Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Een elektroporatiemethode om Rickettsia spp. te transformeren met een fluorescerende eiwitexpressie shuttlevector in tekencellijnen

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

Elektroporatie is een snelle, breed toegepaste methode voor het introduceren van exogene DNA in het geslacht Rickettsia. Dit protocol biedt een bruikbare elektroporatiemethode voor de transformatie van obligate intracellulaire bacteriën in het geslacht Rickettsia.

Abstract

Rickettsioses worden veroorzaakt door een breed scala aan obligate intracellulaire bacteriën die behoren tot het geslacht Rickettsia en die kunnen worden overgedragen op gewervelde gastheren door de beet van geïnfecteerde geleedpotige vectoren. Tot op heden blijven opkomende of opnieuw opkomende epidemische rickettsioses een risico voor de volksgezondheid vanwege de moeilijkheid bij de diagnose, omdat diagnostische methoden beperkt en niet gestandaardiseerd of universeel toegankelijk zijn. Verkeerde diagnose als gevolg van een gebrek aan herkenning van de tekenen en symptomen kan leiden tot vertraagde antibioticabehandeling en slechte gezondheidsresultaten. Een uitgebreid begrip van Rickettsia-kenmerken zou uiteindelijk de klinische diagnose, beoordeling en behandeling verbeteren met verbeterde controle en preventie van de ziekte.

Functionele studies van rickettsiale genen zijn cruciaal voor het begrijpen van hun rol in pathogenese. Dit artikel beschrijft een procedure voor de elektroporatie van de Rickettsia parkeri stam Tate's Hell met de shuttle vector pRAM18dSFA en de selectie van getransformeerde R. parkeri in tekencelkweek met antibiotica (spectinomycine en streptomycine). Er wordt ook een methode beschreven voor de lokalisatie van getransformeerde R. parkeri in tekencellen met behulp van confocale immunofluorescentiemicroscopie, een nuttige techniek voor het controleren van transformatie in vectorcellijnen. Soortgelijke benaderingen zijn ook geschikt voor de transformatie van andere rickettsiae.

Introduction

Rickettsioses worden veroorzaakt door een breed scala aan obligate intracellulaire bacteriën die behoren tot het geslacht Rickettsia (familie Rickettsiaceae, orde Rickettsiales). Het geslacht Rickettsia wordt ingedeeld in vier grote groepen op basis van fylogenetische kenmerken 1,2: de spotted fever-groep (SFG), die die rickettsiae bevat die de meest ernstige en fatale door teken overgedragen rickettsiosen veroorzaken (bijv. Rickettsia rickettsii, de veroorzaker van Rocky Mountain Spotted Fever), de tyfusgroep (TG, bijvoorbeeld Rickettsia prowazekii, de verwekker van epidemische tyfus), de overgangsgroep (TRG, bijv. Rickettsia felis, de veroorzaker van door vlooien overgedragen gevlekte koorts) en de voorouderlijke groep (AG, bijv. Rickettsia bellii).

Onder de oudste bekende door vectoren overgedragen ziekten worden rickettsioses voornamelijk verkregen na overdracht van de pathogenen door de beten van geïnfecteerde geleedpotige vectoren, waaronder teken, vlooien, luizen en mijten 3,4. Hoewel de ontdekking van effectieve antibiotica de behandelingsresultaten verbeterde, blijven opkomende en opnieuw opkomende epidemische rickettsioses traditionele preventie- en controlestrategieën uitdagen. Een uitgebreid begrip van rickettsia / gastheer / vectorinteracties zou uiteindelijk een sterke basis leggen voor het ontwikkelen van nieuwe benaderingen om deze oude ziekten te voorkomen en te genezen.

In de natuur vindt horizontale genoverdracht (HGT) in bacteriën plaats door conjugatie, transductie en transformatie5. In vitro bacteriële transformatie maakt gebruik van deze HGT-concepten, hoewel de intracellulaire aard van rickettsiae enkele uitdagingen met zich meebrengt. De beperkte groeiomstandigheden en slecht begrepen conjugatie- en transductiesystemen bij verschillende soorten rickettsiae hebben de toepassing van conjugatie- en transductiemethoden in rickettsiae 6,7,8 verhinderd. In vergelijking met andere obligate intracellulaire bacteriële geslachten (bijv. Chlamydia, Coxiella, Anaplasma en Ehrlichia), verschilt het geslacht Rickettsia met betrekking tot de groei- en replicatiestrategieën binnen het celcytoplasma, wat specifieke uitdagingen oplegt aan de genetische modificatie van rickettsiae vanwege hun unieke levensstijlkenmerken9.

De eerste hindernis die moet worden overwonnen bij het proberen van de genetische modificatie van rickettsiae is het bereiken van een succesvolle transformatie. Het ontwerpen van een haalbare aanpak met een hoge transformatie-efficiëntie zou dus uiterst waardevol zijn voor het ontwikkelen van genetische hulpmiddelen voor rickettsiae. Hier richten we ons op elektroporatie, een algemeen erkende transformatiemethode die is gebruikt om exogene DNA met succes te introduceren in verschillende soorten rickettsiae, waaronder Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii en Rickettsia buchneri 10,11,12 ,13,14,15,16.

Dit artikel beschrijft een procedure voor de elektroporatie van de R. parkeri-stam Tate's Hell (toetreding: GCA_000965145.1) met de shuttlevector pRAM18dSFA afgeleid van de Rickettsia amblyommatis-stam AaR / SC plasmid pRAM18 ontworpen om mKATE, een verrood fluorescerend eiwit, en aadA te coderen, waardoor spectinomycine en streptomycineresistentie 13,15,20 krijgen. Getransformeerde R. parkeri zijn levensvatbaar en stabiel onderhouden onder antibioticaselectie in tekencellijnen. Daarnaast laten we zien dat de lokalisatie van getransformeerde R. parkeri in levende tekencellen via confocale microscopie kan worden gebruikt om de kwaliteit van transformatiesnelheden in vectorcellijnen te beoordelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vermeerdering en zuivering van R. parkeri uit tekencelkweek

OPMERKING: Alle celkweekprocedures moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II.

  1. Voorbereiding R. parkeri-geïnfecteerde tekencellen
    1. Kweek ISE6-cellen in 25 cm2 celkweekkolven bij 34 °C in 5 ml L15C300 medium17, aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 5% tryptosefosfaatbouillon (TPB) en 0,1% lipoproteïneconcentraat (LPC).
      OPMERKING: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-afgeleide cellijn) is een tekencellijn die op grote schaal wordt gebruikt in veel laboratoria en is dus een essentieel model om teken-pathogeen interacties te bestuderen 17,18,19. De groeisnelheid van ISE6-cellen is langzamer dan die van zoogdiercellen, met een populatieverdubbeling van ≥72 uur. Ise6-cellen die zijn gesubcultiveerd uit een 100% confluentcultuur in een verhouding van 1:5, hebben bijvoorbeeld 3-4 weken nodig om 100% confluent te herwinnen. Gezonde ISE6-cellen worden over het algemeen afgerond met talrijke aanhangende filamenten17.
    2. Tel de ISE6-cellen met een hemocytometer onder een lichtmicroscoop. Gebruik in een concentratie van ~106 cellen/ml (100% confluent).
      1. Spoel de cellen voorzichtig uit de kolf met medium en dispergeer de cellen door te pipetteren om een homogene celsuspensie te genereren. Voeg 20 μL celsuspensie toe tussen de hemocytometer en dek glas af om de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer.
    3. Voeg gastheercelvrij wildtype R. parkeri20 (gemiddeld aantal: 5 × 10 7-10 × 10 7) toe aan de ISE6 celculturen in 25 cm2 celkweekkolven. Incubeer geïnfecteerde R. parkeri-celculturen bij 34 °C in 5 ml compleet medium bestaande uit L15C300 medium, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% natriumbicarbonaat (NaHCO3) en 25 mM HEPES totdat 90%-100% van de cellen geïnfecteerd zijn.
      OPMERKING: De infectiegraad van R. parkeri in ISE6-cellen wordt bepaald door Giemsa-kleuring en de incubatietijd om 90% -100% infectie te bereiken varieert van gemiddeld 5 dagen tot 7 dagen.
    4. Bepaal de infectiegraad via Giemsa-kleuring.
      1. Resuspensie in de bioveiligheidskast de geïnfecteerde celculturen en breng 50 μL van de suspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      2. Verdun de suspensie met volledig medium (1:5 verdunning) en centrifugeer 100 μL op glazen microscoopglaasjes met behulp van een centrifuge bij 113 × g gedurende 5 minuten. Om levende R. parkeri in bedwang te houden, gebruikt u een centrifuge met een verzegelde rotor die is ontworpen om uit de centrifuge te worden verwijderd. Dit maakt het transport van de afgedichte rotor in en uit de kap mogelijk.
        OPMERKING: Aangezien de R. parkeri nog in leven zijn voor de centrifugatie, moet het monster worden ingesloten totdat de rickettsia zijn gedood. De centrifuge die wordt gebruikt om de R. parkeri-cultuur op de glijbaan te laten draaien, moet dus een verzegelde rotor hebben die is ontworpen om uit de centrifuge te worden getild. Met de rotor in de laminaire stromingskap laadt u de monsters in de trechtermicroscoopglaas, sluit u de rotor opnieuw en plaatst u de verzegelde rotor terug in de centrifuge. Schakel vervolgens de centrifuge in en de monsters worden op de microscoopglaasjes gedeponeerd. Nadat de run is voltooid, verwijdert u de verzegelde rotor uit de centrifuge en plaatst u deze in de laminaire stromingskap. Open daar het rotordeksel en verwijder de trechter-microscoop-dia-assemblage in de kap. Eenmaal droog, dompel de glazen microscoopglaasjes onder in absolute methanol, die alle ziekteverwekkers doodt. De trechters en de metalen dragers worden ondergedompeld in verdunde DMQ, die R. parkeri doodt.
      3. Droog de dia's aan de lucht en bevestig in absolute methanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
      4. Beits de glaasjes met Giemsa-vlek (4% in de buffer van Sørenson, pH 6,6) gedurende 30 min bij 37 °C en spoel met water gedurende 5 s.
      5. Bepaal het infectiepercentage (aantal cellen geïnfecteerd met rickettsiae/100 cellen) door middel van lichtmicroscopie.
        OPMERKING: Figuur 1 toont typische Giemsa-vlekresultaten.
  2. Celvrije R. parkeri bereiden
    OPMERKING: Wanneer 90% -100% van de cellen in de cultuur zijn geïnfecteerd, moet de rickettsiae worden geïsoleerd uit de ISE6-cellen en moet elektroporatie worden uitgevoerd.
    1. Voeg steriel 60-90 siliciumcarbide grit toe aan steriele 2 ml microcentrifugebuizen tot een volume van ongeveer 0,2 ml.
    2. Verwijder 2 ml medium uit 100% R. parkeri-geïnfecteerde culturen (stap 1.1.3) en resuspensieer de cellen in de resterende 3 ml medium.
    3. Breng gelijke delen van deze suspensie over in buizen die in stap 1.2.1 zijn bereid.
    4. Vortex elke buis op hoge snelheid gedurende 30 s en plaats de buizen vervolgens op ijs. Laat het gruis binnen enkele seconden bezinken door de zwaartekracht.
    5. Houd in een bioveiligheidskast van klasse II een steriele Luer-lock spuit van 5 ml klaar met de zuiger verlengd en het uiteinde van de zuiger vastgezet in een polystyreenbasis voor 15 ml conische buizen.
    6. Verwijder met behulp van een steriele, 1 ml barrièrepipetpunt gemonteerd op een geschikte pipettor het supernatant van het vortexed celllysaat uit de buis en zorg ervoor dat er geen gruis wordt opgezogen. Steek de pipetpunt in de naafopening van de spuit en werp de inhoud met zachte druk in de spuit. U kunt ook een steriele, barrière 2 ml Pasteur pipet gebruiken die wordt bediend met een rubberen bol.
    7. Bevestig een gesteriliseerd 2 μm poriegroottefilter op de spuitnaaf en filter de R. parkeri-cultuur uit stap 1.2.6 in steriele buisjes van 1,5 ml.
    8. Verzamel de R. parkeri door centrifugeren bij 13.600 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
    9. Resuspendeer de pellet in 1,2 ml ijskoude 300 mM sucrose en centrifugeer opnieuw bij 13.600 × g bij 4 °C gedurende 5 min. Herhaal de resuspensie en centrifugeer voor een totaal van twee sucrosewasbeurten.
    10. Combineer de R. parkeri pellets tot één gekoelde, steriele 1,5 ml microcentrifugebuis in 50 μL ijskoude 300 mM sucrose per transformatie. Als een 25 cm2 kolf R. parkeri genoeg rickettsiae biedt voor twee tot drie transformaties, voeg dan 100-150 μL van 300 mM koude sucrose toe.
      OPMERKING: Indien gewenst kan het aantal rickettsiae worden berekend met behulp van een Petroff-Hausser telkamer. Bij gebruik van een initiële inenting van 5 × 107 -10 × 107 celvrije R. parkeri, duurt het gemiddeld 5-7 dagen om 90% -100% infectie te bereiken, wat ongeveer 5 × 107-10 × 1010 celvrije R. parkeri oplevert.
    11. Resuspendeer de pellet voorzichtig door te pipetteren totdat deze grondig is gedispergeerd. Verdeel het monster in porties van 50 μL in gekoelde, steriele microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
      OPMERKING: Indien gewenst kan de levensvatbaarheid van rickettsi worden beoordeeld door middel van flowcytometrie na kleuring met een fluorescerende kleurstof 21.

2. Transformatie van R. parkeri met het pRAM18dSFA plasmide

  1. Voeg op ijs 3 μg endotoxinevrije pRAM18dSFA plasmide DNA 13,15,20 toe aan elke buis met 50 μL R. parkeri-suspensie en roer het mengsel voorzichtig maar grondig met de pipetpunt.
    OPMERKING: Gebruik bij het bereiden van plasmide-DNA een zuiveringskit met een stap voor het verwijderen van endotoxine om endotoxinevrij plasmide-DNA23 te verkrijgen. We ontdekten dat een bereik van plasmideconcentraties tussen 1 μg en 3 μg per 50 μL R. parkeri-suspensie resulteerde in succesvolle transformaties, terwijl het verhogen van de hoeveelheid plasmide tot 10 μg de transformatie remde.
  2. Breng het bovenstaande mengsel van DNA en R. parkeri over in een gekoeld, steriel elektroporatiecuvet van 0,1 cm (tik zachtjes op de cuvette totdat het mengsel gelijkmatig is verdeeld) en laat het 10-30 minuten op ijs zitten.
  3. Verwijder het medium uit een 100% confluentcultuur van ISE6-cellen en resuspensieer de cellagen in 1,5 ml vers medium met NaHCO3 - en HEPES-buffer (hierboven beschreven in stap 1.1.3). Gebruik één kolf met confluente cellen per transformatie.
  4. Breng de geresuspendeerde cellen over naar een steriele microcentrifugebuis van 2 ml (één buis per 25 cm2 kolf ISE6-cellen).
  5. Elektropomeer het R. parkeri/pRAM18dSFA mengsel op 1,8 KV, 200 ohm, 25 μF met behulp van een elektroporator.
  6. Breng met behulp van een steriele, verlengde pipet met fijne punt een kleine hoeveelheid van de ISE6-celsuspensie (stap 2.4) over in de cuvette en trek de vloeistof voorzichtig op en neer om de cuvette uit te spoelen. Breng het mengsel over in de microcentrifugebuis van 2 ml met de rest van de ISE6-celsuspensie en meng het transformatiemengsel voorzichtig met de cellen.
  7. Centrifugeer de getransformeerde monsters bij 700 × g gedurende 2 minuten bij RT en verhoog vervolgens de centrifugatiesnelheid tot 13.600 × g gedurende 1 minuut meer bij RT.
    OPMERKING: De twee centrifugatiesnelheden bevorderen rickettsial binding met en binnenkomst in de cellen: 700 × g wordt gebruikt om de ISE6-cellen naar beneden te trekken, terwijl 13.600 × g wordt gebruikt om de rickettsiae naar beneden te trekken.
  8. Laat de monsters gedurende 15 min tot 1 uur op RT of 34 °C staan.
  9. Resuspensie van de transformatoren (twee of drie) in ISE6-cellen met een steriele 2 ml barrièrepipetpunt gemonteerd op een pipettor en breng over in twee of drie 25 cm2 celkweekkolven met 3,5 ml vers medium met NaHCO3 en HEPES-buffer. U kunt ook een steriele, barrière 2 ml Pasteur pipet gebruiken die wordt bediend met een rubberen bol.
  10. Schommel de kolven om het mengsel gelijkmatig te verdelen en incubeer vervolgens bij 34 °C.
  11. Voeg na 16-24 uur in stap 2.10 10 ml spectinomycine (50 mg/ml) en 10 μl streptomycine (50 mg/ml) toe aan elke kolf.

3. Observatie van de getransformeerde R. parkeri

OPMERKING: Gebruik een epifluorescentiemicroscoop met rhodamine/TRITC-filters om de kolven te observeren die in stap 2.11 na 3-7 dagen zijn bereid. Zodra plaques zichtbaar zijn in de culturen (5-14 dagen), kan getransformeerde R. parkeri worden gezien die het rode fluorescerende eiwit mKATE uitdrukken, gecodeerd op het pRAM18dSFA-plasmide.

  1. Confocale microscopie
    1. Resuspensieer de celculturen uit de kolven van stap 2.11 en meng 100 μL van deze celculturen met 5 μL Hoechst 33342-oplossing gedurende 10-30 minuten bij RT in het donker.
      OPMERKING: Hoechst 33342 is een celdoorlatende nucleaire counterstain die zich bindt aan levend tekencel-DNA en blauwe fluorescentie uitzendt.
    2. Centrifugeer 50 μL van het mengsel op glazen microscoopglaasjes met behulp van een centrifuge op 5 × g gedurende 3 minuten.
    3. Voeg 3 μL 1x PBS toe aan de plek van cellen die op de dia zijn afgezet, leg over met een afdekslip en bekijk met een confocale microscoop (60x objectief). Gebruik de volgende excitatie- en emissieparameters voor fluorescerende beeldvorming: voor 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), excitatie bij 350 nm, emissie bij 470 nm; voor tetramethylrhodamine (TRITC), excitatie bij 557 nm, emissie bij 576 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De morfologie van R. parkeri in ISE6-cellen onder een lichtmicroscoop na Giemsa-kleuring is weergegeven in figuur 1. In figuur 2 worden getransformeerde R. parkeri die rood fluorescentie-eiwit in ISE6-cellen tot expressie brengen, getoond met behulp van confocale microscopie. Er is een aanzienlijke toename van de infectiegraad van getransformeerde R. parkeri (rood) in ISE6-cellen (blauw, komt overeen met de kernen) van (A) dag 7 tot (B) dag 10 van incubatie.

Figure 1
Figuur 1: Dia's met Giemsa-gekleurde Rickettsia parkeri in ISE6-cellen. ISE6-cellen geïnfecteerd met wild-type R. parkeri bij (A) lage infectie en (B) 90% -100% infectiepercentages. De kernen van de ISE6-cellen kleuren met Giemsa donkerpaars; de R. parkeri verschijnen als donkerpaarse roeden. De rode vakjes tonen intracellulaire rickettsiae en de rode sterretjes geven extracellulaire rickettsiae aan. Alle foto's zijn gemaakt met een lichtmicroscoop met een 100x objectief. Schaalstaven = 50 μm. Afkorting: N = kernen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Getransformeerde Rickettsia parkeri die rood fluorescentie-eiwit tot expressie brengt in ISE6-cellen. pRAM18dSFA-getransformeerde R. parkeri (rood) in ISE6-cellen (blauw), gekleurd met Hoechst 33342 en gedetecteerd door confocale microscopie (A) 7 dagen en (B) 10 dagen na transformatie. Hoechst 33342 kleurt de kernen en de excitatie- en emissiegolflengten zijn vergelijkbaar met DAPI. De samengevoegde signalen zijn een combinatie van DAPI- en TRITC-filterafbeeldingen. Alle beelden zijn gemaakt met een confocale microscoop met een 60x objectief. Schaalstaven = 20 μm. Afkortingen: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; TRITC = tetramethylrhodamine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier demonstreren we een methode voor het introduceren van exogene DNA gecodeerd op de shuttle plasmid pRAM18dSFA in rickettsiae met behulp van elektroporatie. In deze procedure werden celvrije rickettsiae gezuiverd uit gastheercellen, getransformeerd met een rickettsial shuttle vector en vrijgegeven op tekencellen voor infectie. Ook beschreven is een confocale immunofluorescentieprocedure om rode fluorescentie-eiwit-expresserende R. parkeri in tekencellen te detecteren. Vergelijkbare methoden zijn van toepassing op andere Rickettsia-soorten en kunnen met verdere aanpassingen worden aangepast aan andere obligate intracellulaire bacteriën die in staat zijn om een plasmide in stand te houden.

Een succesvolle transformatie in dit protocol vereist drie componenten: exogene DNA, Rickettsia spp. bacteriën en een geschikt type gastheercel22. Afhankelijk van het specifieke onderzoeksdoel kunnen deze componenten worden gewijzigd. Eerst werd het exogene DNA geïntroduceerd via het pRAM18dSFA-plasmide, dat spectinomycine- en streptomycine-selecteerbare markers bevat en mKATE (een verrood fluorescerend eiwit) tot expressie brengt. Dit plasmide verleent ook ampicillineresistentie voor groei in Escherichia coli. Zoals aangetoond in eerdere studies, is het mogelijk om antibioticaresistentiemarkers en de genen voor fluorescerende eiwitten te vervangen13. Ten tweede werden ISE6-cellen geselecteerd om getransformeerde cellijnen te vertegenwoordigen, omdat deze cellijn op grote schaal wordt gebruikt in veel laboratoria en een essentieel model is voor de studie van vector-pathogeeninteracties 17,18,19. Andere soorten teek16 of zoogdiercellen 23,24 kunnen ook worden gebruikt om rickettsiae te laten groeien voor transformatie. Ten slotte werd in dit protocol R. parkeri gebruikt, dat kan worden gemanipuleerd in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) laboratorium met behulp van een klasse II bioveiligheidskast met de juiste veiligheidsmaatregelen. Andere meer pathogene Rickettsia spp. (bijv. R. rickettsii; R. prowazekii) een BSL-3-instelling voor manipulatie vereisen; daarom moet een strenger standaardprotocol voor bioveiligheid worden gebruikt bij het werken met dergelijke middelen.

Hoewel dit protocol kan worden gebruikt als een standaardprocedure voor rickettsiae-transformatie, vereisen verschillende belangrijke technische stappen bijzondere aandacht. Ten eerste moet een succesvolle zuiveringsstap zorgen voor celvrije rickettsiae-overleving en infectiviteit9; daarom is het meest kritieke aspect van de transformatieprocedure het isoleren van infectieuze, celvrije rickettsiae. Elk restzout in de gezuiverde rickettsiae zal resulteren in boogvorming en transformatiefouten. Daarom is het wassen van de geïsoleerde celvrije rickettsiae met sucrose vereist om alle zouten te verwijderen. De koude sucrose-oplossing beschermt ook de rickettsiale membraanintegriteit in de extracellulaire toestand.

Wanneer 90% -100% van de cellen in een cultuur zijn geïnfecteerd, moet de rickettsiae worden geïsoleerd uit de ISE6-cellen en moet elektroporatie zonder vertraging en zonder onderbrekingen worden uitgevoerd, omdat rickettsiae intracellulaire organismen zijn en niet goed overleven buiten cellen. Hoewel rickettsiale culturen bij 4 °C kunnen worden bewaard, mag dit type materiaal niet worden gebruikt voor elektroporatie. Een cultuur die is opgeslagen bij 4 °C kan worden gebruikt om een verse laag ISE6-cellen in te enten, die vervolgens kan worden gebruikt voor elektroporatie zodra de infectie 90% -100% heeft bereikt.

Ten tweede zijn de elektroporatie-instellingen, waaronder spanning, weerstand, capaciteit en tijdconstante, specifiek voor verschillende rickettsial-soorten. De veldsterkte die nodig is tijdens elektroporatie is bijvoorbeeld afhankelijk van de grootte van het rickettsiae en exogene DNA7. Ten slotte is het belangrijk om de getransformeerde rickettsiae onder antibioticaselectie te behouden om het verlies van exogene plasmiden tijdens meerdere passages in gastheercellen te voorkomen9. De concentratie en het type antibioticum dat wordt gebruikt, zijn afhankelijk van de transformatie van de Rickettsia-soort, zoals eerder beschreven 13,15,16,23, en het is belangrijk dat de geselecteerde antibioticummarker niet een is die wordt toegepast in klinische behandelingen.

Om dit protocol te volgen, moeten zowel spectinomycine als streptomycine worden gebruikt voor selectie totdat alle resterende niet-getransformeerde rickettsiae zijn geëlimineerd. Gecombineerd doden de twee antibiotica zowel intracellulaire als extracellulaire rickettsiae en verminderen ze de kans dat resistente wild-type rickettsiae opduikt. Bovendien heeft het gebruik van beide antibiotica geen invloed op downstream-experimenten, zoals de mogelijkheid om ze afzonderlijk te gebruiken om te selecteren op twee verschillende plasmiden, omdat het aadA-gen resistentie verleent tegen zowel spectinomycine als streptomycine. De twee antibiotica die in dit protocol worden gebruikt, verlenen geen resistentie tegen antibiotica die worden gebruikt bij de klinische behandeling van rickettsiale ziekte.

De ISE6-tekencellijn die in deze studie wordt gebruikt, heeft unieke voordelen. Eerst werden ISE6-cellen geïsoleerd uit de zwartbenige teek Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae), de belangrijkste vector voor zeven menselijke pathogenen in de Verenigde Staten. Ten tweede is ISE6 een veel gebruikte tekencellijn in veel laboratoria en is het met succes gebruikt om veel teken-geassocieerde bacteriën (Rickettsia, Anaplasma en Ehrlichia) te herstellen na elektroporatie. Ten derde kunnen sommige pathogene rickettsiae alleen worden vermeerderd in tekencellen, maar niet in zoogdiercellen 17,18,19,24. Tekencellijnen zijn echter relatief kwetsbaar in vergelijking met zoogdiercellen en hebben intensievere kweekvereisten 25,26,27,28. Bovendien is de groeisnelheid van ISE6-cellen aanzienlijk langzamer dan die van zoogdiercellijnen, zelfs als ze met dezelfde initiële dichtheid worden gezaaid, hoewel langzame replicatie voordelig kan zijn wanneer de rickettsiale transformatoren een verminderde groei vertonen.

Dit protocol biedt ook een methode om de transformatie-efficiëntie van rickettsiae in levende cellen bij kritieke experimentele stappen te evalueren, wat helpt bij het optimaliseren van elektroporatie-instellingen of bij het testen van de efficiëntie van verschillende cellijnen voor het herstellen van transformatoren. Niettemin heeft dit protocol beperkingen, vooral voor de kwantificering van de verkregen transformatoren. Transformatie-efficiëntie als indicator van een succesvolle transformatie kan worden aangetoond in een toekomstige studie. De levensvatbaarheid van Rickettsial kan worden beoordeeld met behulp van een geschikte kleuringskit en flowcytometrie21 om de verkregen transformatoren te kwantificeren. Twee parameters zouden worden gebruikt om de transformatie-efficiëntie te bepalen- het aantal levende rickettsiae dat wordt gebruikt voor transformatie en het aantal getransformeerde rickettsiae dat mKATE uitdrukt.

Bovendien kan beeldanalyse met fluorescentiesignalen worden gebruikt om de transformatiesnelheden van verschillende plasmiden te vergelijken. Omdat het onderliggende mechanisme van rickettsiale plasmide-onderhoud slecht wordt begrepen, kunnen goed gekarakteriseerde transformatiesystemen voor het introduceren van exogene plasmiden waardevolle hulpmiddelen zijn voor verder onderzoek. Bovendien zal de directe visualisatie van fluorescerende eiwitexpressie rickettsiae in cellen of weefsels ons begrip van rickettsia / gastheer / vectorinteracties verbeteren. Dit zal informatie opleveren voor het ontwerpen van strategieën om rickettsioses te beheersen en te voorkomen.

Beschikbaarheid van gegevens:
Alle gegevens die ten grondslag liggen aan de resultaten van dit onderzoek zijn openbaar beschikbaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er worden geen belangenconflicten afgekondigd.

Acknowledgments

We danken Timothy J. Kurtti en Benjamin Cull voor hun inzichtelijke discussies en suggesties. Deze studie werd financieel ondersteund door een subsidie aan U.G.M. van de NIH (2R01AI049424) en een subsidie aan U.G.M. van het Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Tags

Biologie Electroporation Rickettsia immunofluorescentie
Een elektroporatiemethode om <em>Rickettsia</em> spp. te transformeren met een fluorescerende eiwitexpressie shuttlevector in tekencellijnen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y.,… More

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter