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Biology

Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

A eletroporação é um método rápido e amplamente adotado para a introdução de DNA exógeno no gênero Rickettsia. Este protocolo fornece um método de eletroporação útil para a transformação de bactérias intracelulares obrigatórias no gênero Rickettsia.

Abstract

As rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias pertencentes ao gênero Rickettsia que podem ser transmitidas aos hospedeiros vertebrados através da picada de vetores artrópodes infectados. Até o momento, as rickettsioses epidêmicas emergentes ou reemergentes continuam sendo um risco para a saúde pública devido à dificuldade no diagnóstico, pois os métodos diagnósticos são limitados e não padronizados ou universalmente acessíveis. O diagnóstico errôneo resultante da falta de reconhecimento dos sinais e sintomas pode resultar em atraso no tratamento com antibióticos e maus resultados de saúde. Uma compreensão abrangente das características da Rickettsia acabaria por melhorar o diagnóstico clínico, a avaliação e o tratamento com melhor controle e prevenção da doença.

Estudos funcionais de genes rickettsianos são cruciais para a compreensão de seu papel na patogênese. Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa Tate's Hell de Rickettsia parkeri com o vetor shuttle pRAM18dSFA e a seleção de R. parkeri transformado em cultura de células de carrapatos com antibióticos (espectromicina e estreptomicina). Um método também é descrito para a localização de R. parkeri transformado em células de carrapatos usando microscopia de imunofluorescência confocal, uma técnica útil para verificar a transformação em linhagens celulares vetoriais. Abordagens semelhantes também são adequadas para a transformação de outras rickettsiae.

Introduction

Rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias que pertencem ao gênero Rickettsia (família Rickettsiaceae, ordem Rickettsiales). O gênero Rickettsia é classificado em quatro grupos principais com base em características filogenéticas1,2: o grupo da febre maculosa (SFG), que contém as rickettsias que causam as rickettsioses transmitidas por carrapatos mais graves e fatais (por exemplo, Rickettsia rickettsii, o agente causador da febre maculosa das Montanhas Rochosas), o grupo do tifo (TG, por exemplo, Rickettsia prowazekii, o agente do tifo epidêmico), o grupo de transição (TRG, por exemplo, Rickettsia felis, o agente causador da febre maculosa transmitida por pulgas) e o grupo ancestral (AG, por exemplo, Rickettsia bellii).

Entre as mais antigas doenças transmitidas por vetores conhecidas, as rickettsioses são adquiridas principalmente após a transmissão dos patógenos através das picadas de vetores artrópodes infectados, incluindo carrapatos, pulgas, piolhos e ácaros 3,4. Embora a descoberta de antibióticos eficazes tenha melhorado os resultados do tratamento, as rickettsioses epidêmicas emergentes e reemergentes continuam a desafiar as estratégias tradicionais de prevenção e controle. Assim, uma compreensão abrangente das interações rickettsia / hospedeiro / vetor acabaria por estabelecer uma base sólida para o desenvolvimento de novas abordagens para prevenir e curar essas doenças antigas.

Na natureza, a transferência horizontal de genes (HGT) em bactérias ocorre por meio de conjugação, transdução e transformação5. A transformação bacteriana in vitro utiliza esses conceitos de HGT, embora a natureza intracelular das rickettsias apresente alguns desafios. As condições restritas de crescimento e os sistemas de conjugação e transdução pouco compreendidos em diferentes espécies de rickettsiae têm impedido a aplicação de métodos de conjugação e transdução em rickettsiae 6,7,8. Comparado com outros gêneros bacterianos intracelulares obrigatórios (por exemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma e Ehrlichia), o gênero Rickettsia difere no que diz respeito às estratégias de crescimento e replicação dentro do citoplasma celular, o que impõe desafios específicos à modificação genética das rickettsias devido às suas características únicas de estilo de vida9.

O obstáculo inicial a ser superado ao tentar a modificação genética das rickettsias é alcançar uma transformação bem-sucedida. Assim, projetar uma abordagem viável com alta eficiência de transformação seria extremamente valioso para o desenvolvimento de ferramentas genéticas para rickettsias. Aqui, nos concentramos na eletroporação, um método de transformação amplamente reconhecido que tem sido usado para introduzir DNA exógeno com sucesso em várias espécies de rickettsiae, incluindo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.

Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa de R. parkeri Tate's Hell (acesso: GCA_000965145.1) com o vetor shuttle pRAM18dSFA derivado do plasmídeo AaR/SC pRAM18 da cepa Rickettsia amblyommatis projetado para codificar mKATE, uma proteína fluorescente de vermelho distante, e aadA, conferindo resistência à espectromicina e estreptomicina13,15,20. R. parkeri transformados são viáveis e mantidos de forma estável sob seleção de antibióticos em linhagens celulares de carrapatos. Além disso, mostramos que a localização de R. parkeri transformado em células vivas de carrapatos via microscopia confocal pode ser usada para avaliar a qualidade das taxas de transformação em linhagens celulares vetoriais.

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Protocol

1. Propagação e purificação de R. parkeri a partir de cultura de células de carrapatos

NOTA: Todos os procedimentos de cultura de células devem ser realizados em um gabinete de biossegurança de classe II.

  1. Preparando R. parkeri-células de carrapatos infectadas
    1. Cultivar células ISE6 em frascos de cultura celular de25 cm 2 a 34 °C em 5 mL de L15C300 em meio17, suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS), caldo de fosfato de triptose a 5% (TPB) e concentrado de lipoproteína a 0,1% (LPC).
      NOTA: O ISE6 (linhagem celular derivada de embriões de Ixodes scapularis) é uma linhagem celular de carrapatos amplamente utilizada em muitos laboratórios e é, portanto, um modelo essencial para estudar as interações carrapato-patógeno17,18,19. A taxa de crescimento das células ISE6 é mais lenta do que a das células de mamíferos, com um tempo de duplicação populacional de ≥72 h. Por exemplo, as células ISE6 subcultivadas a partir de uma cultura 100% confluente a uma proporção de 1:5 levarão 3-4 semanas para recuperar 100% de confluência. As células ISE6 saudáveis serão geralmente arredondadas com numerosos filamentos aderentes17.
    2. Conte as células ISE6 com um hemocitômetro sob um microscópio de luz. Use em uma concentração de ~106 células/mL (100% confluente).
      1. Enxaguar suavemente as células do balão com meio e dispersar as células por pipetagem para gerar uma suspensão celular homogénea. Adicione 20 μL de suspensão celular entre o hemocitômetro e cubra o vidro para contar as células usando um hemocitômetro.
    3. Adicionar R. parkeri 20 do tipo selvagem livre de células hospedeiras (número médio: 5 × 10 7-10 × 107) às culturas de células ISE6 em frascos de cultura celular de 25 cm 2. Incubar culturas de células de R. parkeri infectadas a 34 °C em 5 mL de meio completo consistindo de meio L15C300, FBS a 10%, TPB a 5%, LPC a 0,1%, bicarbonato de sódio a 0,25% (NaHCO3) e HEPES a 25 mM até que 90%-100% das células estejam infectadas.
      NOTA: A taxa de infecção de R. parkeri em células ISE6 é determinada pela coloração de Giemsa, e o tempo de incubação para atingir 90%-100% de infecção varia de 5 dias a 7 dias em média.
    4. Determine a taxa de infecção através da coloração de Giemsa.
      1. No gabinete de biossegurança, ressuspeite as culturas de células infectadas e transfira 50 μL da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      2. Diluir a suspensão com meio completo (diluição 1:5) e centrifugar 100 μL em lâminas de microscópio de vidro utilizando uma centrífuga a 113 × g durante 5 min. Para manter o R. parkeri vivo contido, use uma centrífuga com um rotor selado projetado para ser removido da centrífuga. Isso permite o transporte do rotor selado para dentro e para fora do capô.
        NOTA: Como os R. parkeri ainda estão vivos antes da centrifugação, a amostra precisa ser contida até que a rickettsia seja morta. Assim, a centrífuga usada para girar a cultura de R. parkeri na lâmina deve ter um rotor selado que é projetado para ser levantado da centrífuga. Com o rotor no exaustor de fluxo laminar, carregue as amostras no conjunto de corrediças do funil-microscópio, sele novamente o rotor e coloque o rotor selado de volta na centrífuga. Em seguida, ligue a centrífuga e as amostras serão depositadas nas lâminas do microscópio. Após o término da corrida, remova o rotor selado da centrífuga e coloque-o no exaustor de fluxo laminar. Lá, abra a tampa do rotor e descarregue o conjunto de lâminas funil-microscópio dentro do capô. Uma vez seco, mergulhe as lâminas do microscópio de vidro em metanol absoluto, que mata todos os patógenos. Os funis e os portadores de metal são submersos em DMQ diluído, o que mata R. parkeri.
      3. Seque as lâminas ao ar livre e fixe em metanol absoluto por 5 min à temperatura ambiente (RT).
      4. Manchar as lâminas com a coloração de Giemsa (4% em tampão de Sørenson, pH 6,6) durante 30 min a 37 °C e enxaguar com água durante 5 s.
      5. Determinar a percentagem de infeção (número de células infetadas com rickettsiae/100 células) por microscopia de luz.
        NOTA: A Figura 1 mostra os resultados típicos da coloração de Giemsa.
  2. Preparação de R. parkeri sem células
    NOTA: Quando 90%-100% das células da cultura estão infectadas, as rickettsias devem ser isoladas das células ISE6 e a eletroporação deve ser realizada.
    1. Adicione grão de carboneto de silício estéril 60-90 a tubos de microcentrífuga estéreis de 2 mL a um volume de aproximadamente 0,2 mL.
    2. Remover 2 mL de meio de culturas 100% infectadas por R. parkeri (etapa 1.1.3) e ressuspender as células nos 3 mL restantes de meio.
    3. Transferir porções iguais desta suspensão para tubos preparados na fase 1.2.1.
    4. Vórtice cada tubo em alta velocidade por 30 s e, em seguida, coloque os tubos no gelo. Deixe a areia assentar em segundos pela gravidade.
    5. Em um armário de biossegurança de classe II, tenha uma seringa estéril de 5 mL Luer-lock pronta com o êmbolo estendido e a extremidade do êmbolo presa em uma base de poliestireno para tubos cônicos de 15 mL.
    6. Usando uma ponta de pipeta de barreira estéril de 1 mL montada em um pipetador adequado, remova o sobrenadante do lisado de células vórtices do tubo, tomando cuidado para não aspirar nenhum grão. Insira a ponta do pipeta na abertura do cubo da seringa e ejete o conteúdo na seringa com uma pressão suave. Alternativamente, use uma pipeta Pasteur estéril de barreira de 2 mL operada com um bulbo de borracha.
    7. Fixar um filtro esterilizado de 2 μm de tamanho de poro no cubo da seringa e filtrar a cultura de R. parkeri da etapa 1.2.6 em tubos estéreis de 1,5 ml.
    8. Recolher o R. parkeri por centrifugação a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
    9. Ressuscite o pellet em 1,2 mL de sacarose gelada de 300 mM e centrifugar novamente a 13.600 × g a 4 °C por 5 min. Repetir a ressuspensão e a centrifugação para um total de duas lavagens com sacarose.
    10. Combinar os pellets de R. parkeri em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril, refrigerado, em 50 μL de sacarose gelada de 300 mM por transformação. Como um frasco de 25 cm2 de R. parkeri fornece rickettsias suficientes para duas a três transformações, adicione 100-150 μL de sacarose fria de 300 mM.
      NOTA: Se desejado, o número de rickettsiae pode ser calculado usando uma câmara de contagem de Petroff-Hausser. Ao usar uma inoculação inicial de 5 × 10 7 -10 × 10 7 R. parkeri livre de células, levará em média 5-7 dias para atingir 90%-100% de infecção, produzindo aproximadamente 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri livre de células.
    11. Ressuspeite suavemente o pellet por pipetagem até que esteja completamente disperso. Divida a amostra em porções de 50 μL em tubos microcentrífugos estéreis e estéreis e refrigerados.
      NOTA: Se desejado, a viabilidade da rickettsia pode ser avaliada por citometria de fluxo após coloração com corante fluorescente 21.

2. Transformação de R. parkeri com o plasmídeo pRAM18dSFA

  1. No gelo, adicionar 3 μg de DNA plasmídico pRAM18dSFA 13,15,20 livre de endotoxinas a cada tubo contendo 50 μL de suspensão de R. parkeri e agitar a mistura com a ponta do pipeta suave mas completamente.
    NOTA: Ao preparar o DNA plasmídico, use um kit de purificação que inclua uma etapa de remoção de endotoxinas para produzir DNA plasmidial livre de endotoxinas23. Descobrimos que uma gama de concentrações de plasmídeos entre 1 μg e 3 μg por 50 μL de suspensão de R. parkeri resultou em transformações bem-sucedidas, enquanto o aumento da quantidade de plasmídeo para 10 μg inibiu a transformação.
  2. Transfira a mistura acima de DNA e R. parkeri para uma cubeta de eletroporação de 0,1 cm refrigerada e estéril (bata suavemente na cubeta até que a mistura seja distribuída uniformemente) e deixe-a descansar no gelo por 10-30 min.
  3. Remover o meio de uma cultura 100% confluente de células ISE6 e ressuspender as camadas celulares em 1,5 mL de meio fresco com NaHCO 3 e tampão HEPES (descrito acima na etapa 1.1.3). Utilizar um balão de células confluentes por transformação.
  4. Transferir as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml (um tubo por balão de25 cm 2 de células ISE6).
  5. Eletroporate a mistura de R. parkeri/pRAM18dSFA a 1,8 KV, 200 ohms, 25 μF usando um eletroporador.
  6. Usando um pipeto de transferência de ponta fina estéril e estendido, transfira uma pequena quantidade da suspensão de células ISE6 (etapa 2.4) para a cubeta e puxe suavemente o líquido para cima e para baixo para lavar a cubeta. Transfira a mistura para o tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo o restante da suspensão de células ISE6 e misture suavemente a mistura de transformação com as células.
  7. Centrifugar as amostras transformadas a 700 × g por 2 min no RT e, em seguida, aumentar a velocidade de centrifugação para 13.600 × g por mais 1 min no RT.
    NOTA: As duas velocidades de centrifugação promovem a ligação rickettsial e a entrada nas células: 700 × g são usados para puxar as células ISE6, enquanto 13.600 × g são usados para puxar as rickettsias para baixo.
  8. Deixar as amostras a RT ou a 34 °C durante 15 min a 1 h.
  9. Ressuspender os transformadores (dois ou três) em células ISE6 com uma ponta de pipeta de barreira estéril de 2 mL ajustada a um pipetador e transferir para dois ou três frascos de cultura celular de25 cm 2 contendo 3,5 mL de meio fresco com NaHCO3 e tampão HEPES. Alternativamente, use uma pipeta Pasteur estéril de barreira de 2 mL operada com um bulbo de borracha.
  10. Agitar os balões para espalhar uniformemente a mistura e, em seguida, incubar a 34 °C.
  11. Após 16-24 h, adicionar 10 μL de espectinomicina (50 mg/mL) e 10 μL de estreptomicina (50 mg/mL) a cada balão na etapa 2.10.

3. Observação do R. parkeri transformado

NOTA: Utilizar um microscópio de epifluorescência com filtros de rodamina/TRITC para observar os frascos preparados no passo 2.11 após 3-7 dias. Uma vez que as placas são evidentes nas culturas (5-14 dias), pode-se observar R. parkeri transformado que expressa a proteína fluorescente vermelha mKATE, codificada no plasmídeo pRAM18dSFA.

  1. Microscopia confocal
    1. Ressuspender as culturas celulares a partir dos frascos de passo 2.11 e misturar 100 μL destas culturas celulares com 5 μL de solução Hoechst 33342 durante 10-30 min a RT no escuro.
      NOTA: A Hoechst 33342 é uma contramancha nuclear permeável a células que se liga ao ADN celular vivo e emite fluorescência azul.
    2. Centrifugar 50 μL da mistura em lâminas de microscópio de vidro utilizando uma centrífuga a 5 × g durante 3 min.
    3. Adicione 3 μL de PBS 1x ao ponto de células depositadas na lâmina, sobreponha com uma folha de cobertura e veja com um microscópio confocal (objetiva de 60x). Utilizar os seguintes parâmetros de excitação e emissão para imagens fluorescentes: para 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), excitação a 350 nm, emissão a 470 nm; para a tetrametilrodamina (TRITC), excitação a 557 nm, emissão a 576 nm.

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Representative Results

A morfologia de R. parkeri em células ISE6 sob microscópio de luz após coloração de Giemsa é mostrada na Figura 1. Na Figura 2, R. parkeri transformada expressando proteína de fluorescência vermelha em células ISE6 é mostrada usando microscopia confocal. Há um aumento substancial na taxa de infecção de R. parkeri transformado (vermelho) em células ISE6 (azul, corresponde aos núcleos) do (A) dia 7 para (B) dia 10 de incubação.

Figure 1
Figura 1: Slides mostrando Rickettsia parkeri corada por Giemsa em células ISE6. Células ISE6 infectadas com R. parkeri do tipo selvagem em (A) baixa infecção e (B) 90%-100% de taxas de infecção. Os núcleos das células ISE6 mancham de roxo escuro com Giemsa; os R. parkeri aparecem como hastes roxas escuras. As caixas vermelhas mostram rickettsias intracelulares e os asteriscos vermelhos indicam rickettsias extracelulares. Todas as imagens foram obtidas em microscópio de luz com objetiva de 100x. Barras de escala = 50 μm. Abreviação: N = núcleos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Rickettsia parkeri transformada expressando proteína de fluorescência vermelha em células ISE6. R. parkeri (vermelho) transformado em pRAM18dSFA em células ISE6 (azul), corado com Hoechst 33342 e detectado por microscopia confocal (A) 7 dias e (B) 10 dias após a transformação. Hoechst 33342 cora os núcleos, e seus comprimentos de onda de excitação e emissão são semelhantes aos DAPI. Os sinais mesclados são uma combinação de imagens de filtro DAPI e TRITC. Todas as imagens foram obtidas em microscópio confocal com objetiva 60x. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TRITC = tetrametilrodamina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, demonstramos um método para introduzir DNA exógeno codificado no plasmídeo pRAM18dSFA em rickettsias usando eletroporação. Neste procedimento, as rickettsias livres de células foram purificadas a partir de células hospedeiras, transformadas com um vetor de transporte de rickettsias e liberadas em células de carrapatos para infecção. Também é descrito um procedimento de imunofluorescência confocal para detectar R. parkeri que expressa proteína de fluorescência vermelha em células de carrapatos. Métodos semelhantes são aplicáveis a outras espécies de Rickettsia e, com modificações adicionais, podem ser adaptáveis a outras bactérias intracelulares obrigatórias que são capazes de manter um plasmídeo.

Uma transformação bem-sucedida neste protocolo requer três componentes: DNA exógeno, bactérias Rickettsia spp. e um tipo adequado de célula hospedeira22. Dependendo do objetivo específico da pesquisa, esses componentes podem ser alterados. Primeiro, o DNA exógeno foi introduzido através do plasmídeo pRAM18dSFA, que contém marcadores selecionáveis por espectromicina e estreptomicina e expressa mKATE (uma proteína fluorescente de vermelho distante). Este plasmídeo também confere resistência à ampicilina para o crescimento em Escherichia coli. Como demonstrado em estudos anteriores, é possível substituir os marcadores de resistência a antibióticos e os genes para proteínas fluorescentes13. Em segundo lugar, as células ISE6 foram selecionadas para representar linhagens celulares transformadas, uma vez que essa linhagem celular é amplamente utilizada em muitos laboratórios e é um modelo essencial para o estudo das interações vetor-patógeno17,18,19. Outras espécies de carrapatos16 ou célulasde mamíferos 23,24 também podem ser usadas para cultivar rickettsias para transformação. Finalmente, neste protocolo, foi utilizado R. parkeri, que pode ser manipulado em um laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2) utilizando um gabinete de biossegurança classe II com as devidas precauções de segurança. Outros Rickettsia spp. mais patogênicos (por exemplo, R. rickettsii; R. prowazekii) exigir uma configuração BSL-3 para manipulação; portanto, um protocolo padrão de biossegurança mais rigoroso deve ser usado ao trabalhar com esses agentes.

Embora este protocolo possa ser usado como um procedimento padrão para a transformação de rickettsias, várias etapas técnicas importantes requerem atenção especial. Primeiro, uma etapa de purificação bem-sucedida deve garantir a sobrevivência e a infecciosidade das rickettsias livres de células9; portanto, o aspecto mais crítico do procedimento de transformação é isolar rickettsias infecciosas e livres de células. Qualquer sal residual nas rickettsias purificadas resultará em falha de arco e transformação. Portanto, lavar as rickettsias isoladas livres de células com sacarose é necessário para remover todos os sais. A solução de sacarose fria também protege a integridade da membrana rickettsial na condição extracelular.

Quando 90% a 100% das células de uma cultura estão infectadas, as rickettsias devem ser isoladas das células ISE6 e a eletroporação deve ser realizada sem demora e sem interrupções, pois as rickettsias são organismos intracelulares e não sobrevivem bem fora das células. Embora as culturas de rickettsia possam ser armazenadas a 4 °C, este tipo de material não deve ser utilizado para eletroporação. Uma cultura que tenha sido armazenada a 4 °C pode ser usada para inocular uma nova camada de células ISE6, que pode então ser usada para eletroporação uma vez que a infecção tenha atingido 90% a 100%.

Em segundo lugar, as configurações de eletroporação, incluindo tensão, resistência, capacitância e constante de tempo, são específicas para diferentes espécies de rickettsiais. Por exemplo, a intensidade de campo necessária durante a eletroporação depende do tamanho das rickettsias e do DNA exógeno7. Finalmente, é importante manter as rickettsias transformadas sob seleção antibiótica para evitar a perda de plasmídeos exógenos durante múltiplas passagens em células hospedeiras9. A concentração e o tipo de antibiótico empregado são dependentes da transformação da espécie de Rickettsia, conforme descrito anteriormente 13,15,16,23, sendo importante que o marcador antibiótico selecionado não seja aquele aplicado em tratamentos clínicos.

Para seguir este protocolo, tanto a espectinomicina quanto a estreptomicina devem ser usadas para seleção até que todas as rickettsias residuais não transformadas tenham sido eliminadas. Combinados, os dois antibióticos matam as rickettsias intracelulares e extracelulares e reduzem a probabilidade de surgimento de rickettsias resistentes do tipo selvagem. Além disso, o uso de ambos os antibióticos não afeta os experimentos a jusante, como a capacidade de usá-los separadamente para selecionar dois plasmídeos diferentes, uma vez que o gene aadA confere resistência à espectromicina e à estreptomicina. Os dois antibióticos utilizados neste protocolo não conferem resistência aos antibióticos utilizados no tratamento clínico da rickettsial.

A linhagem celular de carrapatos ISE6 utilizada neste estudo tem vantagens únicas. Primeiro, as células ISE6 foram isoladas do carrapato de patas pretas Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae), o principal vetor de sete patógenos humanos nos Estados Unidos. Em segundo lugar, o ISE6 é uma linhagem celular de carrapatos amplamente utilizada em muitos laboratórios e tem sido usada com sucesso para recuperar muitas bactérias associadas a carrapatos (Rickettsia, Anaplasma e Ehrlichia) após a eletroporação. Em terceiro lugar, algumas rickettsias patogênicas só podem ser propagadas em células de carrapatos, mas não em células de mamíferos17,18,19,24. No entanto, as linhagens celulares de carrapatos são relativamente frágeis em comparação com as células de mamíferos e têm necessidades de cultura mais intensivas 25,26,27,28. Além disso, a taxa de crescimento das células ISE6 é significativamente mais lenta do que a das linhagens celulares de mamíferos, mesmo que semeadas na mesma densidade inicial, embora a replicação lenta possa ser vantajosa quando os transformadores rickettsianos exibem crescimento reduzido.

Este protocolo também fornece um método para avaliar a eficiência de transformação de rickettsias em células vivas em etapas experimentais críticas, o que ajuda a otimizar as configurações de eletroporação ou no teste da eficiência de várias linhagens celulares para a recuperação de transformadores. No entanto, esse protocolo apresenta limitações, principalmente para a quantificação dos transformadores obtidos. A eficiência da transformação como um indicador de uma transformação bem-sucedida poderia ser demonstrada em um estudo futuro. A viabilidade do rickettsial pode ser avaliada por meio de um kit de coloração adequado e citometria de fluxo21 para quantificar os transformadores obtidos. Dois parâmetros seriam usados para determinar a eficiência da transformação - o número de rickettsias vivas usadas para transformação e o número de rickettsias transformadas que expressam mKATE.

Além disso, a análise de imagens com sinais de fluorescência poderia ser usada para comparar as taxas de transformação de diferentes plasmídeos. Como o mecanismo subjacente da manutenção do plasmídeo rickettsial é pouco compreendido, sistemas de transformação bem caracterizados para a introdução de plasmídeos exógenos podem ser ferramentas valiosas para uma investigação mais aprofundada. Além disso, a visualização direta de rickettsias fluorescentes que expressam proteínas em células ou tecidos melhorará nossa compreensão das interações rickettsia / hospedeiro / vetor. Isso fornecerá informações para a concepção de estratégias para controlar e prevenir rickettsioses.

Disponibilidade de dados:
Todos os dados subjacentes aos resultados deste estudo estão disponíveis ao público.

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Disclosures

Não são declarados conflitos de interesses.

Acknowledgments

Agradecemos a Timothy J. Kurtti e Benjamin Cull por suas discussões e sugestões perspicazes. Este estudo foi apoiado financeiramente por uma doação para a U.G.M. do NIH (2R01AI049424) e uma subvenção para a U.G.M. da Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

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Biologia Edição 188 Eletroporação Rickettsia imunofluorescência
Um método de eletroporação para transformar <em>Rickettsia</em> spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos
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Wang, X. R., Burkhardt, N. Y.,… More

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

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