La electroporación es un método rápido y ampliamente adoptado para introducir ADN exógeno en el género Rickettsia. Este protocolo proporciona un método de electroporación útil para la transformación de bacterias intracelulares obligadas en el género Rickettsia.
Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas pertenecientes al género Rickettsia que pueden transmitirse a huéspedes vertebrados a través de la picadura de artrópodos vectores infectados. Hasta la fecha, las rickettsiosis epidémicas emergentes o reemergentes siguen siendo un riesgo para la salud pública debido a la dificultad en el diagnóstico, ya que los métodos de diagnóstico son limitados y no están estandarizados o universalmente accesibles. El diagnóstico erróneo resultante de la falta de reconocimiento de los signos y síntomas puede dar lugar a un retraso en el tratamiento con antibióticos y a resultados de salud deficientes. Una comprensión integral de las características de la rickettsia mejoraría en última instancia el diagnóstico clínico, la evaluación y el tratamiento con un mejor control y prevención de la enfermedad.
Los estudios funcionales de los genes rickettsiales son cruciales para comprender su papel en la patogénesis. Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa de Rickettsia parkeri Tate’s Hell con el vector lanzadera pRAM18dSFA y la selección de R. parkeri transformado en cultivo de células de garrapatas con antibióticos (espectinomicina y estreptomicina). También se describe un método para la localización de R. parkeri transformado en células de garrapatas utilizando microscopía de inmunofluorescencia confocal, una técnica útil para verificar la transformación en líneas celulares vectoriales. Enfoques similares también son adecuados para la transformación de otras rickettsiae.
Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas que pertenecen al género Rickettsia (familia Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). El género Rickettsia se clasifica en cuatro grupos principales basados en características filogenéticas1,2: el grupo de fiebre manchada (SFG), que contiene aquellas rickettsias que causan las rickettsias transmitidas por garrapatas más graves y fatales (por ejemplo, Rickettsia rickettsii, el agente causante de la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas), el grupo del tifus (TG, por ejemplo, Rickettsia prowazekii, el agente del tifus epidémico), el grupo de transición (TRG, por ejemplo, Rickettsia felis, el agente causante de la fiebre maculosa transmitida por pulgas) y el grupo ancestral (AG, por ejemplo, Rickettsia bellii).
Entre las enfermedades transmitidas por vectores más antiguas conocidas, las rickettsiosis se adquieren principalmente después de la transmisión de los patógenos a través de las picaduras de artrópodos vectores infectados, incluyendo garrapatas, pulgas, piojos y ácaros 3,4. Aunque el descubrimiento de antibióticos efectivos mejoró los resultados del tratamiento, las rickettsiosis epidémicas emergentes y reemergentes continúan desafiando las estrategias tradicionales de prevención y control. Por lo tanto, una comprensión integral de las interacciones rickettsia / huésped / vector establecería en última instancia una base sólida para desarrollar nuevos enfoques para prevenir y curar estas enfermedades antiguas.
En la naturaleza, la transferencia horizontal de genes (HGT) en bacterias ocurre a través de la conjugación, transducción y transformación5. La transformación bacteriana in vitro utiliza estos conceptos de HGT, aunque la naturaleza intracelular de rickettsiae presenta algunos desafíos. Las condiciones de crecimiento restringidas y los sistemas de conjugación y transducción poco conocidos en diferentes especies de rickettsias han impedido la aplicación de métodos de conjugación y transducción en rickettsias 6,7,8. En comparación con otros géneros bacterianos intracelulares obligados (por ejemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma y Ehrlichia), el género Rickettsia difiere con respecto a las estrategias de crecimiento y replicación dentro del citoplasma celular, lo que impone desafíos específicos a la modificación genética de rickettsiae debido a sus características únicas de estilo de vida9.
El obstáculo inicial a superar al intentar la modificación genética de rickettsiae es lograr una transformación exitosa. Por lo tanto, diseñar un enfoque factible con alta eficiencia de transformación sería extremadamente valioso para desarrollar herramientas genéticas para rickettsiae. Aquí, nos centramos en la electroporación, un método de transformación ampliamente reconocido que se ha utilizado para introducir ADN exógeno con éxito en varias especies de rickettsiae, incluyendo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii y Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa Tate’s Hell de R. parkeri (accesición: GCA_000965145.1) con el vector lanzadera pRAM18dSFA derivado del plásmido pRAM18 de la cepa AaR/SC de Rickettsia amblyommatis diseñado para codificar mKATE, una proteína fluorescente de color rojo lejano, y aadA, que confiere resistencia a la espectinomicina y la estreptomicina13,15,20. Los R. parkeri transformados son viables y se mantienen establemente bajo selección de antibióticos en líneas celulares de garrapatas. Además, mostramos que la localización de R. parkeri transformado en células vivas de garrapatas mediante microscopía confocal se puede utilizar para evaluar la calidad de las tasas de transformación en líneas celulares vectoriales.
Aquí, demostramos un método para introducir ADN exógeno codificado en el plásmido lanzadera pRAM18dSFA en rickettsiae utilizando electroporación. En este procedimiento, las rickettsias libres de células se purificaron a partir de células huésped, se transformaron con un vector lanzadera rickettsial y se liberaron en las células de garrapatas para la infección. También se describe un procedimiento de inmunofluorescencia confocal para detectar R. parkeri que expresa la proteína de fluorescencia roja en…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Timothy J. Kurtti y Benjamin Cull por sus perspicaces discusiones y sugerencias. Este estudio fue apoyado financieramente por una subvención a U.G.M. del NIH (2R01AI049424) y una subvención a U.G.M. de la Estación Experimental Agrícola de Minnesota (MIN-17-078).
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |