Elektroporasyon, eksojen DNA’yı Rickettsia cinsine sokmak için hızlı, geniş çapta benimsenmiş bir yöntemdir. Bu protokol, Rickettsia cinsindeki zorunlu hücre içi bakterilerin dönüşümü için yararlı bir elektroporasyon yöntemi sağlar.
Rickettsioses, enfekte eklembacaklı vektörlerin ısırığı yoluyla omurgalı konakçılara bulaşabilen Rickettsia cinsine ait çok çeşitli zorunlu hücre içi bakterilerden kaynaklanır. Bugüne kadar, ortaya çıkan veya yeniden ortaya çıkan epidemik riketsiozlar, tanı yöntemleri sınırlı olduğu ve standartlaştırılmadığı veya evrensel olarak erişilebilir olmadığı için tanıdaki zorluk nedeniyle halk sağlığı riski olmaya devam etmektedir. Belirti ve semptomların tanınmamasından kaynaklanan yanlış tanı, gecikmiş antibiyotik tedavisine ve kötü sağlık sonuçlarına neden olabilir. Rickettsia özelliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sonuçta hastalığın daha iyi kontrol ve önlenmesi ile klinik tanı, değerlendirme ve tedaviyi geliştirecektir.
Riketsiyal genlerin fonksiyonel çalışmaları, patogenezdeki rollerini anlamak için çok önemlidir. Bu yazıda, Rickettsia parkeri suşu Tate’s Hell’in mekik vektörü pRAM18dSFA ile elektroporasyonu ve kene hücre kültüründe dönüştürülmüş R. parkeri’nin antibiyotiklerle (spektinomisin ve streptomisin) seçimi için bir prosedür açıklanmaktadır. Vektör hücre hatlarındaki transformasyonu kontrol etmek için yararlı bir teknik olan konfokal immünofloresan mikroskopi kullanılarak kene hücrelerinde transforme R. parkeri’nin lokalizasyonu için bir yöntem de tanımlanmıştır. Benzer yaklaşımlar diğer rickettsiae’lerin dönüşümü için de uygundur.
Rickettsiozlar, Rickettsia cinsine (Rickettsiaceae familyası, Rickettsiales sırası) ait çok çeşitli zorunlu hücre içi bakterilerden kaynaklanır. Rickettsia cinsi, filogenetik özelliklere göre dört ana gruba ayrılır1,2: en şiddetli ve ölümcül kene kaynaklı rickettsiozlara neden olan rickettsiiae’leri içeren benekli ateş grubu (SFG) (örneğin, Rocky Mountain Benekli Ateşinin etken maddesi olan Rickettsia rickettsii), tifüs grubu (TG, örneğin, Rickettsia prowazekii, epidemik tifüsün ajanı), geçiş grubu (TRG, örneğin, pire kaynaklı benekli ateşin etken maddesi olan Rickettsia felis) ve atasal grup (AG, örneğin, Rickettsia bellii).
Bilinen en eski vektör kaynaklı hastalıklar arasında, riketsiyozlar esas olarak patojenlerin keneler, pireler, bitler ve akarlar dahil olmak üzere enfekte eklembacaklı vektörlerinin ısırıkları yoluyla bulaşmasını takiben edinilir 3,4. Etkili antibiyotiklerin keşfi tedavi sonuçlarını iyileştirse de, ortaya çıkan ve yeniden ortaya çıkan epidemik riketsiyozlar geleneksel önleme ve kontrol stratejilerine meydan okumaya devam etmektedir. Bu nedenle, riketsia / konakçı / vektör etkileşimlerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sonuçta bu eski hastalıkları önlemek ve iyileştirmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek için güçlü bir temel oluşturacaktır.
Doğada, bakterilerde yatay gen transferi (HGT) konjugasyon, transdüksiyon ve transformasyon yoluyla gerçekleşir5. İn vitro bakteriyel transformasyon bu HGT kavramlarını kullanır, ancak rickettsiiae’nin hücre içi doğası bazı zorluklar sunar. Rickettsiae’nin farklı türlerinde kısıtlı büyüme koşulları ve iyi anlaşılmamış konjugasyon ve transdüksiyon sistemleri, rickettsiae 6,7,8’de konjugasyon ve transdüksiyon yöntemlerinin uygulanmasını engellemiştir. Diğer zorunlu hücre içi bakteri cinsleriyle (örneğin, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma ve Ehrlichia) karşılaştırıldığında, Rickettsia cinsi, benzersiz yaşam tarzı özellikleri nedeniyle rickettsiiae’nin genetik modifikasyonuna özel zorluklar getiren hücre sitoplazmasındaki büyüme ve replikasyon stratejileri açısından farklılık gösterir9.
Rickettsiae’nin genetik modifikasyonunu denerken üstesinden gelinmesi gereken ilk engel, başarılı bir dönüşüm elde etmektir. Bu nedenle, yüksek dönüşüm verimliliğine sahip uygulanabilir bir yaklaşım tasarlamak, rickettsia için genetik araçlar geliştirmek için son derece değerli olacaktır. Burada, Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii ve Rickettsia buchneri10,11,12 dahil olmak üzere çeşitli rickettsia türlerine eksojen DNA’yı başarılı bir şekilde tanıtmak için kullanılan, yaygın olarak tanınan bir transformasyon yöntemi olan elektroporasyona odaklanıyoruz. ,13,14,15,16.
Bu yazıda, R. parkeri suşu Tate’s Hell’in (katılım: GCA_000965145.1) mekik vektörü pRAM18dSFA ile elektroporasyonu için bir prosedür açıklanmaktadır Rickettsia amblyommatis suşu AaR/SC plazmid pRAM18’den türetilen mekik vektörü pRAM18dSFA ile spektinomisin ve streptomisin direnci13,15,20 sağlayan aadA, çok kırmızı bir floresan proteini olan mKATE’yi kodlamak üzere tasarlanmıştır. Transforme R. parkeri, kene hücre hatlarında antibiyotik seçimi altında uygulanabilir ve istikrarlı bir şekilde korunur. Ek olarak, konfokal mikroskopi yoluyla canlı kene hücrelerinde transforme R. parkeri’nin lokalizasyonunun, vektör hücre hatlarındaki dönüşüm oranlarının kalitesini değerlendirmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Burada, mekik plazmidi pRAM18dSFA üzerinde kodlanmış eksojen DNA’yı elektroporasyon kullanarak rickettsiiae’ye sokmak için bir yöntem gösteriyoruz. Bu prosedürde, hücresiz rickettsiae, konakçı hücrelerden arındırıldı, riketsiyal mekik vektörü ile dönüştürüldü ve enfeksiyon için kene hücrelerine salındı. Ayrıca kene hücrelerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden R. parkeri’yi tespit etmek için konfokal bir immünofloresan prosedürü de tanımlanmıştır. Benzer yöntemler…
The authors have nothing to disclose.
Timothy J. Kurtti ve Benjamin Cull’a anlayışlı tartışmaları ve önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH’den U.G.M.’ye (2R01AI049424) ve Minnesota Tarımsal Deney İstasyonu’ndan (MIN-17-078) U.G.M.’ye verilen bir hibe ile finansal olarak desteklenmiştir.
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |