale würde letztendlich die klinische Diagnose, Bewertung und Behandlung mit verbesserter Kontrolle und Prävention der Krankheit verbessern.
Funktionelle Studien von Rickettsialgenen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in der Pathogenese. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des Rickettsia parkeri Stammes Tate's Hell mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA und die Selektion von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellkultur mit Antibiotika (Spectinomycin und Streptomycin). Es wird auch eine Methode zur Lokalisation von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellen unter Verwendung der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie beschrieben, einer nützlichen Technik zur Überprüfung der Transformation in Vektorzelllinien. Ähnliche Ansätze eignen sich auch für die Transformation anderer Rickettsien.
Introduction
Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien verursacht, die zur Gattung Rickettsia (Familie Rickettsiaceae, Ordnung Rickettsiales) gehören. Die Gattung Rickettsia wird anhand phylogenetischer Merkmale in vier Hauptgruppen eingeteilt1,2: die Fleckfiebergruppe (SFG), die diejenigen Rickettsien enthält, die die schwersten und tödlichsten durch Zecken übertragenen Rickettsiosen verursachen (z. B. Rickettsia rickettsii, der Erreger des Rocky-Mountain-Fleckfiebers), die Typhusgruppe (TG, z. B. Rickettsia prowazekii, der Erreger des epidemischen Typhus), die Übergangsgruppe (TRG, z. B. Rickettsia felis, der Erreger des durch Flöhe übertragenen Fleckfiebers) und die Ahnengruppe (AG, z. B. Rickettsia bellii).
Unter den ältesten bekannten vektorübertragenen Krankheiten werden Rickettsiosen hauptsächlich nach Übertragung der Erreger durch die Bisse infizierter Arthropodenvektoren, einschließlich Zecken, Flöhe, Läuse und Milben erworben 3,4. Obwohl die Entdeckung wirksamer Antibiotika die Behandlungsergebnisse verbesserte, stellen neu auftretende und wieder auftretende epidemische Rickettsiosen weiterhin traditionelle Präventions- und Kontrollstrategien in Frage. Daher würde ein umfassendes Verständnis der Rickettsien/Wirt/Vektor-Interaktionen letztendlich eine solide Grundlage für die Entwicklung neuer Ansätze zur Vorbeugung und Heilung dieser alten Krankheiten schaffen.
In der Natur erfolgt der horizontale Gentransfer (HGT) in Bakterien durch Konjugation, Transduktion und Transformation5. Die bakterielle In-vitro-Transformation nutzt diese HGT-Konzepte, obwohl die intrazelluläre Natur von Rickettsien einige Herausforderungen darstellt. Die eingeschränkten Wachstumsbedingungen und schlecht verstandenen Konjugations- und Transduktionssysteme bei verschiedenen Arten von Rickettsien haben die Anwendung von Konjugations- und Transduktionsmethoden bei Rickettsien 6,7,8 verhindert. Im Vergleich zu anderen obligaten intrazellulären Bakteriengattungen (z.B. Chlamydien, Coxiella, Anaplasma und Ehrlichia) unterscheidet sich die Gattung Rickettsia hinsichtlich der Wachstums- und Replikationsstrategien innerhalb des Zellzytoplasmas, was die genetische Veränderung von Rickettsien aufgrund ihrer einzigartigen Lebensweise vor besondere Herausforderungen stellt9.
Die erste Hürde, die es beim Versuch der genetischen Veränderung von Rickettsien zu überwinden gilt, ist eine erfolgreiche Transformation. Daher wäre die Entwicklung eines praktikablen Ansatzes mit hoher Transformationseffizienz äußerst wertvoll für die Entwicklung genetischer Werkzeuge für Rickettsien. Hier konzentrieren wir uns auf die Elektroporation, eine weithin anerkannte Transformationsmethode, die verwendet wurde, um exogene DNA erfolgreich in mehrere Arten von Rickettsien einzuführen, darunter Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii und Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des R. parkeri-Stammes Tate's Hell (Akzession: GCA_000965145.1) mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA, der vom Rickettsia-Amblyommatis-Stamm AaR/SC-Plasmid pRAM18 abgeleitet ist und entwickelt wurde, um mKATE, ein weit rot fluoreszierendes Protein, und aadA zu kodieren, wodurch Spectinomycin- und Streptomycin-Resistenz13,15,20 verliehen wird. Transformierte R. parkeri sind lebensfähig und werden unter Antibiotikaselektion in Zeckenzelllinien stabil gehalten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Lokalisation von transformiertem R. parkeri in lebenden Zeckenzellen mittels konfokaler Mikroskopie genutzt werden kann, um die Qualität von Transformationsraten in Vektorzelllinien zu beurteilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vermehrung und Reinigung von R. parkeri aus Zeckenzellkulturen
HINWEIS: Alle Zellkulturverfahren sind in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durchzuführen.
- Vorbereitend R. parkeri-infizierte Zeckenzellen
- ISE6-Zellen in 25 cm 2-Zellkulturkolben bei 34 °C in 5 ml L15C300 medium17 züchten, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), 5% Tryptosephosphatbrühe (TPB) und 0,1% Lipoproteinkonzentrat (LPC).
HINWEIS: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-derived cell line) ist eine Zeckenzelllinie, die in vielen Laboratorien ausgiebig verwendet wird und daher ein wesentliches Modell zur Untersuchung von Zecken-Erreger-Interaktionenist 17,18,19. Die Wachstumsrate von ISE6-Zellen ist langsamer als die von Säugetierzellen, mit einer Populationsverdopplungszeit von ≥72 h. Zum Beispiel benötigen ISE6-Zellen, die aus einer 100% konfluenten Kultur im Verhältnis 1:5 subkultiviert werden, 3-4 Wochen, um 100% Konfluenz wiederherzustellen. Gesunde ISE6-Zellen werden im Allgemeinen mit zahlreichen anhaftenden Filamentengerundet 17. - Zählen Sie die ISE6-Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie in einer Konzentration von ~ 106 Zellen / ml (100% konfluent).
- Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit Medium aus dem Kolben und dispergieren Sie die Zellen durch Pipettieren, um eine homogene Zellsuspension zu erzeugen. Fügen Sie 20 μL Zellsuspension zwischen dem Hämozytometer und dem Deckglas hinzu, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.
- Wirtszellfreier Wildtyp R. parkeri 20 (durchschnittliche Anzahl: 5 × 10 7-10 × 107) zu den ISE6-Zellkulturkulturen in 25 cm2 Zellkulturkolben zugeben. Inkubieren infizierter R. parkeri-Zellkulturen bei 34 °C in 5 ml komplettem Medium, bestehend aus L15C300-Medium, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% Natriumbicarbonat (NaHCO3) und 25 mM HEPES, bis 90% -100% der Zellen infiziert sind.
HINWEIS: Die Infektionsrate von R. parkeri in ISE6-Zellen wird durch Giemsa-Färbung bestimmt, und die Inkubationszeit bis zum Erreichen einer Infektion von 90% -100% liegt im Durchschnitt zwischen 5 Tagen und 7 Tagen. - Bestimmen Sie die Infektionsrate über Giemsa-Färbung.
- Resuspendieren Sie im Biosicherheitswerkkasten die infizierten Zellkulturen und geben Sie 50 μL der Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Die Suspension mit vollständigem Medium (1:5 Verdünnung) verdünnen und 100 μL auf Glasobjektträger mit einer Zentrifuge bei 113 × g für 5 min zentrifugieren. Um R. parkeri am Leben zu halten, verwenden Sie eine Zentrifuge mit einem versiegelten Rotor, der so konzipiert ist, dass er aus der Zentrifuge entfernt werden kann. Dies ermöglicht den Transport des abgedichteten Rotors in und aus der Haube.
HINWEIS: Da die R. parkeri vor der Zentrifugation noch am Leben sind, muss die Probe enthalten sein, bis die Rickettsien abgetötet sind. Daher muss die Zentrifuge, mit der die R. parkeri-Kultur auf den Objektträger gedreht wird, einen abgedichteten Rotor haben, der so konzipiert ist, dass er aus der Zentrifuge gehoben werden kann. Wenn sich der Rotor in der Laminar-Flow-Haube befindet, legen Sie die Proben in die Trichtermikroskop-Objektträgerbaugruppe, verschließen Sie den Rotor wieder und setzen Sie den versiegelten Rotor wieder in die Zentrifuge ein. Dann schalten Sie die Zentrifuge ein und die Proben werden auf die Objektträger gelegt. Nachdem der Lauf beendet ist, entfernen Sie den versiegelten Rotor aus der Zentrifuge und legen Sie ihn in die Laminarströmungshaube. Öffnen Sie dort den Rotordeckel und entladen Sie die Trichtermikroskop-Objektträgerbaugruppe in der Haube. Nach dem Trocknen tauchen Sie die Glasmikroskop-Objektträger in absolutes Methanol, das alle Krankheitserreger abtötet. Die Trichter und die Metallträger werden in verdünntes DMQ getaucht, das R. parkeri tötet. - Trocknen Sie die Objektträger an der Luft und fixieren Sie sie in absolutem Methanol für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Die Objektträger mit Giemsa-Färbung (4% im Puffer von Sørenson, pH 6,6) 30 min bei 37 °C färben und 5 s mit Wasser abspülen.
- Bestimmen Sie den Infektionsprozentsatz (Anzahl der mit Rickettsien infizierten Zellen/100 Zellen) durch Lichtmikroskopie.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt typische Giemsa-Färbeergebnisse.
- ISE6-Zellen in 25 cm 2-Zellkulturkolben bei 34 °C in 5 ml L15C300 medium17 züchten, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), 5% Tryptosephosphatbrühe (TPB) und 0,1% Lipoproteinkonzentrat (LPC).
- Herstellung von zellfreiem R. parkeri
HINWEIS: Wenn 90% -100% der Zellen in der Kultur infiziert sind, sollten die Rickettsien aus den ISE6-Zellen isoliert und eine Elektroporation durchgeführt werden.- Fügen Sie sterile 60-90 Siliziumkarbidkörnung zu sterilen 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf ein Volumen von ca. 0,2 ml hinzu.
- Entfernen Sie 2 ml Medium aus 100% R. parkeri-infizierten Kulturen (Schritt 1.1.3) und resuspendieren Sie die Zellen in den verbleibenden 3 ml Medium.
- Gleiche Teile dieser Suspension werden in Röhrchen überführt, die in Schritt 1.2.1 hergestellt wurden.
- Wirbeln Sie jedes Rohr mit hoher Geschwindigkeit für 30 s und legen Sie die Rohre dann auf Eis. Lassen Sie die Körnung innerhalb von Sekunden durch die Schwerkraft absetzen.
- Halten Sie in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II eine sterile 5-ml-Luer-Lock-Spritze bereit, wobei der Kolben ausgefahren und das Ende des Kolbens in einem Polystyrolboden für 15-ml-konische Röhrchen befestigt ist.
- Entfernen Sie mit einer sterilen 1-ml-Barrierepipettenspitze, die an einem geeigneten Pipettor angebracht ist, den Überstand des vortexierten Zelllysats aus dem Röhrchen und achten Sie darauf, keinen Splitt abzusaugen. Führen Sie die Pipetenspitze in die Öffnung der Spritzennabe ein und werfen Sie den Inhalt mit leichtem Druck in die Spritze. Alternativ können Sie eine sterile 2-ml-Pasteur-Pipette verwenden, die mit einem Gummikolben betrieben wird.
- Befestigen Sie einen sterilisierten 2-μm-Porenfilter an der Spritzennabe und filtrieren Sie die R. parkeri-Kultur aus Schritt 1.2.6 in sterile 1,5-ml-Röhrchen.
- R. parkeri wird 5 min lang bei 13.600 × g bei 4 °C bei 13.600 g gesammelt und der Überstand entsorgt.
- Das Pellet in 1,2 mL eiskalter 300 mM Saccharose resuspendieren und nochmals bei 13.600 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Wiederholen Sie die Resuspension und Zentrifugation für insgesamt zwei Saccharosewaschgänge.
- Kombinieren Sie die R. parkeri-Pellets zu einem gekühlten, sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in 50 μL eiskalter 300 mM Saccharose pro Umwandlung. Da ein 25 cm2 Kolben R. parkeri genug Rickettsien für zwei bis drei Umwandlungen liefert, fügen Sie 100-150 μL 300 mM kalte Saccharose hinzu.
HINWEIS: Falls gewünscht, kann die Anzahl der Rickettsien mit einer Petroff-Hausser-Zählkammer berechnet werden. Bei einer anfänglichen Impfung von 5 × 10 7 -10 × 10 7 zellfreien R. parkeri dauert es durchschnittlich 5-7 Tage, um eine 90%-100%ige Infektion zu erreichen, was etwa 5 × 107-10 × 1010 zellfreie R. parkeri ergibt. - Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig durch Pipettieren, bis es vollständig dispergiert ist. Teilen Sie die Probe in 50-μL-Portionen in gekühlte, sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Falls gewünscht, kann die Rickettsiallebensfähigkeit durch Durchflusszytometrie nach Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 21 beurteilt werden.
2. Transformation von R. parkeri mit dem pRAM18dSFA-Plasmid
- Auf Eis 3 μg endotoxinfreies pRAM18dSFA-Plasmid DNA 13,15,20 in jedes Röhrchen mit 50 μL R. parkeri Suspension geben und die Mischung mit der Pipetenspitze vorsichtig, aber gründlich umrühren.
HINWEIS: Verwenden Sie bei der Herstellung von Plasmid-DNA ein Reinigungskit, das einen Schritt zur Entfernung von Endotoxinen enthält, um endotoxinfreie Plasmid-DNA23 zu erhalten. Wir fanden heraus, dass ein Bereich von Plasmidkonzentrationen zwischen 1 μg und 3 μg pro 50 μL R. parkeri Suspension zu erfolgreichen Transformationen führte, während eine Erhöhung der Plasmidmenge auf 10 μg die Transformation hemmte. - Die obige Mischung aus DNA und R. parkeri wird in eine gekühlte, sterile 0,1 cm Spalt-Elektroporationsküvette überführt (klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, bis die Mischung gleichmäßig verteilt ist) und lassen Sie sie 10-30 min auf Eis sitzen.
- Entfernen Sie das Medium aus einer 100% konfluenten Kultur von ISE6-Zellen und resuspendieren Sie die Zellschichten in 1,5 ml frischem Medium mit NaHCO 3 und HEPES-Puffer (oben in Schritt 1.1.3 beschrieben). Verwenden Sie einen Kolben konfluenter Zellen pro Transformation.
- Die resuspendierten Zellen werden in ein steriles 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt (ein Röhrchen pro 25 cm2-Kolben ISE6-Zellen).
- Elektropolat der R. parkeri/pRAM18dSFA-Mischung bei 1,8 KV, 200 Ohm, 25 μF unter Verwendung eines Elektroporators.
- Mit einer sterilen, verlängerten Feinspitzen-Transferpipette eine kleine Menge der ISE6-Zellsuspension (Schritt 2.4) in die Küvette überführen und die Flüssigkeit vorsichtig auf und ab ziehen, um die Küvette auszuwaschen. Die Mischung wird in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Rest der ISE6-Zellsuspension überführt und das Transformationsgemisch vorsichtig mit den Zellen gemischt.
- Zentrifugieren Sie die transformierten Proben bei 700 × g für 2 min bei RT und erhöhen Sie dann die Zentrifugationsgeschwindigkeit auf 13.600 × g für 1 min mehr bei RT.
HINWEIS: Die beiden Zentrifugationsgeschwindigkeiten fördern die Rickettsialbindung mit und den Eintritt in die Zellen: 700 × g werden verwendet, um die ISE6-Zellen herunterzuziehen, während 13.600 × g zum Abziehen der Rickettsien verwendet werden. - Lassen Sie die Proben 15 min bis 1 h bei RT oder 34 °C ruhen.
- Resuspendieren Sie die Transformatoren (zwei oder drei) in ISE6-Zellen mit einer sterilen 2-ml-Barrierepipettenspitze, die an einem Pipettierer angebracht ist, und geben Sie sie in zwei oder drei 25-cm2-Zellkulturkolben mit 3,5 ml frischem Medium mit NaHCO3- und HEPES-Puffer. Alternativ können Sie eine sterile 2-ml-Pasteur-Pipette verwenden, die mit einem Gummikolben betrieben wird.
- Schaukeln Sie die Kolben, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie dann bei 34 °C.
- Nach 16-24 h werden in Schritt 2.10 10 μl Spectinomycin (50 mg/ml) und 10 μl Streptomycin (50 mg/ml) in jeden Kolben gegeben.
3. Beobachtung des transformierten R. parkeri
HINWEIS: Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop mit Rhodamin/TRITC-Filtern, um die in Schritt 2.11 hergestellten Kolben nach 3-7 Tagen zu beobachten. Sobald Plaques in den Kulturen sichtbar sind (5-14 Tage), kann man transformierte R. parkeri sehen, die das rot fluoreszierende Protein mKATE exprimieren, das auf dem pRAM18dSFA-Plasmid kodiert ist.
- Konfokale Mikroskopie
- Die Zellkulturen aus den Kolben der Stufe 2.11 werden resuspendiert und 100 μL dieser Zellkulturen mit 5 μL Hoechst 33342 Lösung für 10-30 min bei RT im Dunkeln gemischt.
HINWEIS: Hoechst 33342 ist eine zelldurchlässige nukleare Gegenfärbung, die an lebende Zeckenzell-DNA bindet und blaue Fluoreszenz emittiert. - 50 μL der Mischung werden mit einer Zentrifuge bei 5 × g für 3 min auf Glasobjektträger zentrifugiert.
- 3 μL 1x PBS an die Stelle der auf dem Objektträger abgelagerten Zellen geben, mit einem Deckglas überlagern und mit einem konfokalen Mikroskop (60x Objektiv) betrachten. Verwenden Sie die folgenden Anregungs- und Emissionsparameter für die Fluoreszenzbildgebung: für 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Anregung bei 350 nm, Emission bei 470 nm; für Tetramethylrhodamin (TRITC), Anregung bei 557 nm, Emission bei 576 nm.
- Die Zellkulturen aus den Kolben der Stufe 2.11 werden resuspendiert und 100 μL dieser Zellkulturen mit 5 μL Hoechst 33342 Lösung für 10-30 min bei RT im Dunkeln gemischt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Morphologie von R. parkeri in ISE6-Zellen unter einem Lichtmikroskop nach Giemsa-Färbung ist in Abbildung 1 dargestellt. In Abbildung 2 sind transformierte R. parkeri , die rotes Fluoreszenzprotein in ISE6-Zellen exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie dargestellt. Es gibt einen erheblichen Anstieg der Infektionsrate von transformiertem R. parkeri (rot) in ISE6-Zellen (blau, entspricht den Kernen) von (A) Tag 7 bis (B) Tag 10 der Inkubation.
Abbildung 1: Objektträger, die Giemsa-gefärbte Rickettsia parkeri in ISE6-Zellen zeigen. ISE6-Zellen, die mit Wildtyp-R. parkeri infiziert sind, bei (A) niedriger Infektion und (B) 90%-100% Infektionsraten. Die Kerne der ISE6-Zellen färben sich mit Giemsa dunkelviolett; die R. parkeri erscheinen als dunkelviolette Stäbchen. Die roten Kästchen zeigen intrazelluläre Rickettsien und die roten Sternchen zeigen extrazelluläre Rickettsien an. Alle Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop mit einem 100-fach-Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzung: N = Kerne. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Transformiertes Rickettsia parkeri exprimierendes rotes Fluoreszenzprotein in ISE6-Zellen. pRAM18dSFA-transformierte R. parkeri (rot) in ISE6-Zellen (blau), gefärbt mit Hoechst 33342 und nachgewiesen durch konfokale Mikroskopie (A) 7 Tage und (B) 10 Tage nach der Transformation. Hoechst 33342 färbt die Kerne, und seine Anregungs- und Emissionswellenlängen sind ähnlich wie DAPI. Die zusammengeführten Signale sind eine Kombination aus DAPI- und TRITC-Filterbildern. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 60-fachen Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; TRITC = Tetramethylrhodamin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier demonstrieren wir eine Methode zur Einführung exogener DNA, die auf dem Shuttle-Plasmid pRAM18dSFA kodiert, in Rickettsien mittels Elektroporation. Bei diesem Verfahren wurden zellfreie Rickettsien von Wirtszellen gereinigt, mit einem Rickettsial-Shuttle-Vektor transformiert und zur Infektion auf Zeckenzellen freigesetzt. Ebenfalls beschrieben ist ein konfokales Immunfluoreszenzverfahren zum Nachweis von rotem Fluoreszenzprotein-exprimierendem R. parkeri in Zeckenzellen. Ähnliche Methoden sind auf andere Rickettsienarten anwendbar und könnten mit weiteren Modifikationen an andere obligate intrazelluläre Bakterien angepasst werden, die in der Lage sind, ein Plasmid aufrechtzuerhalten.
Eine erfolgreiche Transformation in diesem Protokoll erfordert drei Komponenten: exogene DNA, Rickettsia spp.-Bakterien und einen geeigneten Typ von Wirtszellen22. Je nach konkretem Forschungsziel können diese Komponenten verändert werden. Zunächst wurde die exogene DNA über das pRAM18dSFA-Plasmid eingeführt, das Spectinomycin- und Streptomycin-selektierbare Marker enthält und mKATE (ein tiefrot fluoreszierendes Protein) exprimiert. Dieses Plasmid verleiht auch Ampicillinresistenz für das Wachstum in Escherichia coli. Wie frühere Studien gezeigt haben, ist es möglich, Antibiotikaresistenzmarker und die Gene für fluoreszierende Proteine zu ersetzen13. Zweitens wurden ISE6-Zellen ausgewählt, um transformierte Zelllinien darzustellen, da diese Zelllinie in vielen Laboratorien ausgiebig verwendet wird und ein wesentliches Modell für die Untersuchung von Vektor-Pathogen-Interaktionen ist17,18,19. Andere Arten von Zecken16 oder Säugetierzellen23,24 können auch verwendet werden, um Rickettsien für die Transformation zu züchten. Schließlich wurde in diesem Protokoll R. parkeri verwendet, das in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) mit einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II mit geeigneten Sicherheitsvorkehrungen manipuliert werden kann. Andere pathogenere Rickettsia spp. (z. B. R. rickettsii; R. prowazekii) eine BSL-3-Einstellung für die Manipulation erfordern; Daher muss bei der Arbeit mit solchen Mitteln ein strengeres Biosicherheitsstandardprotokoll verwendet werden.
Obwohl dieses Protokoll als Standardverfahren für die Rickettsientransformation verwendet werden kann, erfordern einige wichtige technische Schritte besondere Aufmerksamkeit. Erstens muss ein erfolgreicher Reinigungsschritt das zellfreie Überleben und die Infektiosität von Rickettsien sicherstellen9; Daher ist der kritischste Aspekt des Transformationsprozesses die Isolierung infektiöser, zellfreier Rickettsien. Jedes Restsalz in den gereinigten Rickettsien führt zu Lichtbögen und Transformationsfehlern. Daher ist das Waschen der isolierten zellfreien Rickettsien mit Saccharose erforderlich, um alle Salze zu entfernen. Die kalte Saccharoselösung schützt auch die Integrität der Rickettsialmembran im extrazellulären Zustand.
Wenn 90% -100% der Zellen in einer Kultur infiziert sind, sollten die Rickettsien aus den ISE6-Zellen isoliert werden, und die Elektroporation sollte unverzüglich und ohne Unterbrechungen durchgeführt werden, da Rickettsien intrazelluläre Organismen sind und außerhalb der Zellen nicht gut überleben. Obwohl Rickettsialkulturen bei 4 °C gelagert werden können, sollte diese Art von Material nicht für die Elektroporation verwendet werden. Eine Kultur, die bei 4 °C gelagert wurde, kann verwendet werden, um eine frische Schicht von ISE6-Zellen zu impfen, die dann für die Elektroporation verwendet werden kann, sobald die Infektion 90% -100% erreicht hat.
Zweitens sind die Elektroporationseinstellungen, einschließlich Spannung, Widerstand, Kapazität und Zeitkonstante, spezifisch für verschiedene Rickettsialarten. Zum Beispiel ist die Feldstärke, die während der Elektroporation benötigt wird, abhängig von der Größe der Rickettsien und der exogenen DNA7. Schließlich ist es wichtig, die transformierten Rickettsien unter Antibiotikaselektion zu halten, um den Verlust exogener Plasmide während mehrerer Passagen in Wirtszellen zu verhindern9. Die Konzentration und die Art des verwendeten Antibiotikums hängen von der Umwandlung der Rickettsia-Spezies ab, wie zuvor beschrieben 13,15,16,23, und es ist wichtig, dass der ausgewählte Antibiotikamarker nicht in klinischen Behandlungen angewendet wird.
Um diesem Protokoll zu folgen, sollten sowohl Spectinomycin als auch Streptomycin zur Selektion verwendet werden, bis alle verbleibenden untransformierten Rickettsien eliminiert sind. Zusammen töten die beiden Antibiotika sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Rickettsien ab und verringern die Wahrscheinlichkeit, dass resistente Wildtyp-Rickettsien auftreten. Darüber hinaus hat die Verwendung dieser beiden Antibiotika keinen Einfluss auf nachgeschaltete Experimente, wie z. B. die Möglichkeit, sie separat zu verwenden, um für zwei verschiedene Plasmide auszuwählen, da das aadA-Gen eine Resistenz sowohl gegen Spectinomycin als auch gegen Streptomycin verleiht. Die beiden in diesem Protokoll verwendeten Antibiotika verleihen keine Resistenz gegen Antibiotika, die bei der klinischen Behandlung von Rickettsienerkrankungen eingesetzt werden.
Die in dieser Studie verwendete ISE6-Zeckenzelllinie hat einzigartige Vorteile. Zunächst wurden ISE6-Zellen aus der schwarzbeinigen Zecke Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae) isoliert, dem Hauptvektor für sieben menschliche Krankheitserreger in den Vereinigten Staaten. Zweitens ist ISE6 eine in vielen Laboratorien weit verbreitete Zeckenzelllinie und wurde erfolgreich zur Wiederherstellung vieler Zecken-assoziierter Bakterien (Rickettsia, Anaplasma und Ehrlichia) nach der Elektroporation eingesetzt. Drittens können einige pathogene Rickettsien nur in Zeckenzellen, nicht aber in Säugetierzellenvermehrt werden 17,18,19,24. Zeckenzelllinien sind jedoch im Vergleich zu Säugetierzellen relativ zerbrechlich und haben einen intensiveren Kulturbedarf25,26,27,28. Darüber hinaus ist die Wachstumsrate von ISE6-Zellen signifikant langsamer als die von Säugetierzelllinien, selbst wenn sie mit der gleichen Anfangsdichte ausgesät werden, obwohl eine langsame Replikation vorteilhaft sein kann, wenn die Rickettsialtransformanten ein reduziertes Wachstum aufweisen.
Dieses Protokoll bietet auch eine Methode zur Bewertung der Transformationseffizienz von Rickettsien in lebenden Zellen in kritischen experimentellen Schritten, was dazu beiträgt, die Elektroporationseinstellungen zu optimieren oder die Effizienz verschiedener Zelllinien zur Rückgewinnung von Transformanten zu testen. Dennoch hat dieses Protokoll Grenzen, insbesondere für die Quantifizierung der erhaltenen Transformanten. Transformationseffizienz als Indikator für eine erfolgreiche Transformation könnte in einer zukünftigen Studie nachgewiesen werden. Die Rickettsiallebensfähigkeit könnte unter Verwendung eines geeigneten Färbesets und einer Durchflusszytometrie21 beurteilt werden, um die erhaltenen Transformatoren zu quantifizieren. Zwei Parameter würden verwendet, um die Transformationseffizienz zu bestimmen - die Anzahl der lebenden Rickettsien, die für die Transformation verwendet werden, und die Anzahl der transformierten Rickettsien, die mKATE exprimieren.
Darüber hinaus konnte die Bildanalyse mit Fluoreszenzsignalen verwendet werden, um die Transformationsraten verschiedener Plasmide zu vergleichen. Da der zugrunde liegende Mechanismus der Rickettsialplasmiderhaltung kaum verstanden ist, können gut charakterisierte Transformationssysteme zur Einführung exogener Plasmide wertvolle Werkzeuge für weitere Untersuchungen sein. Darüber hinaus wird die direkte Visualisierung von fluoreszierenden Protein-exprimierenden Rickettsien in Zellen oder Geweben unser Verständnis von Rickettsien/Wirt/Vektor-Interaktionen verbessern. Dies wird Informationen für die Entwicklung von Strategien zur Kontrolle und Vorbeugung von Rickettsiosen liefern.
Datenverfügbarkeit:
Alle Daten, die den Ergebnissen dieser Studie zugrunde liegen, sind öffentlich zugänglich.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.
Acknowledgments
Wir danken Timothy J. Kurtti und Benjamin Cull für ihre aufschlussreichen Diskussionen und Anregungen. Diese Studie wurde finanziell durch einen Zuschuss an U.G.M. vom NIH (2R01AI049424) und einen Zuschuss an U.G.M. von der Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
References
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H.
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E.
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
