Summary

Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile Rickettsia spp.'yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi

Published: October 11, 2022
doi:

Summary

Elektroporasyon, eksojen DNA’yı Rickettsia cinsine sokmak için hızlı, geniş çapta benimsenmiş bir yöntemdir. Bu protokol, Rickettsia cinsindeki zorunlu hücre içi bakterilerin dönüşümü için yararlı bir elektroporasyon yöntemi sağlar.

Abstract

Rickettsioses, enfekte eklembacaklı vektörlerin ısırığı yoluyla omurgalı konakçılara bulaşabilen Rickettsia cinsine ait çok çeşitli zorunlu hücre içi bakterilerden kaynaklanır. Bugüne kadar, ortaya çıkan veya yeniden ortaya çıkan epidemik riketsiozlar, tanı yöntemleri sınırlı olduğu ve standartlaştırılmadığı veya evrensel olarak erişilebilir olmadığı için tanıdaki zorluk nedeniyle halk sağlığı riski olmaya devam etmektedir. Belirti ve semptomların tanınmamasından kaynaklanan yanlış tanı, gecikmiş antibiyotik tedavisine ve kötü sağlık sonuçlarına neden olabilir. Rickettsia özelliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sonuçta hastalığın daha iyi kontrol ve önlenmesi ile klinik tanı, değerlendirme ve tedaviyi geliştirecektir.

Riketsiyal genlerin fonksiyonel çalışmaları, patogenezdeki rollerini anlamak için çok önemlidir. Bu yazıda, Rickettsia parkeri suşu Tate’s Hell’in mekik vektörü pRAM18dSFA ile elektroporasyonu ve kene hücre kültüründe dönüştürülmüş R. parkeri’nin antibiyotiklerle (spektinomisin ve streptomisin) seçimi için bir prosedür açıklanmaktadır. Vektör hücre hatlarındaki transformasyonu kontrol etmek için yararlı bir teknik olan konfokal immünofloresan mikroskopi kullanılarak kene hücrelerinde transforme R. parkeri’nin lokalizasyonu için bir yöntem de tanımlanmıştır. Benzer yaklaşımlar diğer rickettsiae’lerin dönüşümü için de uygundur.

Introduction

Rickettsiozlar, Rickettsia cinsine (Rickettsiaceae familyası, Rickettsiales sırası) ait çok çeşitli zorunlu hücre içi bakterilerden kaynaklanır. Rickettsia cinsi, filogenetik özelliklere göre dört ana gruba ayrılır1,2: en şiddetli ve ölümcül kene kaynaklı rickettsiozlara neden olan rickettsiiae’leri içeren benekli ateş grubu (SFG) (örneğin, Rocky Mountain Benekli Ateşinin etken maddesi olan Rickettsia rickettsii), tifüs grubu (TG, örneğin, Rickettsia prowazekii, epidemik tifüsün ajanı), geçiş grubu (TRG, örneğin, pire kaynaklı benekli ateşin etken maddesi olan Rickettsia felis) ve atasal grup (AG, örneğin, Rickettsia bellii).

Bilinen en eski vektör kaynaklı hastalıklar arasında, riketsiyozlar esas olarak patojenlerin keneler, pireler, bitler ve akarlar dahil olmak üzere enfekte eklembacaklı vektörlerinin ısırıkları yoluyla bulaşmasını takiben edinilir 3,4. Etkili antibiyotiklerin keşfi tedavi sonuçlarını iyileştirse de, ortaya çıkan ve yeniden ortaya çıkan epidemik riketsiyozlar geleneksel önleme ve kontrol stratejilerine meydan okumaya devam etmektedir. Bu nedenle, riketsia / konakçı / vektör etkileşimlerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sonuçta bu eski hastalıkları önlemek ve iyileştirmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek için güçlü bir temel oluşturacaktır.

Doğada, bakterilerde yatay gen transferi (HGT) konjugasyon, transdüksiyon ve transformasyon yoluyla gerçekleşir5. İn vitro bakteriyel transformasyon bu HGT kavramlarını kullanır, ancak rickettsiiae’nin hücre içi doğası bazı zorluklar sunar. Rickettsiae’nin farklı türlerinde kısıtlı büyüme koşulları ve iyi anlaşılmamış konjugasyon ve transdüksiyon sistemleri, rickettsiae 6,7,8’de konjugasyon ve transdüksiyon yöntemlerinin uygulanmasını engellemiştir. Diğer zorunlu hücre içi bakteri cinsleriyle (örneğin, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma ve Ehrlichia) karşılaştırıldığında, Rickettsia cinsi, benzersiz yaşam tarzı özellikleri nedeniyle rickettsiiae’nin genetik modifikasyonuna özel zorluklar getiren hücre sitoplazmasındaki büyüme ve replikasyon stratejileri açısından farklılık gösterir9.

Rickettsiae’nin genetik modifikasyonunu denerken üstesinden gelinmesi gereken ilk engel, başarılı bir dönüşüm elde etmektir. Bu nedenle, yüksek dönüşüm verimliliğine sahip uygulanabilir bir yaklaşım tasarlamak, rickettsia için genetik araçlar geliştirmek için son derece değerli olacaktır. Burada, Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii ve Rickettsia buchneri10,11,12 dahil olmak üzere çeşitli rickettsia türlerine eksojen DNA’yı başarılı bir şekilde tanıtmak için kullanılan, yaygın olarak tanınan bir transformasyon yöntemi olan elektroporasyona odaklanıyoruz. ,13,14,15,16.

Bu yazıda, R. parkeri suşu Tate’s Hell’in (katılım: GCA_000965145.1) mekik vektörü pRAM18dSFA ile elektroporasyonu için bir prosedür açıklanmaktadır Rickettsia amblyommatis suşu AaR/SC plazmid pRAM18’den türetilen mekik vektörü pRAM18dSFA ile spektinomisin ve streptomisin direnci13,15,20 sağlayan aadA, çok kırmızı bir floresan proteini olan mKATE’yi kodlamak üzere tasarlanmıştır. Transforme R. parkeri, kene hücre hatlarında antibiyotik seçimi altında uygulanabilir ve istikrarlı bir şekilde korunur. Ek olarak, konfokal mikroskopi yoluyla canlı kene hücrelerinde transforme R. parkeri’nin lokalizasyonunun, vektör hücre hatlarındaki dönüşüm oranlarının kalitesini değerlendirmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Protocol

1. R. parkeri’nin kene hücre kültüründen yayılması ve saflaştırılması NOT: Tüm hücre kültürü prosedürleri sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Hazırlanıyor R. parkeri-enfekte kene hücreleri25cm2 hücre kültürü şişelerinde ISE6 hücrelerini, 5 mL’lik L15C300 orta17’de 34 ° C’de büyütün,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 5 triptoz fosfat suyu (TPB) ve% 0.1 lip…

Representative Results

Giemsa boyamasından sonra ışık mikroskobu altında ISE6 hücrelerinde R. parkeri’nin morfolojisi Şekil 1’de gösterilmiştir. Şekil 2’de, ISE6 hücrelerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden dönüştürülmüş R. parkeri , konfokal mikroskopi kullanılarak gösterilmiştir. ISE6 hücrelerinde (mavi, çekirdeğe karşılık gelir) transforme R. parkeri’nin (kırmızı) enfeksiyon oranında, inkübasyonun (A</str…

Discussion

Burada, mekik plazmidi pRAM18dSFA üzerinde kodlanmış eksojen DNA’yı elektroporasyon kullanarak rickettsiiae’ye sokmak için bir yöntem gösteriyoruz. Bu prosedürde, hücresiz rickettsiae, konakçı hücrelerden arındırıldı, riketsiyal mekik vektörü ile dönüştürüldü ve enfeksiyon için kene hücrelerine salındı. Ayrıca kene hücrelerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden R. parkeri’yi tespit etmek için konfokal bir immünofloresan prosedürü de tanımlanmıştır. Benzer yöntemler…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Timothy J. Kurtti ve Benjamin Cull’a anlayışlı tartışmaları ve önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH’den U.G.M.’ye (2R01AI049424) ve Minnesota Tarımsal Deney İstasyonu’ndan (MIN-17-078) U.G.M.’ye verilen bir hibe ile finansal olarak desteklenmiştir.

Materials

0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Play Video

Cite This Article
Wang, X., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

View Video