Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

زراعة وتجميد ومعالجة وتصوير عضويات وكرويات كاملة أثناء وجودها في هيدروجيل

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64563
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1, 3,5, 6, 2,3,4
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

Summary

تصف هذه الدراسة منهجيات زراعة وتجميد وإذابة ومعالجة وتلطيخ ووضع العلامات وفحص كرويات وعضويات كاملة تحت مجاهر مختلفة ، بينما تظل سليمة في هيدروجيل داخل جهاز متعدد الأغراض.

Abstract

أصبحت الكائنات العضوية والكروية ، وهي هياكل متنامية ثلاثية الأبعاد في مختبرات زراعة الخلايا ، معترف بها بشكل متزايد كنماذج متفوقة مقارنة بنماذج الثقافة ثنائية الأبعاد ، لأنها تحاكي جسم الإنسان بشكل أفضل ولها مزايا على الدراسات على الحيوانات. ومع ذلك ، تواجه هذه الدراسات عادة مشاكل في التكاثر والاتساق. خلال العمليات التجريبية الطويلة - مع نقل المواد العضوية والكروية بين أوعية زراعة الخلايا المختلفة ، والماصات ، وأجهزة الطرد المركزي - غالبا ما تتلف هذه الهياكل المتنامية 3D الحساسة والهشة أو تضيع. في النهاية ، تتأثر النتائج بشكل كبير ، لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. تقلل الطرق الموضحة هنا من هذه الخطوات المجهدة وتضمن بيئة آمنة ومتسقة للعضويات والكروية طوال تسلسل المعالجة بينما لا تزال في هيدروجيل في جهاز متعدد الأغراض. يمكن للباحثين أن ينمووا ، ويتجمدوا ، ويذوبوا ، ويعالجوا ، ويلطخوا ، ويلصقوا ، ثم يفحصون بنية الكائنات العضوية أو الكروية تحت أدوات مختلفة عالية التقنية ، من المجاهر البؤرية إلى المجاهر الإلكترونية ، باستخدام جهاز واحد متعدد الأغراض. تعمل هذه التقنية على تحسين قابلية استنساخ الدراسات وموثوقيتها وصلاحيتها ، مع الحفاظ على بيئة مستقرة ووقائية للهياكل المتنامية 3D أثناء المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التخلص من الخطوات المجهدة يقلل من أخطاء المعالجة ، ويقلل من الوقت المستغرق ، ويقلل من خطر التلوث.

Introduction

يكمن مستقبل أبحاث الخلايا والعلاج في مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد1،2،3. تعمل النماذج العضوية والكروية على سد الفجوة بين التجارب في المختبر والنماذج الحيوانية من خلال إنشاء نماذج أفضل تحاكي نمو جسم الإنسان وعلم وظائف الأعضاء والأمراض4،5،6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن قابلية استنساخ وتكرار هذه النماذج لا تزال صعبة. علاوة على ذلك ، فإن التعامل مع هذه الهياكل وحصادها ونقلها وطردها بالطرد المركزي باستخدام التقنيات الحالية يؤدي إلى فقدان أو تلف المواد العضوية والكروية في العديد من الظروف ، مما يؤثر بشكل كبير على النتائج.

على الرغم من العديد من البروتوكولات الخاصة بالتلوين النسيجي ، والتلوين الكيميائي المناعي ، ووضع العلامات المناعية ، والحفظ بالتبريد ، لا يوجد نهج عالمي يتعلق بتوحيد الظروف التجريبية ، والتعامل مع هذه الهياكل الحساسة ومعالجتها دون فقدانها أو إتلافها. البروتوكولات الحالية هي أيضا طويلة بشكل لا يصدق ، بالتناوب من بضعة أيام إلى عدة أسابيع ، وتشمل إجراءات معقدة مع الكواشف المختلفة10،11،12،13،14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحصاد ، والماصات ، والطرد المركزي ، ونقل الهياكل المتنامية 3D بين أوعية زراعة الخلايا و cryovials تسبب تغييرات في وضع الهياكل والقوى الميكانيكية ، وتؤثر في النهاية على تمايز ونضج المواد العضوية والكروية. تم الإبلاغ عن أن طوبولوجيا الأنسجة ، وتحديد مواقع الخلايا ، والقوى الميكانيكية تؤثر بشكل كبير على تمايز الخلايا ونضجها6،15،16،17.

لذلك ، من المستحسن تحسين التقنيات التقليدية الحالية لتوليد المواد العضوية والكروية بجودة مستقرة. إن الطريقة / الجهاز الذي سيتخطى الطرد المركزي والخطوات الأخرى الموضحة أعلاه ويوفر المواد في بيئة آمنة واحدة من بداية العمليات المتعددة إلى نهايتها سيكون مفيدا للوصول إلى البيانات الأكثر اتساقا وموثوقية. بالإضافة إلى ذلك ، سيؤدي ذلك إلى تقليل قيود الوقت والعمالة والتكلفة.

يوفر الجهاز متعدد الأغراض (MD) الموصوف هنا بيئة آمنة واحدة لعمليات متعددة من المواد العضوية والكروية (الشكل التكميلي 1). يلغي هذا الجهاز والبروتوكولات المكملة خطوات الحصاد والماصات والنقل والطرد المركزي. تبقى المواد العضوية والكروية في بيئتها المختبرية أثناء العمليات المتسلسلة. تتكون هذه البيئة بشكل أساسي من مكونات مصفوفة خارج الخلية طبيعية أو اصطناعية ، مثل الهلاميات المائية المتاحة تجاريا. بمعنى آخر ، تسمح الطرق الموضحة هنا بمعالجة عينة كاملة من المواد العضوية / الكروية وفحصها وتجميدها أثناء وجودها في قطرة هيدروجيل.

الجهاز المتوافق حيويا مقاوم لدرجات الحرارة بين 60 درجة مئوية و -160 درجة مئوية ، مما يجعل من الممكن استعادة المواد العضوية / المنشطات في خزان النيتروجين السائل عند -160 درجة مئوية أو تحضير كتل الراتنج للمجهر الإلكتروني عند 60 درجة مئوية. تم تصميم مكانة الجهاز لتحديد مساحة محدودة للهياكل المتنامية ثلاثية الأبعاد وتحفيز تكوين الأجسام الكروية أو العضوية بناء على الدراسات السابقة18،19،20،21،22،23. هذا الجزء من الجهاز شفاف ويحتوي على بلاستيك محدد يوفر جودة بصرية عالية (معامل الانكسار: 1.43 ؛ قيمة آبي: 58 ؛ السماكة: 7.8 مل [0.0078 بوصة أو 198 ميكرومتر]). يتسبب كل من الكوة والجزء "الجانبي" المحيط في التألق الذاتي. تبلغ مساحة الكوة الشفافة في الوسط 80 مم 2 ، بينما يبلغ الجزء الجانبي 600 مم2. عمق الحاوية 15 مم ، وسمكها 1.5 مم. هذه الميزات ، بالإضافة إلى حجم وتصميم الجهاز ، تجعل من الممكن إجراء ملاحظات تحت أنواع مختلفة من المجهر عالي التقنية وإعداد العينات للفحوصات المجهرية الإلكترونية (الشكل 2). يوفر نظام إغلاق الجهاز وضعين ، أحدهما مغلق في الثلاجة والآخر يسمح بتدفق الغاز في الحاضنة. تظهر فحوصات انتشار CCK8 والسمية الخلوية تأثيرات مماثلة على الخلايا مقارنة بأطباق زراعة الخلايا التقليدية (الشكل التكميلي 2). يوضح اختبار استبعاد التريبان الأزرق قابلية عالية للخلايا (94٪) أثناء زراعة الخلايا في MD (الشكل 3).

تشمل العمليات التي يمكن إجراؤها لعينة واحدة في الجهاز الواحد (1) الزراعة ، (2) التلوين النسيجي ، (3) التلطيخ المناعي ، بما في ذلك وضع العلامات المناعية الكيميائية والتألقية المناعية ، (4) التجميد ، (5) الذوبان ، (6) الفحص تحت المجاهر الضوئية ، مثل برايتفيلد ، داركفيلد ، مضان ، مجاهر ، بؤرية ، وفائقة الدقة ، (7) طلاء وفحص مباشرة تحت المجهر الإلكتروني الماسح ، أو (8) التحضير للمجهر الإلكتروني النافذ ( الشكل 2).

توجد منهجيات مختلفة للتلطيخ النسيجي ، أو وضع العلامات المناعية الكيميائية ، أو وضع العلامات الفلورية على المواد العضوية والكروية 10،11،12،13،14،24،25. حصادها من هيدروجيل هو الخطوة الأولى والرئيسية للتكنولوجيا الحالية. بعد هذه الخطوة ، تسمح بعض الطرق بوضع العلامات المناعية بالكامل. يتم تضمين المواد العضوية المحصودة في البارافين ، مجزأة ، وموسومة للتلطيخ والمناعة في الآخرين. ومع ذلك ، قد لا تقدم الأقسام العينة بأكملها وتوفر بيانات محدودة فقط تتعلق ببنية 3D للهيكل. علاوة على ذلك ، فإن الأضرار التي لحقت بهذه الهياكل 3D وفقدان المستضدات هي الآثار الجانبية المعروفة لهذه التقنيات.

تسمح البروتوكولات الجديدة التكميلية للفحوصات المجهرية في هذه المقالة بتحليل عينات كاملة لا تزال في هيدروجيل. تتضمن البروتوكولات الموصوفة هنا تركيبتين مطورتين حديثا: محلول للكيمياء الهيستولوجية المناعية (S-IHC) ومحلول لوضع العلامات المناعية (S-IF). تسمح طرق هذه الحلول للباحثين بالحصول على بيانات أكثر دقة ، حيث لا توجد آثار ضارة لسير العمل التقليدي ، مثل الطرد المركزي ، وسحب العينات ، ونقل الهياكل الحساسة. يلغي البروتوكول الموصوف هنا أيضا الحاجة إلى خطوات الحصاد والحجب والتطهير واسترجاع المستضد ، ويقصر الإجراء بأكمله إلى 6-8 ساعات. علاوة على ذلك ، تسمح المنهجية بإضافة واحد إلى ثلاثة أجسام مضادة في وقت واحد إلى نفس S-IF. لذلك ، من الممكن الحصول على النتائج في نفس اليوم حتى بعد تجارب وضع العلامات المتعددة ، وهي ميزة أخرى للبروتوكول الموصوف هنا ؛ عادة ما تستغرق بروتوكولات وضع العلامات المناعية التقليدية الكاملة ما بين 3 أيام وعدة أسابيع10،11،12،13،14.

كما تم حذف تضمين البارافين ، وهو خطوة ضارة أخرى تقلل من المستضد. يبقى هيكل 3D في بيئته في المختبر من بداية إلى نهاية الفحص المجهري. نظرا لأن بنية 3D لا تزال في ظروف نموها ، فإن تعبير البروتين وبيانات التوطين تحاكي ظروف الجسم الحي بشكل أفضل. من المتوقع الحصول على نتائج أكثر دقة ، لأن المنهجية تلغي الخطوات التي تؤثر على تعبير مستضد العينة. يوضح الجدول 1 والجدول 2 كيف أن هذه البروتوكولات الجديدة تلغي الخطوات ، وتوفر الوقت والعمل في المختبر ، وتقلل التكاليف ومنتجات النفايات مقارنة بسير العمل التقليدي.

بالإضافة إلى الخطوات الحاسمة الموضحة أعلاه ، هناك مشكلة أخرى تتمثل في توفير وسيط حفظ بالتبريد وطريقة للحفاظ على بنية 3D للعينة بمعدلات صلاحية خلية أعلى26،27،28،29،30،31. يعد الحفظ بالتبريد ضروريا لإنشاء نظام نموذجي مستقر وتمكين البنوك الحيوية للعضويات والكروية32,33. البنوك الحيوية سيسمح هيكل 3D الأصلي بأكمله بتلخيص أكثر إخلاصا للحالة الطبيعية للصحة أو المرض. الاعتبارات الرئيسية هي راحة وموثوقية الحفظ بالتبريد وذوبان المواد العضوية / الكروية. الانتعاش العضوي بعد الذوبان منخفض جدا في معظم التقنيات الحالية ، وغالبا ما يكون أقل من 50٪. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة نتائج واعدة مع تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة26،27،28،29. أظهر Lee et al. أن 78٪ من الخلايا الكروية نجت بعد الحفظ بالتبريد عندما استخدموا محلول جامعة ويسكونسن الذي يحتوي على 15٪ DMSO28. زادت نسبة بقاء الخلية إلى 83٪ في دراسة Arai et al.29. ومع ذلك ، تتأثر النتائج بعد الحفظ بالتبريد بشكل كبير لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكواشف الخالية من المصل مطلوبة لممارسة التصنيع الجيدة في الإعدادات الصيدلانية والتشخيصية. تستخدم تدفقات العمل التقليدية وسيطا يحتوي على مصل بقري جنيني (FBS) وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لطريقة التجميد البطيء ، وكلاهما مرتبط بالإعاقات. FBS هو منتج مشتق من الحيوانات ويمكن أن يكون له اختلافات في الدفعات. DMSO هو مادة واقية من التبريد ناجحة للغاية ، ولكن التعرض طويل الأمد ، خاصة أثناء الذوبان ، قد يسبب تأثيرات سامة للخلايا30,31.

توضح هذه المقالة أيضا منهجية التجميد / الذوبان للعضويات أو الكرويات بأكملها أثناء وجودها في هيدروجيل. تم استخدام صيغتين لتجميد المواد العضوية والكروية في الدراسة: (1) 10٪ DMSO يحتوي على محلول تجميد تقليدي (FS) و (2) وسط حفظ بالتبريد خال من المصل و DMSO. يحتوي وسيط الحفظ بالتبريد هذا على مكونات مصفوفة خارج الخلية ، والتي تختلف عن الصيغ الحالية. تتكون المصفوفة خارج الخلية من فئتين رئيسيتين من الجزيئات الكبيرة ، البروتيوغليكان ، والبروتينات الليفية ، والتي تعتبر ضرورية للسقالات الفيزيائية للمكونات الخلوية ، ولكنها تبدأ أيضا العمليات المطلوبة لتشكل الأنسجة والتمايز والتوازن34،35،36،37،38،39،40 . توفر الكولاجين قوة الشد ، وتنظم التصاق الخلايا ، وتدعم الانجذاب الكيميائي والهجرة ، وتطور الأنسجة المباشر37. بالإضافة إلى ذلك ، توفر ألياف الإيلاستين ارتدادا للأنسجة التي تخضع لتمدد متكرر38. يوجه بروتين ليفي ثالث ، الفبرونيكتين ، تنظيم المصفوفة الخلالية خارج الخلية وله دور حاسم في التوسط في ارتباط الخلية ويعمل كمنظم ميكانيكي خارج الخلية39. أظهر Du et al. التأثير الواقي من البرودة لهيدروليزات كولاجين الدجاج على نظام نموذج الأكتوميوسين الطبيعي41. تشير نتائجهم إلى أن تحلل الكولاجين يمكن أن يمنع نمو بلورات الجليد ، ويقلل من تمسخ تجميد البروتين والأكسدة بشكل مشابه للمواد الواقية من التبريد التجارية ، ويوفر بنية هلام أفضل بعد دورات التجميد والذوبان. لذلك ، فإن إضافة مكونات المصفوفة خارج الخلية إلى وسائط الحفظ بالتبريد توفر بيئة أكثر أمانا وحماية للعينة وتدعم الهياكل الحية للشفاء بعد التجميد والذوبان.

بالإضافة إلى ذلك ، تصف الدراسة الحالية بروتوكولا مباشرا لتسمية الأغشية السيتوبلازمية ونوى الكائنات العضوية الحية والكروية أثناء وجودها في الهيدروجيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة المواد العضوية والكروية

  1. ضع الهيدروجيل على الثلج طوال الليل (في الثلاجة أو غرفة باردة) ليذوب.
  2. ضع الجهاز متعدد الأغراض المتاح تجاريا (MD ؛ انظر جدول المواد) في الحاضنة قبل يوم واحد من التجربة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) للتدفئة.
  3. ضع أطراف ماصة معقمة عريضة الأطراف في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 1.1-1.3 في اليوم 0 ، ويجب تنفيذ الخطوات 1.4-1.11 في اليوم الأول.
  4. ضع الهيدروجيل على الثلج في غطاء تدفق رقائقي لمدة 15 دقيقة.
    1. اختياري: قم بتخفيف الهيدروجيل في وسط زراعة الخلايا الباردة وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
  5. ضع الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات من خلايا HepG2 (خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية الذي تم الحصول عليه تجاريا ؛ انظر جدول المواد) على الجليد.
  6. لوحة 30-35 ميكرولتر من هيدروجيل 100 ٪ داخل مكانة الجهاز قبل تسخينه لإنشاء قطرة هلام.
  7. ضع 10000 خلية HepG2 في منتصف الجزء العلوي من كل قطرة هيدروجيل (الشكل 2) ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. قم بتغطية قطرة الهيدروجيل ب 200 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني.
  9. قم بتغطية غطاء MD في الموضع الصحيح للسماح بتدفق الغاز ، وضع الجهاز في الحاضنة.
  10. قم بتغذية الخلايا ب 200 ميكرولتر من DMEM بنسبة 10٪ FBS كل يوم.
  11. تحقق من نمو الأجسام الكروية تحت المجهر المقلوب (الشكل 3). يبدأ التكوين الكرويبعد اليوم 3 . يظهر الفيديو 1 موقع الأجسام الكروية على مستويات مختلفة في قبة هيدروجيل.
    ملاحظات: يوصى بشدة بشفط السائل المحيط بالهيدروجيل برفق وإضافة السائل الجديد ببطء إلى البيئة لمنع إتلاف قطرات الهيدروجيل.

2. تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للعضويات / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتسخين المثبت (4٪ بارافورمالدهيد ؛ PFA) ، PBS ، والهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
  2. استنشاق الوسط المحيط بقطرة هيدروجيل باستخدام ماصة ، وأضف 100-200 ميكرولتر من 4٪ PFA لإصلاحه ، واحتضانه لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. استنشاق 4٪ PFA وإضافة 200 ميكرولتر من PBS لغسل 3x لمدة 5 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط PBS واحتضان 200 ميكرولتر من محلول الهيماتوكسيلين لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. شفاط الهيماتوكسيلين وأضف 200 ميكرولتر من dH2O لغسل 3x لمدة 10 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية. استنشاق dH2O واحتضان 200 ميكرولتر من الإيثانول لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. نضح الإيثانول واحتضانه ب 200 ميكرولتر من Eosin (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. نضح Eosin وأضف 200 ميكرولتر من dH2O ليغسل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  6. استنشاق dH2O وإضافة 100 ميكرولتر من الجلسرين لتغطية قطرة هيدروجيل كوسيط تركيب.
  7. اختياري: قم بتركيب مكانه باستخدام غطاء غطاء. يمكن حذف هذه الخطوة لتجنب الضغط على المواد العضوية / الكروية ذات الحجم الكبير.
  8. أغلق غطاء MD بإحكام لتجنب الجفاف حتى الفحص. العينة مستقرة للفحص لمدة 6 أشهر على الأقل.

3. الكيمياء الهيستولوجية المناعية للعضويات / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتسخين المحلول الذي تم الحصول عليه تجاريا للكيمياء الهيستولوجية المناعية (S-IHC ؛ انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
  2. احتضان المواد العضوية أو الكروية في الهيدروجيل مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) في 200 ميكرولتر من dH2O لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. نضح محلول بيروكسيد الهيدروجين واغسله في dH2O لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. شفاط dH2O واحتضن مرتين ب 100 ميكرولتر من S-IHC عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  4. قم بشفط S-IHC واحتضان 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي (انظر جدول المواد) المخفف في S-IHC لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية (باتباع توصيات الشركة المصنعة فيما يتعلق بتخفيف العمل).
  5. استنشاق محلول الأجسام المضادة الأساسي واحتضانه ب 100 ميكرولتر من S-IHC 3x لمدة 5 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية.
  6. استنشاق 100 ميكرولتر من S-IHC واحتضان بجسم مضاد ثانوي بيوتينيل (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  7. استنشاق محلول الأجسام المضادة الثانوي واحتضانه ب 100 ميكرولتر من S-IHC 3x لمدة 5 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية. استنشاق S-IHC واحتضان 100 ميكرولتر من بيروكسيديز الفجل (HRP) المسمى الستربتافيدين (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  8. استنشاق HRP المسمى ستربتافيدين واحتضان 100 ميكرولتر من S-IHC 3x لمدة 5 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية.
  9. قم بشفط S-IHC واحتضانه ب 100 ميكرولتر من خليط محلول كروموجين DAB / AEC (انظر جدول المواد) لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  10. مراقبة شدة تلطيخ تحت المجهر الضوئي.
  11. يغسل ب dH2O 3x لمدة دقيقتين لكل منهما.
  12. اختياري: احتضان 100 ميكرولتر من الهيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) للتلطيخ النووي لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  13. نضح الهيماتوكسيلين واغسله في dH2O لمدة 5 دقائق.
  14. قم بشفط dH2O وقم بتغطية قطرة هيدروجيل ب 100 ميكرولتر من الجلسرين كوسائط تركيب.
  15. أغلق غطاء MD بإحكام حتى الفحص المجهري.
    ملاحظات: تم حذف خطوات استرجاع المستضد وحجب البروتين في هذا البروتوكول لأن S-IHC يلغي هذه الخطوات.

4. وضع العلامات المناعية للعضويات / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتسخين المواد التالية إلى 37 درجة مئوية: 4٪ PFA ، PBS ، S-IF ، محلول الأجسام المضادة الأساسي في S-IF ، محلول الأجسام المضادة الثانوي في S-IF ، البقع النووية ، والجلسرين (انظر جدول المواد).
  2. قم بشفط وسط زراعة الخلية وثبته ب 200 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شفاط المثبت واغسله في S-IF 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما عند 37 درجة مئوية.
  3. أضف dH2O إلى الجانب المحيط بالمكان المناسب لتوفير الرطوبة أثناء الخطوات التالية.
  4. قم بشفط S-IF المحيط بقطرة الهيدروجيل واحتضان قطرة الهيدروجيل ب 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) في S-IF لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. استنشاق محلول الأجسام المضادة الأساسي وغسله في S-IF 3x لمدة 10 دقائق لكل منها عند 37 درجة مئوية.
  6. قم بشفط S-IF واحتضان 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي (انظر جدول المواد) في S-IF لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  7. استنشاق محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسله باستخدام PBS 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  8. استنشاق PBS واحتضان 100 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي النووي التي تحتوي على وسط متصاعد أو جلسرين عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  9. املأ مكانه بالجلسرين لتجنب التجفيف.
  10. اختياري: قم بتغطية مكانه بغطاء غطاء. يمكن حذف هذه الخطوة لتجنب الضغط على المواد العضوية / الكروية.
  11. أغلق MD بإحكام. يمكن تخزين العينات في MDs عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 6 أشهر على الأقل مع الحد الأدنى من فقدان التألق.
  12. استخدم الإعدادات التالية للفحص المجهري متحد البؤر: اضبط قيمة الثقب لجميع القنوات على 20.1 ، واحتفظ بثابت الكسب الرئيسي عند 550 ل 488 نانومتر ، و 485 ل 550 نانومتر ، و 450 ل 594 نانومتر ، والحفاظ على طاقة الليزر ثابتة لجميع التجارب ، وأقل نسبة عند 2.0.
    ملاحظات: الأجسام المضادة الأولية: Anti-Na-K ATPase (1:100) ، مضاد الأرجيناز (1:50) ، مضاد الألبومين (1:50) ، مضاد بيتا غالاكتوزيداز (1:25) ، جسم مضاد مضاد للميتوكوندريا (1:100) ، جسم مضاد مضاد لجولجي (1:50) ، مضاد للسيتوكيراتين 5 (1:100) ، جسم مضاد Ov6 (1:100). الأجسام المضادة الثانوية: الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) - 488 ، الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) -550 ، الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) -488 ، الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) -550 ، الماعز المضاد للدجاج IgY (H + L) -647. التخفيف لجميع الأجسام المضادة الثانوية هو 1: 100. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا استخدام FITC-Phalloidin (1: 100) ، وهو جسم مضاد مترافق (انظر جدول المواد).

5. غشاء البلازما ووضع العلامات على النواة من الكائنات العضوية الحية والكروية في هيدروجيل

  1. قم بإعداد محلول وضع العلامات الذي يحتوي على أليكسا فلور جنين القمح agglutinin (5.0 ميكروغرام / مل) و Hoechst (2 ميكرومتر) في محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) ، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) ، وقم بالتسخين حتى 37 درجة مئوية.
  2. نضح وسط زراعة الخلية وإضافة 100 ميكرولتر من محلول وضع العلامات لتغطية قطرة هيدروجيل. احتضان لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بإزالة محلول الملصقات واغسله مرتين في PBS 2x لمدة 10 دقائق لكل منهما عند 37 درجة مئوية. اختياري: ثبت ب 200 ميكرولتر من 4٪ فورمالديهايد لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. قم بتغطية قطرة هيدروجيل بالجلسرين كوسيط تركيب. اختياري: قم بتركيب مكانه بغطاء زجاجي.
  5. أغلق غطاء MD بإحكام واحتفظ به في الثلاجة في الظلام حتى الفحص المجهري الفلوري / متحد البؤر. إنه مستقر لمدة 6 أشهر على الأقل.

6. تجميد وذوبان المواد العضوية / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتجميد المواد العضوية باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بتسخين محلول التجميد الذي تم الحصول عليه تجاريا (FS ؛ انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية.
    2. قم بشفط وسائط زراعة الخلايا المحيطة بقبة الهيدروجيل برفق.
    3. أضف 200 ميكرولتر من FS بلطف. احتضان العينة مع FS عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. أغلق غطاء الجهاز بإحكام وضعه في صندوق رغوي. ضع صندوق الرغوة هذا في صندوق رغوة آخر ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 3. أغلق صندوقي الرغوة بإحكام. يوفر صندوقان من الرغوة داخل بعضهما البعض نطاق تدرج تبريد درجة الحرارة من 1 إلى 2 درجة مئوية / دقيقة من العينة في الفريزر -20 درجة مئوية.
    5. ضع الصندوق على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. انقل الصندوق إلى فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية واتركه طوال الليل.
    6. أخرج العينة من الصناديق. يمكن الاحتفاظ بالعينة الموجودة في MD في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
    7. انقل MD الذي يحتوي على العينة إلى خزان النيتروجين السائل لتخزينه على المدى الطويل.
  2. قم بإذابة المواد العضوية باتباع الخطوات أدناه.
    1. أخرج MD الذي يحتوي على العينة من الفريزر / خزان النيتروجين وضعه مباشرة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ إلى مكانه (نسبة FS إلى وسط استزراع الخلية هي 1: 1) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. أضف المزيد من وسط الاستزراع الدافئ إلى الكوة (نسبة FS إلى وسط زراعة الخلية هي 1: 2) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. استنشاق الخليط المتوسط و FS برفق. انتقل إلى المجهر الإلكتروني الماسح (الخطوة 7) والمجهر الإلكتروني النافذ (الخطوة 8) تصوير المواد العضوية / الكروية الكاملة في الهيدروجيل.

7. المسح المجهري الإلكتروني للعضويات / الكروية الكاملة

  1. قم بتسخين محلول Karnovsky المثبت وما بعد التثبيت (انظر جدول المواد) لدرجة حرارة الغرفة (RT).
  2. استنشاق وسط زراعة الخلية المحيطة بالهيدروجيل في MD. ضع العينة في MD على الثلج في غطاء التدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة.
  3. استنشاق هيدروجيل المسال المحيط بالمواد العضوية / الكروية بلطف شديد. يمكن أن تبقى كمية محدودة من matrigel في مكانه لتجنب إتلاف العينة وفقدانها.
  4. ثبت باستخدام مثبت Karnovsky (2٪ PFA ، 2.5٪ جلوتارالدهيد في 0.15 M Cacodylate buffer ، و 2 mM CaCl2 ؛ انظر جدول المواد) في RT لمدة 1 ساعة.
  5. شفاط المثبت برفق واغسله بالماء المقطر (dH2O) 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  6. قم بشفط dH2O برفق وقم بتثبيته بمحلول ما بعد التثبيت (1٪ رابع أكسيد الأوزميوم المائي [OsO4] ؛ انظر جدول المواد) عند RT لمدة 1 ساعة.
  7. شفاط ما بعد التثبيت برفق واغسله بالماء المقطر (dH2O) 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  8. يجفف في سلسلة متدرجة من الإيثانول (30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 96٪ ، 100٪) ، خليط من الإيثانول / الأسيتون (1: 1 ؛ 1: 2) ، والأسيتون المطلق عند RT لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  9. جفف باستخدام مجفف نقطة حرجة.
  10. قم بتغطية العينة في الجهاز ب 6 نانومتر من الذهب / البلاديوم باستخدام طبقة رش (انظر جدول المواد) لمدة 90 ثانية.
  11. راقب تحت المجهر الإلكتروني الماسح باستخدام كاشف إلكترون ثانوي داخل العدسة عند 2-3 كيلو فولت في وضع الفراغ (5 × 10-6 مللي أمبير). التقط صورا بمسافة عمل تبلغ 8.1-8.2 مم وبتكبير 675 ضعفا و1050 ضعفا و1570 ضعفا.
    ملاحظات: يتم تنفيذ جميع الخطوات في MD. استخدم 200-250 ميكرولتر من المحلول لكل خطوة.

8. المجهر الإلكتروني النافذ للعضويات / الكروية الكاملة في هيدروجيل

  1. قم بتسخين مثبت Karnovsky إلى 37 درجة مئوية. استنشاق وسط زراعة الخلية المحيطة بالهيدروجيل في MD.
  2. إصلاح العينة مع مثبت Karnovsky في RT لمدة 1 ساعة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  3. بعد الإصلاح مع 2٪ ماء OsO4 و 2.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم في RT لمدة 45 دقيقة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  4. احتضان 0.5٪ ثيوكاربوهيدرازيد (TCH ؛ انظر جدول المواد) في RT لمدة 30 دقيقة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  5. احتضان في 2 ٪ OsO4 المائي في RT لمدة 30 دقيقة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  6. احتضان في محلول أسيتات اليورانيل 2 ٪ (انظر جدول المواد) في RT لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن الاحتفاظ بالأجسام الكروية عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  7. احتضان في محلول أسبارتات الرصاص (انظر جدول المواد) عند 60 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. يغسل ب dH2O 3x لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  8. يجفف في سلسلة متدرجة من الإيثانول (50٪ ، 70٪ ، 90٪ ، 100٪ [x2]) والأسيتون المطلق عند RT لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
  9. تعامل مع مزيج من (1: 1 ؛ 1: 2) الأسيتون / راتنج إيبون وراتنج إيبون النقي (انظر جدول المواد) في RT لمدة 2 ساعة لكل منهما.
  10. بلمرة الراتنج عند 60 درجة مئوية طوال الليل (بحد أدنى 16 ساعة). بعد البلمرة ، قم بإزالة كتلة الراتنج من MD ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 4.
  11. نعلق كتلة الراتنج إلى واحدة أكبر مع الغراء الراتنج. تقليم الكتلة والوصول إلى موقع المواد العضوية أو كروية.
  12. احصل على أقسام شبه رفيعة (1000 نانومتر) ورقيقة جدا (60 نانومتر) باستخدام ميكروتوم فائق (انظر جدول المواد).
  13. ضع المقاطع الرفيعة جدا على 100 شبكة نحاسية وراقبها تحت المجهر الإلكتروني الماسح باستخدام كاشف STEM بجهد متسارع يبلغ 30 كيلو فولت. التقط صورا بمسافة عمل تبلغ 44 مم وبتكبير 2580 × و5020 × و6060 ضعفا.
    ملاحظات: استخدم 200-250 ميكرولتر من المحلول لكل خطوة. يتم تنفيذ الخطوات 8.1-8.10 في MD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمثل هذه المقالة جهازا متعدد الأغراض (MD) ومنهجيات تكميلية للزراعة والتجميد والذوبان والتلوين النسيجي والتلوين الكيميائي المناعي ووضع العلامات المناعية والطلاء ومعالجة المواد العضوية أو الكروية بأكملها بينما لا تزال في هيدروجيل في بيئة واحدة مصممة بشكل فريد. تم تصميم الدراسة الحالية لإعداد كرويات سرطان الكبد HepG2 في 35 قطرة هيدروجيل في 35 MDs. أجريت التجارب في ثلاث نسخ لضمان الدقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف عضويات الرئة في MDs على أنها مثال لإثبات نتائج المنهجيات الحالية للدراسات العضوية.

يوضح الشكل 1 نظرة فاحصة على الجهاز الذي يحتوي على قبة هيدروجيل. تم تصميم حجم وشكل الكوة لتوفير بيئة واقية للهيدروجيل الذي يحتوي على المواد العضوية / الكروية وحفظ الكواشف المستخدمة خلال العمليات المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الجزء الجانبي من الجهاز الذي يحيط بالمكانة كغرفة رطوبة أثناء تجارب التلطيخ المناعي. قد يتراوح وسيط تغذية العينة بين 100-200 ميكرولتر ، اعتمادا على ارتفاع قطرة الهيدروجيل. تركز الدراسة الحالية على الطريقة القائمة على القبة لأن العديد من الهلاميات المائية ومكونات المصفوفة التجارية خارج الخلية ومستخلصات الغشاء القاعدي تسمح للمستخدم بإعداد قطرات. ومع ذلك ، من الممكن أيضا ملء مكانة MD بالهيدروجيل ثم زرع الخلايا الموجودة بداخله لتوليد المواد العضوية / الكروية. قد تكون هذه الطريقة مفضلة إذا كانت لزوجة المصفوفة لا تسمح بإعداد القباب أو إذا كانت التجربة تتضمن كميات كبيرة من المواد العضوية. قد يختلف نوع الهيدروجيل ونسبة الهيدروجيل / الوسيط لإعداد القطرات وفقا لنوع الخلية والتصميم التجريبي والوسيط. الشكل 1  يمثل أيضا تصميم الجهاز الذي يجعل من الممكن التحقيق في المواد العضوية / الكروية تحت المجاهر الإلكترونية Brightfield و Confocal و Scanning بينما لا تزال الكائنات العضوية / الكروية في بيئتها الأصلية في المختبر .

يوضح الشكل 2 كيفية زرع الخلايا في هيدروجيل وفحص تطور الأجسام الكروية أو العضوية. كما تم عرض تصميم وأبعاد الجهاز متعدد الأغراض في هذا الشكل. يوضح الفيديو 1 موقع الكرويات المتنامية ثلاثية الأبعاد في هيدروجيل. يمثل الشكل 3 صورا حية للكرويات النامية من اليوم 3 إلى اليوم 21. قد يختلف وقت تكوين الأجسام الكروية والعضوية وفقا لطبيعة العينة. على سبيل المثال ، تشكلت الأجسام الكروية من خلايا HepG2 وخلايا HEK في غضون 3 أيام ، في حين استمر تكوين الكبد والكائنات العضوية الصفراوية لمدة أسبوعين خلال التجارب.

يظهر الشكل 4 الكرويات الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوسين. تمثل الصورة كرويات محفوظة جيدا وملطخة بشكل متجانس بأحجام مختلفة واندماج من الأجسام الكروية. الخلايا الحية في وسط الكرويات جديرة بالملاحظة. توضح الصورة أيضا الروابط الدقيقة بين الخلايا من الأجسام الكروية المختلفة. لا يمكن تصور هذه الاتصالات الهشة بعد سير العمل التقليدي لأن النقل أو السحب أو الطرد المركزي من شأنه أن يتلفها. الشكل 5  يوضح التلطيخ المناعي للكرويات مع الجسم المضاد الخاص بالأرجيناز ، وهو أحد أكثر العلامات شيوعا لتشخيص وتشخيص سرطان الخلايا الكبدية42,43. تكشف الصور المجهرية عن خلايا سرطان الكبد المتمايزة وغير المتمايزة في نفس الأجسام الكروية. يحتوي هذا الشكل على صور مع وبدون تلطيخ مضاد مع الهيماتوكسيلين. قد يختار الباحثون حذف التلوين المضاد مع الهيماتوكسيلين في الحالات التي يكون فيها من الصعب التمييز بين المناطق المصنفة في بنية 3D.

يمثل الشكل 6 بروتوكولا مباشرا آخر للتصور الكامل للعضويات / الكروية الحية في هيدروجيل: غشاء الخلية الحية وتلطيخ النواة. تسمح المنهجية بنفس كثافة وضع العلامات في المحيط والمركز ، مما يدل على اختراق الكاشف الكامل. يوضح الشكل 7 والشكل 8 والشكل 9 صورا تمثيلية للكرات الكروية المشار إليها بجسم مضاد واحد أو اثنين أو ثلاثة أجسام مضادة على الترتيب. يتم تخفيف واحد إلى ثلاثة أجسام مضادة أولية في S-IF في وقت واحد. وبالمثل ، يتم تخفيف واحد إلى ثلاثة أجسام مضادة ثانوية مطابقة مناسبة للتجربة في وقت واحد في S-IF. يسمح بروتوكول وضع العلامات المناعية للباحثين بتمييز الهياكل ثلاثية الأبعاد في غضون 4-6 ساعات دون فقدها أو إتلافها. الخلفية شفافة ، والتكنولوجيا المستخدمة هنا لا تتطلب مقاصة إضافية أو استرجاع مستضد أو طرق / حلول حظر. تسمح الطريقة أيضا للباحثين بتسمية العينة بأجسام مضادة متعددة في خطوة واحدة. بمعنى آخر ، يقوم المستخدم بإعداد محلول واحد يحتوي على واحد إلى ثلاثة أجسام مضادة أولية وحل آخر مطابق لواحد إلى ثلاثة أجسام مضادة ثانوية. يلغي البروتوكول الموصوف هنا خطوات وضع العلامات المتسلسلة مع الأجسام المضادة المختلفة في المنهجيات التقليدية.

يمثل الشكل 10 الصور المجهرية الإلكترونية للمسح الضوئي والإرسال للكرويات. يوضح الصف الأول صورا لكرويات كاملة في MD تحت المجهر الإلكتروني الماسح. يحتوي الصف الثاني على صور مجهرية إلكترونية للكرويات بعد تحضير كتل الراتنج التي تحتوي على كرويات كاملة التركيب في MD ، بالإضافة إلى صور للكرويات المجزأة والملطخة. تظهر العضيات السيتوبلازمية المحفوظة جيدا وغيرها من الميزات الهيكلية للخلايا فعالية هذا البروتوكول المباشر ، الذي يحمي بنية 3D للعينة بأكملها. يسمح MD أيضا للباحثين بتجميد وإذابة العينات الكاملة في هيدروجيل. الشكل 11  يوضح قباب هيدروجيل والأجسام الكروية بتكبير أعلى قبل وبعد التجميد. المخالفة عند حدود قبة هيدروجيل ملحوظة. ومع ذلك ، فإن استدارة الكرويات المحفوظة بالتبريد مستقرة تقريبا بعد الذوبان مقارنة بالأجسام الكروية قبل التجميد. يتم أيضا تطبيق طرق وضع العلامات على غشاء الخلية الحية والنواة بعد 48 ساعة من الذوبان لتوضيح كيفية تأثير إجراء التجميد / الذوبان على بنية 3D وغشاء الخلية وصلاحية الخلية. يظهر محلول التجميد التقليدي الذي يحتوي على ثنائي ميثيل سلفوكسيد والمحلول الحالي المركب حديثا ، SF ، نتائج مماثلة. أكثر من 75٪ من هياكل 3D يمكن البقاء على قيد الحياة في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التجارب للكشف عن الآثار الجانبية طويلة المدى لكل تركيبة على المواد العضوية والكروية.

يقارن الجدولان 1 والجدول 2 تدفقات العمل التقليدية بتلك الموصوفة هنا بناء على رقم الخطوة والمدة وإنتاج النفايات (أي العدد الإجمالي للقفازات البلاستيكية وأطراف الماصات والماصات المصلية وأنابيب الطرد المركزي وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأوعية زراعة الخلايا والمبردات وما إلى ذلك لكل سير عمل).

يمثل الشكل التكميلي 1 خطوات متسلسلة يمكن تنفيذها في MD واحد بشكل تخطيطي. يوضح الشكل التكميلي 2 نتائج التجارب المصممة لمقارنة صلاحية الخلية والسمية ومعدلات تكاثر خلايا HepG2 في MD أو طبق تقليدي ذو قاع زجاجي. يوضح الشكل التكميلي 3 صناديق الرغوة التي تم استخدامها لتجميد العينات في MD. يلخص الشكل التكميلي 4 خطوات إخراج كتلة راتنجية من MD. يتضمن الشكل التكميلي 5 صورا لعضويات مجرى الهواء التي تم تصنيفها بالفلورسنت المناعي ثم تصورها بينما كانت لا تزال في MD. وبالمثل ، يوضح الفيديو 2 اثنين من عضويات مجرى الهواء المناعية في MD. أخيرا ، الشكل التكميلي 6 هو رسم بياني يقارن متوسط شدة شدة وسم غشاء الخلية في الأجسام الكروية الحية قبل وبعد التجميد باستخدام سير العمل التقليدي وسير العمل الموصوف هنا. تم استخدام برنامج Image J للتحليل.

Figure 1
الشكل 1: جهاز زراعة الخلايا متعدد الأغراض (MD). (أ) تم تصميم الكوة (N) ، الجزء المركزي من الجهاز ، لخلق بيئة واقية للعضويات / الكروية المزروعة في قطرة هيدروجيل (D) أثناء العمليات المتسلسلة. يمكن استخدام الجانب (S) ، الجزء المحيط من مكانه ، كغرفة مرطب أثناء تجارب التلطيخ المناعي. (ب) يسمح المركز الشفاف في الغطاء للمستخدم بمراقبة المواد العضوية / الكروية عند إغلاق الجهاز. (ج) يمكن تلطيخ قبة الهيدروجيل التي تحتوي على مواد عضوية في MD أو تضمينها في كتلة راتنجية للفحص المجهري الإلكتروني النافذ. يتضمن الغطاء أيضا مكانة (N) لمنهجية إسقاط التعليق. يسمح حجم وتصميم الجهاز للمستخدم بفحص الكائنات العضوية / الكروية تحت (D) برايتفيلد ، (E) بؤري ، و (F) مسح المجاهر الإلكترونية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: بذر الخلايا داخل هيدروجيل. (أ) تدخل كرية الخلية الموجودة في الماصة في أعلى القبة. بعد 3-5 أيام ، تصبح الأجسام الكروية مرئية في القبة ، خاصة في محيط القطرة. (ب) تم التقاط ودمج أربع صور حية لكرويات تنمو من كل ربع في قبة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ج) تصميم وأبعاد (بالسنتيمتر) للجهاز متعدد الأغراض (MD). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تطوير كرويات في قطرة هيدروجيل من اليوم 3 إلى اليوم 21. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: الهيماتوكسيلين والأجسام الكروية الملطخة باليوسين داخل MD. تصور الاتصالات بين الخلايا الموجودة في الأجسام الكروية المجاورة أو المنصهرة. العمليات الدقيقة بين الخلايا (الأسهم) مرئية لأن العينة الكاملة في الهيدروجيل ثابتة وملطخة وفحصها دون الإضرار بالهياكل المتنامية 3D. شريط المقياس: اليوم 3 ، اليوم 9 = 50 ميكرومتر ؛ اليوم 7 ، اليوم 17 = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تلطيخ كيميائي مناعي للكرويات الكاملة في الهيدروجيل داخل MD. كانت العينات ملطخة بالمناعة بجسم مضاد خاص بالأرجيناز. تظهر خلايا أرجيناز الإيجابية (الأسهم الحمراء) والسالبة (الأسهم السوداء) في الأجسام الكروية. الصور مأخوذة من تجربتين: (A-C) بدون و (D-F) مع تلطيخ مضاد مع الهيماتوكسيلين. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: صورة متحدة البؤر لعضو عضوي حي في الهيدروجيل. تم تمييز الكائنات العضوية الحية بغشاء الخلية الحية (WGA) وبقع النواة (Hoechst). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: وسم التألق المناعي للكرويات كاملة التركيب في هيدروجيل بجسم مضاد واحد وصبغة نووية (Hoechst). (أ - ج) تظهر اللوحة العلوية كرويا مكتوبا عليه جسم مضاد خاص بإنزيم Na-K ATPase في الغشاء الخلوي. (مد-واو) توضح اللوحة السفلية موقع جسم مضاد آخر خاص بالأرجيناز ، وهو بروتين خلوي خاص بسرطان الخلايا الكبدية ، في كرويات سرطان الكبد. مدة بروتوكول تلطيخ: 6 ساعات. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: وسم التألق المناعي للكرويات الكاملة في هيدروجيل مع اثنين من الأجسام المضادة وصبغة نووية (Hoechst). (A-C) تظهر اللوحة العلوية كروية موصوفة بجسمين مضادين محددين للألبومين و Ov6. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. (D-F) توضح اللوحة السفلية موقع بروتين ألفا فيتو و Ov6 في كرويات سرطان الكبد. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. مدة بروتوكول التلطيخ: 6 ساعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 9
الشكل 9: وسم التألق المناعي للكرويات الكاملة في هيدروجيل مع ثلاثة أجسام مضادة وصبغة نووية (Hoechst). (A-E) يشار إلى الكروي في اللوحة العلوية بأجسام مضادة خاصة ب Arginase و Na-K ATPase و beta-galactosidase. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (F-J) توضح اللوحة الوسطى كروية تحمل علامة Ov6 وبيتا جالاكتوزيداز وبروتين ألفا فيتو. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (K-O) تم تصنيف الكروي في اللوحة السفلية ب FITC-phalloidin ، والجسم المضاد للميتوكوندريا ، والجسم المضاد ل Golgi. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. لاحظ خصوصية الملصقات العالية والخلفية المخفضة. مدة بروتوكول التلطيخ: 6 ساعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 10
الشكل 10: صور المجهر الإلكتروني. (أ - ج) مسح الصور المجهرية الإلكترونية للكرويات بأكملها في هيدروجيل في MD. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (D-F) كما تم تصور السمات الهيكلية الفائقة للخلايا في كروية تحت المجهر الإلكتروني النافذ. قضبان المقياس: (D) = 4 ميكرومتر ؛ (E ، F) = 2 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: صور حية للكرويات قبل التجميد وبعده. (أ-و) يتضح عدم انتظام حدود قباب هيدروجيل بعد التجميد. ومع ذلك ، فإن حجم واستدارة كروية لا تزال متشابهة. (و) يمكن رؤية هجرة الخلايا على سطح المزرعة بعد الذوبان. (ج-ل) يظهر غشاء الخلية الحية (WGA) وتلطيخ النواة (Hoechst) قابلية بقاء خلية مماثلة وأغشية خلوية سليمة قبل وبعد تجميد الأجسام الكروية بأكملها في هيدروجيل في MD. مقياس البصر: (أ ، ب ، د ، ه) = 200 ميكرومتر ؛ (C، F، G-L) = 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سير العمل التقليدي سير العمل مع جهاز متعدد الأغراض (MD)
الخطوات 22 6
الوقت 9 أيام 4 أيام
منتجات النفايات 26 9

الجدول 1: مقارنة رقم الخطوة والوقت وإنتاج النفايات بين تدفقات العمل التقليدية والجديدة خلال تجربة قصيرة الأجل.

سير العمل التقليدي سير العمل مع حل التألق المناعي (S-IF)
الخطوات 25 7
الوقت 120 ساعة 6-8 ساعات
منتجات النفايات 28 10

الجدول 2: مقارنة بين الوسم المناعي التقليدي وبروتوكول الوسم المناعي الجديد.

فيديو 1: سلسلة زمنية من الصور على مستويات مختلفة من هيدروجيل يحتوي على كرويات تحت مجهر تباين طور مقلوب. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 2: بنية ثلاثية الأبعاد لعضويتين في مجرى الهواء تحمل علامة الأجسام المضادة ل Cytokeratin 5 و DAPI. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

الشكل التكميلي 1: نظرة عامة على التجربة. يوضح هذا المخطط الخطوات التجريبية المتسلسلة لزراعة وفحص المواد العضوية الكاملة في هيدروجيل. تتيح التقنية الموصوفة هنا نمو الكائنات العضوية وتجميدها وإذابتها وتسميتها وفحصها تحت مجاهر مختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: مقارنة بين صلاحية الخلية والسمية ومعدلات تكاثر خلايا HepG2 في طبق تقليدي ذو قاع زجاجي أو MD. نمت خلايا HepG2 على (A) طبق زراعة الخلايا التقليدي ذو القاع الزجاجي أو (B) في MD لمقارنة صلاحية الخلية والسمية. (ج) تم استخدام اختبار استبعاد تريبان الأزرق لإثبات الجدوى. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تمت مقارنة النتائج باستخدام السمية الخلوية (D-E) CCK8 ومقايسات تكاثر الخلايا (F). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: ترتيب صندوقي الرغوة. يتم وضع صندوق رغوة واحد داخل الآخر أثناء عملية التجميد البطيئة للعضويات أو الكروية بأكملها في MD. * يشير إلى المربعين . الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: خطوات توضح كيفية إزالة كتلة الراتنج من MD بعد بلمرة الراتنج. (أ) يتم تحضير كتلة الراتنج المحيطة بالأجسام الكروية أو العضوية داخل مكانة MD ثم بلمرة. (ب - د) ثم ، باستخدام قضيب رفيع مناسب ، يتم دفع كتلة الراتنج لإزالتها من مكانه. (ه) بعد ذلك، تتم إزالة كتلة الراتنج، مع البلاستيك الموجود أسفلها. (ف-ز) أخيرا ، يتم استخدام زوج من الملقط لفصلها إذا كانت الكتلة لا تزال متصلة بالبلاستيك. (H) الكتلة جاهزة للتقسيم الرقيق. المواد العضوية أو الكروية ذات التركيب الكامل في كتلة الراتنج (*) جاهزة للتقسيم للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: عضويات مجرى الهواء التي تم تصنيفها بالفلورسنت المناعي ثم تصورها بينما كانت لا تزال في MD. (أ - ج) تظهر اللوحة العلوية عضويات مجرى الهواء الدائرية مع تجويف مركزي. يمثل اللون الأخضر الخلايا السلفية في مجرى الهواء التي تعبر عن Cytokeratin 5 في الحلقة الخارجية للعضو ، ويمثل اللون الأزرق النوى. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (D-F) تعرض اللوحة السفلية الصورة ثلاثية الأبعاد للعضويتين جنبا إلى جنب في مرشحات (D) DAPI و (E) Alexa 488 ، بالإضافة إلى الصورة المدمجة (F). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: مقارنة كثافة وضع العلامات على أغشية الخلايا الحية للخلايا. يقارن الرسم البياني بين الأجسام الكروية قبل وبعد التجميد باستخدام سير العمل التقليدي والمعتمد حاليا. تم إجراء التحليل باستخدام برنامج تحليل الصور Image J. الاختصارات: IntDen = الكثافة المتكاملة (شدة التألق في الكرات الكروية المختارة). CTCF = مضان الخلية الكلي المصحح. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MD ، المكمل للتركيبات والبروتوكولات الموصوفة هنا ، يسهل النمو السريع والعفوي 3D للعضويات والكروية في بيئة أكثر تحكما ويواصل التجربة في نفس الظروف. تبقى العينة في نفس البيئة خلال العملية بأكملها ، ويبقى ما يقرب من 100٪ من البنى المتنامية 3D سليمة في الحاوية. هذا يحسن التجانس أثناء التجارب المتسلسلة ويسمح بفترة استزراع ممتدة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل عدد الخطوات أثناء معالجة المواد العضوية والكروية بشكل كبير مقارنة بسير العمل التقليدي (الشكل 4) ، والذي بدوره يقلل من وقت المناولة والأخطاء البشرية ويقلل من مخاطر التلوث. علاوة على ذلك ، يعمل هذا على تحسين الموثوقية والصلاحية لأن الظروف التجريبية تظل مستقرة مع حماية الهياكل المتنامية 3D في بيئة واحدة. يساعد على توفير الوقت والعمل في المختبر مع تحسين الدقة والموثوقية والصلاحية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح بتتبع الهياكل الفردية المتنامية 3D خلال العملية المتسلسلة بأكملها. يمكن فحص تغيرات الحجم والموضع أثناء الثقافة واستجابتها للمركبات المختلفة في الجهاز. هذا يوفر نموذجا تجريبيا ممتازا في المختبر لتلخيص تطور جسم الإنسان والأمراض. يمكن للباحثين التحقيق في المراحل أثناء اندماج الأجسام الكروية والعضوية ، وهي آلية أساسية للهجرة في الأمراض والتطور الطبيعي44،45،46،47. تفضل الدراسات الحديثة التي تهدف إلى نمذجة الاندماج في المختبر استخدام النماذج العضوية والكروية44،45،46،47.

كما يسمح هذا الجهاز للباحثين بإيقاف التحقيق في حالة طارئة عن طريق تجميدهم في حالتهم الحالية ثم الاستمرار دون أي خسارة عندما تسمح الظروف بإجراء تجارب جديدة. على سبيل المثال ، بسبب جائحة COVID ، احتاج الباحثون إلى إيقاف التجارب على الفور ، وفقدان موادهم وبياناتهم الثمينة. لا يوجد حل حالي لتأمين تجربة إذا كان هناك انقطاع مفاجئ للدراسات بسبب تغير الظروف.

حدود هذه التقنية
تم تطوير التقنيات الموصوفة هنا لفحص التطور التلقائي للعضويات والكروية ، وهو نموذج لفهم تطور جسم الإنسان الطبيعي والأمراض. لذلك ، لا يمكن استخدام الجهاز والمنهجيات الحالية لتطوير كرويات أو عضويات ذات حجم موحد تم تفضيلها لاختبارات فحص المخدرات. هناك قيد آخر يتعلق بحجم الأجسام الكروية والعضوية. يمكن أن تكون المواد العضوية الكاملة والكروية كثيفة للغاية ، حيث تتطلب العديد من طبقات الخلايا كواشف تحافظ على العينات أو تسميها لاختراق قلبها. ومع ذلك ، تختلف فترات الحضانة لجميع البروتوكولات ، بما في ذلك التلوين ووضع العلامات والتجميد ، وفقا لحجم العينة وهلام البيئة المكروية المحيط بالعينة. على سبيل المثال ، تتطلب المواد العضوية الأكبر حجما والمواد الهلامية الأكثر صلابة فترات حضانة أطول للسماح بالتغلغل في مركز العينة.

التطبيقات المستقبلية
يسمح الجهاز وهذه المنهجيات بفحص طويل الأمد للعضويات والكروية المتنامية 3D لفهم تكوين الأعضاء وتشكل الأنسجة والأمراض مع تحسين قابلية التكاثر والموثوقية والدقة. يمكن فحص المواد العضوية أو الكروية الموسومة في MDs باستخدام تقنيات الفحص المجهري عالية التقنية ، بما في ذلك المسح بالليزر متعدد الفوتونات والفحص المجهري الفلوري للورقة الضوئية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين فحص نفس العينة في جهاز واحد تحت كل من المجهر الإلكتروني متحد البؤر والمسح الضوئي لإجراء دراسة مترابطة ، CLEM (المجهر الإلكتروني الضوئي المتلازم). يمكن أيضا استخدام الجهاز والمنهجيات في عضويات البنوك الحيوية والأجسام الكروية مع حماية معماريات 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يمتلك رنان جولهان أكتاس طلبات براءات اختراع MD و S-IHC و S-IF و FS. شارك Olgu Enis Tok في تطوير هذه المنتجات. أولغو إينيس توك وغامزي ديميريل هما عضوان في فريق البحث والتطوير في الشركة المسماة Cellorama. ليس لدى يوسف مصطفى ساتشي وزينب أكبولوت وأوزجيجان كايالار أي تضارب في المصالح يعلنونه.

Acknowledgments

نحن ممتنون لديل ميرتس من جامعة شيكاغو لإعداد الرسوم البيانية، وللدكتور محمد شريف أيدين لدعمه الفني في معهد أبحاث العلوم والتقنيات الصحية بجامعة اسطنبول ميديبول، وللدكتورة رنا كاظمي من جامعة مالتيبي لتحرير المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol (EtOH) Merck 8187602500 Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone Merck 8222512500 Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)   Invitrogen I34406 Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody Biocare Medical CP 028 A Store at +4 °C
Anti-albumin antibody Abcam EPR20195 Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal Abcam 134435 Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5 Abcam 53121 Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody Biocare Medical ACI 3058 A, B Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C1016-500G Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) Abcam ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL  Nest 601051
Centrifuge tubes, 50 mL  Nest 602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus Telstar EN12469
CO2 Incubator Panasonic KM-CC17RU2
Copper Grids Electron Microscopy Sciences G100-Cu Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture   Sigma Aldrich AEC101 Store at +4 °C
Diamond knife Diatome Ultra 45°, 40-US Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology Biofroxx 67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes Nest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41966-029 Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic Bright Slide 2.BS01-105-1000
Epon resin  Sigma 45359-1EA-F Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier Pan Biotech P30-3304 Store at +4 °C
Freezing Solution (FS) Cellorama CellO-F Store at +4 °C
Glass knife maker Leica EM KMR3 For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) Leica 7890-08 Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%  Electron Microscopy Sciences 16210 Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution Sigma Aldrich 56-81-5 Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 Invitrogen A32933 Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35502 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84540 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35552 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84541 Store at +4 °C
Hematoxylin Harris  Bright Slide 2.BS01-104-1000
HepG2 cells ATCC HB-8065 Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 R&D Systems MAB2020 Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354248 Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354234 Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel ThermoFischer Scientific A1413201 Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel Biotechne, R&D Systems BME001-01 Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid Sigma 11189-100G Store at RT
Lead aspartate solution Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate Electron Microscopy Sciences 17900 Store at RT
Leica Confocal Microscope Leica DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss
Microplate reader Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD) Cellorama CellO-M
Nuclear-DNA stain Invitrogen H3569 Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain ThermoFischer Scientific 62248 DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% Electron Microscopy Sciences 19190 Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody R&D systems MAB2020 Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%  Sigma 1.04005.1000 Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets MP Biomedicals, LLC 2810305
Post-fixative solution %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%  Electron Microscopy Sciences 26603-01 Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS Zeiss Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL Nest 620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment Zeiss GeminiSEM 500 We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack ScyTek Laboratories SHP125 Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 Electron Microscopy Sciences 11655 Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] GeneTex GTX22871 Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) Cellorama CellO-IF Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) Cellorama CellO-P Store at +4 °C
Specimen trimming device Leica EM TRIM2 For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater Leica EM ACE200 Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH) Sigma 223220-5G Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Ultra gel super glue Pattex PSG2C For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome Leica EM UC7 For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL Nest 171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL Isolab L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL  Nest 110919HA01
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 190،
زراعة وتجميد ومعالجة وتصوير عضويات وكرويات كاملة أثناء وجودها في هيدروجيل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., … More

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., Akbulut, Z., Kayalar, O., Aktas, R. G. Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel. J. Vis. Exp. (190), e64563, doi:10.3791/64563 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter