Summary
De huidige studie beschrijft methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, kleuren, labelen en onderzoeken van volledige sferoïden en organoïden onder verschillende microscopen, terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat.
Abstract
Organoïden en sferoïden, driedimensionale groeistructuren in celkweeklaboratoria, worden steeds meer erkend als superieure modellen in vergelijking met tweedimensionale kweekmodellen, omdat ze het menselijk lichaam beter nabootsen en voordelen hebben ten opzichte van dierstudies. Deze studies hebben echter vaak problemen met reproduceerbaarheid en consistentie. Tijdens de lange experimentele processen - met overdrachten van organoïden en sferoïden tussen verschillende celkweekvaten, pipetteren en centrifugeren - worden deze gevoelige en fragiele 3D-groeistructuren vaak beschadigd of verloren. Uiteindelijk worden de resultaten aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. De hier beschreven methoden minimaliseren deze stressvolle stappen en zorgen voor een veilige en consistente omgeving voor organoïden en sferoïden gedurende de hele verwerkingssequentie terwijl ze zich nog in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat bevinden. De onderzoekers kunnen groeien, bevriezen, ontdooien, verwerken, vlekken, labelen en vervolgens de structuur van organoïden of sferoïden onderzoeken onder verschillende hightech-instrumenten, van confocale tot elektronenmicroscopen, met behulp van een enkel multifunctioneel apparaat. Deze technologie verbetert de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en validiteit van de studies, terwijl een stabiele en beschermende omgeving voor de 3D-groeistructuren tijdens de verwerking behouden blijft. Bovendien minimaliseert het elimineren van stressvolle stappen afhandelingsfouten, vermindert het de benodigde tijd en vermindert het het risico op besmetting.
Introduction
De toekomst van celonderzoek en -therapie ligt binnen 3D-celculturen 1,2,3. Organoïde en sferoïde modellen dichten de kloof tussen in vitro experimenten en diermodellen door betere modellen te maken die de ontwikkeling van het menselijk lichaam, fysiologie en ziekten nabootsen 4,5,6,7,8,9. De reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid van deze modellen blijven echter een uitdaging. Bovendien resulteert het hanteren, oogsten, overbrengen en centrifugeren van deze structuren met de huidige technologieën in verlies of beschadiging van de organoïden en sferoïden in veel omstandigheden, wat de resultaten aanzienlijk beïnvloedt.
Ondanks vele protocollen voor histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering en cryopreservatie, is er geen universele benadering met betrekking tot het standaardiseren van experimentele omstandigheden, het hanteren en verwerken van deze delicate structuren zonder ze te verliezen of te beschadigen. De huidige protocollen zijn ook ongelooflijk lang, afwisselend van enkele dagen tot enkele weken, en omvatten complexe procedures met verschillende reagentia 10,11,12,13,14. Bovendien veroorzaken het oogsten, pipetteren, centrifugen en overbrengen van 3D-groeistructuren tussen celkweekvaten en cryovialen veranderingen in de positionering van de structuren en mechanische krachten en beïnvloeden ze uiteindelijk de differentiatie en rijping van de organoïden en sferoïden. Er is gemeld dat weefseltopologie, positionering van de cellen en mechanische krachten een significante invloed hebben op celdifferentiatie en rijping 6,15,16,17.
Daarom is het wenselijk om de huidige conventionele technologieën te verbeteren om organoïden en sferoïden met stabiele kwaliteit te genereren. Een methode/apparaat dat de hierboven beschreven centrifugatie en andere stappen overslaat en het materiaal van het begin tot het einde van de meerdere processen in één veilige omgeving levert, zou gunstig zijn om de meest consistente en betrouwbare gegevens te bereiken. Bovendien zal dit de tijds-, arbeids- en kostenbeperkingen verminderen.
Het hier beschreven multipurpose device (MD) biedt één veilige omgeving voor meerdere processen van organoïden en sferoïden (aanvullende figuur 1). Dit apparaat en aanvullende protocollen elimineren de stappen voor het oogsten, pipetteren, overbrengen en centrifugeren. De organoïden en sferoïden blijven in hun in vitro omgeving tijdens de sequentiële processen. Deze omgeving bestaat voornamelijk uit natuurlijke of synthetische extracellulaire matrixcomponenten, zoals in de handel verkrijgbare hydrogels. Met andere woorden, de hier beschreven methoden maken het mogelijk om een monster van organoïden / sferoïden in zijn geheel te verwerken, te onderzoeken en te invriezen terwijl het nog in een hydrogeldruppel zit.
Het biocompatibele apparaat is bestand tegen temperaturen tussen 60 °C en -160 °C, wat het mogelijk maakt om de organoïden/steroïden in een tank met vloeibare stikstof bij -160 °C te herstellen of om harsblokken voor te bereiden voor elektronenmicroscopie bij 60 °C. De niche in het apparaat is ontworpen om een beperkte ruimte voor 3D-groeistructuren te definiëren en de vorming van sferoïden of organoïden te stimuleren op basis van de vorige studies 18,19,20,21,22,23. Dat deel van het apparaat is transparant en bevat een specifieke kunststof die een hoge optische kwaliteit biedt (brekingsindex: 1,43; abbewaarde: 58; dikte: 7,8 mil [0,0078 in of 198 μm]). Zowel de nis als het omringende 'zijdeel' veroorzaken autofluorescentie. De transparante nis in het midden heeft een 80 mm2-oppervlak, terwijl het zijgedeelte 600 mm2 is. De diepte van de container is 15 mm en de dikte is 1,5 mm. Deze kenmerken, naast de grootte en het ontwerp van het apparaat, maken het mogelijk om waarnemingen te doen onder verschillende soorten hightech microscoop en de monsters voor te bereiden op elektronenmicroscopisch onderzoek (figuur 2). Het sluitsysteem van het apparaat biedt twee posities, een verzegeld in de vriezer en de andere waardoor gasstroom in de incubator mogelijk is. CCK8-proliferatie- en cytotoxiciteitstests tonen vergelijkbare effecten op cellen in vergelijking met de traditionele celkweekschalen (aanvullende figuur 2). Trypan blue exclusion test toont een hoge levensvatbaarheid van cellen (94%) tijdens de celkweek in de MD (figuur 3).
De processen die kunnen worden uitgevoerd voor één monster in het enkele apparaat omvatten (1) kweken, (2) histologische kleuring, (3) immunostaining, inclusief immunohistochemische en immunofluorescentielabeling, (4) invriezen, (5) ontdooien, (6) onderzoeken onder optische microscopen, zoals brightfield,darkfield, fluorescentie, confocale en superresolutie microscopen, (7) coating en onderzoek rechtstreeks onder een scanning elektronenmicroscoop, of (8) voorbereiding op transmissie-elektronenmicroscopie ( Figuur 2).
Er bestaan verschillende methodologieën voor histologische kleuring, immunohistochemische etikettering of fluorescerend labelen van organoïden en sferoïden 10,11,12,13,14,24,25. Het oogsten van hen uit de hydrogel is de eerste en belangrijkste stap van de huidige technologie. Na deze stap maken sommige methoden immuno-labeling met hele mount mogelijk. De geoogste organoïden zijn ingebed in paraffine, gesegmenteerd en gelabeld voor kleuring en immunostaining in anderen. Het is echter mogelijk dat de secties niet het volledige monster presenteren en slechts beperkte gegevens bevatten met betrekking tot de 3D-architectuur van de structuur. Bovendien zijn schade aan deze 3D-structuren en verlies van antigeniciteit bekende bijwerkingen van deze technologieën.
De aanvullende nieuwe protocollen voor microscopisch onderzoek in dit artikel maken een analyse mogelijk van monsters van de hele montering die nog in een hydrogel zitten. De hier beschreven protocollen omvatten twee nieuw ontwikkelde formuleringen: oplossing voor immunohistochemie (S-IHC) en oplossing voor immunofluorescentie-etikettering (S-IF). De methoden met deze oplossingen stellen onderzoekers in staat om nauwkeurigere gegevens te verkrijgen, omdat er geen schadelijke effecten zijn van traditionele workflows, zoals centrifuging, pipetteren en overbrengen van de delicate structuren. Het hier beschreven protocol elimineert ook de noodzaak voor het oogsten, blokkeren, opruimen en ophalen van antigeen en verkort de hele procedure tot 6-8 uur. Bovendien maakt de methodologie het mogelijk om tegelijkertijd één tot drie antilichamen toe te voegen aan dezelfde S-IF. Daarom is het mogelijk om de resultaten op dezelfde dag te krijgen, zelfs na de meerdere etiketteringsexperimenten, wat een ander voordeel is van het hier beschreven protocol; traditionele immunofluorescentie-etiketteringsprotocollen met hele mount duren meestal tussen de 3 dagen en enkele weken 10,11,12,13,14.
Paraffine-inbedding, een andere schadelijke stap die de antigeniciteit vermindert, wordt ook weggelaten. De 3D-structuur blijft in zijn in vitro omgeving van het begin tot het einde van het microscopisch onderzoek. Omdat de 3D-structuur in zijn groeiomstandigheden blijft, bootsen de eiwitexpressie- en lokalisatiegegevens in vivo omstandigheden beter na. Er worden nauwkeurigere resultaten verwacht, omdat de methodologie de stappen elimineert die de antigeenexpressie van het monster beïnvloeden. Tabel 1 en tabel 2 laten zien hoe deze nieuwe protocollen stappen elimineren, tijd en arbeid in het laboratorium besparen en kosten en afvalproducten verlagen in vergelijking met traditionele workflows.
Naast de cruciale stappen die hierboven zijn beschreven, is een ander probleem het bieden van een cryopreservatiemedium en een methode om de 3D-structuur van het monster te behouden met hogere levensvatbaarheidssnelhedenvan cellen 26,27,28,29,30,31. Cryopreservatie is essentieel voor het creëren van een stabiel modelsysteem en het mogelijk maken van de biobanking van organoïden en sferoïden32,33. Biobanking van de hele originele 3D-structuur zal een meer getrouwe recapitulatie van de natuurlijke gezondheidstoestand of ziekte mogelijk maken. De belangrijkste overwegingen zijn het gemak en de betrouwbaarheid van cryopreservatie en het ontdooien van organoïden / sferoïden. Post-dooi organoïde herstel is zeer laag in de meeste huidige technologieën, vaak minder dan 50%. Recente studies hebben echter veelbelovende resultaten laten zien met verbeterde overlevingskansenvan 26,27,28,29. Lee et al. toonden aan dat 78% van de sferoïde cellen overleefde na cryopreservatie toen ze de oplossing van de Universiteit van Wisconsin gebruikten die 15% DMSO28 bevatte. De celoverlevingsratio steeg tot 83% in de studie van Arai et al.29. De resultaten na cryopreservatie worden echter aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. Bovendien zijn serumvrije reagentia vereist voor goede productiepraktijken in farmaceutische en diagnostische omgevingen. Traditionele workflows gebruiken een medium met foetaal runderserum (FBS) en dimethylsulfoxide (DMSO) voor de langzaam invriezende methode, die beide geassocieerd zijn met handicaps. FBS is een dierlijk product en kan batchvariaties hebben. DMSO is een zeer succesvol cryoprotectant, maar langdurige blootstelling, vooral tijdens het ontdooien, kan cytotoxische effecten veroorzaken30,31.
Dit artikel beschrijft ook de bevriezings-/ontdooimethode van hele organoïden of sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten. In het onderzoek worden twee formules voor het invriezen van organoïden en sferoïden gebruikt: (1) 10% DMSO met traditionele vriesoplossing (FS) en (2) een serum- en DMSO-vrij cryopreservatiemedium. Dit cryopreservatiemedium bevat extracellulaire matrixcomponenten, die verschillen van de huidige formules. De extracellulaire matrix bestaat uit twee hoofdklassen van macromoleculen, proteoglycanen en vezelige eiwitten, die essentieel zijn voor fysieke steigers voor de cellulaire bestanddelen, maar ook processen initiëren die nodig zijn voor weefselmorfogenese, differentiatie en homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Collageen biedt treksterkte, reguleert de celadhesie, ondersteunt chemotaxis en migratie en directe weefselontwikkeling37. Bovendien bieden elastinevezels terugslag naar weefsels die herhaalde rek ondergaan38. Een derde vezelig eiwit, fibronectine, stuurt de organisatie van de interstitiële extracellulaire matrix en heeft een cruciale rol bij het bemiddelen van celaanhechting en functioneert als een extracellulaire mechano-regulator39. Du et al. hebben het cryoprotectieve effect van kippencollageenhydrolysaat op het natuurlijke actomyosinemodelsysteem41 aangetoond. Hun resultaten suggereren dat collageenhydrolysaat de groei van ijskristallen kan remmen, eiwitbevriezing en oxidatie kan verminderen, vergelijkbaar met commerciële cryoprotectanten, en een betere gelstructuur kan bieden na vries-dooicycli. Daarom biedt het toevoegen van extracellulaire matrixcomponenten aan de cryopreservatiemedia een veiligere en beschermende omgeving voor het monster en ondersteunt het de levende structuren om te genezen na bevriezing-ontdooien.
Bovendien beschrijft de huidige studie een eenvoudig protocol om cytoplasmatische membranen en kernen van levende organoïden en sferoïden te labelen terwijl ze zich nog in de hydrogel bevinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kweken van organoïden en sferoïden
- Leg de hydrogel een nacht op ijs (in een koelkast of een koude ruimte) om te ontdooien.
- Plaats het in de handel verkrijgbare multifunctionele apparaat (MD; zie materiaaltabel) 1 dag voor het experiment (37 °C, 5% CO2) in de incubator om op te warmen.
- Plaats steriele pipetpunten met brede uiteinden in de koelkast bij 4 °C.
OPMERKING: Stappen 1.1-1.3 moeten worden uitgevoerd op dag 0 en stappen 1.4-1.11 moeten worden uitgevoerd op dag 1. - Plaats de hydrogel op ijs in een laminaire stromingskap gedurende 15 minuten.
- Optioneel: Verdun de hydrogel in koud celkweekmedium volgens de aanbeveling van de fabrikant.
- Plaats de buis met een pellet hepG2-cellen (commercieel verkregen hepatocellulair carcinoom cellijn; zie materiaaltabel) op ijs.
- Plaat 30-35 μL van 100% hydrogel in de nis van het voorverwarmde apparaat om een geldruppel te creëren.
- Plaats 10.000 HepG2-cellen in het midden van de bovenkant van elke hydrogeldruppel (figuur 2) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Bedek de hydrogeldruppel met 200 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% Foetaal Runderserum.
- Bedek het deksel van de MD in de juiste positie om gasstroom mogelijk te maken en plaats het apparaat in de incubator.
- Voed de cellen om de dag met 200 μL DMEM met 10% FBS.
- Controleer de groei van de sferoïden onder een omgekeerde microscoop (figuur 3). De vorming van sferoïden begint na de3e dag. Video 1 toont de locatie van sferoïden op verschillende niveaus in een hydrogelkoepel.
OPMERKINGEN: Het wordt sterk aanbevolen om de vloeistof rond de hydrogel voorzichtig op te zuigen en langzaam de nieuwe vloeistof aan het milieu toe te voegen om beschadiging van de hydrogeldruppels te voorkomen.
2. Hematoxyline en Eosine kleuring van whole-mount organoïden / sferoïden in een hydrogel
- Verwarm het fixeermiddel (4% paraformaldehyde; PFA), PBS en Hematoxyline (zie materiaaltabel) tot 37 °C.
- Adem het medium rond de hydrogeldruppel aan met een pipet, voeg 100-200 μL 4% PFA toe om te fixeren en incubeer gedurende 15-20 minuten bij 37 °C.
- Aspirateer de 4% PFA en voeg 200 μL PBS toe om 3x gedurende 5 minuten elk op 37 °C te wassen. Aspirateer vervolgens de PBS en incubeer met 200 μL Hematoxyline-oplossing gedurende 15-20 minuten bij 37 °C.
- Aspirateer de Hematoxyline en voeg 200 μL dH2O toe om 3x gedurende 10 minuten te wassen bij 37 °C. Giet de dH2O aan en incubeer met 200 μL ethanol gedurende 5-10 min bij 37 °C.
- Adem de ethanol op en incubeer met 200 μL eosine (zie materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C. Adem de Eosine aan en voeg 200 μL dH2O toe om gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) te wassen.
- Adem de dH2O aan en voeg 100 μL glycerol toe om de hydrogeldruppel als montagemedium te bedekken.
- Optioneel: Monteer de nis met een coverslip. Deze stap kan worden weggelaten om te voorkomen dat organoïden / sferoïden van aanzienlijke omvang worden samengeknepen.
- Sluit het deksel van MD stevig om uitdroging tot onderzoek te voorkomen. Het monster is stabiel voor onderzoek gedurende ten minste 6 maanden.
3. Immunohistochemie van organoïden/sferoïden in een hydrogel
- Verwarm de commercieel verkregen oplossing voor immunohistochemie (S-IHC; zie materiaaltabel) tot 37 °C.
- Incubeer de organoïden of sferoïden in de hydrogel met 3% waterstofperoxide (H2O2) in 200 μL dH2O gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Giet de waterstofperoxideoplossing aan en was in dH2O gedurende 5 minuten bij 37 °C. Aspirateer de dH2O en incubeer tweemaal met 100 μL S-IHC bij 37 °C gedurende elk 10 minuten.
- Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL primair antilichaam (zie materiaaltabel) verdund in S-IHC gedurende 1-2 uur bij 37 °C (volgens de aanbevelingen van de fabrikant met betrekking tot werkverdunning).
- Aspirateer de primaire antilichaamoplossing en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C.
- Aspirateer 100 μL S-IHC en incubeer met een gebiotinyleerd secundair antilichaam (zie Materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C.
- Aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C. Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL mierikswortelperoxidase (HRP) met het label streptavidin (zie Materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C.
- Aspirateer de HRP gelabelde streptavidin en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C.
- Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL DAB/AEC chromogeenoplossingsmengsel (zie materiaaltabel) gedurende 5-10 minuten bij 37 °C.
- Controleer de intensiteit van de kleuring onder een lichtmicroscoop.
- Wassen met dH2O 3x gedurende 2 min elk.
- Optioneel: Incubeer met 100 μL hematoxyline (zie materiaaltabel) voor nucleaire tegenstaining gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Aspirateer de Hematoxyline en was in dH2O gedurende 5 min.
- Adem de dH2O op en bedek de hydrogeldruppel met 100 μL glycerol als montagemedium.
- Sluit het deksel van de MD stevig tot microscopisch onderzoek.
OPMERKINGEN: Antigeen ophalen en eiwit blokkerende stappen zijn weggelaten in dit protocol, omdat S-IHC deze stappen elimineert.
4. Immunofluorescentie-etikettering van organoïden/sferoïden in een hydrogel
- Warm de volgende materialen op tot 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, primaire antilichaamoplossing in S-IF, secundaire antilichaamoplossing in S-IF, nucleaire vlek en glycerol (zie materiaaltabel).
- Aspirateer het celkweekmedium en fixeer met 200 μL 4% PFA gedurende 15-30 min bij 37 °C. Giet het fixeermiddel aan en was het in S-IF 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C.
- Voeg dH2O toe aan de zijkant rond de nis om vochtigheid te bieden tijdens de volgende stappen.
- Aspirateer de S-IF rond de hydrogeldruppel en incubeer de hydrogeldruppel met 100 μL primaire antilichaamoplossing (zie Materiaaltabel) in S-IF gedurende 30-60 min bij 37 °C.
- Aspirateer de primaire antilichaamoplossing en was in S-IF 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C.
- Aspirateer de S-IF en incubeer met 100 μL secundaire antilichaamoplossing (zie materiaaltabel) in S-IF gedurende 30-60 min bij 37 °C in het donker.
- Aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en was met PBS 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C in het donker.
- Aspirateer de PBS en incubeer met 100 μL kern-DNA-vlek die in het donker een bevestigingsmedium of glycerol bij 37 °C bevat.
- Vul de nis met glycerol om uitdroging te voorkomen.
- Optioneel: Bedek de nis met een coverslip. Deze stap kan worden weggelaten om te voorkomen dat de organoïden / sferoïden worden samengeknepen.
- Sluit de MD goed af. Monsters in MD's kunnen gedurende ten minste 6 maanden bij 4 °C in het donker worden bewaard met minimaal verlies van fluorescentie.
- Gebruik de volgende instellingen voor confocaal microscopisch onderzoek: stel de pinhole-waarde van alle kanalen in op 20,1, houd de gain master constant op 550 voor 488 nm, 485 voor 550 nm en 450 voor 594 nm, houd het laservermogen constant voor alle experimenten en het laagste percentage op 2,0.
OPMERKINGEN: Primaire antilichamen: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumine (1:50), Anti-Beta-galactosidase (1:25), Antimitochondrial antibody (1:100), Anti-Golgi Antibody (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6 antilichaam (1:100). Secundaire antilichamen: Goat anti-Rabbit IgG (H+L)- 488, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-550, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-488, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-550, Goat anti-Chicken IgY(H+L)-647. De verdunning voor alle secundaire antilichamen is 1:100. Daarnaast wordt ook FITC-Phalloidin (1:100), een geconjugeerd antilichaam, gebruikt (zie Materiaaltabel).
5. Plasmamembraan en kernetikettering van levende organoïden en sferoïden in een hydrogel
- Bereid etiketteringsoplossing met Alexa fluor tarwekiem agglutinine (5,0 μg / ml) en Hoechst (2 μM) in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), volgens de aanbevelingen van de fabrikant (zie Tabel met materialen), en warm op tot 37 °C.
- Aspirateer het celkweekmedium en voeg 100 μL etiketteeroplossing toe om de hydrogeldruppel te bedekken. Incubeer gedurende 15-30 min bij 37 °C.
- Verwijder de etiketteeroplossing en was tweemaal in PBS 2x gedurende 10 minuten elk op 37 °C. Optioneel: Fixeer met 200 μL 4% formaldehyde gedurende 15 min bij 37 °C.
- Bedek de hydrogeldruppel met glycerol als bevestigingsmedium. Optioneel: Monteer de nis met een afdekglas.
- Sluit het deksel van de MD goed en bewaar het gekoeld in het donker tot fluorescentie / confocaal microscopisch onderzoek. Het is stabiel voor ten minste 6 maanden.
6. Invriezen en ontdooien van organoïden/sferoïden in een hydrogel
- Vries de organoïden in volgens de onderstaande stappen.
- Warm de in de handel verkregen vriesoplossing (FS; zie materiaaltabel) op tot 37 °C.
- Adem de celkweekmedia rond de hydrogelkoepel voorzichtig aan.
- Voeg voorzichtig 200 μL FS toe. Incubeer het monster met FS bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Sluit het deksel van het apparaat goed en plaats het in een schuimdoos. Plaats deze schuimdoos in een andere schuimdoos, zoals weergegeven in aanvullende figuur 3. Sluit beide schuimdozen goed af. Twee schuimdozen in elkaar zorgen voor een temperatuurkoelingsgradiëntbereik van 1 tot 2° C/min van het monster in een vriezer van -20 °C.
- Plaats de doos gedurende 2 uur op -20 °C. Breng de doos over in een vriezer van -80 °C en laat hem een nacht staan.
- Haal het monster uit de dozen. Het monster in de MD kan gedurende 6 maanden in de vriezer van -80 °C worden bewaard.
- Breng de MD die het monster bevat over naar de tank met vloeibare stikstof voor opslag op langere termijn.
- Ontdooi de organoïden volgens de onderstaande stappen.
- Haal het MD met het monster uit de vriezer/stikstoftank en plaats het direct in een incubator bij 37 °C. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Voeg 200 μL warm kweekmedium toe aan de nis (de verhouding tussen FS en celkweekmedium is 1:1) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Voeg meer warm kweekmedium toe aan de niche (de verhouding tussen FS en celkweekmedium is 1:2) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Aspirateer het medium en FS mengsel voorzichtig. Ga verder met scanning elektronenmicroscopie (stap 7) en transmissie-elektronenmicroscopie (stap 8) beeldvorming van de organoïden/sferoïden in de hydrogel.
7. Scanning elektronenmicroscopie van organoïden/sferoïden met hele montering
- Warm Karnovsky's fixatieve en post-fixatieve oplossing (zie Tabel van Materialen) op tot kamertemperatuur (RT).
- Aspirateer het celkweekmedium rond de hydrogel in de MD. Plaats het monster in de MD op ijs in de laminaire stromingskap gedurende 15 minuten.
- Adem de vloeibare hydrogel rond de organoïden/sferoïden heel voorzichtig aan. Een beperkte hoeveelheid matrigel kan in de niche blijven om te voorkomen dat het monster wordt beschadigd en verloren.
- Fix met Karnovsky's fixatief (2% PFA, 2,5% glutaaraldehyde in 0,15 M cacodylaatbuffer en 2 mM CaCl2; zie Tabel van materialen) bij RT gedurende 1 uur.
- Giet het fixeermiddel voorzichtig aan en was met gedestilleerd water (dH2O) 3x gedurende 15 minuten per stuk.
- Adem de dH2O voorzichtig aan en fixeer met postfixatieve oplossing (1% waterig osmiumtetroxide [OsO4]; zie Materiaaltabel) bij RT gedurende 1 uur.
- Aspirateer het postfixatiemiddel voorzichtig en was met gedestilleerd water (dH2O) 3x gedurende 15 minuten elk.
- Droog uit in een gesorteerde reeks ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mengsel van ethanol/aceton (1:1; 1:2) en absolute aceton bij RT gedurende elk 15 minuten.
- Droog met een kritische puntdroger.
- Bekleed het monster in het apparaat met 6 nm goud/palladium met behulp van een sputtercoater (zie Materiaaltabel) gedurende 90 s.
- Observeer onder een scanning elektronenmicroscoop met een in-lens secundaire elektronendetector bij 2-3 kV in vacuümmodus (5 x 10-6 mA). Maak foto's met een werkafstand van 8,1-8,2 mm en met vergrotingen van 675x, 1050x en 1570x.
OPMERKINGEN: Alle stappen worden uitgevoerd in de MD. Gebruik 200-250 μL oplossing voor elke stap.
8. Transmissie-elektronenmicroscopie van organoïden/sferoïden in een hydrogel
- Warm Karnovsky's fixatief op tot 37 °C. Aspirateer het celkweekmedium rond de hydrogel in de MD.
- Bevestig het monster met Karnovsky's fixatief op RT gedurende 1 uur. Was met dH2O 3x gedurende 15 minuten per stuk.
- Post-fix met 2% waterig OsO4 en 2,5% kaliumferrocyanide bij RT gedurende 45 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.
- Incubeer in 0,5% Thiocarbohydrazide (TCH; zie Tabel van Materialen) bij RT gedurende 30 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.
- Incubeer in 2% waterige OsO4 op RT gedurende 30 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.
- Incubeer in 2% uranylacetaatoplossing (zie materiaaltabel) bij RT gedurende 1 uur.
OPMERKING: In deze stap kunnen sferoïden 's nachts bij 4 °C worden gehouden. - Incubeer in lood aspartaatoplossing (zie materiaaltabel) bij 60 °C gedurende 45 minuten. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.
- Droog uit in een gegradeerde reeks ethanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) en absolute aceton bij RT gedurende elk 15 minuten.
- Behandel met een mengsel van (1:1; 1:2) aceton/eponhars en zuivere eponhars (zie materiaaltabel) op RT gedurende elk 2 uur.
- Polymeriseer de hars bij 60 °C 's nachts (minimaal 16 uur). Verwijder na de polymerisatie het harsblok uit de MD, zoals weergegeven in aanvullende figuur 4.
- Bevestig het harsblok aan een groter blok met een harslijm. Snijd het blok bij en bereik de locatie van organoïden of sferoïden.
- Krijg halfdunne (1.000 nm) en ultradunne secties (60 nm) met behulp van een ultramicrotoom (zie Materiaaltabel).
- Plaats de ultradunne secties op 100 mesh koperen roosters en observeer onder een scanning elektronenmicroscoop met een STEM-detector bij een versnellende spanning van 30 kV. Leg beelden vast met een werkafstand van 44 mm en met vergrotingen van 2580x, 5020x en 6060x.
OPMERKINGEN: Gebruik 200-250 μL oplossing voor elke stap. Stappen 8.1-8.10 worden uitgevoerd in de MD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel vertegenwoordigt een multifunctioneel apparaat (MD) en vormt een aanvulling op methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering, coating en verwerking van volledige organoïden of sferoïden terwijl ze zich nog in een hydrogel bevinden in een enkele uniek ontworpen omgeving. De huidige studie is ontworpen om HepG2-leverkankersferoïden te bereiden in 35 hydrogeldruppels in 35 MD's. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud om nauwkeurigheid te garanderen. Bovendien werden longorganoïden in MD's immunofluorescent gelabeld als een voorbeeld om de resultaten van de huidige methodologieën voor organoïde studies aan te tonen.
Figuur 1 toont een nauwkeurige blik op het apparaat met een hydrogelkoepel. De grootte en vorm van de nis zijn ontworpen om een beschermende omgeving te bieden voor de hydrogel die de organoïden / sferoïden bevat en de reagentia op te slaan die tijdens verschillende processen worden gebruikt. Bovendien kan het zijgedeelte van het apparaat dat de nis omringt, worden gebruikt als de vochtigheidskamer tijdens immunostaining-experimenten. Het medium om het monster te voeden kan variëren tussen 100-200 μL, afhankelijk van de hoogte van de hydrogeldruppel. De huidige studie richt zich op de koepelgebaseerde methode, omdat veel hydrogels, commerciële extracellulaire matrixcomponenten en keldermembraanextracten de gebruiker in staat stellen druppels te bereiden. Het is echter ook mogelijk om de niche van de MD te vullen met de hydrogel en vervolgens de cellen erin te zaaien om organoïden / sferoïden te genereren. Die methode kan de voorkeur krijgen als de viscositeit van de matrix de bereiding van koepels niet mogelijk maakt of als het experiment grote hoeveelheden organoïden omvat. Het hydrogeltype en de hydrogel/medium-verhouding voor de bereiding van druppels kunnen variëren afhankelijk van het celtype, het experimentele ontwerp en het medium. Figuur 1 vertegenwoordigt ook het ontwerp van het apparaat dat het mogelijk maakt om de organoïden / sferoïden onder brightfield-, confocale en scanning-elektronenmicroscopen te onderzoeken, terwijl organoïden / sferoïden zich nog steeds in hun oorspronkelijke in vitro omgeving bevinden.
Figuur 2 laat zien hoe cellen in een hydrogel kunnen worden gezaaid en de ontwikkeling van sferoïden of organoïden kan worden onderzocht. Het ontwerp en de afmetingen van het multifunctionele apparaat zijn ook in die figuur gepresenteerd. Video 1 toont de locatie van 3D groeiende sferoïden in een hydrogel. Figuur 3 toont live beelden van groeiende sferoïden van dag 3 tot dag 21. De tijd voor de vorming van sferoïden en organoïden kan variëren afhankelijk van de aard van het monster. Sferoïden uit HepG2-cellen en HEK-cellen vormden zich bijvoorbeeld binnen 3 dagen, terwijl de vorming van lever- en galorganoïden 2 weken duurde tijdens de experimenten.
Hematoxyline en eosine-gekleurde sferoïden zijn te zien in figuur 4. De afbeelding vertegenwoordigt goed bewaard gebleven en homogeen gekleurde sferoïden met verschillende groottes en fusies van sferoïden. Levende cellen in het midden van de sferoïden zijn opmerkelijk. De afbeelding toont ook de delicate verbindingen tussen de cellen van verschillende sferoïden. Deze fragiele verbindingen konden niet worden gevisualiseerd na traditionele workflows, omdat het overbrengen, pipetteren of centrifugeren ze zou beschadigen. Figuur 5 toont immunostaining van sferoïden met het antilichaam dat specifiek is voor Arginase, een van de meest voorkomende markers voor de diagnose en prognose van hepatocellulair carcinoom42,43. De micrografieën onthullen gedifferentieerde en ongedifferentieerde leverkankercellen in dezelfde sferoïden. Deze figuur bevat afbeeldingen met en zonder tegenstinten met Hematoxyline. Onderzoekers kunnen ervoor kiezen om counterstaining met Hematoxylin weg te laten in gevallen waarin het moeilijk zou zijn om gelabelde gebieden in een 3D-structuur te onderscheiden.
Figuur 6 vertegenwoordigt een ander eenvoudig protocol voor visualisatie van levende organoïden / sferoïden in een hydrogel: levend celmembraan en kernkleuring. De methodologie maakt dezelfde labelingsdichtheid in de periferie en het centrum mogelijk, met volledige reagenspenetratie. Figuur 7, figuur 8 en figuur 9 tonen representatieve afbeeldingen van sferoïden gelabeld met respectievelijk één, twee of drie antilichamen. Eén tot drie primaire antilichamen worden tegelijkertijd verdund in S-IF. Evenzo worden één tot drie overeenkomende secundaire antilichamen die geschikt zijn voor het experiment gelijktijdig verdund in S-IF. Het immunolabelingprotocol stelt onderzoekers in staat om de 3D-structuren binnen 4-6 uur te markeren zonder ze te verliezen of te beschadigen. De achtergrond is transparant en de technologie die hier wordt gebruikt, vereist geen extra clearing, antigeen ophalen of blokkerende methoden / oplossingen. De methode stelt onderzoekers ook in staat om het monster in één stap te labelen met meerdere antilichamen. Met andere woorden, de gebruiker bereidt één oplossing met één tot drie primaire antilichamen en een andere oplossing die overeenkomt met één tot drie secundaire antilichamen. Het hier beschreven protocol elimineert sequentiële etiketteringsstappen met verschillende antilichamen in conventionele methodologieën.
Figuur 10 toont scanning en transmissie elektronenmicroscopische beelden van de sferoïden. De eerste rij toont foto's van hele sferoïden in de MD onder een scanning elektronenmicroscoop. De tweede rij bevat transmissie-elektronenmicroscopische afbeeldingen van sferoïden na bereiding van de harsblokken met hele sferoïden in de MD, evenals afbeeldingen van gesneden en gekleurde sferoïden. Goed bewaard gebleven cytoplasmatische organellen en andere ultrastructurele kenmerken van de cellen tonen de effectiviteit van dit eenvoudige protocol, dat de 3D-structuur van het hele monster beschermt. De MD stelt de onderzoekers ook in staat om de monsters van de hele mount in een hydrogel te bevriezen en te ontdooien. Figuur 11 demonstreert hydrogelkoepels en de sferoïden bij een hogere vergroting voor en na het bevriezen. De onregelmatigheid aan de grenzen van de hydrogelkoepel is opmerkelijk. De ronding van de gecryopreserveerde sferoïden is echter bijna stabiel na het ontdooien in vergelijking met de sferoïden vóór het invriezen. Live celmembraan- en kernetiketteringsmethoden worden ook 48 uur na het ontdooien toegepast om aan te tonen hoe de bevriezings- / ontdooiprocedure de 3D-architectuur, het celmembraan en de levensvatbaarheid van de cel beïnvloedde. De traditionele vriesoplossing met dimethylsulfoxide en de huidige nieuw geformuleerde oplossing, SF, laten vergelijkbare resultaten zien. Meer dan 75% van de 3D-structuren zou in dit protocol kunnen overleven. Er zijn echter verdere experimenten nodig om de bijwerkingen op lange termijn van elke formulering op organoïden en sferoïden te onthullen.
Tabel 1 en tabel 2 vergelijken de traditionele workflows met de hier beschreven workflows op basis van stapnummer, duur en afvalproductie (d.w.z. het totale aantal plastic handschoenen, pipetpunten, serologische pipetten, centrifugebuizen, microcentrifugebuizen, celkweekvaten, cryovialen, enz. voor elke workflow).
Aanvullende figuur 1 geeft opeenvolgende stappen weer die schematisch in één MD kunnen worden uitgevoerd. Aanvullende figuur 2 toont de resultaten van de experimenten die zijn ontworpen om de levensvatbaarheid, toxiciteit en proliferatiesnelheden van HepG2-cellen in een MD of een traditionele schotel met glazen bodem te vergelijken. Aanvullende figuur 3 toont de schuimdozen die zijn gebruikt voor het invriezen van de monsters in MD's. Aanvullende figuur 4 geeft een overzicht van de stappen om een harsblok uit een MD te halen. Aanvullende figuur 5 bevat afbeeldingen van luchtwegorganoïden die immunofluorescent werden gelabeld en vervolgens werden gevisualiseerd terwijl ze nog in MD's zaten. Evenzo toont Video 2 twee immunofluorescent gelabelde luchtwegorganoïden in een MD. Ten slotte is aanvullende figuur 6 een grafiek waarin de gemiddelde intensiteit van de intensiteit van de celmembraanetikettering in levende sferoïden voor en na bevriezing wordt vergeleken met behulp van de traditionele workflow en de hier beschreven workflow. Image J software is gebruikt voor analyse.
Figuur 1: Het multifunctionele celkweekapparaat (MD). (A) De nis (N), het centrale deel van het apparaat, is ontworpen om een beschermende omgeving te creëren voor de organoïden / sferoïden die tijdens opeenvolgende processen in een hydrogeldruppel (D) worden gekweekt. De zijkant (S), het omringende deel van de nis, kan worden gebruikt als een luchtbevochtigerkamer tijdens immunostaining-experimenten. (B) Het transparante midden in het deksel stelt de gebruiker in staat om de organoïden / sferoïden te observeren wanneer het apparaat gesloten is. (C) De hydrogelkoepel met organoïden in de MD kan worden gekleurd of ingebed in een harsblok voor transmissie-elektronenmicroscopie. Het deksel bevat ook de nis (N) voor het ophangen van druppels. De grootte en het ontwerp van het apparaat stellen de gebruiker in staat om de organoïden / sferoïden te onderzoeken onder (D) brightfield, (E) confocale en (F) scanning elektronenmicroscopen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Cellen zaaien in een hydrogel. (A) De celpellet in de pipet wordt in de bovenkant van de koepel gestoken. Na 3-5 dagen worden sferoïden zichtbaar in de koepel, vooral aan de rand van de druppel. (B) Vier live beelden van groeiende sferoïden uit elk kwartaal in een koepel werden vastgelegd en samengevoegd. Schaalbalk = 200 μm. (C)Het ontwerp en de afmetingen (in centimeters) van het multipurpose device (MD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het ontwikkelen van sferoïden in een hydrogeldruppel van dag 3 tot dag 21. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Hematoxyline en Eosine-gekleurde sferoïden met hele vaten in de MD. Visualisatie van de verbindingen tussen de cellen in de aangrenzende of fuserende sferoïden. De delicate processen tussen de cellen (pijlen) zijn zichtbaar omdat het monster in de hydrogel wordt gefixeerd, gekleurd en onderzocht zonder de 3D-groeistructuren te beschadigen. Schaalbalk: dag 3, dag 9 = 50 μm; dag 7, dag 17 = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Immunohistochemische kleuring van sferoïden in de hydrogel in de MD. De monsters waren immunostained met een antilichaam specifiek voor Arginase. Arginase positieve (rode pijlen) en negatieve (zwarte pijlen) cellen worden gezien in de sferoïden. Beelden zijn afkomstig uit twee experimenten: (A-C) zonder en (D-F) met counterstaining met Hematoxyline. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Confocale afbeelding van een levende organoïde in de hydrogel. De levende organoïden werden gelabeld met het levende celmembraan (WGA) en kernvlekken (Hoechst). Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Immunofluorescentie labeling van whole-mount sferoïden in een hydrogel met één antilichaam en een kernvlek (Hoechst). (A-C) Het bovenste paneel toont een sferoïde gelabeld met een antilichaam dat specifiek is voor Na-K ATPase in het celmembraan. (D-F) Het onderste paneel toont de locatie van een ander antilichaam dat specifiek is voor Arginase, een cytosolisch eiwit dat specifiek is voor hepatocellulair carcinoom, in sferoïden voor leverkanker. Duur van het kleuringsprotocol: 6 uur. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Immunofluorescentie-etikettering van sferoïden met hele mount in een hydrogel met twee antilichamen en een kernvlek (Hoechst). (A-C) Het bovenste paneel toont een sferoïde gelabeld met twee antilichamen die specifiek zijn voor albumine en Ov6. Schaalbalk = 5 μm. (D-F) Het onderste paneel toont de locatie van alfa-feto-eiwit en Ov6 in sferoïden voor leverkanker. Schaalbalk = 20 μm. Duur van het kleuringsprotocol: 6 uur. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.
Figuur 9: Immunofluorescentie labeling van whole-mount sferoïden in een hydrogel met drie antilichamen en een kernvlek (Hoechst). (A-E) De sferoïde in het bovenste paneel is gelabeld met antilichamen die specifiek zijn voor Arginase, Na-K ATPase en beta-galactosidase. Schaalbalk = 10 μm. (F-J) Het middelste paneel toont een sferoïde gelabeld met Ov6, bèta-galactosidase en alfa-feto-eiwit. Schaalbalk = 20 μm. (K-O) De sferoïde in het onderste paneel is gelabeld met FITC-falloïdine, anti-mitochondriaal antilichaam en anti-Golgi-antilichaam. Schaalbalk = 20 μm. Let op de hoge labelspecificiteit en verminderde achtergrond. Duur van het kleuringsprotocol: 6 uur. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.
Figuur 10: Elektronenmicroscopiebeelden. (A-C) Scanning elektronenmicroscopische beelden van volledige sferoïden in de hydrogel in de MD. Schaalbalk = 10 μm. (D-F) Ultrastructurele kenmerken van de cellen in een sferoïde zijn ook gevisualiseerd onder een transmissie-elektronenmicroscoop. Schaalstaven: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 11: Live beelden van sferoïden voor en na het invriezen. (A-F) De onregelmatigheid van de randen van de hydrogelkoepels is duidelijk na bevriezing. De grootte en rondheid van sferoïden blijven echter vergelijkbaar. (F) Celmigratie op het kweekoppervlak is te zien na het ontdooien. (G-L) Het levende celmembraan (WGA) en kernkleuring (Hoechst) vertonen een vergelijkbare levensvatbaarheid van de cel en intacte celmembranen voor en na het bevriezen van de volledige sferoïden in een hydrogel in de MD. Schaal basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Traditionele workflow | Workflow met multifunctioneel apparaat (MD) | |
| Stappen | 22 | 6 |
| Tijd | 9 dagen | 4 dagen |
| Afvalproducten | 26 | 9 |
Tabel 1: Vergelijking van stapnummer, tijd en afvalproductie tussen de traditionele en nieuwe workflows tijdens een kortlopend experiment.
| Traditionele workflow | Workflow met oplossing voor immunofluorescentie (S-IF) | |
| Stappen | 25 | 7 |
| Tijd | 120 u | 6-8 uur |
| Afvalproducten | 28 | 10 |
Tabel 2: Vergelijking van de conventionele immunolabeling en het nieuwe immunolabeling protocol.
Video 1: Tijdreeksen van beelden op verschillende niveaus van een hydrogel met sferoïden onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: 3D-structuur van twee luchtwegorganoïden gelabeld met antilichamen voor Cytokeratine 5 en DAPI. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Overzicht van het experiment. Dit schema toont de sequentiële experimentele stappen voor het kweken en onderzoeken van organoïden in een hydrogel. De hier beschreven technologie maakt het mogelijk om de organoïden onder verschillende microscopen te laten groeien, bevriezen, ontdooien, labelen en onderzoeken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Vergelijking van de levensvatbaarheid, toxiciteit en proliferatiesnelheden van HepG2-cellen in een traditionele schotel met glazen bodem of een MD. HepG2-cellen werden gekweekt op (A) een traditionele celkweekschaal met glazen bodem of (B) in een MD om de levensvatbaarheid en toxiciteit van cellen te vergelijken. (C) Trypan blue exclusion test werd gebruikt om de levensvatbaarheid aan te tonen. Schaalbalk = 20 μm. De resultaten werden vergeleken met behulp van (D-E) CCK8 cytotoxiciteit en (F) celproliferatie assays. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Opstelling van de twee schuimdozen. De ene schuimdoos wordt in de andere geplaatst tijdens het langzame vriesproces van de gehele organoïden of sferoïden in de MD. *geeft de twee vakken aan. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Stappen die aantonen hoe het harsblok uit de MD moet worden verwijderd na polymerisatie van de hars. (A) Het harsblok rond de sferoïden of organoïden wordt in de MD-niche bereid en vervolgens gepolymeriseerd. (B-D) Vervolgens wordt met een geschikte dunne staaf het harsblok geduwd om het uit de nis te verwijderen. (E) Vervolgens wordt het harsblok, met het plastic eronder, verwijderd. (F-G) Ten slotte wordt een pincet gebruikt om ze te scheiden als het blok nog aan het plastic is bevestigd. (H) Het blok is klaar voor dunne secties. De organoïden of sferoïden in het harsblok (*) zijn klaar voor sectie voor transmissie-elektronenmicroscopie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 5: Luchtwegorganoïden die immunofluorescent gelabeld waren en vervolgens gevisualiseerd terwijl ze nog in MD's zaten. (A-C) Het bovenste paneel toont cirkelvormige luchtwegorganoïden met een centraal lumen. Groen vertegenwoordigt luchtwegvoorlopercellen die Cytokeratine 5 tot expressie brengen in de buitenste ring van de organoïde en blauw vertegenwoordigt de kernen. Schaalbalk = 50 μm. (D-F) Het onderste paneel toont de driedimensionale afbeelding van de twee naast elkaar staande organoïden in de filters (D) DAPI en (E) Alexa 488, evenals de (F) samengevoegde afbeelding. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 6: Vergelijking van de labelingdichtheid op de levende celmembranen van de cellen. De grafiek vergelijkt de sferoïden voor en na het bevriezen met behulp van de traditionele en momenteel aangenomen workflow. De analyse werd uitgevoerd met behulp van de Image J-beeldanalysesoftware. Afkortingen: IntDen = Integrated Density (fluorescentie-intensiteit in de geselecteerde sferoïden). CTCF = Gecorrigeerde totale celfluorescentie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De MD, als aanvulling op formuleringen en protocollen die hier worden beschreven, vergemakkelijkt snelle en spontane 3D-groei van organoïden en sferoïden in een meer gecontroleerde omgeving en zet het experiment voort in dezelfde omstandigheden. Het monster blijft gedurende het hele proces in dezelfde omgeving en bijna 100% van de 3D-groeiarchitecturen blijven intact in de container. Dit verbetert de homogeniteit tijdens de sequentiële experimenten en maakt een langere kweekperiode mogelijk. Bovendien is het aantal stappen tijdens organoïden- en sferoïdenverwerking drastisch verminderd in vergelijking met traditionele workflows (figuur 4), wat op zijn beurt de verwerkingstijd en menselijke fouten minimaliseert en het besmettingsrisico vermindert. Bovendien verbetert dit de betrouwbaarheid en validiteit, omdat de experimentele omstandigheden stabiel blijven en tegelijkertijd de 3D-teeltstructuren in één omgeving beschermen. Het helpt tijd en arbeid in het laboratorium te besparen en tegelijkertijd de nauwkeurigheid, betrouwbaarheid en validiteit te verbeteren. Bovendien maakt het het volgen van individuele 3D-groeistructuren mogelijk tijdens het hele sequentiële proces. Onderzoek van de grootte- en positieveranderingen tijdens de kweek en hun reactie op verschillende verbindingen is mogelijk in het apparaat. Dit biedt een uitstekend in vitro experimenteel model voor recapitulatie van de ontwikkeling van het menselijk lichaam en ziekten. Onderzoekers kunnen de stadia onderzoeken tijdens de fusie van sferoïden en organoïden, een essentieel mechanisme voor migratie bij ziekten en normale ontwikkeling 44,45,46,47. Recente studies gericht op de modellering van fusie in het laboratorium geven de voorkeur aan organoïde en sferoïde modellen 44,45,46,47.
Met dit apparaat kunnen onderzoekers ook het onderzoek in een dringende situatie stoppen door ze in hun huidige staat te bevriezen en vervolgens zonder verlies door te gaan wanneer de omstandigheden nieuwe experimenten toelaten. Vanwege de COVID-pandemie moesten onderzoekers bijvoorbeeld onmiddellijk stoppen met experimenten, waardoor hun kostbare materialen en gegevens verloren gingen. Er is momenteel geen oplossing om een experiment veilig te stellen als er een plotselinge onderbreking van de studies is als gevolg van een verandering van omstandigheden.
Beperkingen van de techniek
De hier beschreven technieken zijn ontwikkeld om de spontane ontwikkeling van organoïden en sferoïden te onderzoeken, een model om de evolutie van het normale menselijk lichaam en ziekten te begrijpen. Daarom kunnen het huidige apparaat en de huidige methodologieën niet worden gebruikt voor het ontwikkelen van sferoïden of organoïden van uniforme grootte die de voorkeur hebben gekregen voor screeningstests voor geneesmiddelen. Een andere beperking houdt verband met de grootte van de sferoïden en organoïden. Volledige organoïden en sferoïden kunnen zeer dicht zijn, met verschillende cellagen die reagentia nodig hebben die de monsters bewaren of labelen om hun kern te penetreren. De incubatietijden voor alle protocollen, inclusief kleuring, etikettering en bevriezing, variëren echter afhankelijk van de grootte van het monster en de micro-omgevingsgel rond het monster. Grotere organoïden en stijvere gels vereisen bijvoorbeeld langere incubatieperioden om penetratie in het midden van het monster mogelijk te maken.
Toekomstige toepassingen
Het apparaat en deze methodologieën maken langdurig onderzoek van 3D-groeiende organoïden en sferoïden mogelijk om organogenese, weefselmorfogenese en ziekten te begrijpen en tegelijkertijd de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en nauwkeurigheid te verbeteren. De organoïden of sferoïden die in MD's zijn gelabeld, kunnen worden onderzocht met behulp van hightech microscopietechnologieën, waaronder multifotonenlaserscanning en lichtbladfluorescentiemicroscopie. Bovendien kunnen onderzoekers hetzelfde monster in één enkel apparaat onderzoeken onder zowel een confocale als een scanning elektronenmicroscoop om een correlatieve studie te maken, CLEM (Correlative light electron microscopy). Het apparaat en de methodologieën kunnen ook worden gebruikt voor het biobanken van organoïden en sferoïden terwijl 3D-architecturen worden beschermd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ranan Gulhan Aktas is eigenaar van MD, S-IHC, S-IF en FS patentaanvragen. Olgu Enis Tok was betrokken bij de ontwikkeling van deze producten. Olgu Enis Tok en Gamze Demirel zijn R&D-teamleden van het bedrijf genaamd Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut en Ozgecan Kayalar hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
We zijn Dale Mertes van de Universiteit van Chicago dankbaar voor het opstellen van diagrammen, dr. Mehmet Serif Aydin voor zijn technische ondersteuning aan het Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, en dr. Rana Kazemi van de Maltepe University voor het redigeren van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Merck | 8187602500 | Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT |
| Acetone | Merck | 8222512500 | Store at RT |
| Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst in Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C |
| Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody | Biocare Medical | CP 028 A | Store at +4 °C |
| Anti-albumin antibody | Abcam | EPR20195 | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal | Abcam | 134435 | Store at +4 °C, Dilution: 1:25 |
| Anti-cytokeratin 5 | Abcam | 53121 | Store at +4 °C, Dilution: 1:100 |
| Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody | Biocare Medical | ACI 3058 A, B | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT |
| Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Nest | 601051 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Nest | 602052 | |
| Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
| Copper Grids | Electron Microscopy Sciences | G100-Cu | Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh |
| Critical Point Dryer | Leica | EM CPD300 | For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone |
| DAB/AEC chromogen solution mixture | Sigma Aldrich | AEC101 | Store at +4 °C |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45°, 40-US | Use for ultra-thin sections for TEM |
| Dimethyl sulfoxide for molecular biology | Biofroxx | 67-68-5 | |
| Disposable Plastic Pasteur Pippettes | Nest | ||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | Store at +4 °C |
| Eosin Y Solution Alcoholic | Bright Slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Epon resin | Sigma | 45359-1EA-F | Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C |
| Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier | Pan Biotech | P30-3304 | Store at +4 °C |
| Freezing Solution (FS) | Cellorama | CellO-F | Store at +4 °C |
| Glass knife maker | Leica | EM KMR3 | For make glass knives in 8 mm thickness |
| Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) | Leica | 7890-08 | Use for ultra- or semi-thin sections for TEM |
| Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% | Electron Microscopy Sciences | 16210 | Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C |
| Glycerol solution | Sigma Aldrich | 56-81-5 | Store at -20 C, Dilution :1:100 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | Store at RT |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | Store at +4 °C |
| Hematoxylin Harris | Bright Slide | 2.BS01-104-1000 | |
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | Store in nitrogen tank |
| Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 | R&D Systems | MAB2020 | Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354248 | Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354234 | Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| Hydrogel | Biotechne, R&D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C |
| Karnovsky's fixative | %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples | ||
| L-Aspartic acid | Sigma | 11189-100G | Store at RT |
| Lead aspartate solution | Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh | ||
| Lead nitrate | Electron Microscopy Sciences | 17900 | Store at RT |
| Leica Confocal Microscope | Leica | DMi8 | |
| LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Microplate reader | Biotek Synergy | ||
| Multipurpose Device (MD) | Cellorama | CellO-M | |
| Nuclear-DNA stain | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C |
| Nuclear-DNA stain | ThermoFischer Scientific | 62248 | DAPI solution, Store at +4 °C |
| Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% | Electron Microscopy Sciences | 19190 | Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light |
| Ov6 antibody | R&D systems | MAB2020 | Store at +4 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% | Sigma | 1.04005.1000 | Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Store at +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| Post-fixative solution | %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh | ||
| Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26603-01 | Store at RT |
| Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS | Zeiss | Item no.: 491206-0001-000 | |
| Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL | Nest | 620611 | |
| Scanning Electron Microscopy with STEM attachment | Zeiss | GeminiSEM 500 | We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs. |
| SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | Store at +4 °C |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 | Electron Microscopy Sciences | 11655 | Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C |
| Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | Store at -20 °C |
| Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | Store at +4 °C |
| Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Store at +4 °C |
| Specimen trimming device | Leica | EM TRIM2 | For prepare epon sample block to ultramicrotome |
| Sputter coater | Leica | EM ACE200 | Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultra gel super glue | Pattex | PSG2C | For glue polymerized epon block with sample to holder epon block |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM) |
| Universal Pipette Tips, 10 µL | Nest | 171215-1101 | |
| Universal Pipette Tips, 1000 µL | Isolab | L-002 | |
| Universal Pipette Tips, 200 µL | Nest | 110919HA01 | |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT |
References
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
- Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
- Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
- Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
- Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
- Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
- Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
- Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
- Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
- Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
- Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
- Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
- Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
- De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
- Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
- Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
- Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
- Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
- Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
- Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
- Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
- Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
- Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).
