Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Odling, frysning, bearbetning och avbildning av hela organoider och sfäroider medan de fortfarande är i en hydrogel

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64563
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1, 3,5, 6, 2,3,4
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

Summary

Den aktuella studien beskriver metoder för odling, frysning, upptining, bearbetning, färgning, märkning och undersökning av hela sfäroider och organoider under olika mikroskop, medan de förblir intakta i en hydrogel i en mångsidig enhet.

Abstract

Organoider och sfäroider, tredimensionella odlingsstrukturer i cellodlingslaboratorier, blir alltmer erkända som överlägsna modeller jämfört med tvådimensionella odlingsmodeller, eftersom de efterliknar människokroppen bättre och har fördelar jämfört med djurstudier. Dessa studier står dock ofta inför problem med reproducerbarhet och konsistens. Under de långa experimentella processerna - med överföringar av organoider och sfäroider mellan olika cellodlingskärl, pipettering och centrifugering - skadas eller förloras ofta dessa mottagliga och ömtåliga 3D-växande strukturer. I slutändan påverkas resultaten avsevärt, eftersom 3D-strukturerna inte kan bibehålla samma egenskaper och kvalitet. Metoderna som beskrivs här minimerar dessa stressiga steg och säkerställer en säker och konsekvent miljö för organoider och sfäroider under hela bearbetningssekvensen medan de fortfarande befinner sig i en hydrogel i en mångsidig enhet. Forskarna kan växa, frysa, tina, bearbeta, fläcka, märka och sedan undersöka strukturen hos organoider eller sfäroider under olika högteknologiska instrument, från konfokala till elektronmikroskop, med hjälp av en enda mångsidig enhet. Denna teknik förbättrar studiernas reproducerbarhet, tillförlitlighet och validitet, samtidigt som en stabil och skyddande miljö för 3D-odlingsstrukturerna under bearbetningen upprätthålls. Dessutom minimerar eliminering av stressiga steg hanteringsfel, minskar tidsåtgången och minskar risken för kontaminering.

Introduction

Framtiden för cellforskning och terapi ligger inom 3D-cellkulturerna 1,2,3. Organoid- och sfäroidmodeller stänger klyftan mellan in vitro-experiment och djurmodeller genom att skapa bättre modeller som efterliknar människokroppens utveckling, fysiologi och sjukdomar 4,5,6,7,8,9. Reproducerbarheten och repeterbarheten hos dessa modeller är dock fortfarande utmanande. Dessutom resulterar hantering, skörd, överföring och centrifugering av dessa strukturer med nuvarande teknik i förlust eller skada på organoider och sfäroider under många förhållanden, vilket väsentligt påverkar resultaten.

Trots många protokoll för histologisk färgning, immunohistokemisk färgning, immunofluorescensmärkning och kryokonservering finns det inget universellt tillvägagångssätt relaterat till standardisering av experimentella förhållanden, hantering och bearbetning av dessa känsliga strukturer utan att förlora eller skada dem. Nuvarande protokoll är också otroligt långa, alternerande från några dagar till flera veckor, och inkluderar komplexa procedurer med olika reagenser 10,11,12,13,14. Dessutom orsakar skörd, pipettering, centrifugering och överföring av 3D-växande strukturer mellan cellodlingskärl och kryovialer förändringar i placeringen av strukturerna och mekaniska krafter och påverkar i slutändan differentieringen och mognaden av organoiderna och sfäroiderna. Det har rapporterats att vävnadstopologi, positionering av cellerna och mekaniska krafter signifikant påverkar celldifferentiering och mognad 6,15,16,17.

Därför är det önskvärt att förbättra den nuvarande konventionella tekniken för att generera organoider och sfäroider med stabil kvalitet. En metod / enhet som hoppar över centrifugeringen och andra steg som beskrivs ovan och tillhandahåller materialet i en enda säker miljö från början till slutet av de flera processerna skulle vara fördelaktigt för att nå de mest konsekventa och tillförlitliga uppgifterna. Dessutom kommer detta att minska tids-, arbets- och kostnadsbegränsningarna.

Den multifunktionella enheten (MD) som beskrivs här ger en enda säker miljö för flera processer av organoider och sfäroider (kompletterande figur 1). Denna enhet och kompletterande protokoll eliminerar skörde-, pipettering-, överförings- och centrifugeringsstegen. Organoiderna och sfäroiderna förblir i sin in vitro-miljö under sekventiella processer. Denna miljö består huvudsakligen av naturliga eller syntetiska extracellulära matriskomponenter, som kommersiellt tillgängliga hydrogeler. Med andra ord tillåter de metoder som beskrivs här att ett helmonterat prov av organoider / sfäroider bearbetas, undersöks och fryses medan det fortfarande är i en hydrogeldroppe.

Den biokompatibla enheten är resistent mot temperaturer mellan 60 °C och -160 °C, vilket gör det möjligt att återställa organoiderna/steroiderna i en behållare för flytande kväve vid -160 °C eller att förbereda hartsblock för elektronmikroskopi vid 60 °C. Nischen i enheten har utformats för att definiera ett begränsat utrymme för 3D-växande strukturer och stimulera bildandet av sfäroider eller organoider baserat på tidigare studier 18,19,20,21,22,23. Den delen av enheten är transparent och innehåller en specifik plast som ger hög optisk kvalitet (brytningsindex: 1,43; abbe-värde: 58; tjocklek: 7,8 mil [0,0078 tum eller 198 μm]). Både nischen och den omgivande "sidodelen" orsakar autofluorescens. Den transparenta nischen i mitten har ett område på 80 mm 2, medan sidodelen är 600 mm2. Behållarens djup är 15 mm och tjockleken är 1,5 mm. Dessa funktioner, förutom enhetens storlek och design, gör det möjligt att göra observationer under olika typer av högteknologiska mikroskop och förbereda proverna för elektronmikroskopiska undersökningar (Figur 2). Anordningens stängningssystem ger två lägen, en förseglad i frysen och den andra tillåter gasflöde i inkubatorn. CCK8-proliferations- och cytotoxicitetsanalyser visar liknande effekter på celler jämfört med de traditionella cellodlingsskålarna (kompletterande figur 2). Trypan blå uteslutningstest visar hög cellviabilitet (94%) under cellodlingen i MD (Figur 3).

De processer som kan utföras för ett prov i den enda anordningen innefattar (1) odling, (2) histologisk färgning, (3) immunfärgning, inklusive immunohistokemisk och immunofluorescensmärkning, (4) frysning, (5) upptining, (6) undersökning under optiska mikroskop, såsom ljusfält, mörkfält, fluorescens, konfokala och superupplösta mikroskop, (7) beläggning och undersökning direkt under ett svepelektronmikroskop, eller (8) förberedelse för transmissionselektronmikroskopi ( Figur 2).

Olika metoder finns för histologisk färgning, immunohistokemisk märkning eller fluorescerande märkning av organoider och sfäroider 10,11,12,13,14,24,25. Att skörda dem från hydrogelen är det första och viktigaste steget i den nuvarande tekniken. Efter detta steg tillåter vissa metoder helmonterad immunmärkning. De skördade organoiderna är inbäddade i paraffin, sektionerade och märkta för färgning och immunfärgning i andra. Avsnitten kanske dock inte presenterar hela urvalet och ger endast begränsade data relaterade till strukturens 3D-arkitektur. Dessutom är skador på dessa 3D-strukturer och förlust av antigenicitet välkända biverkningar av dessa tekniker.

De kompletterande nya protokollen för mikroskopiska undersökningar i denna artikel möjliggör en analys av helmonterade prover som fortfarande finns i en hydrogel. Protokollen som beskrivs här inkluderar två nyutvecklade formuleringar: lösning för immunhistokemi (S-IHC) och lösning för immunofluorescensmärkning (S-IF). Metoderna med dessa lösningar gör det möjligt för forskare att få mer exakta data, eftersom det inte finns några skadliga effekter av traditionella arbetsflöden, såsom centrifugering, pipettering och överföring av de känsliga strukturerna. Protokollet som beskrivs här eliminerar också behovet av skörd, blockering, röjning och antigenhämtningssteg och förkortar hela proceduren till 6-8 timmar. Dessutom tillåter metoden att samtidigt lägga till en till tre antikroppar till samma S-IF. Därför är det möjligt att få resultaten samma dag även efter de flera märkningsexperimenten, vilket är en annan fördel med protokollet som beskrivs här; Traditionella helmonterade immunofluorescensmärkningsprotokoll tar vanligtvis mellan 3 dagar och flera veckor 10,11,12,13,14.

Paraffinbäddning, ett annat skadligt steg som minskar antigeniciteten, utelämnas också. 3D-strukturen förblir i sin in vitro-miljö från början till slutet av den mikroskopiska undersökningen. Eftersom 3D-strukturen förblir i sina odlingsförhållanden efterliknar proteinuttrycks- och lokaliseringsdata in vivo-förhållanden bättre. Mer exakta resultat förväntas, eftersom metoden eliminerar stegen som påverkar provets antigenuttryck. Tabell 1 och tabell 2 visar hur dessa nya protokoll eliminerar steg, sparar tid och arbete i labbet och minskar kostnader och avfallsprodukter jämfört med traditionella arbetsflöden.

Förutom de avgörande stegen som beskrivs ovan är ett annat problem att tillhandahålla ett kryokonserveringsmedium och metod för att bevara provets 3D-struktur med högre cellviabilitetshastigheter 26,27,28,29,30,31. Kryokonservering är avgörande för att skapa ett stabilt modellsystem och möjliggöra biobankning av organoider och sfäroider32,33. Biobanking hela den ursprungliga 3D-strukturen möjliggör en mer trogen rekapitulation av det naturliga hälsotillståndet eller sjukdomen. De viktigaste övervägandena är bekvämligheten och tillförlitligheten hos kryokonservering och upptining av organoider / sfäroider. Organisk oidåtervinning efter upptining är mycket låg i de flesta nuvarande tekniker, ofta mindre än 50%. Nya studier har dock visat lovande resultat med förbättrad överlevnad26,27,28,29. visade att 78% av sfäroidcellerna överlevde efter kryokonservering när de använde University of Wisconsin-lösningen innehållande 15% DMSO28. Cellöverlevnadsförhållandet ökade till 83% i studien av Arai et al.29. Resultaten efter kryokonservering påverkas dock avsevärt eftersom 3D-strukturerna inte kan bibehålla samma egenskaper och kvalitet. Dessutom krävs serumfria reagenser för god tillverkningssed i farmaceutiska och diagnostiska miljöer. Traditionella arbetsflöden använder ett medium som innehåller fetalt bovint serum (FBS) och dimetylsulfoxid (DMSO) för långsam frysningsmetod, som båda är förknippade med handikapp. FBS är en animalisk produkt och kan ha batchvariationer. DMSO är ett mycket framgångsrikt kryoskyddande medel, men långvarig exponering, särskilt under upptining, kan orsaka cytotoxiska effekter30,31.

Denna artikel beskriver också frysnings- / upptiningsmetoden för hela organoider eller sfäroider medan de fortfarande är i en hydrogel. Två formler för frysning av organoider och sfäroider används i studien: (1) 10% DMSO innehållande traditionell fryslösning (FS) och (2) ett serum- och DMSO-fritt kryokonserveringsmedium. Detta kryokonserveringsmedium innehåller extracellulära matriskomponenter, som skiljer sig från nuvarande formler. Den extracellulära matrisen består av två huvudklasser av makromolekyler, proteoglykaner och fibrösa proteiner, som är väsentliga för fysisk byggnadsställning för de cellulära beståndsdelarna, men initierar också processer som krävs för vävnadsmorfogenes, differentiering och homeostas 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagener ger draghållfasthet, reglerar celladhesion, stöder kemotaxi och migration och direkt vävnadsutveckling37. Dessutom ger elastinfibrer rekyl till vävnader som genomgår upprepad stretch38. Ett tredje fibröst protein, fibronektin, styr organisationen av den interstitiella extracellulära matrisen och har en avgörande roll för att förmedla cellfästning och fungerar som en extracellulär mekanoregulator39. har visat den kryoskyddande effekten av kycklingkollagenhydrolysat på det naturliga aktomyosinmodellsystemet41. Deras resultat tyder på att kollagenhydrolysat kan hämma iskristalltillväxt, minska proteinfrysning-denaturering och oxidation på samma sätt som kommersiella kryoskyddande medel och ge en bättre gelstruktur efter frys-tina cykler. Att lägga till extracellulära matriskomponenter till kryokonserveringsmediet ger därför en säkrare och skyddande miljö för provet och stöder de levande strukturerna att läka efter frysning-upptining.

Dessutom beskriver den aktuella studien ett enkelt protokoll för att märka cytoplasmatiska membran och kärnor av levande organoider och sfäroider medan de fortfarande finns i hydrogelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Odla organoider och sfäroider

  1. Placera hydrogelen på is över natten (i kylskåp eller kylrum) för att tina.
  2. Placera den kommersiellt tillgängliga multifunktionella enheten (MD; se materialtabell) i inkubatorn 1 dag före experimentet (37 ° C, 5% CO2) för att värma.
  3. Placera sterila breda pipettspetsar i kylen vid 4 °C.
    OBS: Steg 1.1-1.3 ska utföras på dag 0 och steg 1.4-1.11 ska utföras på dag 1.
  4. Lägg hydrogelen på is i en laminär flödeshuv i 15 minuter.
    1. Valfritt: Späd hydrogelen i kallcellsodlingsmedium enligt tillverkarens rekommendation.
  5. Placera röret som innehåller en pellet av HepG2-celler (kommersiellt erhållen hepatocellulär karcinomcellinje; se materialtabell) på is.
  6. Platta 30-35 μL 100% hydrogel inom nischen hos den förvärmda anordningen för att skapa en geldroppe.
  7. Placera 10 000 HepG2-celler i mitten av toppen av varje hydrogeldroppe (figur 2) och inkubera i 15 minuter vid 37 °C.
  8. Täck hydrogeldroppen med 200 μl Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) med 10% Fetal Bovine Serum.
  9. Täck locket på MD i rätt läge för att tillåta gasflöde och placera enheten i inkubatorn.
  10. Mata cellerna med 200 μL DMEM med 10% FBS varannan dag.
  11. Kontrollera tillväxten av sfäroiderna under ett inverterat mikroskop (figur 3). Sfäroidbildning börjar efter den 3: e dagen. Video 1 visar placeringen av sfäroider på olika nivåer i en hydrogelkupol.
    ANMÄRKNINGAR: Det rekommenderas starkt att försiktigt aspirera vätskan som omger hydrogelen och långsamt tillsätta den nya vätskan till miljön för att förhindra att hydrogeldropparna skadas.

2. Hematoxylin och Eosin färgning av helmonterade organoider / sfäroider i en hydrogel

  1. Värm fixeringsmedlet (4% paraformaldehyd; PFA), PBS och hematoxylin (se materialförteckning) till 37 °C.
  2. Sug upp mediet som omger hydrogeldroppen med en pipett, tillsätt 100–200 μl 4 % PFA för att fixera och inkubera i 15–20 minuter vid 37 °C.
  3. Sug upp 4% PFA och tillsätt 200 μL PBS för att tvätta 3x i 5 min vardera vid 37 °C. Aspirera sedan PBS och inkubera med 200 μl Hematoxylinlösning i 15–20 minuter vid 37 °C.
  4. Sug upp Hematoxylin och tillsätt 200 μL dH2O för att tvätta 3x i 10 min vardera vid 37 °C. Aspirera dH2O-värdet och inkubera med 200 μl etanol i 5–10 minuter vid 37 °C.
  5. Aspirera etanolen och inkubera med 200 μl Eosin (se materialtabell) i 10 minuter vid 37 °C. Aspirera Eosin och tillsätt 200 μL dH2O för att tvätta i 5 min vid rumstemperatur (RT).
  6. Aspirera dH2O och tillsätt 100 μL glycerol för att täcka hydrogelfallet som monteringsmedium.
  7. Valfritt: Montera nischen med en täckglas. Detta steg kan utelämnas för att undvika att klämma organoider / sfäroider av betydande storlek.
  8. Stäng locket på MD ordentligt för att undvika torkning tills undersökning. Provet är stabilt för undersökning i minst 6 månader.

3. Immunohistokemi av helmonterade organoider / sfäroider i en hydrogel

  1. Värm den kommersiellt erhållna lösningen för immunhistokemi (S-IHC; se materialförteckning) till 37 °C.
  2. Inkubera organoiderna eller sfäroiderna i hydrogelen med 3% väteperoxid (H2O2) i 200 μl dH 2O i 5 min vid 37 °C.
  3. Sug väteperoxidlösningen och tvätta idH 2O i 5 minuter vid 37 °C. Sug upp dH2O och inkubera två gånger med 100 μl S-IHC vid 37 °C i 10 minuter vardera.
  4. Sug S-IHC och inkubera med 100 μL primär antikropp (se materialtabell) utspädd i S-IHC i 1-2 timmar vid 37 °C (enligt tillverkarens rekommendationer om arbetsutspädning).
  5. Aspirera den primära antikroppslösningen och inkubera med 100 μL S-IHC 3x i 5 minuter vardera vid 37 °C.
  6. Aspirera 100 μl S-IHC och inkubera med en biotinylerad sekundär antikropp (se materialtabell) i 10 minuter vid 37 °C.
  7. Sug den sekundära antikroppslösningen och inkubera med 100 μl S-IHC 3x i 5 minuter vardera vid 37 °C. Aspirera S-IHC och inkubera med 100 μl pepparrotsperoxidas (HRP) märkt streptavidin (se materialtabell) i 10 minuter vid 37 °C.
  8. Aspirera HRP-märkt streptavidin och inkubera med 100 μL S-IHC 3x i 5 min vardera vid 37 °C.
  9. Sug upp S-IHC och inkubera med 100 μl DAB/AEC-kromogenlösningsblandning (se materialtabell) i 5–10 minuter vid 37 °C.
  10. Övervaka färgningens intensitet under ett ljusmikroskop.
  11. Tvätta med dH 2 O 3x i2min vardera.
  12. Valfritt: Inkubera med 100 μl hematoxylin (se materialförteckning) för kärnteknisk motfärgning i 5 minuter vid 37 °C.
  13. Aspirera Hematoxylin och tvätta i dH2O i 5 min.
  14. Aspirera dH2O och täck hydrogeldroppen med 100 μL glycerol som monteringsmedium.
  15. Stäng locket på MD ordentligt tills mikroskopisk undersökning.
    OBS: Antigenhämtning och proteinblockeringssteg utelämnas i detta protokoll eftersom S-IHC eliminerar dessa steg.

4. Immunofluorescensmärkning av helmonterade organoider / sfäroider i en hydrogel

  1. Värm upp följande material till 37 °C: 4 % PFA, PBS, S-IF, primär antikroppslösning i S-IF, sekundär antikroppslösning i S-IF, kärnfläck och glycerol (se materialförteckning).
  2. Sug cellodlingsmediet och fixera med 200 μl 4 % PFA i 15–30 minuter vid 37 °C. Sug fixeringsmedlet och tvätta i S-IF 3x i 10 min vardera vid 37 °C.
  3. Lägg till dH2O på sidan som omger nischen för att ge fuktighet under följande steg.
  4. Sug upp S-IF som omger hydrogeldroppen och inkubera hydrogeldroppen med 100 μl primär antikroppslösning (se materialtabell) i S-IF i 30–60 minuter vid 37 °C.
  5. Sug den primära antikroppslösningen och tvätta i S-IF 3x i 10 min vardera vid 37 °C.
  6. Sug S-IF och inkubera med 100 μL sekundär antikroppslösning (se materialtabell) i S-IF i 30–60 minuter vid 37 °C i mörker.
  7. Aspirera den sekundära antikroppslösningen och tvätta med PBS 3x i 10 min vardera vid 37 °C i mörker.
  8. Aspirera PBS och inkubera med 100 μl kärn-DNA-fläck innehållande monteringsmedium eller glycerol vid 37 °C i mörker.
  9. Fyll nischen med glycerol för att undvika torkning.
  10. Valfritt: Täck nischen med en täckglas. Detta steg kan utelämnas för att undvika att klämma på organoiderna / sfäroiderna.
  11. Tätt stäng MD. Prover i MD kan förvaras vid 4 °C i mörker i minst 6 månader med minimal förlust av fluorescens.
  12. Använd följande inställningar för konfokalmikroskopisk undersökning: ställ in pinhålsvärdet för alla kanaler till 20,1, håll förstärkningsmasterkonstanten vid 550 för 488 nm, 485 för 550 nm och 450 för 594 nm, håll lasereffekten konstant för alla experiment och den lägsta procentsatsen vid 2,0.
    OBS: Primära antikroppar: Anti-Na-K ATPas (1:100), Anti-arginas (1:50), Anti-Albumin (1:50), Anti-Beta-galaktosidas (1:25), Antimitokondriell antikropp (1:100), Anti-Golgi Antikropp (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6 antikropp (1:100). Sekundära antikroppar: Get anti-kanin IgG (H + L) - 488, Get anti-kanin IgG (H + L) -550, Get anti-Mouse IgG (H + L) -488, Get anti-Mouse IgG (H + L) -550, Get anti-Chicken IgY (H + L) -647. Utspädningen för alla sekundära antikroppar är 1:100. Dessutom används FITC-Phalloidin (1:100), en konjugerad antikropp, (se Materialförteckning).

5. Plasmamembran och kärnmärkning av levande organoider och sfäroider i en hydrogel

  1. Förbered märkningslösning som innehåller Alexa-fluorvetegroddsagglutinin (5,0 μg / ml) och Hoechst (2 μM) i Hanks balanserade saltlösning (HBSS), enligt tillverkarens rekommendationer (se materialtabell) och värm upp till 37 ° C.
  2. Aspirera cellodlingsmediet och tillsätt 100 μL märkningslösning för att täcka hydrogeldroppen. Inkubera i 15–30 min vid 37 °C.
  3. Ta bort märkningslösningen och tvätta två gånger i PBS 2x i 10 min vardera vid 37 °C. Tillval: Fixera med 200 μl 4 % formaldehyd i 15 min vid 37 °C.
  4. Täck hydrogeldroppen med glycerol som monteringsmedium. Valfritt: Montera nischen med ett täckglas.
  5. Stäng locket på MD ordentligt och håll det kylt i mörkret tills fluorescens / konfokal mikroskopisk undersökning. Den är stabil i minst 6 månader.

6. Frysning och upptining av helmonterade organoider/sfäroider i en hydrogel

  1. Frys organoiderna enligt stegen nedan.
    1. Värm upp den kommersiellt erhållna fryslösningen (FS; se materialtabell) till 37 °C.
    2. Aspirera cellodlingsmediet som omger hydrogelkupolen försiktigt.
    3. Tillsätt 200 μL FS försiktigt. Inkubera provet med FS vid 37 °C i 1 timme.
    4. Stäng enhetens lock ordentligt och placera det i en skumlåda. Placera denna skumlåda i en annan skumlåda, som visas i kompletterande figur 3. Stäng båda skumlådorna tätt. Två skumlådor inuti varandra ger ett temperaturkylningsgradientintervall på 1 till 2 ° C / min av provet i en frys på -20 ° C.
    5. Placera lådan vid -20 °C i 2 timmar. Överför lådan till en frys på -80 °C och låt den stå över natten.
    6. Ta ut provet från lådorna. Provet i MD kan förvaras i frysen för -80 °C i 6 månader.
    7. Överför MD som innehåller provet till tanken på flytande kväve för långvarig lagring.
  2. Tina organoiderna enligt stegen nedan.
    1. Ta ut MD som innehåller provet från frysen/kvävetanken och placera det direkt i en inkubator vid 37 °C. Inkubera i 1 timme vid 37 °C.
    2. Tillsätt 200 μl varmt odlingsmedium till nischen (förhållandet mellan FS och cellodlingsmediet är 1:1) och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
    3. Tillsätt mer varmt odlingsmedium till nischen (förhållandet mellan FS och cellodlingsmediet är 1:2) och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
    4. Aspirera mediet och FS-blandningen försiktigt. Fortsätt till svepelektronmikroskopi (steg 7) och transmissionselektronmikroskopi (steg 8) avbildning av helmonterade organoider / sfäroider i hydrogelen.

7. Svepelektronmikroskopi av helmonterade organoider / sfäroider

  1. Värm upp Karnovskys fixativa och postfixativa lösning (se materialtabell) till rumstemperatur (RT).
  2. Aspirera cellodlingsmediet som omger hydrogelen i MD. Placera provet i MD på is i den laminära flödeshuven i 15 minuter.
  3. Aspirera den flytande hydrogelen som omger organoiderna / sfäroiderna mycket försiktigt. En begränsad mängd matrigel kan stanna i nischen för att undvika att skada och förlora provet.
  4. Fixa med Karnovskys fixeringsmedel (2% PFA, 2,5% glutaraldehyd i 0,15 M Cacodylate buffert och 2 mM CaCl2; se Materialförteckning) vid RT i 1 h.
  5. Aspirera fixeringsmedlet försiktigt och tvätta med destillerat vatten (dH2O) 3x i 15 min vardera.
  6. AspireradH2Oförsiktigt och fixera med postfixativ lösning (1% vattenhaltig osmiumtetroxid [OsO4]; se materialtabell) vid RT i 1 h.
  7. Aspirera postfixativet försiktigt och tvätta med destillerat vatten (dH2O) 3x i 15 min vardera.
  8. Dehydrat i en graderad serie etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), blandning av etanol / aceton (1: 1; 1: 2) och absolut aceton vid RT i 15 minuter vardera.
  9. Torka med en kritisk punkttork.
  10. Täck provexemplaret i enheten med 6 nm guld/palladium med en sputterbeläggning (se materialförteckning) i 90 s.
  11. Observera under ett svepelektronmikroskop med en sekundär elektrondetektor i linsen vid 2-3 kV i vakuumläge (5 x 10-6 mA). Ta bilder med ett arbetsavstånd på 8,1-8,2 mm och vid 675x, 1050x och 1570x förstoringar.
    OBS: Alla steg utförs i MD. Använd 200-250 μl lösning för varje steg.

8. Transmissionselektronmikroskopi av helmonterade organoider/sfäroider i en hydrogel

  1. Värm upp Karnovskys fixeringsmedel till 37 °C. Aspirera cellodlingsmediet som omger hydrogelen i MD.
  2. Fixa provet med Karnovskys fixativ vid RT i 1 timme. Tvätta med dH2O 3x i 15 min vardera.
  3. Postfixering med 2% vattenhaltig OsO4 och 2,5% kaliumferrocyanid vid RT i 45 min. Tvätta med dH2O 3x i 10 min vardera.
  4. Inkubera i 0,5 % tiokarbohydrazid (TCH; se materialtabell) vid RT i 30 minuter. Tvätta med dH2O 3x i 10 min vardera.
  5. Inkubera i 2% vattenhaltig OsO4 vid RT i 30 min. Tvätta med dH2O 3x i 10 min vardera.
  6. Inkubera i 2% uranylacetatlösning (se materialtabell) vid RT i 1 timme.
    OBS: I detta steg kan sfäroider hållas vid 4 ° C över natten.
  7. Inkubera i blyaspartatlösning (se materialtabellen) vid 60 °C i 45 minuter. Tvätta med dH2O 3x i 10 min vardera.
  8. Dehydrat i en graderad serie etanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) och absolut aceton vid RT i 15 minuter vardera.
  9. Behandla med en blandning av (1:1; 1:2) aceton/eponiharts och rent eponiharts (se materialtabell) vid RT i 2 timmar vardera.
  10. Polymerisera hartset vid 60 °C över natten (minst 16 timmar). Efter polymerisationen, avlägsna hartsblocket från MD, som visas i kompletterande figur 4.
  11. Fäst hartsblocket på ett större med ett hartslim. Trimma blocket och nå platsen för organoider eller sfäroider.
  12. Få halvtunna (1 000 nm) och ultratunna sektioner (60 nm) med en ultramikrotom (se Materialförteckning).
  13. Placera de ultratunna sektionerna på 100 mesh kopparnät och observera under ett svepelektronmikroskop med en STEM-detektor vid en accelererande spänning på 30 kV. Ta bilder med ett arbetsavstånd på 44 mm och vid 2580x, 5020x och 6060x förstostor.
    OBS: Använd 200-250 μL lösning för varje steg. Steg 8.1-8.10 utförs i MD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna artikel representerar en mångsidig enhet (MD) och kompletterar metoder för odling, frysning, upptining, histologisk färgning, immunohistokemisk färgning, immunofluorescensmärkning, beläggning och bearbetning av hela organoider eller sfäroider medan de fortfarande är i en hydrogel i en enda unikt utformad miljö. Den aktuella studien var utformad för att förbereda HepG2 levercancersfäroider i 35 hydrogeldroppar i 35 MD. Experiment utfördes i tre exemplar för att säkerställa noggrannhet. Dessutom var lungorganoider i MD immunofluorescerande märkta som ett exempel för att visa resultaten av de nuvarande metoderna för organoidstudier.

Figur 1 visar en närmare titt på enheten som innehåller en hydrogelkupol. Nischens storlek och form är utformad för att ge en skyddande miljö för hydrogelen som innehåller organoiderna / sfäroiderna och spara de reagens som används under olika processer. Dessutom kan sidodelen av anordningen som omger nischen användas som fuktighetskammaren under immunfärgningsexperiment. Mediet för att mata provet kan variera mellan 100-200 μL, beroende på höjden på hydrogeldroppen. Den aktuella studien fokuserar på den kupolbaserade metoden eftersom många hydrogeler, kommersiella extracellulära matriskomponenter och källarmembranextrakt gör det möjligt för användaren att förbereda droppar. Det är dock också möjligt att fylla nischen av MD med hydrogelen och sedan fröa cellerna inuti den för att generera organoider / sfäroider. Den metoden kan vara att föredra om matrisens viskositet inte tillåter framställning av kupoler eller om experimentet omfattar stora volymer organoider. Hydrogeltypen och hydrogel/ mediumförhållandet för beredning av droppar kan variera beroende på celltyp, experimentell design och medium. Figur 1  representerar också enhetens design som gör det möjligt att undersöka organoider / sfäroider under brightfield-, konfokal- och svepelektronmikroskop medan organoider / sfäroider fortfarande är i sin ursprungliga in vitro-miljö .

Figur 2 presenterar hur man fröer celler i en hydrogel och undersöker utvecklingen av sfäroider eller organoider. Designen och måtten på den mångsidiga enheten har också presenterats i den figuren. Video 1 visar placeringen av 3D-växande sfäroider i en hydrogel. Figur 3 representerar levande bilder av växande sfäroider från dag 3 till dag 21. Tiden för bildandet av sfäroider och organoider kan variera beroende på provets art. Till exempel bildades sfäroider från HepG2-celler och HEK-celler inom 3 dagar, medan bildandet av lever- och gallorganoider varade i 2 veckor under experimenten.

Hematoxylin och Eosinfärgade sfäroider ses i figur 4. Bilden representerar välbevarade och homogent färgade sfäroider i olika storlekar och fusioner av sfäroider. Levande celler i mitten av sfäroiderna är anmärkningsvärda. Bilden visar också de känsliga kopplingarna mellan cellerna från olika sfäroider. Dessa bräckliga anslutningar kunde inte visualiseras efter traditionella arbetsflöden eftersom överföring, pipettering eller centrifugering skulle skada dem. Figur 5  visar immunfärgning av sfäroider med antikroppen som är specifik för arginas, en av de vanligaste markörerna för diagnos och prognos för hepatocellulärt karcinom42,43. Mikrograferna avslöjar differentierade och odifferentierade levercancerceller i samma sfäroider. Denna figur innehåller bilder med och utan motfärgning med Hematoxylin. Forskare kan välja att utelämna motfärgning med Hematoxylin i fall där det skulle vara svårt att skilja märkta områden i en 3D-struktur.

Figur 6 representerar ett annat enkelt protokoll för helmonterad visualisering av levande organoider / sfäroider i en hydrogel: levande cellmembran och kärnfärgning. Metoden möjliggör samma märkningstäthet i periferin och mitten, vilket visar fullständig reagenspenetration. Figur 7, figur 8 och figur 9 visar representativa bilder av sfäroider märkta med en, två respektive tre antikroppar. En till tre primära antikroppar späds ut i S-IF samtidigt. På liknande sätt späds en till tre matchande sekundära antikroppar som är lämpliga för experimentet samtidigt i S-IF. Immunmärkningsprotokollet gör det möjligt för forskare att markera 3D-strukturerna inom 4-6 timmar utan att förlora eller skada dem. Bakgrunden är transparent, och tekniken som används här kräver inte ytterligare clearing, antigenhämtning eller blockeringsmetoder / lösningar. Metoden gör det också möjligt för forskare att märka provet med flera antikroppar i ett enda steg. Med andra ord förbereder användaren en lösning som innehåller en till tre primära antikroppar och en annan lösning som matchar med en till tre sekundära antikroppar. Protokollet som beskrivs här eliminerar sekventiella märkningssteg med olika antikroppar i konventionella metoder.

Figur 10 representerar svep- och överföringselektronmikroskopiska bilder av sfäroiderna. Den första raden visar bilder av hela sfäroider i MD under ett svepelektronmikroskop. Den andra raden innehåller transmissionselektronmikroskopiska bilder av sfäroider efter beredning av hartsblocken innehållande helmonterade sfäroider i MD, samt bilder av snittade och färgade sfäroider. Välbevarade cytoplasmatiska organeller och andra ultrastrukturella egenskaper hos cellerna visar effektiviteten av detta enkla protokoll, vilket skyddar 3D-strukturen hos hela provet. MD tillåter också forskarna att frysa och tina de helmonterade proverna i en hydrogel. Figur 11  demonstrerar hydrogelkupoler och sfäroiderna vid en högre förstoring före och efter frysning. Oregelbundenheten vid gränserna för hydrogelkupolen är anmärkningsvärd. Rundheten hos de kryokonserverade sfäroiderna är dock nästan stabil efter upptining jämfört med sfäroiderna före frysning. Levande cellmembran och kärnmärkningsmetoder tillämpas också 48 timmar efter upptining för att visa hur frysnings- / upptiningsproceduren påverkade 3D-arkitekturen, cellmembranet och cellviabiliteten. Den traditionella fryslösningen innehållande dimetylsulfoxid och den nuvarande nyformulerade lösningen, SF, visar liknande resultat. Mer än 75% av 3D-strukturerna kan överleva i detta protokoll. Emellertid, ytterligare experiment behövs för att avslöja de långsiktiga biverkningarna av varje formulering på organoider och sfäroider.

Tabell 1 och tabell 2 jämför de traditionella arbetsflödena med de som beskrivs här baserat på stegnummer, varaktighet och avfallsproduktion (dvs. det totala antalet plasthandskar, pipettspetsar, serologiska pipetter, centrifugrör, mikrocentrifugrör, cellodlingskärl, kryovialer etc. för varje arbetsflöde).

Kompletterande figur 1 representerar sekventiella steg som kan utföras i en enda MD schematiskt. Kompletterande figur 2 visar resultaten av experimenten som är utformade för att jämföra cellviabiliteten, toxiciteten och proliferationshastigheterna hos HepG2-celler i en MD eller en traditionell glasbottnad skål. Kompletterande figur 3 visar de skumlådor som har använts för att frysa proverna i MD. Tilläggsfigur 4 sammanfattar stegen för att ta ut ett hartsblock från en MD. Kompletterande figur 5 inkluderar bilder av luftvägsorganoider som var immunofluorescerande märkta och sedan visualiserade medan de fortfarande var i MD. På samma sätt visar Video 2 två immunofluorescerande märkta luftvägsorganoider i en MD. Slutligen är kompletterande figur 6 en graf som jämför medelintensiteten för cellmembranmärkningsintensitet i levande sfäroider före och efter frysning med hjälp av traditionellt arbetsflöde och arbetsflödet som beskrivs här. Image J-programvaran har använts för analys.

Figure 1
Bild 1: Multifunktionscellodlingsenheten (MD). (A) Nischen (N), den centrala delen av enheten, är utformad för att skapa en skyddande miljö för de organoider / sfäroider som odlas i en hydrogeldroppe (D) under sekventiella processer. Sidan (S), den omgivande delen av nischen, kan användas som en luftfuktarkammare under immunfärgningsexperiment. (B) Det genomskinliga centrumet i locket gör det möjligt för användaren att observera organoiderna / sfäroiderna när enheten är stängd. (C) Hydrogelkupolen som innehåller organoider i MD kan färgas eller bäddas in i ett hartsblock för transmissionselektronmikroskopi. Locket innehåller också nischen (N) för hängande droppmetodik. Enhetens storlek och design gör det möjligt för användaren att undersöka organoiderna / sfäroiderna under (D) ljusfält, (E) konfokala och (F) svepelektronmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Såda celler inuti en hydrogel. (A) Cellpelleten i pipetten sätts in i toppen av kupolen. Efter 3-5 dagar blir sfäroider synliga i kupolen, särskilt vid droppens periferi. (B) Fyra levande bilder av växande sfäroider från varje kvartal i en kupol fångades och slogs samman. Skalstreck = 200 μm. (C)Utformningen och måtten (i centimeter) för multifunktionsenheten (MD). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Utveckla sfäroider i en hydrogeldroppe från dag 3 till dag 21. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Hematoxylin och Eosinfärgade helmonterade sfäroider i MD. Visualisering av anslutningarna mellan cellerna i de intilliggande eller smältande sfäroiderna. De känsliga processerna mellan cellerna (pilarna) är synliga eftersom helmonteringsprovet i hydrogelen fixeras, färgas och undersöks utan att skada 3D-odlingsstrukturerna. Skalstreck: dag 3, dag 9 = 50 μm; dag 7, dag 17 = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Immunohistokemisk färgning av helmonterade sfäroider i hydrogelen i MD. Proverna immunbesudlades med en antikropp specifik för arginas. Arginaspositiva (röda pilar) och negativa (svarta pilar) celler ses i sfäroiderna. Bilderna är från två experiment: (A-C) utan och (D-F) med motfärgning med hematoxylin. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Konfokal bild av en levande organoid i hydrogelen. De levande organoiderna märktes med levande cellmembran (WGA) och kärnfläckar (Hoechst). Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Immunofluorescensmärkning av helmonterade sfäroider i en hydrogel med en antikropp och en kärnfläck (Hoechst). (AC) Den övre panelen visar en sfäroid märkt med en antikropp som är specifik för Na-K ATPase i cellmembranet. (D-F) Den nedre panelen visar placeringen av en annan antikropp som är specifik för arginas, ett cytosoliskt protein som är specifikt för hepatocellulärt karcinom, i levercancersfäroider. Färgningsprotokollets varaktighet: 6 timmar. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Immunofluorescensmärkning av helmonterade sfäroider i en hydrogel med två antikroppar och en kärnfläck (Hoechst). (A-C) Den övre panelen visar en sfäroid märkt med två antikroppar som är specifika för albumin och Ov6. Skalstreck = 5 μm. (D-F) Den nedre panelen visar placeringen av alfa-fettoprotein och Ov6 i levercancersfäroider. Skalstreck = 20 μm. Färgningsprotokollets varaktighet: 6 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Immunofluorescensmärkning av helmonterade sfäroider i en hydrogel med tre antikroppar och en kärnfläck (Hoechst). (A-E) Sfäroiden i den övre panelen är märkt med antikroppar som är specifika för arginas, Na-K ATPas och beta-galaktosidas. Skalstreck = 10 μm. (F-J) Mittpanelen visar en sfäroid märkt med Ov6, beta-galaktosidas och alfa-feato-protein. Skalstreck = 20 μm. (K-O) Sfäroiden i den nedre panelen har märkts med FITC-falloidin, anti-mitokondriell antikropp och anti-Golgi-antikropp. Skalstreck = 20 μm. Observera den höga märkningsspecificiteten och den reducerade bakgrunden. Färgningsprotokollets varaktighet: 6 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Elektronmikroskopibilder. (AC) Svepelektronmikroskopiska bilder av hela sfäroider i hydrogelen i MD. Skalstreck = 10 μm. (D-F) Ultrastrukturella egenskaper hos cellerna i en sfäroid har också visualiserats under ett transmissionselektronmikroskop. Skalstänger: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: Live-bilder av sfäroider före och efter frysning. (A–F) Oregelbundenheten hos hydrogelkupolernas gränser är uppenbar efter frysning. Storleken och rundheten hos sfäroider förblir emellertid likartade. (F) Cellmigration på odlingsytan kan ses efter upptining. (G–L) Det levande cellmembranet (WGA) och kärnfärgningen (Hoechst) uppvisar liknande cellviabilitet och intakta cellmembran före och efter frysning av hela sfäroiderna i en hydrogel i MD. Skala basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tradional arbetsflöde Arbetsflöde med multifunktionsenhet (MD)
Trappsteg 22 6
Tid 9 dagar 4 dagar
Avfallsprodukter 26 9

Tabell 1: Jämförelse av stegnummer, tid och avfallsproduktion mellan traditionella och nya arbetsflöden under ett kortsiktigt experiment.

Traditionellt arbetsflöde Arbetsflöde med lösning för immunofluorescens (S-IF)
Trappsteg 25 7
Tid 120 timmar 6-8 timmar
Avfallsprodukter 28 10

Tabell 2: Jämförelse av konventionell immunmärkning och det nya immunmärkningsprotokollet.

Video 1: Tidsserier av bilder på olika nivåer av en hydrogel innehållande sfäroider under ett inverterat faskontrastmikroskop. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: 3D-struktur av två luftvägsorganoider märkta med antikroppar för Cytokeratin 5 och DAPI. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande figur 1: Översikt över experimentet. Detta schema visar de sekventiella experimentella stegen för odling och undersökning av helmonterade organoider i en hydrogel. Tekniken som beskrivs här gör det möjligt att odla, frysa, tina, märka och undersöka organoiderna under olika mikroskop. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Jämförelse av cellviabilitet, toxicitet och proliferationshastigheter för HepG2-celler i en traditionell glasbottnad skål eller en MD. HepG2-celler odlades på (A) en traditionell glasbottnad cellodlingsskål eller (B) i en MD för att jämföra cellviabilitet och toxicitet. (C) Trypan blå uteslutning test användes för att visa viabiliteten. Skalstreck = 20 μm. Resultaten jämfördes med (D-E) CCK8 cytotoxicitet och (F) cellproliferationsanalyser. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Placering av de två skumlådorna. En skumlåda placeras inuti den andra under den långsamma frysningsprocessen av hela organoiderna eller sfäroiderna i MD. *betecknar de två rutorna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Steg som visar hur hartsblocket avlägsnas från MD efter polymerisation av hartset. (A) Hartsblocket som omger sfäroiderna eller organoiderna bereds inuti MD-nischen och polymeriseras sedan. (B–D) Sedan, med en lämplig tunn stång, skjuts hartsblocket för att ta bort det från nischen. (E) Därefter avlägsnas hartsblocket, med plasten nedan. (F–G) Slutligen används ett par pincett för att separera dem om blocket fortfarande är fäst vid plasten. (H) Blocket är klart för tunn sektionering. De helmonterade organoiderna eller sfäroiderna i hartsblocket (*) är redo för sektionering för transmissionselektronmikroskopi. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Luftvägsorganoider som var immunofluorescerande märkta och sedan visualiserades medan de fortfarande var i MD. (AC) Den övre panelen visar cirkulära luftvägsorganoider med en central lumen. Grön representerar luftvägsstamceller som uttrycker Cytokeratin 5 i organoidens yttersta ring, och blått representerar kärnorna. Skalstreck = 50 μm. (D-F) Den nedre panelen visar den tredimensionella bilden av de två organoiderna sida vid sida i (D) DAPI- och (E) Alexa 488-filtren, liksom (F) sammanslagna bilden. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 6: Jämförelse av märkningstätheten på cellernas levande cellmembran. Diagrammet jämför sfäroiderna före och efter frysning med hjälp av det traditionella och för närvarande antagna arbetsflödet. Analysen utfördes med hjälp av bildanalysprogramvaran Image J. Förkortningar: IntDen = Integrerad densitet (fluorescensintensitet i de valda sfäroiderna). CTCF = Korrigerad total cellfluorescens. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MD, som kompletterar formuleringar och protokoll som beskrivs här, underlättar snabb och spontan 3D-tillväxt av organoider och sfäroider i en mer kontrollerad miljö och fortsätter experimentet under samma förhållanden. Provet stannar i samma miljö under hela processen, och nästan 100% av de 3D-växande arkitekturerna förblir intakta i behållaren. Detta förbättrar homogeniteten under de sekventiella experimenten och möjliggör en längre odlingsperiod. Dessutom minskar antalet steg under organoider och sfäroidbearbetning drastiskt jämfört med traditionella arbetsflöden (figur 4), vilket i sin tur minimerar hanteringstiden och mänskliga fel och minskar föroreningsrisken. Dessutom förbättrar detta tillförlitligheten och validiteten eftersom experimentella förhållanden förblir stabila samtidigt som de skyddar 3D-odlingsstrukturerna i en enda miljö. Det hjälper till att spara tid och arbete i labbet samtidigt som noggrannheten, tillförlitligheten och giltigheten förbättras. Dessutom möjliggör det spårning av enskilda 3D-odlingsstrukturer under hela sekventiell process. Undersökning av storlek och positionsförändringar under kulturen och deras svar på olika föreningar är möjlig i anordningen. Detta ger en utmärkt in vitro experimentell modell för rekapitulation av utvecklingen av människokroppen och sjukdomarna. Forskare kan undersöka stadierna under fusionen av sfäroider och organoider, en viktig mekanism för migration i sjukdomar och normal utveckling44,45,46,47. Nya studier som syftar till modellering av fusion i labbet föredrar att använda organoid- och sfäroidmodeller44,45,46,47.

Denna enhet gör det också möjligt för forskare att stoppa undersökningen i en brådskande situation genom att frysa dem i sitt nuvarande tillstånd och sedan fortsätta utan förlust när förhållandena tillåter nya experiment. Till exempel, på grund av COVID-pandemin, behövde forskare stoppa experiment omedelbart och förlora sina värdefulla material och data. Det finns ingen nuvarande lösning för att säkra ett experiment om det plötsligt avbryts av studierna på grund av förändrade omständigheter.

Begränsningar av tekniken
De tekniker som beskrivs här har utvecklats för att undersöka den spontana utvecklingen av organoider och sfäroider, en modell för att förstå utvecklingen av den normala människokroppen och sjukdomar. Därför kan den nuvarande anordningen och metoderna inte användas för att utveckla sfäroider eller organoider av enhetlig storlek som har föredragits för drogscreeningstester. En annan begränsning är relaterad till storleken på sfäroiderna och organoiderna. Fullständiga organoider och sfäroider kan vara mycket täta, med flera cellskikt som kräver reagens som bevarar eller märker proverna för att tränga in i deras kärna. Inkubationsperioderna för alla protokoll, inklusive färgning, märkning och frysning, varierar dock beroende på provets storlek och mikromiljögelén som omger provet. Till exempel kräver större organoider och styvare geler mer förlängda inkubationsperioder för att möjliggöra penetration i mitten av provet.

Framtida applikationer
Enheten och dessa metoder möjliggör långsiktig undersökning av 3D-växande organoider och sfäroider för att förstå organogenes, vävnadsmorfogenes och sjukdomar samtidigt som reproducerbarheten, tillförlitligheten och noggrannheten förbättras. De organoider eller sfäroider som är märkta i MD kan undersökas med hjälp av högteknologisk mikroskopiteknik, inklusive multifotonlaserskanning och ljus-ark fluorescensmikroskopi. Dessutom kan forskare undersöka samma prov i en enda enhet under både ett konfokalt och svepelektronmikroskop för att göra en korrelativ studie, CLEM (Correlative light electron microscopy). Enheten och metoderna kan också användas för biobankorganoider och sfäroider samtidigt som de skyddar 3D-arkitekturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ranan Gulhan Aktas äger MD, S-IHC, S-IF och FS patentansökningar. Olgu Enis Tok var involverad i utvecklingen av dessa produkter. Olgu Enis Tok och Gamze Demirel är FoU-teammedlemmar i företaget som heter Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut och Ozgecan Kayalar har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Dale Mertes från University of Chicago för utarbetandet av diagram, till Dr. Mehmet Serif Aydin för hans tekniska support vid Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies och till Dr. Rana Kazemi från Maltepe University för redigering av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol (EtOH) Merck 8187602500 Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone Merck 8222512500 Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)   Invitrogen I34406 Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody Biocare Medical CP 028 A Store at +4 °C
Anti-albumin antibody Abcam EPR20195 Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal Abcam 134435 Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5 Abcam 53121 Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody Biocare Medical ACI 3058 A, B Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C1016-500G Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) Abcam ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL  Nest 601051
Centrifuge tubes, 50 mL  Nest 602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus Telstar EN12469
CO2 Incubator Panasonic KM-CC17RU2
Copper Grids Electron Microscopy Sciences G100-Cu Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture   Sigma Aldrich AEC101 Store at +4 °C
Diamond knife Diatome Ultra 45°, 40-US Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology Biofroxx 67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes Nest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41966-029 Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic Bright Slide 2.BS01-105-1000
Epon resin  Sigma 45359-1EA-F Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier Pan Biotech P30-3304 Store at +4 °C
Freezing Solution (FS) Cellorama CellO-F Store at +4 °C
Glass knife maker Leica EM KMR3 For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) Leica 7890-08 Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%  Electron Microscopy Sciences 16210 Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution Sigma Aldrich 56-81-5 Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 Invitrogen A32933 Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35502 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84540 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35552 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84541 Store at +4 °C
Hematoxylin Harris  Bright Slide 2.BS01-104-1000
HepG2 cells ATCC HB-8065 Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 R&D Systems MAB2020 Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354248 Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354234 Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel ThermoFischer Scientific A1413201 Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel Biotechne, R&D Systems BME001-01 Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid Sigma 11189-100G Store at RT
Lead aspartate solution Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate Electron Microscopy Sciences 17900 Store at RT
Leica Confocal Microscope Leica DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss
Microplate reader Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD) Cellorama CellO-M
Nuclear-DNA stain Invitrogen H3569 Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain ThermoFischer Scientific 62248 DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% Electron Microscopy Sciences 19190 Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody R&D systems MAB2020 Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%  Sigma 1.04005.1000 Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets MP Biomedicals, LLC 2810305
Post-fixative solution %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%  Electron Microscopy Sciences 26603-01 Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS Zeiss Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL Nest 620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment Zeiss GeminiSEM 500 We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack ScyTek Laboratories SHP125 Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 Electron Microscopy Sciences 11655 Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] GeneTex GTX22871 Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) Cellorama CellO-IF Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) Cellorama CellO-P Store at +4 °C
Specimen trimming device Leica EM TRIM2 For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater Leica EM ACE200 Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH) Sigma 223220-5G Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Ultra gel super glue Pattex PSG2C For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome Leica EM UC7 For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL Nest 171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL Isolab L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL  Nest 110919HA01
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).

Tags

Biologi utgåva 190
Odling, frysning, bearbetning och avbildning av hela organoider och sfäroider medan de fortfarande är i en hydrogel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., … More

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., Akbulut, Z., Kayalar, O., Aktas, R. G. Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel. J. Vis. Exp. (190), e64563, doi:10.3791/64563 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter