Elektroporering er en rask, bredt vedtatt metode for å introdusere eksogent DNA i slekten Rickettsia. Denne protokollen gir en nyttig elektroporeringsmetode for transformasjon av obligatoriske intracellulære bakterier i slekten Rickettsia.
Rickettsioses er forårsaket av et bredt spekter av obligatoriske intracellulære bakterier som tilhører slekten Rickettsia som kan overføres til vertebrate verter gjennom bitt av infiserte leddyrvektorer. Til dags dato forblir nye eller gjenoppståtte epidemiske rickettsioser en folkehelserisiko på grunn av vanskeligheten med diagnosen, da diagnostiske metoder er begrensede og ikke standardiserte eller universelt tilgjengelige. Feildiagnostisering som følge av manglende gjenkjennelse av tegn og symptomer kan føre til forsinket antibiotikabehandling og dårlige helseutfall. En omfattende forståelse av Rickettsia-egenskaper vil til slutt forbedre klinisk diagnose, vurdering og behandling med forbedret kontroll og forebygging av sykdommen.
Funksjonelle studier av rickettsiale gener er avgjørende for å forstå deres rolle i patogenesen. Dette papiret beskriver en prosedyre for elektroporering av Rickettsia parkeri-stammen Tate’s Hell med skyttelvektoren pRAM18dSFA og valg av transformert R. parkeri i krysscellekultur med antibiotika (spektinomycin og streptomycin). En metode er også beskrevet for lokalisering av transformert R. parkeri i kryssceller ved bruk av konfokal immunfluorescensmikroskopi, en nyttig teknikk for å kontrollere transformasjon i vektorcellelinjer. Lignende tilnærminger er også egnet for transformasjon av andre rickettsiae.
Rickettsioses er forårsaket av et bredt spekter av obligatoriske intracellulære bakterier som tilhører slekten Rickettsia (familie Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). Slekten Rickettsia er klassifisert i fire hovedgrupper basert på fylogenetiske egenskaper1,2: flekkfebergruppen (SFG), som inneholder de rickettsiae som forårsaker de mest alvorlige og dødelige flåttbårne rickettsiosene (f.eks. Rickettsia rickettsii, årsaksmidlet til Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, f.eks. Rickettsia prowazekii, agenten for epidemisk tyfus), overgangsgruppen (TRG, f.eks. Rickettsia felis, det forårsakende middelet til loppebåren flekkfeber), og forfedregruppen (AG, f.eks. Rickettsia bellii).
Blant de eldste kjente vektorbårne sykdommene er rickettsioser hovedsakelig anskaffet etter overføring av patogenene gjennom biter av infiserte leddyrvektorer, inkludert flått, lopper, lus og midd 3,4. Selv om oppdagelsen av effektive antibiotika forbedret behandlingsresultatene, fortsetter nye og gjenoppståtte epidemiske rickettsioses å utfordre tradisjonelle forebyggings- og kontrollstrategier. Dermed vil en omfattende forståelse av rickettsia / vert / vektorinteraksjoner til slutt etablere et sterkt fundament for å utvikle nye tilnærminger for å forebygge og kurere disse gamle sykdommene.
I naturen skjer horisontal genoverføring (HGT) i bakterier gjennom konjugering, transduksjon og transformasjon5. In vitro bakteriell transformasjon benytter disse HGT-konseptene, selv om den intracellulære naturen til rickettsiae gir noen utfordringer. De begrensede vekstforholdene og dårlig forstått konjugerings- og transduksjonssystemer i forskjellige arter av rickettsiae har forhindret anvendelse av konjugerings- og transduksjonsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Sammenlignet med andre obligatoriske intracellulære bakterielle slekter (f.eks. Chlamydia, Coxiella, Anaplasma og Ehrlichia), er slekten Rickettsia forskjellig med hensyn til vekst- og replikasjonsstrategiene i cellecytoplasma, noe som pålegger spesifikke utfordringer for genetisk modifisering av rickettsiae på grunn av deres unike livsstilsegenskaper9.
Den første hindringen å overvinne når man forsøker genetisk modifisering av rickettsiae er å oppnå vellykket transformasjon. Dermed vil utforming av en gjennomførbar tilnærming med høy transformasjonseffektivitet være ekstremt verdifull for å utvikle genetiske verktøy for rickettsiae. Her fokuserer vi på elektroporering, en bredt anerkjent transformasjonsmetode som har blitt brukt til å introdusere eksogent DNA med suksess i flere arter av rickettsiae, inkludert Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii og Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Dette papiret beskriver en prosedyre for elektroporering av R. parkeri-stammen Tate’s Hell (tiltredelse: GCA_000965145.1) med skyttelvektoren pRAM18dSFA avledet fra Rickettsia amblyommatis-stammen AaR / SC plasmid pRAM18 konstruert for å kode mKATE, et langt rødt fluorescerende protein, og aadA, som gir spektinomycin og streptomycinresistens13,15,20. Transformert R. parkeri er levedyktig og stabilt opprettholdt under antibiotikavalg i krysscellelinjer. I tillegg viser vi at lokalisering av transformert R. parkeri i levende flåttceller via konfokalmikroskopi kan brukes til å vurdere kvaliteten på transformasjonshastigheter i vektorcellelinjer.
Her demonstrerer vi en metode for å introdusere eksogent DNA kodet på skyttelplasmidet pRAM18dSFA i rickettsiae ved hjelp av elektroporering. I denne prosedyren ble cellefri rickettsiae renset fra vertsceller, transformert med en rickettsial shuttle vektor, og frigjort på flåttceller for infeksjon. Også beskrevet er en konfokal immunfluorescensprosedyre for å oppdage rød fluorescensprotein-uttrykkende R. parkeri i kryssceller. Lignende metoder gjelder for andre Rickettsia-arter , og med ytterlige…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Timothy J. Kurtti og Benjamin Cull for deres innsiktsfulle diskusjoner og forslag. Denne studien ble økonomisk støttet av et tilskudd til U.G.M. fra NIH (2R01AI049424) og et tilskudd til U.G.M. fra Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |