Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64563
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1, 3,5, 6, 2,3,4
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

Summary

Bu çalışma, çok amaçlı bir cihaz içindeki bir hidrojelde bozulmadan kalırken, tüm sferoidlerin ve organoidlerin çeşitli mikroskoplar altında kültürlenmesi, dondurulması, çözülmesi, işlenmesi, boyanması, etiketlenmesi ve incelenmesi için metodolojileri açıklamaktadır.

Abstract

Hücre kültürü laboratuvarlarında üç boyutlu büyüyen yapılar olan organoidler ve sferoidler, insan vücudunu daha iyi taklit ettikleri ve hayvan çalışmalarına göre avantajlara sahip oldukları için iki boyutlu kültür modellerine kıyasla daha üstün modeller olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar genellikle tekrarlanabilirlik ve tutarlılık ile ilgili sorunlarla karşı karşıyadır. Uzun deneysel süreçler sırasında - organoidlerin ve sferoidlerin farklı hücre kültürü damarları arasında transferi, pipetleme ve santrifüjleme ile - bu hassas ve kırılgan 3D büyüyen yapılar genellikle hasar görür veya kaybolur. Sonuçta, sonuçlar önemli ölçüde etkilenir, çünkü 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamaz. Burada açıklanan yöntemler, bu stresli adımları en aza indirir ve çok amaçlı bir cihazda hala bir hidrojel içindeyken, işleme dizisi boyunca organoidler ve sferoidler için güvenli ve tutarlı bir ortam sağlar. Araştırmacılar, tek bir çok amaçlı cihaz kullanarak organoidlerin veya sferoidlerin yapısını konfokalden elektron mikroskoplarına kadar çeşitli yüksek teknoloji ürünü aletler altında büyütebilir, dondurabilir, çözebilir, işleyebilir, lekeleyebilir, etiketleyebilir ve daha sonra inceleyebilirler. Bu teknoloji, çalışmaların tekrarlanabilirliğini, güvenilirliğini ve geçerliliğini geliştirirken, işleme sırasında 3D büyüyen yapılar için istikrarlı ve koruyucu bir ortam sağlar. Ek olarak, stresli adımları ortadan kaldırmak taşıma hatalarını en aza indirir, alınan süreyi azaltır ve kontaminasyon riskini azaltır.

Introduction

Hücre araştırması ve tedavisinin geleceği, 3D hücre kültürleri 1,2,3'te yatmaktadır. Organoid ve sferoid modeller, insan vücudu gelişimini, fizyolojisini ve hastalıklarını taklit eden daha iyi modeller oluşturarak in vitro deneyler ve hayvan modelleri arasındaki boşluğu kapatır 4,5,6,7,8,9. Bununla birlikte, bu modellerin tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği zorlu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, bu yapıların mevcut teknolojilerle taşınması, toplanması, aktarılması ve santrifüjlenmesi, organoidlerin ve sferoidlerin birçok koşulda kaybolmasına veya hasar görmesine neden olur ve sonuçları önemli ölçüde etkiler.

Histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme ve kriyoprezervasyon için birçok protokole rağmen, deneysel koşulların standartlaştırılması, bu hassas yapıların kaybedilmeden veya zarar görmeden ele alınması ve işlenmesi ile ilgili evrensel bir yaklaşım yoktur. Mevcut protokoller de inanılmaz derecede uzundur, birkaç günden birkaç haftaya kadar değişmektedir ve çeşitli reaktiflerle karmaşık prosedürler içermektedir10,11,12,13,14. Ek olarak, hücre kültürü damarları ve kriyovyaller arasında 3D büyüyen yapıların toplanması, pipetlenmesi, santrifüjlenmesi ve aktarılması, yapıların ve mekanik kuvvetlerin konumlandırılmasında değişikliklere neden olur ve sonuçta organoidlerin ve sferoidlerin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkiler. Doku topolojisinin, hücrelerin konumlandırılmasının ve mekanik kuvvetlerin hücre farklılaşmasını ve olgunlaşmasını önemli ölçüde etkilediği bildirilmiştir 6,15,16,17.

Bu nedenle, istikrarlı kalitede organoidler ve sferoidler üretmek için mevcut geleneksel teknolojilerin geliştirilmesi arzu edilir. Santrifüjleme ve yukarıda açıklanan diğer adımları atlayacak ve çoklu proseslerin başından sonuna kadar malzemeyi tek bir güvenli ortamda sağlayacak bir yöntem/cihaz, en tutarlı ve güvenilir verilere ulaşmak için faydalı olacaktır. Ek olarak, bu zaman, işçilik ve maliyet kısıtlamalarını azaltacaktır.

Burada açıklanan çok amaçlı cihaz (MD), organoidlerin ve sferoidlerin çoklu işlemleri için tek bir güvenli ortam sağlar (Ek Şekil 1). Bu cihaz ve tamamlayıcı protokoller hasat, pipetleme, aktarma ve santrifüj adımlarını ortadan kaldırır. Organoidler ve sferoidler, sıralı süreçler sırasında in vitro ortamlarında kalırlar. Bu ortam esas olarak ticari olarak temin edilebilen hidrojeller gibi doğal veya sentetik hücre dışı matris bileşenlerini içerir. Başka bir deyişle, burada açıklanan yöntemler, bir hidrojel damlası halindeyken bütün monte edilmiş bir organoid / sferoid örneğinin işlenmesine, incelenmesine ve dondurulmasına izin verir.

Biyouyumlu cihaz, 60 °C ile -160 °C arasındaki sıcaklıklara dayanıklıdır, bu da organoidlerin / steroidlerin -160 ° C'de bir sıvı azot tankına geri yüklenmesini veya 60 ° C'de elektron mikroskobu için reçine bloklarının hazırlanmasını mümkün kılar. Cihazdaki niş, 3D büyüyen yapılar için sınırlı bir alan tanımlamak ve önceki çalışmalara dayanarak sferoidlerin veya organoidlerin oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır 18,19,20,21,22,23. Cihazın bu kısmı şeffaftır ve yüksek optik kalite sağlayan belirli bir plastik içerir (kırılma indisi: 1.43; abbe değeri: 58; kalınlık: 7.8 mil [0.0078 in veya 198 μm]). Hem niş hem de çevresindeki 'yan' kısım otofloresana neden olur. Merkezdeki şeffaf niş 80 mm 2 alana sahipken, yan kısım 600 mm2'dir. Kabın derinliği 15 mm'dir ve kalınlığı 1,5 mm'dir. Bu özellikler, cihazın büyüklüğüne ve tasarımına ek olarak, farklı tipte yüksek teknolojili mikroskoplar altında gözlemler yapmayı ve numunelerin elektron mikroskobik incelemeleri için hazırlanmasını mümkün kılmaktadır (Şekil 2). Cihazın kapatma sistemi, biri dondurucuda kapatılmış, diğeri inkübatörde gaz akışına izin veren iki konum sağlar. CCK8 proliferasyonu ve sitotoksisite testleri, geleneksel hücre kültürü yemeklerine kıyasla hücreler üzerinde benzer etkiler göstermektedir (Ek Şekil 2). Tripan mavisi dışlama testi, MD'deki hücre kültürü sırasında yüksek hücre canlılığını (% 94) göstermektedir (Şekil 3).

Tek bir cihazda bir numune için gerçekleştirilebilecek işlemler arasında (1) kültürleme, (2) histolojik boyama, (3) immünohistokimyasal ve immünofloresan etiketleme dahil immünoboyama, (4) dondurma, (5) çözülme, (6) parlak alan, karanlık alan, floresan, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskoplar gibi optik mikroskoplar altında inceleme, (7) doğrudan taramalı elektron mikroskobu altında kaplama ve inceleme veya (8) iletim elektron mikroskobu için hazırlık ( Şekil 2).

Histolojik boyama, immünohistokimyasal etiketleme veya organoidleri ve sferoidleri floresan olarak etiketlemek için farklı metodolojiler mevcuttur 10,11,12,13,14,24,25. Onları hidrojelden toplamak, mevcut teknolojinin ilk ve ana adımıdır. Bu adımdan sonra, bazı yöntemler bütüne monte immüno-etiketlemeye izin verir. Hasat edilen organoidler parafine gömülür, bölümlere ayrılır ve diğerlerinde boyama ve immün boyama için etiketlenir. Ancak, bölümler tüm örneği sunmayabilir ve yapının 3B mimarisiyle ilgili yalnızca sınırlı veriler sağlayabilir. Ayrıca, bu 3D yapılara verilen hasar ve antijenite kaybı, bu teknolojilerin iyi bilinen yan etkileridir.

Bu makaledeki mikroskobik incelemeler için tamamlayıcı yeni protokoller, hala bir hidrojel içinde bulunan bütün montajlı numunelerin analizine izin vermektedir. Burada açıklanan protokoller yeni geliştirilen iki formülasyonu içermektedir: immünohistokimya çözeltisi (S-IHC) ve immünofloresan etiketleme için çözelti (S-IF). Bu çözümlere sahip yöntemler, araştırmacıların daha doğru veriler elde etmelerini sağlar, çünkü santrifüjleme, pipetleme ve hassas yapıların aktarılması gibi geleneksel iş akışlarının zararlı etkileri yoktur. Burada açıklanan protokol ayrıca hasat, blokaj, temizleme ve antijen alma adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve tüm prosedürü 6-8 saate kısaltır. Ayrıca, metodoloji aynı S-IF'ye aynı anda bir ila üç antikor eklenmesine izin verir. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün bir başka avantajı olan çoklu etiketleme deneylerinden sonra bile sonuçları aynı gün içinde elde etmek mümkündür; Geleneksel tam montajlı immünofloresan etiketleme protokolleri tipik olarak 3 gün ile birkaç hafta arasında sürer 10,11,12,13,14.

Antijeniteyi azaltan bir başka zararlı adım olan parafin gömme de ihmal edilir. 3D yapı, mikroskobik incelemenin başından sonuna kadar in vitro ortamında kalır. 3D yapı büyüme koşullarında kaldığından, protein ekspresyonu ve lokalizasyon verileri in vivo koşulları daha iyi taklit eder. Metodoloji, numunenin antijen ekspresyonunu etkileyen adımları ortadan kaldırdığı için daha doğru sonuçlar beklenmektedir. Tablo 1 ve Tablo 2, bu yeni protokollerin geleneksel iş akışlarına kıyasla adımları nasıl ortadan kaldırdığını, laboratuvarda zamandan ve iş gücünden nasıl tasarruf ettiğini ve maliyetleri ve atık ürünleri nasıl azalttığını göstermektedir.

Yukarıda açıklanan önemli adımlara ek olarak, başka bir sorun, numunenin 3D yapısını daha yüksek hücre canlılık oranları 26,27,28,29,30,31 ile korumak için bir kriyoprezervasyon ortamı ve yöntemi sağlamaktır. Kriyoprezervasyon, stabil bir model sistemi oluşturmak ve organoidlerin ve sferoidlerin biyobankacılığını sağlamak için gereklidir32,33. Biyobankacılığın tüm orijinal 3D yapısı, doğal sağlık veya hastalık durumunun daha sadık bir şekilde özetlenmesine izin verecektir. Kriyoprezervasyonun kolaylığı ve güvenilirliği ve organoidlerin/sferoidlerin çözülmesi en önemli hususlardır. Çözülme sonrası organoid iyileşmesi çoğu güncel teknolojide çok düşüktür, genellikle% 50'den azdır. Bununla birlikte, son çalışmalar26,27,28,29 sağkalım oranlarının artmasıyla umut verici sonuçlar göstermiştir. Lee ve ark., % 15 DMSO 28 içeren Wisconsin Üniversitesi solüsyonunu kullandıklarında sferoid hücrelerin%78'inin kriyoprezervasyondan sonra hayatta kaldığını göstermiştir. Arai ve ark.29'un çalışmasında hücre sağkalım oranı% 83'e yükselmiştir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon sonrası sonuçlar, 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamadığından önemli ölçüde etkilenir. Ek olarak, farmasötik ve teşhis ortamlarında iyi üretim uygulamaları için serumsuz reaktifler gereklidir. Geleneksel iş akışları, yavaş dondurma yöntemi için fetal sığır serumu (FBS) ve dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir ortam kullanır ve her ikisi de handikaplarla ilişkilidir. FBS, hayvansal kaynaklı bir üründür ve parti varyasyonlarına sahip olabilir. DMSO çok başarılı bir kriyoprotektandır, ancak özellikle çözülme sırasında uzun süreli maruz kalma sitotoksik etkilere neden olabilir30,31.

Bu makalede ayrıca, hala bir hidrojel halindeyken tüm organoidlerin veya sferoidlerin donma / çözülme metodolojisi açıklanmaktadır. Çalışmada organoidlerin ve sferoidlerin dondurulması için iki formül kullanılmıştır: (1) geleneksel dondurma çözeltisi (FS) içeren% 10 DMSO ve (2) serum ve DMSO içermeyen bir kriyoprezervasyon ortamı. Bu kriyoprezervasyon ortamı, mevcut formüllerden farklı olan hücre dışı matris bileşenleri içerir. Hücre dışı matris, hücresel bileşenler için fiziksel iskele için gerekli olan iki ana makromolekül sınıfı, proteoglikanlar ve lifli proteinlerden oluşur, ancak aynı zamanda doku morfogenezi, farklılaşma ve homeostaz için gerekli süreçleri başlatır 34,35,36,37,38,39,40 . Kollajenler gerilme mukavemeti sağlar, hücre yapışmasını düzenler, kemotaksisi ve migrasyonu destekler ve doku gelişimini yönlendirir37. Ek olarak, elastin lifleri, tekrarlanan gerilme38'e maruz kalan dokulara geri tepme sağlar. Üçüncü bir fibröz protein olan fibronektin, interstisyel hücre dışı matriksin organizasyonunu yönlendirir ve hücre bağlanmasına aracılık etmede çok önemli bir role sahiptir ve hücre dışı bir mekano-düzenleyici olarak işlev görür39. Du ve ark. tavuk kollajen hidrolizatının doğal aktomiyozin model sistemi41 üzerindeki kriyoprotektif etkisini göstermiştir. Sonuçları, kollajen hidrolizatının buz kristali büyümesini inhibe edebileceğini, ticari kriyoprotektanlara benzer şekilde protein dondurucu-denatürasyonunu ve oksidasyonunu azaltabileceğini ve donma-çözülme döngülerinden sonra daha iyi bir jel yapısı sağlayabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, kriyoprezervasyon ortamına hücre dışı matriks bileşenlerinin eklenmesi, numune için daha güvenli ve koruyucu bir ortam sağlar ve donma-çözülme sonrası canlı yapıların iyileşmesini destekler.

Ek olarak, bu çalışma, canlı organoidlerin ve sferoidlerin sitoplazmik membranlarını ve çekirdeklerini hala hidrojel içindeyken etiketlemek için basit bir protokol tanımlamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Organoidlerin ve sferoidlerin kültürlenmesi

  1. Çözülmesi için hidrojeli gece boyunca (buzdolabında veya soğuk bir odada) buzun üzerine yerleştirin.
  2. Ticari olarak temin edilebilen çok amaçlı cihazı (MD; bakınız Malzeme Tablosu) deneyden 1 gün önce (37 °C, %5 CO2) inkübatöre ısıtın.
  3. Steril geniş uçlu pipet uçlarını buzdolabına 4 °C'de yerleştirin.
    NOT: Adım 1.1-1.3 0. Günde, 1.4-1.11 adımları ise 1. Gün gerçekleştirilmelidir.
  4. Hidrojeli 15 dakika boyunca laminer bir akış başlığında buzun üzerine yerleştirin.
    1. İsteğe bağlı: Hidrojeli üreticinin tavsiyesine göre soğuk hücre kültürü ortamında seyreltin.
  5. HepG2 hücrelerinin bir peletini (ticari olarak elde edilen hepatosellüler karsinom hücre hattı; bakınız Malzeme Tablosu) içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin.
  6. Plaka 30-35 μL% 100 hidrojel bir jel damlası oluşturmak için önceden ısıtılmış cihazın nişi içinde.
  7. Her hidrojel damlasının üst kısmının ortasına 10.000 HepG2 hücresi yerleştirin (Şekil 2) ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Hidrojel damlasını% 10 Fetal Sığır Serumu ile 200 μL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile örtün.
  9. Gaz akışına izin vermek için MD'nin kapağını doğru konumda örtün ve cihazı inkübatöre yerleştirin.
  10. Hücreleri her gün% 10 FBS ile 200 μL DMEM ile besleyin.
  11. Sferoidlerin büyümesini ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin (Şekil 3). Küresel oluşum 3. günden sonra başlar. Video 1 , bir hidrojel kubbede farklı seviyelerde sferoidlerin yerini göstermektedir.
    NOTLAR: Hidrojeli çevreleyen sıvının nazikçe aspire edilmesi ve hidrojel damlalarının zarar görmesini önlemek için yeni sıvının yavaşça çevreye eklenmesi şiddetle tavsiye edilir.

2. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin hematoksilin ve Eozin boyanması

  1. Fiksatifi ısıtın (% 4 paraformaldehit; PFA), PBS ve hematoksilin (bkz. malzeme tablosu) 37 °C'ye kadar.
  2. Hidrojel damlasını çevreleyen ortamı bir pipetle aspire edin, sabitlemek için 100-200 μL% 4 PFA ekleyin ve 37 ° C'de 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. % 4 PFA'yı aspire edin ve 37 ° C'de her biri 5 dakika boyunca 3x'i yıkamak için 200 μL PBS ekleyin. Daha sonra, PBS'yi aspire edin ve 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca 200 μL Hematoksilin çözeltisi ile inkübe edin.
  4. Hematoksilin'i aspire edin ve 37 ° C'de her biri 10 dakika boyunca 3x'i yıkamak için200μL dH 2 O ekleyin. dH2O'yu aspire edin ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 200 μL etanol ile inkübe edin.
  5. Etanol aspire edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca 200 μL Eozin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin. Eozini aspire edin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika yıkamak için200μL dH 2 O ekleyin.
  6. dH2O'yu aspire edin ve hidrojel damlasını montaj ortamı olarak örtmek için 100 μL gliserol ekleyin.
  7. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak kayması ile monte edin. Bu adım, önemli büyüklükteki organoidlerin / sferoidlerin sıkılmasını önlemek için atlanabilir.
  8. Muayeneye kadar kurumasını önlemek için MD'nin kapağını sıkıca kapatın. Numune en az 6 ay boyunca muayene için stabildir.

3. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin immünohistokimyası

  1. İmmünohistokimya için ticari olarak elde edilen çözeltiyi (S-IHC; bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'ye ısıtın.
  2. Hidrojeldeki organoidleri veya sferoidleri, 37 ° C'de 5 dakika boyunca200μL dH 2 O'da% 3 hidrojen peroksit (H2 O 2) ile inkübe edin.
  3. Hidrojen peroksit çözeltisini aspire edin ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca dH2O'da yıkayın. dH2O'yu aspire edin ve her biri 10 dakika boyunca 37 ° C'de 100 μL S-IHC ile iki kez inkübe edin.
  4. S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 1-2 saat boyunca S-IHC'de seyreltilmiş 100 μL birincil antikor (bkz. Malzeme Tablosu) ile inkübe edin (üreticinin çalışma seyreltmesi ile ilgili tavsiyelerini takiben).
  5. Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin.
  6. 100 μL S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca biyotinile ikincil bir antikor (bakınız Malzeme Tablosu) ile inkübe edin.
  7. Sekonder antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin. S-IHC'yi aspire edin ve streptavidin etiketli 100 μL yaban turpu peroksidaz (HRP) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  8. HRP etiketli streptavidini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin.
  9. S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 100 μL DAB / AEC kromojen çözeltisi karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  10. Boyama yoğunluğunu bir ışık mikroskobu altında izleyin.
  11. Her biri 2 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  12. İsteğe bağlı: 37 ° C'de 5 dakika boyunca nükleer karşı boyama için 100 μL Hematoksilin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  13. Hematoksilin aspire edin ve dH2O'da 5 dakika yıkayın.
  14. dH2O'yu aspire edin ve hidrojel damlasını montaj ortamı olarak 100 μL gliserol ile örtün.
  15. Mikroskobik incelemeye kadar MD'nin kapağını sıkıca kapatın.
    NOTLAR: Antijen alımı ve protein bloke etme adımları bu protokolde ihmal edilir, çünkü S-IHC bu adımları ortadan kaldırır.

4. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin/sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi

  1. Aşağıdaki malzemeleri 37 °C'ye ısıtın:% 4 PFA, PBS, S-IF, S-IF'de birincil antikor çözeltisi, S-IF'de ikincil antikor çözeltisi, nükleer leke ve gliserol (bkz.
  2. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve 37 ° C'de 15-30 dakika boyunca 200 μL% 4 PFA ile sabitleyin. Fiksatifi aspire edin ve her biri 37 ° C'de 10 dakika boyunca S-IF 3x'te yıkayın.
  3. Aşağıdaki adımlar sırasında nem sağlamak için nişi çevreleyen tarafa dH2O ekleyin.
  4. Hidrojel damlasını çevreleyen S-IF'yi aspire edin ve hidrojel damlasını 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca S-IF'de 100 μL birincil antikor çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  5. Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve 37 ° C'de her biri 10 dakika boyunca S-IF 3x'te yıkayın.
  6. S-IF'yi aspire edin ve karanlıkta 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca S-IF'de 100 μL ikincil antikor çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  7. İkincil antikor solüsyonunu aspire edin ve karanlıkta 37 °C'de her biri 10 dakika boyunca PBS 3x ile yıkayın.
  8. PBS'yi aspire edin ve karanlıkta 37 ° C'de montaj ortamı veya gliserol içeren 100 μL nükleer-DNA lekesi ile inkübe edin.
  9. Kurumasını önlemek için nişi gliserol ile doldurun.
  10. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak fişi ile örtün. Organoidlerin / sferoidlerin sıkılmasını önlemek için bu adım atlanabilir.
  11. MD'yi sıkıca kapatın. MD'lerdeki numuneler, en az floresan kaybı ile karanlıkta en az 6 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
  12. Konfokal mikroskobik inceleme için aşağıdaki ayarları kullanın: tüm kanalların iğne deliği değerini 20,1 olarak ayarlayın, kazanç ana sabitini 488 nm için 550, 550 nm için 485 ve 594 nm için 450 olarak tutun, tüm deneyler için lazer gücünü sabit tutun ve en düşük yüzdeyi 2,0'da tutun.
    NOTLAR: Primer antikorlar: Anti-Na-K ATPaz (1:100), Anti-Arginaz (1:50), Anti-Albümin (1:50), Anti-Beta-galaktosidaz (1:25), Antimitokondriyal antikor (1:100), Anti-Golgi Antikoru (1:50), Anti-Sitokeratin 5 (1:100), Ov6 antikoru (1:100). İkincil antikorlar: Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) - 488, Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) -550, Keçi anti-Fare IgG (H + L) -488, Keçi anti-Fare IgG (H + L) -550, Keçi anti-Tavuk IgY (H + L) -647. Tüm sekonder antikorlar için seyreltme 1:100'dür. Ek olarak, konjuge bir antikor olan FITC-Phalloidin (1:100 ) de kullanılır (bkz.

5. Bir hidrojel içinde canlı organoidlerin ve sferoidlerin plazma zarı ve çekirdeğin etiketlenmesi

  1. Üreticinin tavsiyelerine göre (bkz. Malzeme Tablosu) Hank'in dengeli tuz çözeltisinde Alexa flor buğday tohumu aglutinin (5.0 μg / mL) ve Hoechst (2 μM) içeren etiketleme çözeltisi hazırlayın ve 37 ° C'ye kadar ısıtın.
  2. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve hidrojel damlasını örtmek için 100 μL etiketleme çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. Etiketleme solüsyonunu çıkarın ve PBS 2x'te her biri 37 °C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. İsteğe bağlı: 37 °C'de 15 dakika boyunca 200 μL %4 formaldehit ile sabitleyin.
  4. Hidrojel damlasını montaj ortamı olarak gliserol ile örtün. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak camı ile monte edin.
  5. MD'nin kapağını sıkıca kapatın ve floresan / konfokal mikroskobik incelemeye kadar karanlıkta buzdolabında saklayın. En az 6 ay boyunca stabildir.

6. Tüm monte organoidlerin / sferoidlerin bir hidrojel içinde dondurulması ve çözülmesi

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek organoidleri dondurun.
    1. Ticari olarak elde edilen dondurma çözeltisini (FS; bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'ye ısıtın.
    2. Hidrojel kubbeyi çevreleyen hücre kültürü ortamını nazikçe aspire edin.
    3. Yavaşça 200 μL FS ekleyin. Numuneyi FS ile 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    4. Cihazın kapağını sıkıca kapatın ve bir köpük kutuya yerleştirin. Bu köpük kutusunu, Ek Şekil 3'te gösterildiği gibi başka bir köpük kutuya yerleştirin. Her iki köpük kutuyu da sıkıca kapatın. Birbirinin içindeki iki köpük kutu, -20 °C'lik bir dondurucuda numunenin 1 ila 2°C/dak'lık bir sıcaklık soğutma gradyanı aralığını sağlar.
    5. Kutuyu 2 saat boyunca -20 °C'ye yerleştirin. Kutuyu -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın ve gece boyunca bırakın.
    6. Numuneyi kutulardan çıkarın. MD'deki numune -80 °C dondurucuda 6 ay boyunca saklanabilir.
    7. Numuneyi içeren MD'yi daha uzun süreli depolama için sıvı azot tankına aktarın.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek organoidleri çözün.
    1. Numuneyi içeren MD'yi dondurucu/azot tankından çıkarın ve doğrudan 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    2. Nişe 200 μL ılık kültür ortamı ekleyin (FS'nin hücre kültürü ortamına oranı 1: 1'dir) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Nişe daha sıcak kültür ortamı ekleyin (FS'nin hücre kültürü ortamına oranı 1: 2'dir) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Ortam ve FS karışımını nazikçe aspire edin. Hidrojeldeki tüm montajlı organoidlerin / sferoidlerin taramalı elektron mikroskobu (adım 7) ve iletim elektron mikroskobu (adım 8) görüntülemesine devam edin.

7. Tüm monte organoidlerin / sferoidlerin taramalı elektron mikroskopisi

  1. Karnovsky'nin fiksatif ve post-fiksatif çözeltisini (bakınız Malzeme Tablosu) oda sıcaklığına (RT) ısıtın.
  2. MD'deki hidrojeli çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin. Numuneyi MD'de laminer akış başlığındaki buz üzerine 15 dakika boyunca yerleştirin.
  3. Organoidleri / sferoidleri çevreleyen sıvılaştırılmış hidrojeli çok nazikçe aspire edin. Sınırlı miktarda matrigel, numuneye zarar vermemek ve kaybetmemek için niş içinde kalabilir.
  4. Karnovsky'nin fiksatif (% 2 PFA,% 2.5 glutaraldehit 0.15 M Kakodilat tamponunda ve 2 mM CaCl2; bakınız Malzeme Tablosu) ile RT'de 1 saat boyunca sabitleyin.
  5. Fiksatifi nazikçe aspire edin ve her biri 15 dakika boyunca damıtılmış suyla (dH2O) 3x yıkayın.
  6. dH2O'yu nazikçe aspire edin ve 1 saat boyunca RT'de post-fiksatif çözelti (% 1 sulu osmiyum tetroksit [OsO4]; Malzeme Tablosuna bakınız) ile sabitleyin.
  7. Post-fiksatifi nazikçe aspire edin ve her biri 15 dakika boyunca damıtılmış su (dH2O) 3x ile yıkayın.
  8. Derecelendirilmiş bir etanol serisinde dehidrat (% 30,% 50,% 70,% 80,% 90,% 96,% 100), etanol / aseton karışımı (1: 1; 1: 2) ve RT'de her biri 15 dakika boyunca mutlak aseton.
  9. Kritik noktalı kurutucu ile kurulayın.
  10. Cihazdaki numuneyi 90 sn boyunca bir püskürtme kaplayıcı kullanarak 6 nm altın / paladyum ile kaplayın (bkz.
  11. Vakum modunda (5 x 10-6 mA) 2-3 kV'ta lens içi ikincil elektron dedektörü ile taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. 8,1-8,2 mm çalışma mesafesi ve 675x, 1050x ve 1570x büyütmelerde görüntüler çekin.
    NOTLAR: Tüm adımlar MD'de gerçekleştirilir. Her adım için 200-250 μL çözelti kullanın.

8. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin iletim elektron mikroskobu

  1. Karnovsky'nin sabitleyicisini 37 ° C'ye ısıtın. MD'deki hidrojeli çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin.
  2. Numuneyi Karnovsky'nin RT'deki fiksatif ile 1 saat sabitleyin. Her biri 15 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  3. RT'de45 dakika boyunca% 2 sulu OsO 4 ve% 2.5 potasyum ferrosiyanür ile post-fix. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  4. RT'de 30 dakika boyunca% 0.5 Tiyokarbohidrazit (TCH; Malzeme Tablosuna bakınız) içinde inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  5. RT'de %2 sulu OsO4'te 30 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  6. RT'de 1 saat boyunca% 2 uranil asetat çözeltisinde (Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
    NOT: Bu adımda, sferoidler gece boyunca 4 ° C'de tutulabilir.
  7. Kurşun aspartat çözeltisinde (bakınız Malzeme Tablosu) 60 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  8. Derecelendirilmiş bir etanol serisinde (% 50,% 70,% 90,% 100 [x2]) ve RT'de her biri 15 dakika boyunca mutlak asetonda dehidratasyon.
  9. RT'de her biri 2 saat boyunca (1:1; 1:2) aseton/Epon reçinesi ve saf Epon reçinesi (bkz. Malzeme Tablosu) karışımı ile muamele edin.
  10. Reçineyi gece boyunca 60 °C'de polimerize edin (en az 16 saat). Polimerizasyondan sonra, Ek Şekil 4'te gösterildiği gibi reçine bloğunu MD'den çıkarın.
  11. Reçine bloğunu reçine yapıştırıcı ile daha büyük bir bloğa takın. Bloğu kesin ve organoidlerin veya sferoidlerin konumuna ulaşın.
  12. Bir ultramikrotom kullanarak yarı ince (1.000 nm) ve ultra ince kesitler (60 nm) alın (bkz.
  13. Ultra ince kesitleri 100 örgü bakır ızgaraya yerleştirin ve 30 kV'luk hızlanan voltajda bir STEM dedektörü ile taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. 44 mm çalışma mesafesi ve 2580x, 5020x ve 6060x büyütmelerde görüntüler yakalayın.
    NOTLAR: Her adım için 200-250 μL çözelti kullanın. MD'de 8.1-8.10 arası adımlar gerçekleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu makale, çok amaçlı bir cihazı (MD) ve kültürleme, dondurma, çözme, histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme, kaplama ve tüm organoidlerin veya sferoidlerin işlenmesi için metodolojileri tamamlayan metodolojileri benzersiz bir şekilde tasarlanmış tek bir ortamda bir hidrojel içinde temsil etmektedir. Mevcut çalışma, 35 MD'de 35 hidrojel damlasında HepG2 karaciğer kanseri sferoidlerini hazırlamak için tasarlanmıştır. Ek olarak, MD'lerdeki akciğer organoidleri, organoid çalışmalar için mevcut metodolojilerin sonuçlarını göstermek için örnek olarak immünofloresan olarak etiketlenmiştir.

Şekil 1 , bir hidrojel kubbe içeren cihaza yakından bakmayı göstermektedir. Nişin büyüklüğü ve şekli, organoidleri / sferoidleri içeren hidrojel için koruyucu bir ortam sağlamak ve çeşitli işlemler sırasında kullanılan reaktifleri kaydetmek için tasarlanmıştır. Ek olarak, nişi çevreleyen cihazın yan kısmı, immün boyama deneyleri sırasında nem odası olarak kullanılabilir. Numuneyi besleyecek ortam, hidrojel damlasının yüksekliğine bağlı olarak 100-200 μL arasında değişebilir. Mevcut çalışma, kubbe tabanlı yönteme odaklanmaktadır, çünkü birçok hidrojel, ticari hücre dışı matris bileşenleri ve bazal membran ekstraktları kullanıcının damla hazırlamasına izin vermektedir. Bununla birlikte, MD'nin nişini hidrojel ile doldurmak ve daha sonra organoidler / sferoidler üretmek için içindeki hücreleri tohumlamak da mümkündür. Bu yöntem, matrisin viskozitesi kubbelerin hazırlanmasına izin vermiyorsa veya deney büyük miktarlarda organoid içeriyorsa tercih edilebilir. Damlaların hazırlanması için hidrojel tipi ve hidrojel / orta oran, hücre tipine, deneysel tasarıma ve ortama göre değişebilir. Şekil 1  Ayrıca, organoidler / sferoidler hala doğal in vitro ortamlarındayken, organoidleri / sferoidleri parlak alan, konfokal ve taramalı elektron mikroskopları altında araştırmayı mümkün kılan cihazın tasarımını temsil eder.

Şekil 2 , bir hidrojeldeki hücrelerin nasıl tohumlanacağını ve sferoidlerin veya organoidlerin gelişimini nasıl inceleyeceğini göstermektedir. Çok amaçlı cihazın tasarımı ve boyutları da bu şekilde sunulmuştur. Video 1, bir hidrojel içinde 3D büyüyen sferoidlerin yerini göstermektedir. Şekil 3, 3. günden 21. güne kadar büyüyen sferoidlerin canlı görüntülerini temsil etmektedir. Sferoidlerin ve organoidlerin oluşum süresi, numunenin doğasına göre değişebilir. Örneğin, HepG2 hücrelerinden ve HEK hücrelerinden gelen sferoidler 3 gün içinde oluşurken, karaciğer ve safra organoidlerinin oluşumu deneyler sırasında 2 hafta sürdü.

Hematoksilin ve Eozin lekeli sferoidler Şekil 4'te görülmektedir. Görüntü, farklı boyutlarda iyi korunmuş ve homojen olarak lekelenmiş sferoidleri ve sferoidlerin füzyonlarını temsil etmektedir. Sferoidlerin merkezindeki canlı hücreler dikkat çekicidir. Görüntü ayrıca farklı sferoidlerden gelen hücreler arasındaki hassas bağlantıları da göstermektedir. Bu kırılgan bağlantılar, aktarım, pipetleme veya santrifüjleme onlara zarar vereceğinden geleneksel iş akışlarından sonra görselleştirilemedi. Şekil 5  hepatosellüler karsinomun tanı ve prognozunda en sık görülen belirteçlerden biri olan Arginaz için spesifik antikor ile sferoidlerin immünoboyamasını gösterir42,43. Mikrograflar, aynı sferoidlerde farklılaşmış ve farklılaşmamış karaciğer kanseri hücrelerini ortaya koymaktadır. Bu şekil, Hematoksilin ile karşı boyama yapan ve olmayan görüntüleri içerir. Araştırmacılar, 3D yapıdaki etiketli alanları ayırt etmenin zor olacağı durumlarda Hematoksilin ile karşı boyamayı atlamayı seçebilirler.

Şekil 6 , bir hidrojeldeki canlı organoidlerin / sferoidlerin tam montajlı görselleştirilmesi için başka bir basit protokolü temsil eder: canlı hücre zarı ve çekirdek boyama. Metodoloji, çevre ve merkezde aynı etiketleme yoğunluğuna izin verir ve tam reaktif penetrasyonunu gösterir. Şekil 7, Şekil 8 ve Şekil 9 , sırasıyla bir, iki veya üç antikor ile etiketlenmiş sferoidlerin temsili görüntülerini göstermektedir. Bir ila üç primer antikor aynı anda S-IF'de seyreltilir. Benzer şekilde, deney için uygun olan bir ila üç eşleşen ikincil antikor aynı anda S-IF'de seyreltilir. İmmünoetiketleme protokolü, araştırmacıların 3D yapıları kaybetmeden veya zarar vermeden 4-6 saat içinde işaretlemelerini sağlar. Arka plan şeffaftır ve burada kullanılan teknoloji ek temizleme, antijen alımı veya bloke etme yöntemleri/çözümleri gerektirmez. Yöntem ayrıca araştırmacıların numuneyi tek bir adımda birden fazla antikor ile etiketlemelerini sağlar. Başka bir deyişle, kullanıcı bir ila üç birincil antikor içeren bir çözelti ve bir ila üç ikincil antikor ile eşleşen başka bir çözelti hazırlar. Burada açıklanan protokol, geleneksel metodolojilerde farklı antikorlarla sıralı etiketleme adımlarını ortadan kaldırır.

Şekil 10 , sferoidlerin tarama ve iletim elektron mikroskobik görüntülerini temsil etmektedir. İlk satır, MD'deki tüm sferoidlerin resimlerini taramalı elektron mikroskobu altında göstermektedir. İkinci sıra, MD'de bütün monte sferoidleri içeren reçine bloklarının hazırlanmasından sonra sferoidlerin iletim elektron mikroskobik görüntülerini ve ayrıca kesitli ve lekeli sferoidlerin görüntülerini içerir. İyi korunmuş sitoplazmik organeller ve hücrelerin diğer ultrayapısal özellikleri, tüm numunenin 3D yapısını koruyan bu basit protokolün etkinliğini göstermektedir. MD ayrıca araştırmacıların tüm monte edilmiş örnekleri bir hidrojel içinde dondurmalarına ve çözmelerine izin verir. Şekil 11  hidrojel kubbeleri ve sferoidleri donmadan önce ve sonra daha yüksek bir büyütmede gösterir. Hidrojel kubbenin sınırlarındaki düzensizlik dikkat çekicidir. Bununla birlikte, kriyokorunmuş sferoidlerin yuvarlaklığı, çözülmeden önce sferoidlere kıyasla çözüldükten sonra neredeyse kararlıdır. Canlı hücre zarı ve çekirdek etiketleme yöntemleri, donma / çözülme prosedürünün 3D mimarisini, hücre zarını ve hücre canlılığını nasıl etkilediğini göstermek için çözülmeden 48 saat sonra da uygulanır. Dimetil sülfoksit içeren geleneksel dondurma çözeltisi ve mevcut yeni formüle edilmiş çözelti SF, benzer sonuçlar göstermektedir. 3D yapıların% 75'inden fazlası bu protokolde hayatta kalabilir. Bununla birlikte, her formülasyonun organoidler ve sferoidler üzerindeki uzun vadeli yan etkilerini ortaya çıkarmak için daha fazla deneye ihtiyaç vardır.

Tablo 1 ve Tablo 2, geleneksel iş akışlarını adım sayısına, süreye ve atık üretimine (yani, her iş akışı için toplam plastik eldiven, pipet uçları, serolojik pipetler, santrifüj tüpleri, mikrosantrifüj tüpleri, hücre kültürü kapları, kriyovyaller vb.) göre burada açıklananlarla karşılaştırır.

Ek Şekil 1 , şematik olarak tek bir MD'de gerçekleştirilebilecek sıralı adımları temsil eder. Ek Şekil 2 , bir MD veya geleneksel cam tabanlı bir tabakta HepG2 hücrelerinin hücre canlılığını, toksisitesini ve çoğalma oranlarını karşılaştırmak için tasarlanmış deneylerin sonuçlarını göstermektedir. Ek Şekil 3 , MD'lerdeki numuneleri dondurmak için kullanılan köpük kutuları göstermektedir. Ek Şekil 4 , bir MD'den bir reçine bloğu çıkarma adımlarını özetlemektedir. Ek Şekil 5 , immünofloresan etiketli ve daha sonra hala MD'lerde iken görselleştirilen hava yolu organoidlerinin görüntülerini içerir. Benzer şekilde, Video 2, bir MD'de iki immünofloresan etiketli hava yolu organoidini göstermektedir. Son olarak, Ek Şekil 6 , geleneksel iş akışını ve burada açıklanan iş akışını kullanarak donmadan önce ve sonra canlı sferoidlerdeki hücre zarı etiketleme yoğunluğunun ortalama yoğunluğunu karşılaştıran bir grafiktir. Analiz için Image J yazılımı kullanılmıştır.

Figure 1
Şekil 1: Çok amaçlı hücre kültürü aygıtı (MD). (A) Cihazın orta kısmı olan niş (N), sıralı işlemler sırasında bir hidrojel damlasında (D) yetiştirilen organoidler / sferoidler için koruyucu bir ortam oluşturmak üzere tasarlanmıştır. Nişin çevresindeki kısım olan yan (S), immün boyama deneyleri sırasında nemlendirici oda olarak kullanılabilir. (B) Kapaktaki şeffaf merkez, cihaz kapalıyken kullanıcının organoidleri/sferoidleri gözlemlemesini sağlar. (C) MD'deki organoidleri içeren hidrojel kubbe, iletim elektron mikroskobu için boyanabilir veya bir reçine bloğuna gömülebilir. Kapak ayrıca asılı damla metodolojisi için niş (N) içerir. Cihazın boyutu ve tasarımı, kullanıcının organoidleri / sferoidleri (D) parlak alan, (E) konfokal ve (F) taramalı elektron mikroskopları altında incelemesine izin verir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Bir hidrojel içindeki hücrelerin tohumlanması. (A) Pipetteki hücre peleti kubbenin üst kısmına yerleştirilir. 3-5 gün sonra, sferoidler kubbede, özellikle de damlanın çevresinde görünür hale gelir. (B) Bir kubbede her çeyrekten büyüyen sferoidlerin dört canlı görüntüsü yakalandı ve birleştirildi. Ölçek çubuğu = 200 μm. (C)Çok amaçlı cihazın (MD) tasarımı ve boyutları (santimetre cinsinden).

Figure 3
Şekil 3: 3 . günden 21. güne kadar bir hidrojel damlasında sferoidlerin geliştirilmesi. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: MD içindeki hematoksilin ve Eozin lekeli bütün montajlı sferoidler. Bitişik veya kaynaşan sferoidlerde bulunan hücreler arasındaki bağlantıların görselleştirilmesi. Hücreler (oklar) arasındaki hassas süreçler görülebilir, çünkü hidrojeldeki bütün montajlı numune, 3D büyüyen yapılara zarar vermeden sabitlenir, lekelenir ve incelenir. Ölçek çubuğu: gün 3, gün 9 = 50 μm; 7. gün, 17. gün = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: MD içindeki hidrojeldeki bütün montajlı sferoidlerin immünohistokimyasal boyanması. Örnekler Arginaz'a özgü bir antikor ile immünoboyalıydı. Sereoidlerde arginaz pozitif (kırmızı oklar) ve negatif (siyah oklar) hücreler görülür. Görüntüler iki deneyden alınmıştır: (A-C) olmadan ve (D-F) Hematoksilin ile karşı boyama ile. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Hidrojeldeki canlı bir organoidin konfokal görüntüsü. Canlı organoidler canlı hücre zarı (WGA) ve çekirdek boyaları (Hoechst) ile etiketlendi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Bir hidrojel içinde bir antikor ve nükleer leke (Hoechst) ile bütün monte sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi. (A-C) Üst panel, hücre zarındaki Na-K ATPaz için spesifik bir antikor ile etiketlenmiş bir sferoid gösterir. (D-F) Alt panel, karaciğer kanseri sferoidlerinde hepatosellüler karsinom için spesifik bir sitozolik protein olan Arginaz için spesifik başka bir antikorun yerini göstermektedir. Boyama protokolünün süresi: 6 saat. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: İki antikor ve bir nükleer boya (Hoechst) içeren bir hidrojel içindeki tüm monte sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi. (A-C) Üst panel, albümin ve Ov6 için spesifik iki antikor ile etiketlenmiş bir sferoid gösterir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (D-F) Alt panel, karaciğer kanseri sferoidlerinde alfa feto proteini ve Ov6'nın yerini gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Boyama protokolünün süresi: 6 saat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Üç antikor ve bir nükleer boya (Hoechst) içeren bir hidrojel içindeki tüm monte sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi. (A-E) Üst paneldeki sferoid, Arginaz, Na-K ATPaz ve beta-galaktosidaz için spesifik antikorlarla etiketlenmiştir. Ölçek çubuğu = 10 μm. (F-J) Orta panel, Ov6, beta-galaktosidaz ve alfa-feto proteini ile etiketlenmiş bir sferoid gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (K-O) Alt paneldeki sferoid, FITC-faloidin, anti-mitokondriyal antikor ve anti-Golgi antikoru ile etiketlenmiştir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Yüksek etiketleme özgüllüğüne ve azaltılmış arka plana dikkat edin. Boyama protokolünün süresi: 6 saat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: Elektron mikroskobu görüntüleri. (A-C) MD'deki hidrojeldeki tüm sferoidlerin elektron mikroskobik görüntülerinin taranması. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D-F) Bir küredeki hücrelerin ultrayapısal özellikleri de bir transmisyon elektron mikroskobu altında görselleştirilmiştir. Ölçek çubukları: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 11
Şekil 11: Donmadan önce ve sonra sferoidlerin canlı görüntüleri. (A-F) Hidrojel kubbelerin sınırlarının düzensizliği donma işleminden sonra belirgindir. Bununla birlikte, sferoidlerin büyüklüğü ve yuvarlaklığı benzer kalır. (F) Kültür yüzeyindeki hücre göçü çözülmeden sonra görülebilir. (G-L) Canlı hücre zarı (WGA) ve çekirdek boyama (Hoechst), MD'deki bir hidrojelde tüm sferoidlerin dondurulmasından önce ve sonra benzer hücre canlılığını ve sağlam hücre zarlarını gösterir. Ölçek basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Radyonal iş akışı Çok amaçlı aygıtla (MD) iş akışı
Adım -ları 22 6
Saat 9 günler 4 gün
Atık Ürünler 26 9

Tablo 1: Kısa süreli bir deney sırasında geleneksel ve yeni iş akışları arasındaki adım sayısı, zaman ve atık üretiminin karşılaştırılması.

Geleneksel iş akışı İmmünofloresan için Çözelti ile İş Akışı (S-IF)
Adım -ları 25 7
Saat 120 saat 6-8 saat
Atık Ürünler 28 10

Tablo 2: Konvansiyonel immünoetiketleme ile yeni immünoetiketleme protokolünün karşılaştırılması.

Video 1: Ters faz kontrast mikroskobu altında sferoidler içeren bir hidrojelin farklı seviyelerinde görüntülerin zaman serisi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2: Sitokeratin 5 ve DAPI antikorları ile etiketlenmiş iki hava yolu organoidinin 3D yapısı. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: Deneye genel bakış. Bu şema, bir hidrojelde bütün monte organoidlerin yetiştirilmesi ve incelenmesi için sıralı deneysel adımları göstermektedir. Burada açıklanan teknoloji, organoidlerin farklı mikroskoplar altında yetiştirilmesini, dondurulmasını, çözülmesini, etiketlenmesini ve incelenmesini mümkün kılar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Geleneksel cam tabanlı bir tabakta veya bir MD'de HepG2 hücrelerinin hücre canlılığı, toksisitesi ve çoğalma oranlarının karşılaştırılması. HepG2 hücreleri, hücre canlılığını ve toksisitesini karşılaştırmak için geleneksel bir cam tabanlı hücre kültürü kabında (A) veya (B) bir MD'de yetiştirildi. (C) Uygulanabilirliği göstermek için Trypan mavi dışlama testi kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 20 μm. Sonuçlar (D-E) CCK8 sitotoksisitesi ve (F) hücre proliferasyon testleri kullanılarak karşılaştırıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: İki köpük kutunun düzenlenmesi. MD'deki tüm organoidlerin veya sferoidlerin yavaş donma işlemi sırasında bir köpük kutusu diğerinin içine yerleştirilir. *iki kutuyu gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: Reçinenin polimerizasyonundan sonra reçine bloğunun MD'den nasıl çıkarılacağını gösteren adımlar. (A) Sferoidleri veya organoidleri çevreleyen reçine bloğu, MD nişinin içinde hazırlanır ve daha sonra polimerize edilir. (B-D) Daha sonra, uygun bir ince çubukla, reçine bloğu nişten çıkarmak için itilir. (E) Daha sonra, aşağıdaki plastikle birlikte reçine bloğu çıkarılır. (F-G) Son olarak, blok hala plastiğe bağlıysa bunları ayırmak için bir çift cımbız kullanılır. (H) Blok ince kesitleme için hazırdır. Reçine bloğundaki (*) bütün montajlı organoidler veya sferoidler, iletim elektron mikroskobu için bölümlemeye hazırdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 5: İmmünofloresan etiketli ve daha sonra hala MD'lerde iken görselleştirilen hava yolu organoidleri. (A-C) Üst panel, merkezi lümenli dairesel hava yolu organoidlerini gösterir. Yeşil, organoidin en dış halkasında Sitokeratin 5'i eksprese eden hava yolu progenitör hücrelerini temsil eder ve mavi çekirdeği temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D-F) Alt panel, (D) DAPI ve (E) Alexa 488 filtrelerindeki iki yan yana organoidin üç boyutlu görüntüsünü ve (F) birleştirilmiş görüntüyü gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: Hücrelerin canlı hücre zarları üzerindeki etiketleme yoğunluğunun karşılaştırılması. Grafik, geleneksel ve şu anda benimsenen iş akışını kullanarak donmadan önce ve sonra sferoidleri karşılaştırır. Analiz, Image J görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kısaltmalar: IntDen = Entegre Yoğunluk (seçilen sferoidlerde floresan yoğunluğu). CTCF = Düzeltilmiş toplam hücre floresansı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan formülasyonları ve protokolleri tamamlayan MD, organoidlerin ve sferoidlerin daha kontrollü bir ortamda hızlı ve spontan 3D büyümesini kolaylaştırır ve deneyi aynı koşullarda sürdürür. Numune tüm süreç boyunca aynı ortamda kalır ve 3B büyüyen mimarilerin yaklaşık %100'ü konteynerde bozulmadan kalır. Bu, sıralı deneyler sırasında homojenliği arttırır ve uzun bir kültür periyoduna izin verir. Ek olarak, organoidler ve küresel işleme sırasındaki adımların sayısı, geleneksel iş akışlarına kıyasla önemli ölçüde azaltılmıştır (Şekil 4), bu da taşıma süresini ve insan hatalarını en aza indirir ve kontaminasyon riskini azaltır. Ayrıca, bu, deneysel koşullar sabit kalırken, 3D büyüyen yapıları tek bir ortamda koruduğu için güvenilirliği ve geçerliliği artırır. Doğruluk, güvenilirlik ve geçerliliği artırırken laboratuvarda zamandan ve iş gücünden tasarruf etmeye yardımcı olur. Ek olarak, tüm sıralı süreç boyunca bireysel 3D büyüyen yapıların izlenmesine izin verir. Kültür sırasındaki boyut ve pozisyon değişikliklerinin ve bunların farklı bileşiklere tepkilerinin incelenmesi cihazda mümkündür. Bu, insan vücudunun ve hastalıkların gelişiminin özetlenmesi için mükemmel bir in vitro deneysel model sağlar. Araştırmacılar, hastalıklarda göç ve normal gelişim için gerekli bir mekanizma olan sferoidlerin ve organoidlerin füzyonu sırasındaki aşamaları araştırabilirler44,45,46,47. Laboratuvarda füzyonun modellenmesini amaçlayan son çalışmalar, organoid ve sferoid modellerin44,45,46,47 kullanılmasını tercih etmektedir.

Bu cihaz aynı zamanda araştırmacıların soruşturmayı acil bir durumda mevcut durumlarında dondurarak durdurmalarını ve daha sonra koşullar yeni deneylere izin verdiğinde herhangi bir kayıp olmadan devam etmelerini sağlar. Örneğin, COVID salgını nedeniyle, araştırmacıların değerli materyallerini ve verilerini kaybederek deneyleri derhal durdurmaları gerekiyordu. Koşulların değişmesi nedeniyle çalışmaların aniden kesintiye uğraması durumunda bir deneyi güvence altına almak için mevcut bir çözüm yoktur.

Tekniğin sınırlamaları
Burada açıklanan teknikler, normal insan vücudunun ve hastalıkların evrimini anlamak için bir model olan organoidlerin ve sferoidlerin kendiliğinden gelişimini incelemek için geliştirilmiştir. Bu nedenle, mevcut cihaz ve metodolojiler, uyuşturucu tarama testleri için tercih edilen eşit büyüklükte sferoidler veya organoidler geliştirmek için kullanılamaz. Diğer bir sınırlama, sferoidlerin ve organoidlerin büyüklüğü ile ilgilidir. Tam organoidler ve sferoidler çok yoğun olabilir, numuneleri çekirdeklerine nüfuz etmek için koruyan veya etiketleyen reaktifler gerektiren birkaç hücre katmanı vardır. Bununla birlikte, boyama, etiketleme ve dondurma dahil olmak üzere tüm protokoller için kuluçka süreleri, numunenin boyutuna ve numuneyi çevreleyen mikro ortam jeline göre değişir. Örneğin, daha büyük organoidler ve daha sert jeller, numunenin merkezine nüfuz etmek için daha uzun kuluçka süreleri gerektirir.

Gelecekteki uygulamalar
Cihaz ve bu metodolojiler, tekrarlanabilirliği, güvenilirliği ve doğruluğu artırırken organogenezi, doku morfogenezini ve hastalıkları anlamak için 3D büyüyen organoidlerin ve sferoidlerin uzun süreli incelenmesine izin verir. MD'lerde etiketlenen organoidler veya sferoidler, multifoton lazer taraması ve ışık tabakası floresan mikroskobu dahil olmak üzere yüksek teknolojili mikroskopi teknolojileri kullanılarak incelenebilir. Ek olarak, araştırmacılar aynı numuneyi hem konfokal hem de taramalı elektron mikroskobu altında tek bir cihazda inceleyebilir ve CLEM (Correlative light electron microscopy) adlı bir korelasyon çalışması yapabilirler. Cihaz ve metodolojiler, 3D mimarileri korurken biyobankacılık organoidleri ve sferoidler için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ranan Gülhan Aktaş, MD, S-IHC, S-IF ve FS patent başvurularının sahibidir. Olgu Enis Tok bu ürünlerin geliştirilmesinde yer aldı. Olgu Enis Tok ve Gamze Demirel, Celorama isimli şirketin Ar-Ge ekibi üyeleridir. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut ve Özgecan Kayalar'ın beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

Diyagramların hazırlanması için Chicago Üniversitesi'nden Dale Mertes'e, İstanbul Medipol Üniversitesi Sağlık Bilimleri ve Teknolojileri Araştırma Enstitüsü'ndeki teknik desteği için Dr. Mehmet Serif Aydın'a ve makalenin editörlüğünü yaptığı için Maltepe Üniversitesi'nden Dr. Rana Kazemi'ye minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol (EtOH) Merck 8187602500 Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone Merck 8222512500 Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)   Invitrogen I34406 Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody Biocare Medical CP 028 A Store at +4 °C
Anti-albumin antibody Abcam EPR20195 Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal Abcam 134435 Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5 Abcam 53121 Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody Biocare Medical ACI 3058 A, B Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C1016-500G Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) Abcam ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL  Nest 601051
Centrifuge tubes, 50 mL  Nest 602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus Telstar EN12469
CO2 Incubator Panasonic KM-CC17RU2
Copper Grids Electron Microscopy Sciences G100-Cu Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture   Sigma Aldrich AEC101 Store at +4 °C
Diamond knife Diatome Ultra 45°, 40-US Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology Biofroxx 67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes Nest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41966-029 Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic Bright Slide 2.BS01-105-1000
Epon resin  Sigma 45359-1EA-F Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier Pan Biotech P30-3304 Store at +4 °C
Freezing Solution (FS) Cellorama CellO-F Store at +4 °C
Glass knife maker Leica EM KMR3 For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) Leica 7890-08 Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%  Electron Microscopy Sciences 16210 Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution Sigma Aldrich 56-81-5 Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 Invitrogen A32933 Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35502 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84540 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35552 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84541 Store at +4 °C
Hematoxylin Harris  Bright Slide 2.BS01-104-1000
HepG2 cells ATCC HB-8065 Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 R&D Systems MAB2020 Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354248 Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354234 Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel ThermoFischer Scientific A1413201 Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel Biotechne, R&D Systems BME001-01 Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid Sigma 11189-100G Store at RT
Lead aspartate solution Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate Electron Microscopy Sciences 17900 Store at RT
Leica Confocal Microscope Leica DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss
Microplate reader Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD) Cellorama CellO-M
Nuclear-DNA stain Invitrogen H3569 Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain ThermoFischer Scientific 62248 DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% Electron Microscopy Sciences 19190 Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody R&D systems MAB2020 Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%  Sigma 1.04005.1000 Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets MP Biomedicals, LLC 2810305
Post-fixative solution %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%  Electron Microscopy Sciences 26603-01 Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS Zeiss Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL Nest 620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment Zeiss GeminiSEM 500 We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack ScyTek Laboratories SHP125 Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 Electron Microscopy Sciences 11655 Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] GeneTex GTX22871 Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) Cellorama CellO-IF Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) Cellorama CellO-P Store at +4 °C
Specimen trimming device Leica EM TRIM2 For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater Leica EM ACE200 Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH) Sigma 223220-5G Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Ultra gel super glue Pattex PSG2C For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome Leica EM UC7 For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL Nest 171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL Isolab L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL  Nest 110919HA01
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).

Tags

Biyoloji Sayı 190
Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., … More

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., Akbulut, Z., Kayalar, O., Aktas, R. G. Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel. J. Vis. Exp. (190), e64563, doi:10.3791/64563 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter