Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Метод электропорации для преобразования риккетсии spp. с флуоресцентным белково-экспрессирующим челночным вектором в клеточных линиях клещей

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

Электропорация — это быстрый, широко распространенный метод введения экзогенной ДНК в род Rickettsia. Данный протокол обеспечивает полезный метод электропорации для трансформации облигатных внутриклеточных бактерий рода Rickettsia.

Abstract

Риккетсиозы вызываются широким спектром облигатных внутриклеточных бактерий, принадлежащих к роду Rickettsia , которые могут передаваться позвоночным хозяевам через укус инфицированных членистоногих векторов. На сегодняшний день возникающие или вновь возникающие эпидемические риккетсиозы остаются риском для здоровья населения из-за трудностей в диагностике, поскольку методы диагностики ограничены и не стандартизированы или общедоступны. Ошибочный диагноз, возникающий в результате отсутствия распознавания признаков и симптомов, может привести к задержке лечения антибиотиками и плохим результатам для здоровья. Всестороннее понимание характеристик риккетсии в конечном итоге улучшит клиническую диагностику, оценку и лечение с улучшенным контролем и профилактикой заболевания.

Функциональные исследования риккетсиальных генов имеют решающее значение для понимания их роли в патогенезе. В данной работе описана процедура электропорации штамма Rickettsia parkeri Tate's Hell с челночным вектором pRAM18dSFA и селекция трансформированного R. parkeri в культуре клеток клещей с антибиотиками (спектиномицин и стрептомицин). Также описан способ локализации трансформированного R. parkeri в клещевых клетках с использованием конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии, полезной методики проверки трансформации в векторных клеточных линиях. Подобные подходы подходят и для трансформации других риккетсий.

Introduction

Риккетсиозы вызываются широким спектром облигатных внутриклеточных бактерий, которые принадлежат к роду Rickettsia (семейство Rickettsiaceae, отряд Rickettsiales). Род Rickettsia классифицируется на четыре основные группы на основе филогенетических характеристик 1,2: группа пятнистой лихорадки (SFG), которая содержит те риккетсии, которые вызывают наиболее тяжелые и смертельные клещевые риккетсиозы (например, Rickettsia rickettsii, возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор), группа тифа (TG, например, Rickettsia prowazekii, возбудитель эпидемического тифа), переходная группа (TRG, например, Rickettsia felis, возбудитель пятнистой лихорадки, переносимой блохами), и предковая группа (AG, например, Rickettsia bellii).

Среди старейших известных трансмиссивных заболеваний риккетсиозы в основном приобретаются после передачи патогенов через укусы инфицированных членистоногих переносчиков, включая клещей, блох, вшей и клещей 3,4. Хотя открытие эффективных антибиотиков улучшило результаты лечения, возникающие и вновь возникающие эпидемические риккетсиозы продолжают бросать вызов традиционным стратегиям профилактики и контроля. Таким образом, всестороннее понимание взаимодействия риккетсии/хозяина/вектора в конечном итоге создаст прочную основу для разработки новых подходов к профилактике и лечению этих древних заболеваний.

В природе горизонтальный перенос генов (HGT) у бактерий происходит путем конъюгации, трансдукции и трансформации5. Бактериальная трансформация in vitro использует эти концепции HGT, хотя внутриклеточная природа риккетсий представляет некоторые проблемы. Ограниченные условия роста и плохо изученные системы конъюгации и трансдукции у разных видов риккетсий препятствовали применению методов конъюгации и трансдукции у риккетсий 6,7,8. По сравнению с другими облигатными внутриклеточными бактериальными родами (например, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma и Ehrlichia), род Rickettsia отличается в отношении стратегий роста и репликации в цитоплазме клеток, что создает специфические проблемы для генетической модификации риккетсий из-за их уникальных особенностей образа жизни9.

Первоначальное препятствие, которое необходимо преодолеть при попытке генетической модификации риккетсий, заключается в достижении успешной трансформации. Таким образом, разработка осуществимого подхода с высокой эффективностью трансформации была бы чрезвычайно ценной для разработки генетических инструментов для риккетсий. Здесь мы сосредоточимся на электропорации, широко признанном методе трансформации, который был использован для успешного введения экзогенной ДНК в несколько видов риккетсий, включая Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii и Rickettsia buchneri 10,11,12 ,13,14,15,16.

В данной статье описывается процедура электропорации штамма R. parkeri Tate's Hell (присоединение: GCA_000965145.1) с челночным вектором pRAM18dSFA, полученным из штамма Rickettsia amblyommatis AaR/SC плазмиды pRAM18, спроектированного для кодирования mKATE, дальнекрасого флуоресцентного белка, и aadA, придающего резистентность к спектиномицину и стрептомицину 13,15,20. Трансформированные R. parkeri жизнеспособны и стабильно поддерживаются при выделении антибиотиков в клеточных линиях клещей. Кроме того, показано, что локализация трансформированного R. parkeri в живых клетках клещей с помощью конфокальной микроскопии может быть использована для оценки качества скоростей трансформации в векторных клеточных линиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Размножение и очистка R. parkeri из культуры клещевых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры культивирования клеток должны выполняться в шкафу биобезопасности класса II.

  1. Подготовка R. parkeri-инфицированные клетки клещей
    1. Выращивайте клетки ISE6 в колбах для культивирования клеток размером25 см2 при 34 °C в 5 мл среды L15C30017, дополненных 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 5% триптозно-фосфатным бульоном (TPB) и 0,1% липопротеиновым концентратом (LPC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ISE6 (клеточная линия эмбриона Ixodes scapularis) является клеточной линией клещей, широко используемой во многих лабораториях и, таким образом, является важной моделью для изучения взаимодействия клещей и патогенов 17,18,19. Скорость роста клеток ISE6 медленнее, чем у клеток млекопитающих, со временем удвоения популяции ≥72 ч. Например, клеткам ISE6, субкультивированным из 100% сливающейся культуры в соотношении 1:5, потребуется 3-4 недели, чтобы восстановить 100% слияние. Здоровые клетки ISE6, как правило, округляются с многочисленными прилипшими нитями17.
    2. Подсчитайте клетки ISE6 с помощью гемоцитометра под световым микроскопом. Использовать в концентрации ~106 клеток/мл (100% слияние).
      1. Осторожно промойте клетки из колбы средой и рассейте клетки путем пипетирования, чтобы получить однородную клеточную суспензию. Добавьте 20 мкл клеточной суспензии между гемоцитометром и накройте стекло, чтобы подсчитать клетки с помощью гемоцитометра.
    3. Добавьте бесклеточный хозяин дикого типа R. parkeri20 (среднее число: 5 × 107-10 × 107) в клеточные культуры ISE6 в колбах для клеточных культурпо 25 см2 . Инкубируют инфицированные культуры клеток R. parkeri при 34 °C в 5 мл полной среды, состоящей из среды L15C300, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% бикарбоната натрия (NaHCO3) и 25 мМ HEPES до заражения 90%-100% клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень инфицирования R. parkeri в клетках ISE6 определяется окрашиванием Giemsa, а время инкубации для достижения 90%-100% инфекции колеблется в среднем от 5 дней до 7 дней.
    4. Определите скорость заражения с помощью окрашивания Giemsa.
      1. В шкафу биобезопасности повторно суспендируют инфицированные клеточные культуры и переносят 50 мкл суспензии в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
      2. Разбавить суспензию полной средой (разведение 1:5) и центрифугу 100 мкл на предметные стекла микроскопа с помощью центрифуги при 113 × г в течение 5 мин. Чтобы сохранить живое R. parkeri , используйте центрифугу с герметичным ротором, который предназначен для удаления из центрифуги. Это позволяет транспортировать герметичный ротор внутрь и из капота.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку R. parkeri все еще живы до центрифугирования, образец необходимо содержать до тех пор, пока риккетсии не будут убиты. Таким образом, центрифуга, используемая для вращения культуры R. parkeri на слайде, должна иметь герметичный ротор, который предназначен для поднятия из центрифуги. С ротором в ламинарной проточной вытяжке загрузите образцы в узел слайда воронкообразного микроскопа, повторно запечатайте ротор и поместите герметичный ротор обратно в центрифугу. Затем включите центрифугу, и образцы осаждаются на предметные стекла микроскопа. После завершения пробега снимите герметичный ротор с центрифуги и поместите его в ламинарную вытяжку. Там откройте крышку ротора и разгрузите затвор воронки-микроскопа внутри капота. После высыхания погрузите стекла микроскопа в абсолютный метанол, который убивает все патогены. Воронки и металлические носители погружены в разбавленный DMQ, который убивает R. parkeri.
      3. Высушите горки на воздухе и зафиксируйте в абсолютном метаноле на 5 мин при комнатной температуре (RT).
      4. Окрашивайте слайды пятном Giemsa (4% в буфере Соренсона, рН 6,6) в течение 30 мин при 37 °C и смывайте водой в течение 5 с.
      5. Определить процент заражения (количество клеток, инфицированных риккетсиями/100 клеток) с помощью световой микроскопии.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны типичные результаты окрашивания Giemsa.
  2. Приготовление бесклеточного R. parkeri
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда 90%-100% клеток в культуре инфицированы, риккетсии должны быть выделены из клеток ISE6 и должна быть выполнена электропорация.
    1. Добавьте стерильную зернистость из карбида кремния 60-90 в стерильные микроцентрифужные трубки объемом около 0,2 мл.
    2. Удалите 2 мл среды из 100% R. parkeri-инфицированных культур (шаг 1.1.3) и повторно суспендируйте клетки в оставшихся 3 мл среды.
    3. Переложите равные части этой суспензии в трубы, подготовленные на этапе 1.2.1.
    4. Вращайте каждую трубку на высокой скорости в течение 30 с, а затем поместите трубки на лед. Дайте песку осесть в течение нескольких секунд под действием силы тяжести.
    5. В шкафу биобезопасности класса II иметь готовый стерильный шприц Luer-lock объемом 5 мл с вытянутым плунжером и концом плунжера, закрепленным в полистирольной основе для конических труб объемом 15 мл.
    6. Используя стерильный, 1 мл барьерный наконечник пипетки, установленный на подходящем пипеторе, удалите супернатант вихревого лизата ячейки из трубки, следя за тем, чтобы не аспирировать песок. Вставьте наконечник пипетки в отверстие ступицы шприца и вытолкните содержимое в шприц с мягким давлением. В качестве альтернативы используйте стерильную барьерную пипетку Пастера 2 мл, управляемую резиновой колбой.
    7. Прикрепите стерилизованный фильтр размером пор 2 мкм к шприцевому концентратору и фильтруйте культуру R. parkeri со стадии 1,2,6 в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.
    8. Соберите R. parkeri путем центрифугирования при 13 600 × г при 4 °C в течение 5 мин и выбросьте супернатант.
    9. Повторно суспендируют гранулу в 1,2 мл ледяной сахарозы 300 мМ и центрифугу снова при 13 600 × г при 4 °C в течение 5 мин. Повторите ресуспензию и центрифугирование в общей сложности две промывки сахарозы.
    10. Смешайте гранулы R. parkeri в одну охлажденную стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл в 50 мкл ледяной сахарозы 300 мМ на трансформацию. Поскольку одна колба R. parkeri размером25 см2 обеспечивает достаточное количество риккетсий для двух-трех превращений, добавляют 100-150 мкл 300 мМ холодной сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании количество риккетсий может быть рассчитано с помощью счетной камеры Петроффа-Хауссера. При использовании начальной прививки 5 × 107 -10 × 107 бесклеточных R. parkeri, в среднем потребуется 5-7 дней, чтобы достичь 90%-100% инфекции, в результате чего будет примерно 5 × 107-10 × 1010 бесклеточных R. parkeri.
    11. Аккуратно повторно суспендируйте гранулу путем пипетки до тех пор, пока она не будет полностью диспергирована. Разделите образец на порции по 50 мкл в охлажденных, стерильных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При желании жизнеспособность риккетсии может быть оценена с помощью проточной цитометрии после окрашивания флуоресцентным красителем 21.

2. Трансформация R. parkeri с плазмидой pRAM18dSFA

  1. На льду добавьте 3 мкг свободной от эндотоксинов плазмиды pRAM18dSFAДНК 13,15,20 в каждую трубку, содержащую 50 мкл суспензии R. parkeri, и осторожно, но тщательно перемешайте смесь кончиком пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При получении плазмидной ДНК используйте набор для очистки, который включает в себя этап удаления эндотоксинов для получения плазмидной ДНК23 без эндотоксинов. Мы обнаружили, что диапазон плазмидных концентраций от 1 мкг до 3 мкг на 50 мкл суспензии R. parkeri приводил к успешным превращениям, тогда как увеличение количества плазмиды до 10 мкг ингибировало трансформацию.
  2. Переложите вышеуказанную смесь ДНК и R. parkeri в охлажденную, стерильную электропорационную кювету с зазором 0,1 см (осторожно постучите по кювете до равномерного распределения смеси) и дайте ей постоять на льду в течение 10-30 мин.
  3. Удалите среду из 100% сливающейся культуры клеток ISE6 и повторно суспендируйте клеточные слои в 1,5 мл свежей среды с буфером NaHCO3 и HEPES (описанным выше на этапе 1.1.3). Используйте одну колбу сливающихся клеток для каждого преобразования.
  4. Перенесите повторно суспендированные клетки в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 2 мл (одна трубка на 25см2 колбы клеток ISE6).
  5. Электропорат смеси R. parkeri/pRAM18dSFA при 1,8 кВ, 200 Ом, 25 мкФ с помощью электропоратора.
  6. Используя стерильную, удлиненную передаточную пипетку с тонким наконечником, переведите небольшое количество клеточной суспензии ISE6 (этап 2.4) в кювету и осторожно потяните жидкость вверх и вниз, чтобы промыть кювету. Переложите смесь в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую оставшуюся часть клеточной суспензии ISE6, и осторожно смешайте трансформационную смесь с клетками.
  7. Центрифугируйте преобразованные образцы при 700 × g в течение 2 мин при RT, а затем увеличьте скорость центрифугирования до 13 600 × g в течение 1 мин больше при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Две скорости центрифугирования способствуют риккетсиальному связыванию с клетками и входу в них: 700 × g используется для вытягивания клеток ISE6, в то время как 13 600 × g используется для вытягивания риккетсий.
  8. Дайте образцам постоять при RT или 34 °C в течение 15 мин до 1 ч.
  9. Повторное суспендирование трансформантов (два или три) в ячейках ISE6 с помощью стерильного 2 мл барьерного наконечника пипетки, установленного на пипетке, и перенос в две или три колбы для культивирования клетокразмером 25 см2 , содержащие 3,5 мл свежей среды с буфером NaHCO3 и HEPES. В качестве альтернативы используйте стерильную барьерную пипетку Пастера 2 мл, управляемую резиновой колбой.
  10. Раскачать колбы, чтобы равномерно распределить смесь, а затем инкубировать при 34 °C.
  11. Через 16-24 ч добавляют 10 мкл спектиномицина (50 мг/мл) и 10 мкл стрептомицина (50 мг/мл) в каждую колбу на стадии 2.10.

3. Наблюдение за трансформированным Р. Паркери

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эпифлуоресцентный микроскоп с фильтрами родамина/TRITC для наблюдения за колбами, приготовленными на этапе 2.11 через 3-7 дней. Как только бляшки проявляются в культурах (5-14 дней), можно увидеть трансформированные R. parkeri , которые экспрессируют красный флуоресцентный белок mKATE, кодируемый на плазмиде pRAM18dSFA.

  1. Конфокальная микроскопия
    1. Повторно суспендируют клеточные культуры из колб стадии 2,11 и смешивают 100 мкл этих клеточных культур с 5 мкл раствора Hoechst 33342 в течение 10-30 мин при РТ в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 представляет собой клеточно-проницаемое ядерное контрокрашение, которое связывается с ДНК живых клеток клещей и испускает синюю флуоресценцию.
    2. Центрифугу 50 мкл смеси наносят на стекла микроскопа с помощью центрифуги при 5 × г в течение 3 мин.
    3. Добавьте 3 мкл 1x PBS к месту клеток, нанесенных на слайде, наложите на него крышку и посмотрите с помощью конфокального микроскопа (объектив 60x). Для флуоресцентной визуализации используют следующие параметры возбуждения и излучения: для 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), возбуждение при 350 нм, излучение при 470 нм; для тетраметилродамина (TRITC) возбуждение при 557 нм, эмиссия при 576 нм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Морфология R. parkeri в клетках ISE6 под световым микроскопом после окрашивания Giemsa показана на рисунке 1. На рисунке 2 трансформированный R. parkeri , экспрессирующий красный флуоресцентный белок в клетках ISE6, показан с использованием конфокальной микроскопии. Наблюдается существенное увеличение скорости инфицирования трансформированного R. parkeri (красного) в клетках ISE6 (синий, соответствует ядрам) с (А) дня 7 до (В) 10 дня инкубации.

Figure 1
Рисунок 1: Слайды, показывающие окрашенную Giemsa Rickettsia parkeri в клетках ISE6. Клетки ISE6, инфицированные R. parkeri дикого типа при (A) низкой инфекции и (B) 90%-100% инфекции. Ядра клеток ISE6 окрашиваются в темно-фиолетовый с Giemsa; R. parkeri появляются в виде темно-фиолетовых стержней. Красные коробки показывают внутриклеточные риккетсии, а красные звездочки указывают на внеклеточные риккетсии. Все снимки были сделаны на световой микроскоп со 100-кратным объективом. Шкала баров = 50 мкм. Аббревиатура: N = ядра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Трансформированная Rickettsia parkeri , экспрессирующая красный флуоресцентный белок в клетках ISE6. pRAM18dSFA-трансформированный R. parkeri (красный) в клетках ISE6 (синий), окрашенный Hoechst 33342 и обнаруженный конфокальной микроскопией (A) через 7 дней и (B) через 10 дней после трансформации. Hoechst 33342 окрашивает ядра, а его длины волн возбуждения и излучения аналогичны DAPI. Объединенные сигналы представляют собой комбинацию изображений фильтра DAPI и TRITC. Все снимки были сделаны на конфокальный микроскоп с 60-кратным объективом. Шкала стержней = 20 мкм. Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; TRITC = тетраметилродамин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы демонстрируем метод введения экзогенной ДНК, закодированной на челночной плазмиде pRAM18dSFA, в риккетсии с использованием электропорации. В этой процедуре бесклеточные риккетсии были очищены от клеток-хозяев, преобразованы риккетсиальным челночным вектором и выпущены на клещевые клетки для инфекции. Также описана конфокальная процедура иммунофлуоресценции для обнаружения экспрессирующего белка красного флуоресценции R. parkeri в клетках клещей. Аналогичные методы применимы к другим видам риккетсий и с дальнейшими модификациями могут быть адаптированы к другим облигатным внутриклеточным бактериям, которые способны поддерживать плазмиду.

Успешная трансформация в этом протоколе требует трех компонентов: экзогенной ДНК, бактерий Rickettsia spp. и подходящего типа клетки-хозяина22. В зависимости от конкретной цели исследования эти компоненты могут быть изменены. Во-первых, экзогенная ДНК была введена через плазмиду pRAM18dSFA, которая содержит спектиномицин- и стрептомицин-селективные маркеры и экспрессирует mKATE (дальний красный флуоресцентный белок). Эта плазмида также придает ампициллину устойчивость к росту в Escherichia coli. Как показано в предыдущих исследованиях, можно заменить маркеры устойчивости к антибиотикам и гены флуоресцентных белков13. Во-вторых, клетки ISE6 были выбраны для представления трансформированных клеточных линий, поскольку эта клеточная линия широко используется во многих лабораториях и является важной моделью для изучения векторно-патогенных взаимодействий 17,18,19. Другие виды клещей16 или клетки млекопитающих 23,24 также могут быть использованы для выращивания риккетсий для трансформации. Наконец, в этом протоколе был использован R. parkeri, которым можно манипулировать в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2) с использованием шкафа биобезопасности класса II с надлежащими мерами предосторожности. Другие более патогенные Rickettsia spp. (например, R. rickettsii; Р. провазекии) требовать настройку BSL-3 для манипуляций; поэтому при работе с такими агентами необходимо использовать более строгий стандартный протокол биобезопасности.

Хотя этот протокол может быть использован в качестве стандартной процедуры для трансформации риккетсий, несколько ключевых технических шагов требуют особого внимания. Во-первых, успешный этап очистки должен обеспечить бесклеточную выживаемость риккетсий и инфекционность9; следовательно, наиболее важным аспектом процедуры трансформации является выделение инфекционных, бесклеточных риккетсий. Любая остаточная соль в очищенных риккетсиях приведет к дуговому и трансформационному нарушению. Поэтому для удаления всех солей требуется промывание изолированных бесклеточных риккетсий сахарозой. Холодный раствор сахарозы также защищает целостность риккетсиальной мембраны во внеклеточном состоянии.

Когда 90%-100% клеток в культуре инфицированы, риккетсии должны быть выделены из клеток ISE6, а электропорация должна быть выполнена без задержек и без перерывов, так как риккетсии являются внутриклеточными организмами и не выживают хорошо вне клеток. Хотя риккетсиальные культуры могут храниться при 4 °C, этот тип материала не следует использовать для электропорации. Культура, которая хранилась при 4 ° C, может быть использована для посева свежего слоя клеток ISE6, который затем может быть использован для электропорации, как только инфекция достигнет 90%-100%.

Во-вторых, настройки электропорации, включая напряжение, сопротивление, емкость и постоянную времени, специфичны для различных видов риккетсий. Например, напряженность поля, необходимая при электропорации, зависит от размера риккетсий и экзогенной ДНК7. Наконец, важно поддерживать трансформированные риккетсии под выбором антибиотиков, чтобы предотвратить потерю экзогенных плазмид во время множественных проходов в клетках-хозяевах9. Концентрация и тип используемого антибиотика зависят от трансформируемого вида риккетсии, как описано ранее 13,15,16,23, и важно, чтобы выбранный маркер антибиотика не был тем, который применяется в клинических методах лечения.

Чтобы следовать этому протоколу, как спектиномицин, так и стрептомицин должны использоваться для отбора до тех пор, пока не будут устранены все остаточные нетрансформированные риккетсии. В совокупности эти два антибиотика убивают как внутриклеточные, так и внеклеточные риккетсии и снижают вероятность появления резистентных риккетсий дикого типа. Кроме того, использование обоих этих антибиотиков не влияет на последующие эксперименты, такие как возможность использовать их отдельно для выбора двух разных плазмид, поскольку ген aadA придает устойчивость как к спектиномицину, так и к стрептомицину. Два антибиотика, используемые в этом протоколе, не дают устойчивости к антибиотикам, используемым в клиническом лечении риккетсиозной болезни.

Клеточная линия тиков ISE6, используемая в этом исследовании, имеет уникальные преимущества. Во-первых, клетки ISE6 были выделены из черноногого клеща Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae), основного вектора для семи патогенов человека в Соединенных Штатах. Во-вторых, ISE6 является широко используемой клеточной линией клещей во многих лабораториях и успешно используется для восстановления многих клещевых бактерий (риккетсии, анаплазмы и эрлихии) после электропорации. В-третьих, некоторые патогенные риккетсии могут размножаться только в клетках клещей, но не в клетках млекопитающих 17,18,19,24. Тем не менее, клеточные линии клещей относительно хрупки по сравнению с клетками млекопитающих и имеют более интенсивные требования к культуре 25,26,27,28. Кроме того, скорость роста клеток ISE6 значительно медленнее, чем у клеточных линий млекопитающих, даже если они посеяны с той же начальной плотностью, хотя медленная репликация может быть выгодной, когда риккетсиальные трансформанты демонстрируют сниженный рост.

Этот протокол также предоставляет метод оценки эффективности трансформации риккетсий в живых клетках на критических экспериментальных этапах, который помогает оптимизировать настройки электропорации или в тестировании эффективности различных клеточных линий для восстановления трансформаторов. Тем не менее, этот протокол имеет ограничения, особенно для количественной оценки полученных трансформаторов. Эффективность трансформации как показатель успешной трансформации может быть продемонстрирована в будущем исследовании. Жизнеспособность риккетсии может быть оценена с использованием подходящего набора для окрашивания и проточной цитометрии21 для количественной оценки полученных трансформаторов. Для определения эффективности преобразования будут использоваться два параметра - количество живых риккетсий, используемых для преобразования, и количество трансформированных риккетсий, которые выражают mKATE.

Кроме того, анализ изображений с флуоресцентными сигналами может быть использован для сравнения скоростей трансформации различных плазмид. Поскольку основной механизм поддержания риккетсиозных плазмид плохо изучен, хорошо охарактеризованные системы трансформации для введения экзогенных плазмид могут быть ценными инструментами для дальнейшего исследования. Кроме того, прямая визуализация флуоресцентных белково-экспрессирующих риккетсий в клетках или тканях улучшит наше понимание взаимодействия риккетсий/хозяин/векторов. Это даст информацию для разработки стратегий контроля и профилактики риккетсиозов.

Доступность данных:
Все данные, лежащие в основе результатов этого исследования, являются общедоступными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов не декларируется.

Acknowledgments

Мы благодарим Тимоти Куртти и Бенджамина Калла за их проницательные дискуссии и предложения. Это исследование было финансово поддержано грантом U.G.M. от NIH (2R01AI049424) и грантом U.G.M. от Миннесотской сельскохозяйственной экспериментальной станции (MIN-17-078).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Tags

Биология выпуск 188 Электропорация Риккетсия иммунофлуоресценция
Метод электропорации для преобразования <em>риккетсии</em> spp. с флуоресцентным белково-экспрессирующим челночным вектором в клеточных линиях клещей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y.,… More

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter