Summary
La electroporación es un método rápido y ampliamente adoptado para introducir ADN exógeno en el género Rickettsia. Este protocolo proporciona un método de electroporación útil para la transformación de bacterias intracelulares obligadas en el género Rickettsia.
Abstract
Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas pertenecientes al género Rickettsia que pueden transmitirse a huéspedes vertebrados a través de la picadura de artrópodos vectores infectados. Hasta la fecha, las rickettsiosis epidémicas emergentes o reemergentes siguen siendo un riesgo para la salud pública debido a la dificultad en el diagnóstico, ya que los métodos de diagnóstico son limitados y no están estandarizados o universalmente accesibles. El diagnóstico erróneo resultante de la falta de reconocimiento de los signos y síntomas puede dar lugar a un retraso en el tratamiento con antibióticos y a resultados de salud deficientes. Una comprensión integral de las características de la rickettsia mejoraría en última instancia el diagnóstico clínico, la evaluación y el tratamiento con un mejor control y prevención de la enfermedad.
Los estudios funcionales de los genes rickettsiales son cruciales para comprender su papel en la patogénesis. Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa de Rickettsia parkeri Tate's Hell con el vector lanzadera pRAM18dSFA y la selección de R. parkeri transformado en cultivo de células de garrapatas con antibióticos (espectinomicina y estreptomicina). También se describe un método para la localización de R. parkeri transformado en células de garrapatas utilizando microscopía de inmunofluorescencia confocal, una técnica útil para verificar la transformación en líneas celulares vectoriales. Enfoques similares también son adecuados para la transformación de otras rickettsiae.
Introduction
Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas que pertenecen al género Rickettsia (familia Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). El género Rickettsia se clasifica en cuatro grupos principales basados en características filogenéticas1,2: el grupo de fiebre manchada (SFG), que contiene aquellas rickettsias que causan las rickettsias transmitidas por garrapatas más graves y fatales (por ejemplo, Rickettsia rickettsii, el agente causante de la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas), el grupo del tifus (TG, por ejemplo, Rickettsia prowazekii, el agente del tifus epidémico), el grupo de transición (TRG, por ejemplo, Rickettsia felis, el agente causante de la fiebre maculosa transmitida por pulgas) y el grupo ancestral (AG, por ejemplo, Rickettsia bellii).
Entre las enfermedades transmitidas por vectores más antiguas conocidas, las rickettsiosis se adquieren principalmente después de la transmisión de los patógenos a través de las picaduras de artrópodos vectores infectados, incluyendo garrapatas, pulgas, piojos y ácaros 3,4. Aunque el descubrimiento de antibióticos efectivos mejoró los resultados del tratamiento, las rickettsiosis epidémicas emergentes y reemergentes continúan desafiando las estrategias tradicionales de prevención y control. Por lo tanto, una comprensión integral de las interacciones rickettsia / huésped / vector establecería en última instancia una base sólida para desarrollar nuevos enfoques para prevenir y curar estas enfermedades antiguas.
En la naturaleza, la transferencia horizontal de genes (HGT) en bacterias ocurre a través de la conjugación, transducción y transformación5. La transformación bacteriana in vitro utiliza estos conceptos de HGT, aunque la naturaleza intracelular de rickettsiae presenta algunos desafíos. Las condiciones de crecimiento restringidas y los sistemas de conjugación y transducción poco conocidos en diferentes especies de rickettsias han impedido la aplicación de métodos de conjugación y transducción en rickettsias 6,7,8. En comparación con otros géneros bacterianos intracelulares obligados (por ejemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma y Ehrlichia), el género Rickettsia difiere con respecto a las estrategias de crecimiento y replicación dentro del citoplasma celular, lo que impone desafíos específicos a la modificación genética de rickettsiae debido a sus características únicas de estilo de vida9.
El obstáculo inicial a superar al intentar la modificación genética de rickettsiae es lograr una transformación exitosa. Por lo tanto, diseñar un enfoque factible con alta eficiencia de transformación sería extremadamente valioso para desarrollar herramientas genéticas para rickettsiae. Aquí, nos centramos en la electroporación, un método de transformación ampliamente reconocido que se ha utilizado para introducir ADN exógeno con éxito en varias especies de rickettsiae, incluyendo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii y Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa Tate's Hell de R. parkeri (accesición: GCA_000965145.1) con el vector lanzadera pRAM18dSFA derivado del plásmido pRAM18 de la cepa AaR/SC de Rickettsia amblyommatis diseñado para codificar mKATE, una proteína fluorescente de color rojo lejano, y aadA, que confiere resistencia a la espectinomicina y la estreptomicina13,15,20. Los R. parkeri transformados son viables y se mantienen establemente bajo selección de antibióticos en líneas celulares de garrapatas. Además, mostramos que la localización de R. parkeri transformado en células vivas de garrapatas mediante microscopía confocal se puede utilizar para evaluar la calidad de las tasas de transformación en líneas celulares vectoriales.
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Protocol
1. Propagación y purificación de R. parkeri a partir de cultivo de células de garrapatas
NOTA: Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase II.
- Preparando R. parkeri-células de garrapatas infectadas
- Cultivar células ISE6 en matraces de cultivo celular de 25 cm 2 a 34 °C en 5 ml de L15C300 medio17, suplementado con 5%de suero fetal bovino (FBS), 5% de caldo de fosfato de triptosa (TPB) y 0,1% de concentrado de lipoproteínas (LPC).
NOTA: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-derived cell line) es una línea celular de garrapata ampliamente utilizada en muchos laboratorios y, por lo tanto, es un modelo esencial para estudiar las interacciones garrapata-patógeno17,18,19. La tasa de crecimiento de las células ISE6 es más lenta que la de las células de mamíferos, con un tiempo de duplicación de la población de ≥72 h. Por ejemplo, las células ISE6 subcultivadas a partir de un cultivo 100% confluente en una proporción de 1:5 tardarán de 3 a 4 semanas en recuperar el 100% de confluencia. Las células ISE6 sanas generalmente se redondearán con numerosos filamentos adheridos17. - Cuente las células ISE6 con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico. Usar a una concentración de ~106 células/ml (100% confluente).
- Enjuagar suavemente las células del matraz con medio y dispersar las células pipeteando para generar una suspensión celular homogénea. Agregue 20 μL de suspensión celular entre el hemocitómetro y cubra el vidrio para contar las células con un hemocitómetro.
- Añadir R. parkeri 20 de tipo silvestre libre de células hospedadoras (número medio: 5 × 10 7-10 × 107) a los cultivos celulares ISE6 en matraces de cultivo celular de 25 cm2. Incubar cultivos celulares de R. parkeri infectados a 34 °C en 5 ml de medio completo compuesto por medio L15C300, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% bicarbonato de sodio (NaHCO3) y 25 mM HEPES hasta que el 90%-100% de las células estén infectadas.
NOTA: La tasa de infección de R. parkeri en las células ISE6 está determinada por la tinción de Giemsa, y el tiempo de incubación para alcanzar el 90% -100% de infección varía de 5 días a 7 días en promedio. - Determinar la tasa de infección a través de la tinción de Giemsa.
- En el gabinete de bioseguridad, resuspender los cultivos celulares infectados y transferir 50 μL de la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Diluir la suspensión con medio completo (dilución 1:5) y centrifugar 100 μL en portaobjetos de microscopio de vidrio utilizando una centrífuga a 113 × g durante 5 min. Para mantener vivo R. parkeri contenido, use una centrífuga con un rotor sellado que esté diseñado para ser retirado de la centrífuga. Esto permite el transporte del rotor sellado dentro y fuera del capó.
NOTA: Como los R. parkeri todavía están vivos antes de la centrifugación, la muestra debe contenerse hasta que se elimine la rickettsia. Por lo tanto, la centrífuga utilizada para hacer girar el cultivo de R. parkeri sobre la corredera debe tener un rotor sellado que esté diseñado para ser levantado fuera de la centrífuga. Con el rotor en la campana de flujo laminar, cargue las muestras en el conjunto de portaobjetos de embudo-microscopio, vuelva a sellar el rotor y vuelva a colocar el rotor sellado en la centrífuga. Luego, encienda la centrífuga y las muestras se depositan en los portaobjetos del microscopio. Una vez finalizada la carrera, retire el rotor sellado de la centrífuga y colóquelo en la campana de flujo laminar. Allí, abra la tapa del rotor y descargue el conjunto de portaobjetos de embudo-microscopio dentro del capó. Una vez seco, sumerja los portaobjetos del microscopio de vidrio en metanol absoluto, que mata a todos los patógenos. Los embudos y los portadores metálicos se sumergen en DMQ diluido, lo que mata a R. parkeri. - Seque al aire los portaobjetos y fíjelos en metanol absoluto durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Manchar los portaobjetos con tinción de Giemsa (4% en tampón de Sørenson, pH 6,6) durante 30 min a 37 °C y enjuagar con agua durante 5 s.
- Determinar el porcentaje de infección (número de células infectadas con rickettsiae/100 células) mediante microscopía óptica.
NOTA: La Figura 1 muestra los resultados típicos de la tinción de Giemsa.
- Cultivar células ISE6 en matraces de cultivo celular de 25 cm 2 a 34 °C en 5 ml de L15C300 medio17, suplementado con 5%de suero fetal bovino (FBS), 5% de caldo de fosfato de triptosa (TPB) y 0,1% de concentrado de lipoproteínas (LPC).
- Preparación de R. parkeri libre de células
NOTA: Cuando el 90%-100% de las células en el cultivo están infectadas, las rickettsias deben aislarse de las células ISE6 y se debe realizar la electroporación.- Agregue grano de carburo de silicio estéril 60-90 a tubos de microcentrífuga estériles de 2 ml a un volumen de aproximadamente 0,2 ml.
- Extraer 2 ml de medio de cultivos infectados con R. parkeri al 100% (paso 1.1.3) y resuspender las células en los 3 ml restantes de medio.
- Transfiera partes iguales de esta suspensión a los tubos preparados en el paso 1.2.1.
- Vórtice cada tubo a alta velocidad durante 30 s y luego coloque los tubos sobre hielo. Deje que la arena se asiente en segundos por gravedad.
- En un gabinete de bioseguridad de clase II, tenga lista una jeringa Luer-lock estéril de 5 ml con el émbolo extendido y el extremo del émbolo asegurado en una base de poliestireno para tubos cónicos de 15 ml.
- Utilizando una punta de pipeta de barrera estéril de 1 ml instalada en un pipete adecuado, retire el sobrenadante del lisado celular vórtice del tubo, teniendo cuidado de no aspirar ningún grano. Inserte la punta de la pipeta en la abertura del cubo de la jeringa y expulse el contenido en la jeringa con una presión suave. Alternativamente, utilice una pipeta estéril Pasteur de barrera de 2 ml operada con una bombilla de goma.
- Coloque un filtro esterilizado de tamaño de poro de 2 μm en el cubo de la jeringa y filtre el cultivo de R. parkeri del paso 1.2.6 en tubos estériles de 1,5 ml.
- Recoger el R. parkeri por centrifugación a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en 1,2 ml de sacarosa helada de 300 mM y centrifugar de nuevo a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min. Repita la resuspensión y centrifugación para un total de dos lavados de sacarosa.
- Combine los gránulos de R. parkeri en un tubo de microcentrífuga refrigerado y estéril de 1,5 ml en 50 μL de sacarosa helada de 300 mM por transformación. Como un matraz de 25 cm2 de R. parkeri proporciona suficientes rickettsias para dos o tres transformaciones, añadir 100-150 μL de sacarosa fría de 300 mM.
NOTA: Si se desea, el número de rickettsias se puede calcular utilizando una cámara de conteo de Petroff-Hausser. Cuando se utiliza una inoculación inicial de 5 × 107 -10 × 10 7 R. parkeri libre de células, tomará 5-7 días en promedio alcanzar el 90% -100% de infección, produciendo aproximadamente 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri libre de células. - Resuspenda suavemente el pellet pipeteando hasta que se disperse completamente. Dividir la muestra en porciones de 50 μL en tubos de microcentrífuga refrigerados y estériles de 1,5 ml.
NOTA: Si se desea, la viabilidad rickettsial puede evaluarse mediante citometría de flujo después de la tinción con un colorante fluorescente 21.
2. Transformación de R. parkeri con el plásmido pRAM18dSFA
- En hielo, añadir 3 μg de pRAM18dSFA ADN plásmido libre de endotoxinas13,15,20 a cada tubo que contenga 50 μL de suspensión de R. parkeri y agitar la mezcla con la punta de la pipeta suave pero completamente.
NOTA: Al preparar ADN plásmido, utilice un kit de purificación que incluya un paso de eliminación de endotoxinas para obtener ADN plásmido libre de endotoxinas23. Encontramos que un rango de concentraciones de plásmidos de entre 1 μg y 3 μg por 50 μL de suspensión de R. parkeri dio lugar a transformaciones exitosas, mientras que el aumento de la cantidad de plásmido a 10 μg inhibió la transformación. - Transfiera la mezcla anterior de ADN y R. parkeri a una cubeta de electroporación refrigerada y estéril de 0,1 cm (golpee suavemente la cubeta hasta que la mezcla se distribuya uniformemente) y déjela reposar en hielo durante 10-30 minutos.
- Retire el medio de un cultivo 100% confluente de células ISE6 y resuspenda las capas celulares en 1,5 ml de medio fresco con NaHCO 3 y tampón HEPES (descrito anteriormente en el paso 1.1.3). Utilice un matraz de células confluentes por transformación.
- Transfiera las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml (un tubo por cada matraz de 25 cm2 de células ISE6).
- Electroporar la mezcla de R. parkeri/pRAM18dSFA a 1,8 KV, 200 ohmios, 25 μF utilizando un electroporador.
- Con una pipeta de transferencia de punta fina estéril y extendida, transfiera una pequeña cantidad de la suspensión de células ISE6 (paso 2.4) a la cubeta y tire suavemente del líquido hacia arriba y hacia abajo para lavar la cubeta. Transfiera la mezcla al tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene el resto de la suspensión celular ISE6 y mezcle suavemente la mezcla de transformación con las células.
- Centrifugar las muestras transformadas a 700 × g durante 2 min a RT, y luego aumentar la velocidad de centrifugación a 13.600 × g durante 1 min más a RT.
NOTA: Las dos velocidades de centrifugación promueven la unión rickettsial y la entrada en las células: 700 × g se utilizan para tirar hacia abajo de las células ISE6, mientras que 13.600 × g se utilizan para tirar hacia abajo de las rickettsias. - Dejar reposar las muestras a RT o 34 °C durante 15 min a 1 h.
- Resuspender los transformadores (dos o tres) en células ISE6 con una punta de pipeta de barrera estéril de 2 ml instalada en una pipeta y transferir a dos o tres matraces de cultivo celular de 25cm2 que contengan 3,5 ml de medio fresco con tampón NaHCO3 y HEPES. Alternativamente, utilice una pipeta estéril Pasteur de barrera de 2 ml operada con una bombilla de goma.
- Mece los matraces para esparcir la mezcla uniformemente y luego incubar a 34 °C.
- Después de 16-24 h, añadir 10 μL de espectinomicina (50 mg/ml) y 10 μL de estreptomicina (50 mg/ml) a cada matraz en la etapa 2.10.
3. Observación del R. parkeri transformado
NOTA: Utilice un microscopio de epifluorescencia con filtros de rodamina/TRITC para observar los matraces preparados en el paso 2.11 después de 3-7 días. Una vez que las placas son evidentes en los cultivos (5-14 días), se puede ver R. parkeri transformado que expresa la proteína fluorescente roja mKATE, codificada en el plásmido pRAM18dSFA.
- Microscopía confocal
- Resuspender los cultivos celulares de los matraces del paso 2.11 y mezclar 100 μL de estos cultivos celulares con 5 μL de solución Hoechst 33342 durante 10-30 min a RT en la oscuridad.
NOTA: Hoechst 33342 es una contratinción nuclear permeable a las células que se une al ADN de las células vivas de garrapatas y emite fluorescencia azul. - Centrifugar 50 μL de la mezcla en portaobjetos de microscopio de vidrio utilizando una centrífuga a 5 × g durante 3 min.
- Agregue 3 μL de 1x PBS al punto de células depositadas en el portaobjetos, superponga con un cubreobjetos y vea con un microscopio confocal (objetivo 60x). Utilice los siguientes parámetros de excitación y emisión para imágenes fluorescentes: para 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), excitación a 350 nm, emisión a 470 nm; para tetrametilrodamina (TRITC), excitación a 557 nm, emisión a 576 nm.
- Resuspender los cultivos celulares de los matraces del paso 2.11 y mezclar 100 μL de estos cultivos celulares con 5 μL de solución Hoechst 33342 durante 10-30 min a RT en la oscuridad.
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Representative Results
La morfología de R. parkeri en células ISE6 bajo un microscopio óptico después de la tinción de Giemsa se muestra en la Figura 1. En la Figura 2, R. parkeri transformada que expresa proteína de fluorescencia roja en células ISE6 se muestra mediante microscopía confocal. Hay un aumento sustancial en la tasa de infección de R. parkeri transformado (rojo) en células ISE6 (azul, corresponde a los núcleos) desde (A) día 7 hasta (B) día 10 de incubación.
Figura 1: Diapositivas que muestran Rickettsia parkeri teñido con Giemsa en células ISE6. Células ISE6 infectadas con R. parkeri de tipo salvaje a (A) tasas de infección bajas y (B) 90% -100%. Los núcleos de las células ISE6 se tiñen a púrpura oscuro con Giemsa; los R. parkeri aparecen como varillas de color púrpura oscuro. Los cuadros rojos muestran rickettsias intracelulares, y los asteriscos rojos indican rickettsias extracelulares. Todas las imágenes fueron tomadas en un microscopio de luz con un objetivo de 100x. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: N = núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Rickettsia parkeri transformada expresando proteína de fluorescencia roja en células ISE6. pRAM18dSFA-transformado R. parkeri (rojo) en células ISE6 (azul), teñido con Hoechst 33342 y detectado por microscopía confocal (A) 7 días y (B) 10 días después de la transformación. Hoechst 33342 tiñe los núcleos, y sus longitudes de onda de excitación y emisión son similares a DAPI. Las señales combinadas son una combinación de imágenes de filtro DAPI y TRITC. Todas las imágenes fueron tomadas en un microscopio confocal con un objetivo de 60x. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TRITC = tetrametilrodamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, demostramos un método para introducir ADN exógeno codificado en el plásmido lanzadera pRAM18dSFA en rickettsiae utilizando electroporación. En este procedimiento, las rickettsias libres de células se purificaron a partir de células huésped, se transformaron con un vector lanzadera rickettsial y se liberaron en las células de garrapatas para la infección. También se describe un procedimiento de inmunofluorescencia confocal para detectar R. parkeri que expresa la proteína de fluorescencia roja en células de garrapatas. Métodos similares son aplicables a otras especies de Rickettsia y con modificaciones adicionales podrían ser adaptables a otras bacterias intracelulares obligadas que son capaces de mantener un plásmido.
Una transformación exitosa en este protocolo requiere tres componentes: ADN exógeno, bacterias Rickettsia spp. y un tipo adecuado de célula huésped22. Dependiendo del objetivo específico de la investigación, estos componentes se pueden cambiar. Primero, el ADN exógeno se introdujo a través del plásmido pRAM18dSFA, que contiene marcadores seleccionables por espectinomicina y estreptomicina y expresa mKATE (una proteína fluorescente de color rojo lejano). Este plásmido también confiere resistencia a la ampicilina para el crecimiento en Escherichia coli. Como se demostró en estudios previos, es posible reemplazar los marcadores de resistencia a los antibióticos y los genes por proteínas fluorescentes13. En segundo lugar, las células ISE6 fueron seleccionadas para representar líneas celulares transformadas, ya que esta línea celular es ampliamente utilizada en muchos laboratorios y es un modelo esencial para el estudio de las interacciones vector-patógeno17,18,19. Otras especies de garrapata16 o células de mamíferos23,24 también se pueden utilizar para cultivar rickettsias para la transformación. Finalmente, en este protocolo, se utilizó R. parkeri, que puede ser manipulado en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) utilizando un gabinete de bioseguridad de clase II con las precauciones de seguridad adecuadas. Otras especies de Rickettsia más patógenas (p. ej., R. rickettsii; R. prowazekii) requieren una configuración BSL-3 para la manipulación; Por lo tanto, se debe utilizar un protocolo estándar de bioseguridad más estricto cuando se trabaja con dichos agentes.
Aunque este protocolo se puede utilizar como un procedimiento estándar para la transformación de rickettsias, varios pasos técnicos clave requieren especial atención. En primer lugar, un paso de purificación exitoso debe garantizar la supervivencia e infectividad de rickettsias libres de células9; Por lo tanto, el aspecto más crítico del procedimiento de transformación es aislar las rickettsias infecciosas y libres de células. Cualquier sal residual en las rickettsias purificadas resultará en una falla de arco y transformación. Por lo tanto, se requiere lavar las rickettsias aisladas libres de células con sacarosa para eliminar todas las sales. La solución de sacarosa fría también protege la integridad de la membrana rickettsial en la condición extracelular.
Cuando el 90%-100% de las células en un cultivo están infectadas, las rickettsias deben aislarse de las células ISE6, y la electroporación debe realizarse sin demora y sin interrupciones, ya que las rickettsias son organismos intracelulares y no sobreviven bien fuera de las células. Aunque los cultivos de rickettsia pueden almacenarse a 4 °C, este tipo de material no debe utilizarse para la electroporación. Un cultivo que se ha almacenado a 4 °C se puede utilizar para inocular una capa fresca de células ISE6, que luego se puede utilizar para la electroporación una vez que la infección ha alcanzado el 90% -100%.
En segundo lugar, los ajustes de electroporación, incluidos el voltaje, la resistencia, la capacitancia y la constante de tiempo, son específicos de diferentes especies de rickettsias. Por ejemplo, la intensidad de campo requerida durante la electroporación depende del tamaño de las rickettsias y del ADN exógeno7. Finalmente, es importante mantener las rickettsias transformadas bajo selección antibiótica para prevenir la pérdida de plásmidos exógenos durante múltiples pasajes en las células huésped9. La concentración y el tipo de antibiótico empleado dependen de la transformación de la especie de Rickettsia, como se describió anteriormente 13,15,16,23, y es importante que el marcador antibiótico seleccionado no sea uno que se aplique en tratamientos clínicos.
Para seguir este protocolo, tanto la espectinomicina como la estreptomicina deben usarse para la selección hasta que se hayan eliminado todas las rickettsias residuales no transformadas. Combinados, los dos antibióticos matan las rickettsias intracelulares y extracelulares y reducen la probabilidad de que surjan rickettsias resistentes de tipo salvaje. Además, el uso de ambos antibióticos no afecta a los experimentos posteriores, como la capacidad de usarlos por separado para seleccionar dos plásmidos diferentes, ya que el gen aadA confiere resistencia tanto a la espectinomicina como a la estreptomicina. Los dos antibióticos utilizados en este protocolo no confieren resistencia a los antibióticos utilizados en el tratamiento clínico de la enfermedad rickettsial.
La línea celular de garrapatas ISE6 utilizada en este estudio tiene ventajas únicas. Primero, se aislaron células ISE6 de la garrapata de patas negras Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae), el principal vector de siete patógenos humanos en los Estados Unidos. En segundo lugar, ISE6 es una línea celular de garrapatas ampliamente utilizada en muchos laboratorios y se ha utilizado con éxito para recuperar muchas bacterias asociadas a garrapatas (Rickettsia, Anaplasma y Ehrlichia) después de la electroporación. En tercer lugar, algunas rickettsias patógenas sólo pueden propagarse en células de garrapatas pero no en células de mamíferos17,18,19,24. Sin embargo, las líneas celulares de garrapatas son relativamente frágiles en comparación con las células de mamíferos y tienen requisitos de cultivo más intensivos25,26,27,28. Además, la tasa de crecimiento de las células ISE6 es significativamente más lenta que la de las líneas celulares de mamíferos, incluso si se siembran con la misma densidad inicial, aunque la replicación lenta puede ser ventajosa cuando los transformadores rickettsiales exhiben un crecimiento reducido.
Este protocolo también proporciona un método para evaluar la eficiencia de transformación de rickettsiae en células vivas en pasos experimentales críticos, lo que ayuda a optimizar la configuración de electroporación o en la prueba de la eficiencia de varias líneas celulares para recuperar transformadores. Sin embargo, este protocolo tiene limitaciones, especialmente para la cuantificación de los transformadores obtenidos. La eficiencia de la transformación como indicador de una transformación exitosa podría demostrarse en un estudio futuro. La viabilidad rickettsial podría evaluarse mediante un kit de tinción adecuado y citometría de flujo21 para cuantificar los transformadores obtenidos. Se utilizarían dos parámetros para determinar la eficiencia de la transformación: el número de rickettsiae vivas utilizadas para la transformación y el número de rickettsiae transformadas que expresan mKATE.
Además, el análisis de imágenes con señales de fluorescencia podría utilizarse para comparar las tasas de transformación de diferentes plásmidos. Como el mecanismo subyacente del mantenimiento del plásmido rickettsial es poco conocido, los sistemas de transformación bien caracterizados para introducir plásmidos exógenos pueden ser herramientas valiosas para una mayor investigación. Además, la visualización directa de rickettsias que expresan proteínas fluorescentes en células o tejidos mejorará nuestra comprensión de las interacciones rickettsia/huésped/vector. Esto proporcionará información para diseñar estrategias para controlar y prevenir la rickettsiosis.
Disponibilidad de datos:
Todos los datos subyacentes a los resultados de este estudio están disponibles públicamente.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Timothy J. Kurtti y Benjamin Cull por sus perspicaces discusiones y sugerencias. Este estudio fue apoyado financieramente por una subvención a U.G.M. del NIH (2R01AI049424) y una subvención a U.G.M. de la Estación Experimental Agrícola de Minnesota (MIN-17-078).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
References
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