Elektroporering är en snabb, allmänt antagen metod för att införa exogent DNA i släktet Rickettsia. Detta protokoll ger en användbar elektroporationsmetod för omvandling av obligatoriska intracellulära bakterier i släktet Rickettsia.
Rickettsioses orsakas av ett brett spektrum av obligatoriska intracellulära bakterier som tillhör släktet Rickettsia som kan överföras till ryggradsdjursvärdar genom bett av infekterade leddjursvektorer. Hittills är nya eller återuppkommande epidemiska rickettsioses fortfarande en folkhälsorisk på grund av svårigheten att diagnostisera, eftersom diagnostiska metoder är begränsade och inte standardiserade eller allmänt tillgängliga. Feldiagnos till följd av bristande erkännande av tecken och symtom kan leda till försenad antibiotikabehandling och dåliga hälsoutfall. En omfattande förståelse av Rickettsia-egenskaper skulle i slutändan förbättra klinisk diagnos, bedömning och behandling med förbättrad kontroll och förebyggande av sjukdomen.
Funktionella studier av rickettsialgener är avgörande för att förstå deras roll i patogenesen. Detta dokument beskriver ett förfarande för elektroporering av Rickettsia parkeri-stammen Tate’s Hell med skyttelvektorn pRAM18dSFA och valet av transformerad R. parkeri i fästcellsodling med antibiotika (spektinomycin och streptomycin). En metod beskrivs också för lokalisering av transformerad R. parkeri i fästingceller med hjälp av konfokal immunofluorescensmikroskopi, en användbar teknik för att kontrollera transformation i vektorcellinjer. Liknande tillvägagångssätt är också lämpliga för omvandling av andra rickettsiae.
Rickettsioses orsakas av ett brett spektrum av obligatoriska intracellulära bakterier som tillhör släktet Rickettsia (familj Rickettsiaceae, ordning Rickettsiales). Släktet Rickettsia klassificeras i fyra huvudgrupper baserat på fylogenetiska egenskaper1,2: den fläckiga febergruppen (SFG), som innehåller de rickettsiae som orsakar de allvarligaste och dödligaste fästingburna rickettsioserna (t.ex. Rickettsia rickettsii, orsaksmedlet för Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, t.ex. Rickettsia prowazekii, agenten för epidemisk tyfus), övergångsgruppen (TRG, t.ex. Rickettsia felis, orsaksmedlet för loppburen fläckig feber) och förfädersgruppen (AG, t.ex. Rickettsia bellii).
Bland de äldsta kända vektorburna sjukdomarna förvärvas rickettsioses huvudsakligen efter överföring av patogenerna genom bett av infekterade leddjursvektorer, inklusive fästingar, loppor, löss och kvalster 3,4. Även om upptäckten av effektiva antibiotika förbättrade behandlingsresultaten, fortsätter nya och återuppkommande epidemiska rickettsioses att utmana traditionella förebyggande och kontrollstrategier. Således skulle en omfattande förståelse av rickettsia / värd / vektorinteraktioner i slutändan skapa en stark grund för att utveckla nya metoder för att förebygga och bota dessa gamla sjukdomar.
I naturen sker horisontell genöverföring (HGT) i bakterier genom konjugering, transduktion och transformation5. In vitro bakteriell transformation använder dessa HGT-koncept, även om rickettsiaes intracellulära natur innebär vissa utmaningar. De begränsade tillväxtförhållandena och dåligt förstådda konjugerings- och transduktionssystemen hos olika arter av rickettsiae har förhindrat tillämpningen av konjugerings- och transduktionsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Jämfört med andra obligatoriska intracellulära bakteriesläkten (t.ex. klamydia, Coxiella, Anaplasma och Ehrlichia) skiljer sig släktet Rickettsia med avseende på tillväxt- och replikationsstrategierna inom cellcytoplasman, vilket innebär specifika utmaningar för den genetiska modifieringen av rickettsiae på grund av deras unika livsstilsegenskaper9.
Det första hindret att övervinna när man försöker genetisk modifiering av rickettsiae är att uppnå framgångsrik omvandling. Således skulle utformningen av ett genomförbart tillvägagångssätt med hög transformationseffektivitet vara extremt värdefullt för att utveckla genetiska verktyg för rickettsiae. Här fokuserar vi på elektroporation, en allmänt erkänd transformationsmetod som har använts för att framgångsrikt introducera exogent DNA i flera arter av rickettsiae, inklusive Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii och Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Detta dokument beskriver ett förfarande för elektroporering av R. parkeri-stammen Tate’s Hell (anslutning: GCA_000965145.1) med skyttelvektorn pRAM18dSFA härledd från Rickettsia amblyommatis-stammen AaR / SC-plasmid pRAM18 konstruerad för att koda mKATE, ett långt rött fluorescerande protein, och aadA, vilket ger spektinomycin och streptomycinresistens13,15,20. Transformerade R. parkeri är livskraftiga och stabilt underhållna under antibiotikaval i fästingcellinjer. Dessutom visar vi att lokaliseringen av transformerade R. parkeri i levande fästingceller via konfokalmikroskopi kan användas för att bedöma kvaliteten på transformationshastigheter i vektorcellinjer.
Här demonstrerar vi en metod för att införa exogent DNA kodat på skyttelplasmiden pRAM18dSFA i rickettsiae med hjälp av elektroporation. I denna procedur renades cellfri rickettsiae från värdceller, transformerades med en rickettsial shuttlevektor och släpptes ut på fästceller för infektion. Dessutom beskrivs ett konfokalt immunofluorescensförfarande för att detektera röd fluorescensproteinuttryckande R. parkeri i fästingceller. Liknande metoder är tillämpliga på andra Rickettsia-arter…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Timothy J. Kurtti och Benjamin Cull för deras insiktsfulla diskussioner och förslag. Denna studie stöddes ekonomiskt av ett bidrag till U.G.M. från NIH (2R01AI049424) och ett bidrag till U.G.M. från Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |