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Biology

हाइड्रोजेल में रहते हुए पूरे ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड की संवर्धन, ठंड, प्रसंस्करण और इमेजिंग

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64563
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1, 3,5, 6, 2,3,4
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

Summary

वर्तमान अध्ययन विभिन्न माइक्रोस्कोप के तहत पूरे स्फेरॉइड और ऑर्गेनोइड्स की खेती, ठंड, पिघलने, प्रसंस्करण, धुंधला, लेबलिंग और जांच करने के तरीकों का वर्णन करता है, जबकि वे एक बहुउद्देशीय उपकरण के भीतर एक हाइड्रोगेल में बरकरार रहते हैं।

Abstract

सेल कल्चर लैब्स में तीन-आयामी बढ़ती संरचनाएं ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड, दो-आयामी संस्कृति मॉडल की तुलना में बेहतर मॉडल के रूप में तेजी से मान्यता प्राप्त हो रही हैं, क्योंकि वे मानव शरीर की बेहतर नकल करते हैं और पशु अध्ययन पर फायदे हैं। हालांकि, इन अध्ययनों को आमतौर पर प्रजनन क्षमता और स्थिरता के साथ समस्याओं का सामना करना पड़ता है। लंबी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दौरान - विभिन्न सेल कल्चर वाहिकाओं, पिपेटिंग और सेंट्रीफ्यूजिंग के बीच ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के हस्तांतरण के साथ - ये अतिसंवेदनशील और नाजुक 3 डी बढ़ती संरचनाएं अक्सर क्षतिग्रस्त या खो जाती हैं। अंततः, परिणाम काफी प्रभावित होते हैं, क्योंकि 3 डी संरचनाएं समान विशेषताओं और गुणवत्ता को बनाए नहीं रख सकती हैं। यहां वर्णित विधियां इन तनावपूर्ण चरणों को कम करती हैं और प्रसंस्करण अनुक्रम में ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के लिए एक सुरक्षित और सुसंगत वातावरण सुनिश्चित करती हैं, जबकि वे अभी भी एक बहुउद्देशीय उपकरण में हाइड्रोगेल में हैं। शोधकर्ता एकल बहुउद्देशीय उपकरण का उपयोग करके कॉन्फोकल से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप तक विभिन्न उच्च तकनीक उपकरणों के तहत ऑर्गेनोइड्स या स्फेरॉइड की संरचना की जांच कर सकते हैं, फ्रीज कर सकते हैं, पिघला सकते हैं, प्रक्रिया कर सकते हैं, दाग, लेबल कर सकते हैं। यह तकनीक प्रसंस्करण के दौरान 3 डी बढ़ती संरचनाओं के लिए एक स्थिर और सुरक्षात्मक वातावरण बनाए रखते हुए अध्ययन की प्रजनन क्षमता, विश्वसनीयता और वैधता में सुधार करती है। इसके अलावा, तनावपूर्ण कदमों को खत्म करने से हैंडलिंग त्रुटियों को कम किया जाता है, समय कम हो जाता है, और संदूषण का खतरा कम हो जाता है।

Introduction

सेल अनुसंधान और चिकित्सा का भविष्य 3 डी सेल संस्कृतियों 1,2,3 के भीतर निहित है। ऑर्गनॉइड और स्फेरॉइड मॉडल बेहतर मॉडल बनाकर इन विट्रो प्रयोगों और पशु मॉडल के बीच की खाई को बंद करते हैं जो मानव शरीर के विकास, शरीर विज्ञान और बीमारियों 4,5,6,7,8,9 की नकल करते हैं। हालांकि, इन मॉडलों की प्रजनन क्षमता और पुनरावृत्ति चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। इसके अलावा, वर्तमान प्रौद्योगिकियों के साथ इन संरचनाओं को संभालने, कटाई, स्थानांतरित करने और सेंट्रीफ्यूज करने से कई स्थितियों में ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड का नुकसान या क्षति होती है, जिससे परिणामों पर काफी प्रभाव पड़ता है।

हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए कई प्रोटोकॉल के बावजूद, प्रयोगात्मक स्थितियों को मानकीकृत करने, इन नाजुक संरचनाओं को खोने या नुकसान पहुंचाए बिना उन्हें संभालने और संसाधित करने से संबंधित कोई सार्वभौमिक दृष्टिकोण नहीं है। वर्तमान प्रोटोकॉल भी अविश्वसनीय रूप से लंबे हैं, कुछ दिनों से कई हफ्तों तक बारी-बारी से, और इसमें विभिन्न अभिकर्मकों 10,11,12,13,14 के साथ जटिल प्रक्रियाएं शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, सेल कल्चर वाहिकाओं और क्रायोवियल्स के बीच 3 डी बढ़ती संरचनाओं की कटाई, पिपेटिंग, सेंट्रीफ्यूजिंग और स्थानांतरित करने से संरचनाओं और यांत्रिक बलों की स्थिति में परिवर्तन होता है, और अंततः ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड के भेदभाव और परिपक्वता को प्रभावित करता है। यह बताया गया है कि ऊतक टोपोलॉजी, कोशिकाओं की स्थिति, और यांत्रिक बल सेल भेदभाव और परिपक्वता 6,15,16,17 को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करते हैं।

इसलिए, स्थिर गुणवत्ता के साथ ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए वर्तमान पारंपरिक प्रौद्योगिकियों में सुधार करना वांछनीय है। एक विधि / डिवाइस जो सेंट्रीफ्यूजेशन और ऊपर वर्णित अन्य चरणों को छोड़ देगा और कई प्रक्रियाओं की शुरुआत से अंत तक एक सुरक्षित वातावरण में सामग्री प्रदान करेगा, सबसे सुसंगत और विश्वसनीय डेटा तक पहुंचने के लिए फायदेमंद होगा। इसके अतिरिक्त, यह समय, श्रम और लागत की बाधाओं को कम करेगा।

यहां वर्णित बहुउद्देशीय उपकरण (एमडी) ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड (पूरक चित्रा 1) की कई प्रक्रियाओं के लिए एक सुरक्षित वातावरण प्रदान करता है। यह उपकरण और पूरक प्रोटोकॉल कटाई, पाइपिंग, ट्रांसफरिंग और सेंट्रीफ्यूजिंग चरणों को समाप्त करते हैं। अनुक्रमिक प्रक्रियाओं के दौरान ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड अपने इन विट्रो वातावरण में रहते हैं। इस वातावरण में मुख्य रूप से प्राकृतिक या सिंथेटिक बाह्य मैट्रिक्स घटक शामिल हैं, जैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हाइड्रोगेल। दूसरे शब्दों में, यहां वर्णित विधियां ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड के पूरे माउंट नमूने को हाइड्रोगेल ड्रॉप में अभी भी संसाधित, जांच और जमे हुए होने की अनुमति देती हैं।

बायोकंपैटिबल डिवाइस 60 डिग्री सेल्सियस और -160 डिग्री सेल्सियस के बीच के तापमान के लिए प्रतिरोधी है, जो -160 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन टैंक में ऑर्गेनोइड्स / स्टेरॉयड को बहाल करना या 60 डिग्री सेल्सियस पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए राल ब्लॉक तैयार करना संभव बनाता है। डिवाइस में आला को 3 डी बढ़ती संरचनाओं के लिए एक सीमित स्थान को परिभाषित करने और पिछले अध्ययनों 18,19,20,21,22,23 के आधार पर स्फेरॉइड या ऑर्गेनोइड के गठन को प्रोत्साहित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। डिवाइस का वह हिस्सा पारदर्शी है और इसमें एक विशिष्ट प्लास्टिक है जो उच्च ऑप्टिकल गुणवत्ता प्रदान करता है (अपवर्तक सूचकांक: 1.43; abbe मान: 58; मोटाई: 7.8 mil [0.0078 in या 198 μm])। आला और आसपास के 'साइड' भाग दोनों ऑटोफ्लोरेसेंस का कारण बनते हैं। केंद्र में पारदर्शी आला में 80 मिमी2 क्षेत्र है, जबकि साइड भाग 600 मिमी2 है। कंटेनर की गहराई 15 मिमी है, और मोटाई 1.5 मिमी है। ये विशेषताएं, डिवाइस के आकार और डिजाइन के अलावा, विभिन्न प्रकार के उच्च तकनीक माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन करना और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक परीक्षाओं के लिए नमूने तैयार करना संभव बनाती हैं (चित्रा 2)। डिवाइस की समापन प्रणाली दो स्थिति प्रदान करती है, एक फ्रीजर में सील की जाती है और दूसरी इनक्यूबेटर में गैस प्रवाह की अनुमति देती है। सीसीके 8 प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी परख पारंपरिक सेल संस्कृति व्यंजनों (पूरक चित्रा 2) की तुलना में कोशिकाओं पर समान प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण एमडी (चित्रा 3) में सेल संस्कृति के दौरान उच्च सेल व्यवहार्यता (94%) प्रदर्शित करता है।

एकल उपकरण में एक नमूने के लिए की जा सकने वाली प्रक्रियाओं में (1) संवर्धन, (2) हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन, (3) इम्यूनोस्टेनिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग सहित, (4) फ्रीजिंग, (5) पिघलना, (6) ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत जांच करना, जैसे ब्राइटफील्ड, डार्कफील्ड, फ्लोरेसेंस, कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप, (7) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत कोटिंग और सीधे जांच करना, या (8) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए तैयारी करना शामिल है। चित्र 2)।

हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लेबलिंग, या फ्लोरोसेंटली लेबलिंग ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड 10,11,12,13,14,24,25 के लिए अलग-अलग पद्धतियां मौजूद हैं। हाइड्रोगेल से उनकी कटाई वर्तमान तकनीक का पहला और प्रमुख कदम है। इस चरण के बाद, कुछ विधियां पूरे-माउंट इम्यूनो-लेबलिंग की अनुमति देती हैं। काटे गए ऑर्गेनोइड्स पैराफिन में एम्बेडेड होते हैं, वर्गीकृत होते हैं, और दूसरों में धुंधला और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए लेबल किया जाता है। हालांकि, अनुभाग पूरे नमूने को प्रस्तुत नहीं कर सकते हैं और संरचना के 3 डी आर्किटेक्चर से संबंधित केवल सीमित डेटा प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, इन 3 डी संरचनाओं को नुकसान और एंटीजेनिसिटी का नुकसान इन प्रौद्योगिकियों के प्रसिद्ध दुष्प्रभाव हैं।

इस लेख में सूक्ष्म परीक्षाओं के लिए पूरक नए प्रोटोकॉल अभी भी एक हाइड्रोगेल में पूरे माउंट नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में दो नए विकसित फॉर्मूलेशन शामिल हैं: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (एस-आईएचसी) के लिए समाधान और इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग (एस-आईएफ) के लिए समाधान। इन समाधानों के साथ विधियां शोधकर्ताओं को अधिक सटीक डेटा प्राप्त करने की अनुमति देती हैं, क्योंकि पारंपरिक वर्कफ़्लोज़ का कोई हानिकारक प्रभाव नहीं होता है, जैसे कि सेंट्रीफ्यूजिंग, पिपेटिंग और नाजुक संरचनाओं का स्थानांतरण। यहां वर्णित प्रोटोकॉल कटाई, अवरुद्ध, समाशोधन और एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरणों की आवश्यकता को भी समाप्त करता है, और पूरी प्रक्रिया को 6-8 घंटे तक छोटा कर देता है। इसके अलावा, कार्यप्रणाली एक ही एस-आईएफ में एक से तीन एंटीबॉडी को एक साथ जोड़ने की अनुमति देती है। इसलिए, कई लेबलिंग प्रयोगों के बाद भी एक ही दिन परिणाम प्राप्त करना संभव है, जो यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक और लाभ है; पारंपरिक होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग प्रोटोकॉल आमतौर पर 3 दिनों और कई हफ्तों 10,11,12,13,14 के बीच लेते हैं।

पैराफिन एम्बेडिंग, एक और हानिकारक कदम जो एंटीजेनेसिटी को कम करता है, को भी छोड़ दिया जाता है। सूक्ष्म परीक्षा की शुरुआत से अंत तक 3 डी संरचना अपने इन विट्रो वातावरण में रहती है। चूंकि 3 डी संरचना अपनी बढ़ती स्थितियों में बनी हुई है, इसलिए प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण डेटा विवो स्थितियों में बेहतर नकल करते हैं। अधिक सटीक परिणामों की उम्मीद है, क्योंकि कार्यप्रणाली नमूने की एंटीजन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने वाले चरणों को समाप्त करती है। तालिका 1 और तालिका 2 प्रदर्शित करती है कि ये नए प्रोटोकॉल चरणों को कैसे समाप्त करते हैं, प्रयोगशाला में समय और श्रम बचाते हैं, और पारंपरिक वर्कफ़्लो की तुलना में लागत और अपशिष्ट उत्पादों को कम करते हैं।

ऊपर वर्णित महत्वपूर्ण चरणों के अलावा, एक और समस्या उच्च सेल व्यवहार्यता दर 26,27,28,29,30,31 के साथ नमूने की 3 डी संरचना को संरक्षित करने के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम और विधि प्रदान कर रही है। क्रायोप्रिजर्वेशन एक स्थिर मॉडल सिस्टम बनाने और ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड32,33 के बायोबैंकिंग को सक्षम करने के लिए आवश्यक है। संपूर्ण मूल 3 डी संरचना को बायोबैंकिंग स्वास्थ्य या बीमारी की प्राकृतिक स्थिति के अधिक वफादार पुनर्मूल्यांकन की अनुमति देगा। मुख्य विचार क्रायोप्रिजर्वेशन की सुविधा और विश्वसनीयता और ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड का पिघलना है। अधिकांश वर्तमान प्रौद्योगिकियों में पोस्ट-पिघलना ऑर्गेनॉइड रिकवरी बहुत कम है, अक्सर 50% से कम। हालांकि, हाल के अध्ययनों ने26,27,28,29 की बेहतर जीवित रहने की दर के साथ आशाजनक परिणाम दिखाए हैं। ली एट अल ने प्रदर्शित किया कि 78% स्फेरॉइड कोशिकाएं क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद बच गईं जब उन्होंने विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के समाधान का उपयोग किया जिसमें 15% डीएमएसओ28 था। अराई एट अल.29 के अध्ययन में सेल उत्तरजीविता अनुपात बढ़कर 83% हो गया। हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद के परिणाम काफी प्रभावित होते हैं क्योंकि 3 डी संरचनाएं समान विशेषताओं और गुणवत्ता को बनाए नहीं रख सकती हैं। इसके अलावा, दवा और नैदानिक सेटिंग्स में अच्छे विनिर्माण अभ्यास के लिए सीरम-मुक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। पारंपरिक वर्कफ़्लोज़ धीमी-ठंड विधि के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) युक्त माध्यम का उपयोग करते हैं, जो दोनों विकलांगता से जुड़े होते हैं। एफबीएस एक पशु-व्युत्पन्न उत्पाद है और इसमें बैच विविधताएं हो सकती हैं। डीएमएसओ एक बहुत ही सफल क्रायोप्रोटेक्टेंट है, लेकिन लंबे समय तक जोखिम, विशेष रूप से पिघलने के दौरान, साइटोटोक्सिक प्रभाव30,31 का कारण बन सकता है।

यह लेख हाइड्रोजेल में रहते हुए भी पूरे ऑर्गेनोइड या स्फेरॉइड की ठंड / पिघलने की पद्धति का वर्णन करता है। अध्ययन में ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड को फ्रीज करने के लिए दो सूत्रों का उपयोग किया जाता है: (1) पारंपरिक फ्रीजिंग समाधान (एफएस) युक्त 10% डीएमएसओ और (2) एक सीरम- और डीएमएसओ-मुक्त क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम। इस क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम में बाह्य मैट्रिक्स घटक होते हैं, जो वर्तमान सूत्रों से अलग होते हैं। बाह्य मैट्रिक्स में मैक्रोमोलेक्यूल्स, प्रोटिओग्लाइकेन्स और रेशेदार प्रोटीन के दो मुख्य वर्ग शामिल हैं, जो सेलुलर घटकों के लिए भौतिक मचान के लिए आवश्यक हैं, लेकिन ऊतक मोर्फोजेनेसिस, भेदभाव और होमियोस्टेसिस 34,35,36,37,38,39,40 के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को भी शुरू करते हैं। . कोलेजन तन्यता शक्ति प्रदान करते हैं, सेल आसंजन को विनियमित करते हैं, केमोटैक्सिस और प्रवासन का समर्थन करते हैं, और प्रत्यक्ष ऊतक विकास37. इसके अलावा, इलास्टिन फाइबर ऊतकों को पुनरावृत्ति प्रदान करते हैं जो बार-बार खिंचाव से गुजरतेहैं। एक तीसरा रेशेदार प्रोटीन, फाइब्रोनेक्टिन, अंतरालीय बाह्य मैट्रिक्स के संगठन को निर्देशित करता है और कोशिका लगाव की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और एक बाह्य मेकेनो-नियामक39 के रूप में कार्य करता है। डु एट अल ने प्राकृतिक एक्टोमायोसिन मॉडल सिस्टम41 पर चिकन कोलेजन हाइड्रोलाइसेट के क्रायोप्रोटेक्टिव प्रभाव का प्रदर्शन किया है। उनके परिणाम बताते हैं कि कोलेजन हाइड्रोलाइसेट बर्फ क्रिस्टल के विकास को रोक सकता है, वाणिज्यिक क्रायोप्रोटेक्टेंट्स के समान प्रोटीन फ्रीज-विकृतीकरण और ऑक्सीकरण को कम कर सकता है, और फ्रीज-पिघलना चक्र के बाद बेहतर जेल संरचना प्रदान कर सकता है। इसलिए, क्रायोप्रिजर्वेशन मीडिया में बाह्य मैट्रिक्स घटकों को जोड़ना नमूने के लिए अधिक सुरक्षित और सुरक्षात्मक वातावरण प्रदान करता है और ठंड-पिघलने के बाद जीवित संरचनाओं को ठीक करने का समर्थन करता है।

इसके अतिरिक्त, वर्तमान अध्ययन साइटोप्लाज्मिक झिल्ली और जीवित ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के नाभिक को लेबल करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जबकि वे अभी भी हाइड्रोगेल में हैं।

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Protocol

1. ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड की खेती

  1. हाइड्रोजेल को पिघलने के लिए रात भर बर्फ पर रखें (रेफ्रिजरेटर या ठंडे कमरे में)।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बहुउद्देशीय डिवाइस (एमडी; सामग्री की तालिका देखें) को प्रयोग से 1 दिन पहले इनक्यूबेटर में गर्म करने के लिए रखें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)।
  3. रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ चौड़े-अंत पिपेट टिप्स रखें।
    नोट: चरण 1.1-1.3 दिन 0 पर किया जाना है, और चरण 1.4-1.11 दिन 1 पर किया जाना है।
  4. हाइड्रोजेल को 15 मिनट के लिए एक लामिनार प्रवाह हुड में बर्फ पर रखें।
    1. वैकल्पिक: निर्माता की सिफारिश के अनुसार कोल्ड सेल कल्चर माध्यम में हाइड्रोगेल को पतला करें।
  5. हेपजी 2 कोशिकाओं (व्यावसायिक रूप से प्राप्त हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइन; सामग्री की तालिका देखें) की एक गोली युक्त ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  6. जेल ड्रॉप बनाने के लिए प्री-वार्मेड डिवाइस के आला के भीतर 100% हाइड्रोजेल की प्लेट 30-35 μL।
  7. प्रत्येक हाइड्रोजेल ड्रॉप (चित्रा 2) के शीर्ष के बीच में 10,000 हेपजी 2 कोशिकाओं को रखें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. 10% भ्रूण बोवाइन सीरम के साथ डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के 200 μL के साथ हाइड्रोगेल ड्रॉप को कवर करें।
  9. गैस प्रवाह की अनुमति देने के लिए एमडी के ढक्कन को सही स्थिति में कवर करें, और डिवाइस को इनक्यूबेटर में रखें।
  10. कोशिकाओं को हर दूसरे दिन 10% एफबीएस के साथ 200 μL DMEM के साथ खिलाएं।
  11. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत स्फेरॉइड के विकास की जांच करें (चित्रा 3)। स्फेरॉइड गठन 3 वें दिन के बाद शुरू होताहै । वीडियो 1 एक हाइड्रोगेल गुंबद में विभिन्न स्तरों पर स्फेरॉइड के स्थान को दर्शाता है।
    नोट: हाइड्रोजेल के आसपास के तरल को धीरे से एस्पिरेट करने और हाइड्रोगेल बूंदों को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए धीरे-धीरे पर्यावरण में नए तरल को जोड़ने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।

2. हाइड्रोजेल में पूरे माउंट ऑर्गेनोइड्स/स्फेरॉइड का हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला होना

  1. फिक्सेटिव को गर्म करें (4% पैराफॉर्मलडिहाइड; पीएफए), पीबीएस, और हेमेटॉक्सिलिन ( सामग्री की तालिका देखें) 37 डिग्री सेल्सियस तक।
  2. हाइड्रोजेल ड्रॉप के आसपास के माध्यम को पिपेट के साथ एस्पिरेट करें, ठीक करने के लिए 4% पीएफए का 100-200 μL जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 4% पीएफए को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3x धोने के लिए 200 μL PBS जोड़ें। फिर, पीबीएस को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए हेमेटॉक्सिलिन समाधान के 200 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
  4. हेमेटॉक्सिलिन को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3x धोने के लिए200μL dH 2 O जोड़ें। डीएच2ओ को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए 200 μL इथेनॉल के साथ इनक्यूबेट करें।
  5. इथेनॉल को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 μL Eosin ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें। ईओसिन को एस्पायरेट करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए धोने के लिए200μL dH 2 O जोड़ें।
  6. डीएच2ओ को एस्पिरेट करें और हाइड्रोगेल ड्रॉप को बढ़ते माध्यम के रूप में कवर करने के लिए ग्लिसरॉल के 100 μL जोड़ें।
  7. वैकल्पिक: एक कवरस्लिप के साथ आला को माउंट करें। इस चरण को काफी आकार के ऑर्गेनोइड्स / स्फेरॉइड को निचोड़ने से बचने के लिए छोड़ा जा सकता है।
  8. परीक्षा तक सूखने से बचने के लिए एमडी के ढक्कन को मजबूती से बंद करें। नमूना कम से कम 6 महीने के लिए परीक्षा के लिए स्थिर है।

3. हाइड्रोजेल में होल-माउंट ऑर्गेनोइड्स/स्फेरॉइड का इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (एस-आईएचसी; सामग्री की तालिका देखें) के लिए व्यावसायिक रूप से प्राप्त समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. हाइड्रोजेल में ऑर्गेनोइड्स या स्फेरॉइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए200 μL dH 2 O में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड(H2 O 2) के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए डीएच2ओ में धो लें। डीएच2ओ को एस्पिरेट करें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL S-IHC के साथ दो बार इनक्यूबेट करें।
  4. एस-आईएचसी को एस्पिरेट करें और 100 μL प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए एस-आईएचसी में पतला करें (काम करने के कमजोर पड़ने के बारे में निर्माता की सिफारिशों के बाद)।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एस-आईएचसी 3 एक्स के 100 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
  6. एस-आईएचसी के एस्पिरेट 100 μL और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए बायोटिनिलेटेड द्वितीयक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
  7. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एस-आईएचसी 3 एक्स के 100 μL के साथ इनक्यूबेट करें। एस-आईएचसी को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए स्ट्रेप्टाविडिन ( सामग्री की तालिका देखें) लेबल वाले हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) के 100 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
  8. स्ट्रेप्टाविडिन लेबल वाले एचआरपी को एस्पिरेटेड करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एस-आईएचसी 3 एक्स के 100 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
  9. एस-आईएचसी को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए डीएबी / एईसी क्रोमोजेन समाधान मिश्रण ( सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
  10. प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत धुंधला होने की तीव्रता की निगरानी करें।
  11. 2 मिनट के लिए डीएच2ओ 3 एक्स से धो लें।
  12. वैकल्पिक: 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए परमाणु काउंटरस्टेनिंग के लिए हेमेटॉक्सिलिन के 100 μL ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
  13. हेमेटॉक्सिलिन को एस्पिरेट करें और 5 मिनट के लिए डीएच2ओ में धो लें।
  14. डीएच2ओ को एस्पिरेट करें और हाइड्रोगेल ड्रॉप को 100 μL ग्लिसरॉल के साथ कवर करें।
  15. माइक्रोस्कोपिक परीक्षा तक एमडी के ढक्कन को मजबूती से बंद करें।
    नोट: एंटीजन पुनर्प्राप्ति और प्रोटीन ब्लॉकिंग चरणों को इस प्रोटोकॉल में छोड़ दिया जाता है क्योंकि एस-आईएचसी इन चरणों को समाप्त करता है।

4. हाइड्रोजेल में पूरे माउंट ऑर्गेनोइड्स/ स्फेरॉइड की इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग

  1. निम्नलिखित सामग्रियों को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें: 4% पीएफए, पीबीएस, एस-आईएफ, एस-आईएफ में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान, एस-आईएफ में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान, परमाणु दाग, और ग्लिसरॉल ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए 4% पीएफए के 200 μL के साथ ठीक करें। फिक्सेटिव को एस्पिरेट करें और एस-आईएफ 3एक्स में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर धो लें।
  3. निम्नलिखित चरणों के दौरान आर्द्रता प्रदान करने के लिए आला के आसपास की तरफ डीएच2ओ जोड़ें।
  4. हाइड्रोजेल ड्रॉप के आसपास एस-आईएफ को एस्पिरेट करें और हाइड्रोगेल ड्रॉप को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए एस-आईएफ में 100 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एस-आईएफ 3 एक्स में धो लें।
  6. एस-आईएफ को एस्पिरेट करें और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए एस-आईएफ में 100 μL द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
  7. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पीबीएस 3एक्स के साथ धोएं।
  8. पीबीएस को एस्पिरेट करें और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर माउंटिंग माध्यम या ग्लिसरॉल युक्त 100 μL परमाणु-डीएनए दाग के साथ इनक्यूबेट करें।
  9. सूखने से बचने के लिए ग्लिसरॉल के साथ आला भरें।
  10. वैकल्पिक: एक कवरस्लिप के साथ आला को कवर करें। इस चरण को ऑर्गेनोइड्स / स्फेरॉइड को निचोड़ने से बचने के लिए छोड़ा जा सकता है।
  11. MD को कसकर बंद करें। एमडी में नमूने प्रतिदीप्ति के न्यूनतम नुकसान के साथ कम से कम 6 महीने के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  12. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक परीक्षा के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: सभी चैनलों के पिनहोल मान को 20.1 पर सेट करें, 488 एनएम के लिए 550 पर गेन मास्टर स्थिरांक रखें, 550 एनएम के लिए 485, और 594 एनएम के लिए 450, सभी प्रयोगों के लिए लेजर पावर स्थिर रखें, और सबसे कम प्रतिशत 2.0 पर रखें।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी: एंटी-ना-के एटीपीस (1: 100), एंटी-आर्जिनेस (1: 50), एंटी-एल्ब्यूमिन (1: 50), एंटी-बीटा-गैलेक्टोसिडेस (1: 25), एंटीमाइटोकॉन्ड्रियल एंटीबॉडी (1: 100), एंटी-गोल्गी एंटीबॉडी (1: 50), एंटी-साइटोकेराटिन 5 (1: 100), ओवी 6 एंटीबॉडी (1: 100)। द्वितीयक एंटीबॉडी: बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) - 488, बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) -550, बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) -488, बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) -550, बकरी विरोधी चिकन आईजीवाई (एच + एल) -647। सभी द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने 1: 100 है। इसके अतिरिक्त, एफआईटीसी-फेलोइडिन (1: 100), एक संयुग्मित एंटीबॉडी, का भी उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

5. एक हाइड्रोगेल में जीवित ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड के प्लाज्मा झिल्ली और न्यूक्लियस लेबलिंग

  1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में एलेक्सा फ्लूर गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन (5.0 μg / mL) और Hoechst (2 μM) युक्त लेबलिंग समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें), और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. सेल कल्चर माध्यम को एस्पायरेट करें और हाइड्रोगेल ड्रॉप को कवर करने के लिए लेबलिंग समाधान के 100 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. लेबलिंग समाधान निकालें और पीबीएस 2एक्स में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दो बार धोएं। वैकल्पिक: 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4% फॉर्मलाडेहाइड के 200 μL के साथ ठीक करें।
  4. हाइड्रोजेल ड्रॉप को ग्लिसरॉल के साथ एक बढ़ते माध्यम के रूप में कवर करें। वैकल्पिक: कवर ग्लास के साथ आला को माउंट करें।
  5. एमडी के ढक्कन को कसकर बंद करें और इसे फ्लोरेसेंस / कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक परीक्षा तक अंधेरे में प्रशीतित रखें। यह कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर है।

6. हाइड्रोजेल में होल-माउंट ऑर्गेनोइड्स/स्फेरॉइड की ठंड और पिघलना

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए ऑर्गेनोइड्स को फ्रीज करें।
    1. व्यावसायिक रूप से प्राप्त ठंड समाधान (एफएस; सामग्री की तालिका देखें) को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. हाइड्रोगेल गुंबद के आसपास के सेल कल्चर मीडिया को धीरे से एस्पिरेट करें।
    3. धीरे से एफएस के 200 μL जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एफएस के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें।
    4. डिवाइस के ढक्कन को कसकर बंद करें और इसे फोम बॉक्स में रखें। इस फोम बॉक्स को दूसरे फोम बॉक्स में रखें, जैसा कि पूरक चित्र 3 में दिखाया गया है। दोनों फोम बॉक्स को कसकर बंद करें। एक दूसरे के अंदर दो फोम बॉक्स -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूने के 1 से 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट की तापमान शीतलन ढाल सीमा प्रदान करते हैं।
    5. बॉक्स को 2 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। बॉक्स को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें और इसे रात भर छोड़ दें।
    6. बक्से से नमूना निकालें। एमडी में नमूना 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जा सकता है।
    7. एमडी जिसमें नमूना होता है, को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए ऑर्गेनोइड्स को पिघलाएं।
    1. नाइट्रोजन टैंक से नमूना युक्त एमडी को बाहर निकालें और इसे सीधे 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. आला में गर्म संस्कृति माध्यम के 200 μL जोड़ें (एफएस और सेल संस्कृति माध्यम का अनुपात 1: 1 है) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. आला में अधिक गर्म संस्कृति माध्यम जोड़ें (सेल संस्कृति माध्यम के लिए एफएस का अनुपात 1: 2 है) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. मध्यम और एफएस मिश्रण को धीरे से एस्पिरेट करें। हाइड्रोगेल में पूरे-माउंट ऑर्गेनोइड्स / स्फेरॉइड की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चरण 7) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चरण 8) इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें।

7. होल-माउंट ऑर्गेनोइड्स/स्फेरॉइड की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. कमरे के तापमान (आरटी) के लिए कार्नोव्स्की के फिक्सेटिव और पोस्ट-फिक्सेटिव समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) को गर्म करें।
  2. एमडी में हाइड्रोगेल के आसपास सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें। नमूने को 15 मिनट के लिए लामिनार प्रवाह हुड में बर्फ पर एमडी में रखें।
  3. ऑर्गेनोइड्स/स्फेरॉइड के आसपास के तरल हाइड्रोजेल को बहुत धीरे-धीरे एस्पिरेट करें। नमूने को नुकसान पहुंचाने और खोने से बचने के लिए सीमित मात्रा में मैट्रिगेल आला में रह सकता है।
  4. 1 घंटे के लिए आरटी पर कार्नोव्स्की के फिक्सेटिव (2% पीएफए, 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड 0.15 एम कैकोडिलेट बफर में, और 2 एमएम सीएसीएल2; सामग्री की तालिका देखें) के साथ फिक्स करें।
  5. फिक्सेटिव को धीरे से एस्पिरेट करें और आसुत जल (डीएच2ओ) 3x से 15 मिनट के लिए धो लें।
  6. डीएच2ओ को धीरे से एस्पिरेट करें और 1 घंटे के लिए आरटी पर पोस्ट-फिक्सेटिव घोल (1% जलीय ऑस्मियम टेट्रोक्साइड [ओएसओ4]; सामग्री की तालिका देखें) के साथ ठीक करें।
  7. पोस्ट-फिक्सेटिव को धीरे से एस्पिरेट करें और आसुत जल (डीएच2ओ) 3 गुना से 15 मिनट के लिए धो लें।
  8. इथेनॉल की एक श्रेणीबद्ध श्रृंखला (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), इथेनॉल / एसीटोन का मिश्रण (1: 1; 1: 2), और आरटी पर पूर्ण एसीटोन प्रत्येक 15 मिनट के लिए निर्जलित करें।
  9. क्रिटिकल पॉइंट ड्रायर से सुखाएं।
  10. 90 सेकंड के लिए स्पटर कोटर का उपयोग करके डिवाइस में नमूने को 6 एनएम गोल्ड / पैलेडियम के साथ कोट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  11. वैक्यूम मोड (5 x 10-6 mA) में 2-3 kV पर एक इन-लेंस द्वितीयक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। 8.1-8.2 मिमी और 675x, 1050x और 1570x आवर्धन की कार्य दूरी के साथ चित्र लें।
    नोट: एमडी में सभी चरण किए जाते हैं। प्रत्येक चरण के लिए समाधान के 200-250 μL का उपयोग करें।

8. हाइड्रोजेल में होल-माउंट ऑर्गेनोइड्स/स्फेरॉइड की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. कार्नोवस्की के फिक्सेटिव को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। एमडी में हाइड्रोगेल के आसपास सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें।
  2. 1 घंटे के लिए आरटी पर कार्नोव्स्की के फिक्सेटिव के साथ नमूना ठीक करें। 15 मिनट के लिए डीएच2ओ 3 एक्स से धो लें।
  3. 45 मिनट के लिए आरटी पर 2% जलीय ओएसओ 4 और 2.5% पोटेशियम फेरोसाइनाइड के साथ पोस्ट-फिक्स। 10 मिनट के लिए डीएच2ओ 3 एक्स से धो लें।
  4. 30 मिनट के लिए आरटी पर 0.5% थियोकार्बोहाइड्राज़ाइड (टीसीएच; सामग्री की तालिका देखें) में इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए डीएच2ओ 3 एक्स से धो लें।
  5. 30 मिनट के लिए आरटी पर 2% जलीय ओएसओ4 में इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए डीएच2ओ 3 एक्स से धो लें।
  6. 1 घंटे के लिए आरटी पर 2% यूरिनिल एसीटेट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) में इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस चरण में, स्फेरॉइड को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  7. 45 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर लीड एस्पार्टेट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) में इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए डीएच2ओ 3 एक्स से धो लें।
  8. इथेनॉल की एक श्रेणीबद्ध श्रृंखला (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) और 15 मिनट के लिए आरटी पर पूर्ण एसीटोन में निर्जलित करें।
  9. 2 घंटे के लिए आरटी पर (1: 1; 1: 2) एसीटोन / इपोन राल और शुद्ध एपोन राल ( सामग्री की तालिका देखें) के मिश्रण के साथ इलाज करें।
  10. राल को रात भर (न्यूनतम 16 घंटे) 60 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीमराइज करें। पोलीमराइजेशन के बाद, एमडी से राल ब्लॉक को हटा दें, जैसा कि पूरक चित्र 4 में दिखाया गया है।
  11. राल ब्लॉक को राल गोंद के साथ एक बड़े से संलग्न करें। ब्लॉक को ट्रिम करें और ऑर्गेनोइड या स्फेरॉइड के स्थान तक पहुंचें।
  12. अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके अर्ध-पतला (1,000 एनएम) और अल्ट्रा-पतले खंड (60 एनएम) प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  13. अल्ट्रा-पतले खंडों को 100 जाल तांबा ग्रिड पर रखें और 30 केवी के तेज वोल्टेज पर एसटीईएम डिटेक्टर के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। 44 मिमी और 2580x, 5020x और 6060x आवर्धन की कार्य दूरी के साथ छवियों को कैप्चर करें।
    नोट: प्रत्येक चरण के लिए समाधान के 200-250 μL का उपयोग करें। चरण 8.1-8.10 एमडी में किए जाते हैं।

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Representative Results

वर्तमान लेख एक बहुउद्देशीय उपकरण (एमडी) का प्रतिनिधित्व करता है और एक विशिष्ट रूप से डिज़ाइन किए गए वातावरण में हाइड्रोगेल में रहते हुए पूरे ऑर्गेनोइड्स या स्फेरॉइड के संवर्धन, ठंड, पिघलने, हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला, इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग, कोटिंग और प्रसंस्करण के लिए पूरक पद्धतियों का प्रतिनिधित्व करता है। वर्तमान अध्ययन को 35 एमडी में 35 हाइड्रोगेल बूंदों में हेपजी 2 यकृत कैंसर स्फेरॉइड तैयार करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। सटीकता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग तीन प्रतियों में आयोजित किए गए थे। इसके अतिरिक्त, एमडी में फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स को ऑर्गेनॉइड अध्ययन के लिए वर्तमान पद्धतियों के परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबल किया गया था।

चित्रा 1 एक हाइड्रोगेल गुंबद युक्त डिवाइस पर करीब से नज़र डालता है। आला का आकार और आकार ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड युक्त हाइड्रोगेल के लिए एक सुरक्षात्मक वातावरण प्रदान करने और विभिन्न प्रक्रियाओं के दौरान उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों को बचाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसके अलावा, आला को घेरने वाले डिवाइस के साइड हिस्से को इम्यूनोस्टेनिंग प्रयोगों के दौरान आर्द्रता कक्ष के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हाइड्रोजेल ड्रॉप की ऊंचाई के आधार पर नमूने को खिलाने का माध्यम 100-200 μL के बीच भिन्न हो सकता है। वर्तमान अध्ययन गुंबद-आधारित विधि पर केंद्रित है क्योंकि कई हाइड्रोगेल, वाणिज्यिक बाह्य मैट्रिक्स घटक और तहखाने झिल्ली अर्क उपयोगकर्ता को बूंदें तैयार करने की अनुमति देते हैं। हालांकि, हाइड्रोजेल के साथ एमडी के आला को भरना और फिर ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए इसके अंदर कोशिकाओं को बीज देना भी संभव है। उस विधि को प्राथमिकता दी जा सकती है यदि मैट्रिक्स की चिपचिपाहट गुंबदों की तैयारी की अनुमति नहीं देती है या यदि प्रयोग में ऑर्गेनोइड्स की बड़ी मात्रा शामिल है। बूंदों की तैयारी के लिए हाइड्रोगेल प्रकार और हाइड्रोगेल / मध्यम अनुपात सेल प्रकार, प्रयोगात्मक डिजाइन और माध्यम के अनुसार भिन्न हो सकता है। चित्र 1  डिवाइस के डिजाइन का भी प्रतिनिधित्व करता है जो ब्राइटफील्ड, कॉन्फोकल और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड्स / स्फेरॉइड की जांच करना संभव बनाता है, जबकि ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड अभी भी अपने मूल इन विट्रो वातावरण में हैं।

चित्रा 2 प्रस्तुत करता है कि हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को कैसे बीज दिया जाए और स्फेरॉइड या ऑर्गेनोइड के विकास की जांच की जाए। बहुउद्देशीय उपकरण के डिजाइन और आयामों को भी उस आंकड़े में प्रस्तुत किया गया है। वीडियो 1 एक हाइड्रोगेल में 3 डी बढ़ते स्फेरॉइड के स्थान को दर्शाता है। चित्रा 3 दिन 3 से दिन 21 तक बढ़ते स्फेरॉइड की लाइव छवियों का प्रतिनिधित्व करता है। स्फेरॉइड और ऑर्गेनोइड के गठन का समय नमूने की प्रकृति के अनुसार भिन्न हो सकता है। उदाहरण के लिए, हेपजी 2 कोशिकाओं और एचईके कोशिकाओं से स्फेरॉइड 3 दिनों के भीतर बने, जबकि प्रयोगों के दौरान यकृत और पित्त ऑर्गेनोइड का गठन 2 सप्ताह तक चला।

हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन-सना हुआ स्फेरॉइड चित्रा 4 में देखा जाता है। छवि स्फेरॉइड के विभिन्न आकारों और संलयन पर अच्छी तरह से संरक्षित और समरूप रूप से सना हुआ स्फेरॉइड का प्रतिनिधित्व करती है। स्फेरॉइड के केंद्र में जीवित कोशिकाएं उल्लेखनीय हैं। छवि विभिन्न स्फेरॉइड से कोशिकाओं के बीच नाजुक कनेक्शन को भी प्रदर्शित करती है। इन नाजुक कनेक्शनों को पारंपरिक वर्कफ़्लो के बाद कल्पना नहीं की जा सकती थी क्योंकि स्थानांतरित करने, पाइपिंग करने या सेंट्रीफ्यूजिंग उन्हें नुकसान पहुंचाएगा। चित्र 5  आर्जिनेस के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ स्फेरॉइड के इम्यूनोस्टेनिंग को प्रदर्शित करता है, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा42,43 के निदान और पूर्वानुमान के लिए सबसे आम मार्करों में से एक है। माइक्रोग्राफ एक ही स्फेरॉइड में विभेदित और अविभाजित यकृत कैंसर कोशिकाओं को प्रकट करते हैं। इस आंकड़े में हेमेटॉक्सिलिन के साथ काउंटरस्टेनिंग के साथ और बिना छवियां शामिल हैं। शोधकर्ता उन मामलों में हेमेटॉक्सिलिन के साथ काउंटरस्टेनिंग को छोड़ना चुन सकते हैं जिनमें 3 डी संरचना में लेबल क्षेत्रों को अलग करना मुश्किल होगा।

चित्रा 6 एक हाइड्रोगेल में जीवित ऑर्गेनोइड्स / स्फेरॉइड के पूरे-माउंट विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक और सरल प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है: जीवित कोशिका झिल्ली और नाभिक धुंधला। कार्यप्रणाली परिधि और केंद्र में एक ही लेबलिंग घनत्व की अनुमति देती है, जो पूर्ण अभिकर्मक प्रवेश दिखाती है। चित्रा 7, चित्रा 8, और चित्रा 9 क्रमशः एक, दो या तीन एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवियां दिखाते हैं। एस-आईएफ में एक साथ एक से तीन प्राथमिक एंटीबॉडी पतला होते हैं। इसी तरह, प्रयोग के लिए उपयुक्त एक से तीन मिलान द्वितीयक एंटीबॉडी को एस-आईएफ में एक साथ पतला किया जाता है। इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को उन्हें खोने या नुकसान पहुंचाए बिना 4-6 घंटे के भीतर 3 डी संरचनाओं को चिह्नित करने की अनुमति देता है। पृष्ठभूमि पारदर्शी है, और यहां उपयोग की जाने वाली तकनीक को अतिरिक्त समाशोधन, एंटीजन पुनर्प्राप्ति, या अवरुद्ध विधियों / समाधानों की आवश्यकता नहीं है। विधि शोधकर्ताओं को एक ही चरण में कई एंटीबॉडी के साथ नमूने को लेबल करने की अनुमति देती है। दूसरे शब्दों में, उपयोगकर्ता एक समाधान तैयार करता है जिसमें एक से तीन प्राथमिक एंटीबॉडी होते हैं और एक से तीन द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ मेल खाने वाला दूसरा समाधान होता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल पारंपरिक पद्धतियों में विभिन्न एंटीबॉडी के साथ अनुक्रमिक लेबलिंग चरणों को समाप्त करता है।

चित्रा 10 स्फेरॉइड की स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक छवियों का प्रतिनिधित्व करता है। पहली पंक्ति एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत एमडी में पूरे स्फेरॉइड के चित्रों को प्रदर्शित करती है। दूसरी पंक्ति में एमडी में पूरे-माउंट स्फेरॉइड वाले राल ब्लॉकों की तैयारी के बाद स्फेरॉइड की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक छवियां होती हैं, साथ ही सेक्शनेड और सना हुआ स्फेरॉइड की छवियां भी होती हैं। अच्छी तरह से संरक्षित साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल और कोशिकाओं की अन्य अल्ट्रास्ट्रक्चरल विशेषताएं इस सरल प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करती हैं, जो पूरे नमूने की 3 डी संरचना की रक्षा करती हैं। एमडी शोधकर्ताओं को हाइड्रोगेल में पूरे माउंट के नमूनों को फ्रीज और पिघलाने की भी अनुमति देता है। चित्र 11  ठंड से पहले और बाद में उच्च आवर्धन पर हाइड्रोगेल गुंबद और स्फेरॉइड प्रदर्शित करता है। हाइड्रोगेल गुंबद की सीमाओं पर अनियमितता उल्लेखनीय है। हालांकि, ठंड से पहले स्फेरॉइड की तुलना में पिघलने के बाद क्रायोप्रिजर्व्ड स्फेरॉइड की गोलाई लगभग स्थिर होती है। पिघलने के 48 घंटे बाद लाइव सेल झिल्ली और न्यूक्लियस लेबलिंग विधियों को भी लागू किया जाता है ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि ठंड / पिघलने की प्रक्रिया ने 3 डी आर्किटेक्चर, सेल झिल्ली और सेल व्यवहार्यता को कैसे प्रभावित किया। डाइमिथाइल सल्फोक्साइड युक्त पारंपरिक ठंड समाधान और वर्तमान नए तैयार समाधान, एसएफ, समान परिणाम प्रदर्शित करते हैं। 3 डी संरचनाओं के 75% से अधिक इस प्रोटोकॉल में जीवित रह सकते हैं। हालांकि, ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड पर प्रत्येक फॉर्मूलेशन के दीर्घकालिक दुष्प्रभावों को प्रकट करने के लिए आगे के प्रयोगों की आवश्यकता है।

तालिका 1 और तालिका 2 पारंपरिक वर्कफ़्लो की तुलना चरण संख्या, अवधि और अपशिष्ट उत्पादन (यानी, प्लास्टिक दस्ताने, पिपेट टिप्स, सीरोलॉजिकल पिपेट, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब, सेल कल्चर जहाजों, क्रायोवियल्स आदि की कुल संख्या) के आधार पर यहां वर्णित लोगों के साथ करते हैं।

पूरक चित्रा 1 अनुक्रमिक चरणों का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें एकल एमडी योजनाबद्ध रूप से किया जा सकता है। पूरक चित्र 2 एमडी या पारंपरिक ग्लास-बॉटम डिश में हेपजी 2 कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता, विषाक्तता और प्रसार दरों की तुलना करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों के परिणामों को प्रदर्शित करता है। पूरक चित्र 3 उन फोम बक्से को दर्शाता है जिनका उपयोग एमडी में नमूनों को फ्रीज करने के लिए किया गया है। पूरक चित्र 4 एमडी से राल ब्लॉक निकालने के चरणों को सारांशित करता है। पूरक चित्रा 5 में वायुमार्ग ऑर्गेनोइड्स की छवियां शामिल हैं जो इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबल किए गए थे और फिर जब वे अभी भी एमडी में थे तो कल्पना की गई थी। इसी तरह, वीडियो 2 एक एमडी में दो इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबल वायुमार्ग ऑर्गेनोइड्स को प्रदर्शित करता है। अंत में, पूरक चित्रा 6 एक ग्राफ है जो पारंपरिक वर्कफ़्लो और यहां वर्णित वर्कफ़्लो का उपयोग करके ठंड से पहले और बाद में जीवित स्फेरॉइड में सेल झिल्ली लेबलिंग तीव्रता की औसत तीव्रता की तुलना करता है। इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण के लिए किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: बहुउद्देशीय सेल संस्कृति डिवाइस (एमडी)। (ए) आला (एन), डिवाइस का केंद्रीय भाग, अनुक्रमिक प्रक्रियाओं के दौरान हाइड्रोगेल ड्रॉप (डी) में उगाए गए ऑर्गेनोइड्स / स्फेरॉइड के लिए एक सुरक्षात्मक वातावरण बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। साइड (एस), आला के आसपास के हिस्से, इम्यूनोस्टेनिंग प्रयोगों के दौरान ह्यूमिडिफायर कक्ष के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। (बी) ढक्कन में पारदर्शी केंद्र उपयोगकर्ता को डिवाइस बंद होने पर ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड का निरीक्षण करने की अनुमति देता है। (सी) एमडी में ऑर्गेनोइड युक्त हाइड्रोगेल गुंबद को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए राल ब्लॉक में दाग या एम्बेडेड किया जा सकता है। ढक्कन में हैंगिंग ड्रॉप पद्धति के लिए आला (एन) भी शामिल है। डिवाइस का आकार और डिजाइन उपयोगकर्ता को (डी) ब्राइटफील्ड, (ई) कॉन्फोकल, और (एफ) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड की जांच करने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक हाइड्रोगेल के अंदर सीडिंग कोशिकाएं। (ए) पिपेट में सेल पेलेट गुंबद के शीर्ष में डाला जाता है। 3-5 दिनों के बाद, गुंबद में स्फेरॉइड दिखाई देने लगते हैं, खासकर बूंद की परिधि पर। (बी) एक गुंबद में प्रत्येक तिमाही से बढ़ते स्फेरॉइड की चार लाइव छवियों को कैप्चर किया गया और विलय कर दिया गया। स्केल पट्टी = 200 μm. (C) बहुउद्देशीय डिवाइस (MD) का डिज़ाइन और आयाम (सेंटीमीटर में). कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दिन 3 से दिन 21 तक हाइड्रोगेल ड्रॉप में स्फेरॉइड विकसित करना। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एमडी के भीतर हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन-सना हुआ पूरे माउंट स्फेरॉइड। आसन्न या फ्यूजिंग स्फेरॉइड में स्थित कोशिकाओं के बीच कनेक्शन का विज़ुअलाइज़ेशन। कोशिकाओं (तीर) के बीच नाजुक प्रक्रियाएं दिखाई देती हैं क्योंकि हाइड्रोगेल में पूरे माउंट का नमूना 3 डी बढ़ती संरचनाओं को नुकसान पहुंचाए बिना तय, दागदार और जांच की जाती है। स्केल बार: दिन 3, दिन 9 = 50 μm; दिन 7, दिन 17 = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एमडी के भीतर हाइड्रोगेल में पूरे-माउंट स्फेरॉइड का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन। नमूने आर्जिनेस के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन्ड थे। आर्जिनेस पॉजिटिव (लाल तीर) और नकारात्मक (काले तीर) कोशिकाएं स्फेरॉइड में देखी जाती हैं। छवियां दो प्रयोगों से हैं: (ए-सी) बिना और (डी-एफ) हेमेटॉक्सिलिन के साथ काउंटरस्टेनिंग के साथ। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: हाइड्रोगेल में एक जीवित ऑर्गेनॉइड की कॉन्फोकल छवि। जीवित ऑर्गेनोइड्स को जीवित कोशिका झिल्ली (डब्ल्यूजीए) और न्यूक्लियस दाग (होचस्ट) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एक एंटीबॉडी और एक परमाणु दाग (होचस्ट) के साथ एक हाइड्रोगेल में पूरे-माउंट स्फेरॉइड की इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग। (ए-सी) ऊपरी पैनल कोशिका झिल्ली में Na-K ATPase के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया एक स्फेरॉइड दिखाता है। (डी-एफ) निचला पैनल यकृत कैंसर स्फेरॉइड में हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के लिए विशिष्ट साइटोसोलिक प्रोटीन आर्जिनेस के लिए विशिष्ट एक और एंटीबॉडी के स्थान को दर्शाता है। धुंधला प्रोटोकॉल की अवधि: 6 घंटे। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: दो एंटीबॉडी और एक परमाणु दाग (होचस्ट) के साथ एक हाइड्रोगेल में पूरे-माउंट स्फेरॉइड की इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग। (ए-सी) ऊपरी पैनल एल्बुमिन और ओवी 6 के लिए विशिष्ट दो एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया एक स्फेरॉइड दिखाता है। स्केल बार = 5 μm. (D-F) निचला पैनल यकृत कैंसर स्फेरॉइड में अल्फा फेटो प्रोटीन और Ov6 के स्थान को प्रदर्शित करता है। स्केल बार = 20 μm। धुंधला प्रोटोकॉल की अवधि: 6 घंटे कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: तीन एंटीबॉडी और एक परमाणु दाग (होचस्ट) के साथ एक हाइड्रोगेल में पूरे-माउंट स्फेरॉइड की इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग। (ए-ई) ऊपरी पैनल में स्फेरॉइड को आर्जिनेस, एनए-के एटीपीस और बीटा-गैलेक्टोसिडेस के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। (एफ-जे) मध्य पैनल ओवी 6, बीटा-गैलेक्टोसिडेस और अल्फा-फेटो प्रोटीन के साथ लेबल किए गए एक स्फेरॉइड को प्रदर्शित करता है। (के-ओ) निचले पैनल में स्फेरॉइड को एफआईटीसी-फेलोइडिन, एंटी-माइटोकॉन्ड्रियल एंटीबॉडी और एंटी-गोल्गी एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है। स्केल बार = 20 μm। उच्च लेबलिंग विशिष्टता और कम पृष्ठभूमि पर ध्यान दें। धुंधला प्रोटोकॉल की अवधि: 6 घंटे कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां। (ए-सी) एमडी में हाइड्रोगेल में पूरे स्फेरॉइड की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक छवियां। स्केल बार = 10 μm. (D-F) एक स्फेरॉइड में कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चरल विशेषताओं को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत भी देखा गया है। स्केल सलाखों: (डी) = 4 μm; (E, F) = 2 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्र 11: ठंड से पहले और बाद में स्फेरॉइड की लाइव छवियां। (ए-एफ) हाइड्रोगेल गुंबदों की सीमाओं की अनियमितता ठंड के बाद स्पष्ट है। हालांकि, स्फेरॉइड का आकार और गोलाई समान रहती है। (एफ) पिघलने के बाद संस्कृति की सतह पर सेल माइग्रेशन देखा जा सकता है। (जी-एल) एमडी में हाइड्रोजेल में पूरे स्फेरॉइड को फ्रीज करने से पहले और बाद में जीवित कोशिका झिल्ली (डब्ल्यूजीए) और न्यूक्लियस स्टेनिंग (होचस्ट) समान सेल व्यवहार्यता और बरकरार कोशिका झिल्ली प्रदर्शित करते हैं। स्केल बेसर: (ए, बी, डी, ई) = 200 μm; (C, F, G-L) = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ट्रेडिओनल वर्कफ़्लो बहुउद्देशीय डिवाइस (MD) के साथ वर्कफ़्लो
सीढ़ी 22 6
समय 9 दिन 4 दिन
अपशिष्ट उत्पाद 26 9

तालिका 1: अल्पकालिक प्रयोग के दौरान पारंपरिक और नए वर्कफ़्लो के बीच चरण संख्या, समय और अपशिष्ट उत्पादन की तुलना।

पारंपरिक वर्कफ़्लो इम्यूनोफ्लोरेसेंस (एस-आईएफ) के लिए समाधान के साथ वर्कफ़्लो
सीढ़ी 25 7
समय 120 घंटे 6-8 घंटे
अपशिष्ट उत्पाद 28 10

तालिका 2: पारंपरिक इम्यूनोलेबलिंग और नए इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल की तुलना।

वीडियो 1: एक उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत स्फेरॉइड युक्त हाइड्रोगेल के विभिन्न स्तरों पर छवियों की समय श्रृंखला। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: साइटोकेराटिन 5 और डीएपीआई के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए दो वायुमार्ग ऑर्गेनोइड्स की 3 डी संरचना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: प्रयोग का अवलोकन। यह योजनाबद्ध एक हाइड्रोगेल में पूरे माउंट ऑर्गेनोइड्स को बढ़ाने और जांचने के लिए अनुक्रमिक प्रयोगात्मक चरणों को दर्शाता है। यहां वर्णित तकनीक विभिन्न माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड्स को विकसित करना, फ्रीज करना, पिघलना, लेबल करना और जांचना संभव बनाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: पारंपरिक ग्लास-बॉटम डिश या एमडी में हेपजी 2 कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता, विषाक्तता और प्रसार दर की तुलना। हेपजी 2 कोशिकाओं को सेल व्यवहार्यता और विषाक्तता की तुलना करने के लिए एमडी में (ए) एक पारंपरिक ग्लास-बॉटम सेल कल्चर डिश या (बी) पर उगाया गया था। (सी) व्यवहार्यता प्रदर्शित करने के लिए ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण का उपयोग किया गया था। स्केल बार = 20 μm। परिणामों की तुलना (डी-ई) सीसीके 8 साइटोटॉक्सिसिटी और (एफ) सेल प्रसार परख का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3: दो फोम बक्से की व्यवस्था। एमडी में पूरे ऑर्गेनोइड या स्फेरॉइड की धीमी ठंड प्रक्रिया के दौरान एक फोम बॉक्स को दूसरे के अंदर रखा जाता है। * दो बक्से को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: राल के पोलीमराइजेशन के बाद एमडी से राल ब्लॉक को हटाने के तरीके का प्रदर्शन करने वाले कदम। (ए) स्फेरॉइड या ऑर्गेनोइड के आसपास राल ब्लॉक एमडी आला के अंदर तैयार किया जाता है और फिर बहुलक बनाया जाता है। (बी-डी) फिर, एक उपयुक्त पतली रॉड के साथ, राल ब्लॉक को आला से हटाने के लिए धक्का दिया जाता है। (ई) इसके बाद, राल ब्लॉक, नीचे प्लास्टिक के साथ, हटा दिया जाता है। (F-G) अंत में, चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग उन्हें अलग करने के लिए किया जाता है यदि ब्लॉक अभी भी प्लास्टिक से जुड़ा हुआ है। (एच) ब्लॉक पतली सेक्शनिंग के लिए तैयार है। राल ब्लॉक (*) में पूरे-माउंट ऑर्गेनोइड या स्फेरॉइड ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए सेक्शनिंग के लिए तैयार हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 5: वायुमार्ग ऑर्गेनोइड्स जो इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबल किए गए थे और फिर एमडी में रहते हुए कल्पना की गई थी। (ए-सी) ऊपरी पैनल एक केंद्रीय लुमेन के साथ गोलाकार वायुमार्ग ऑर्गेनोइड दिखाता है। हरा अंग की सबसे बाहरी अंगूठी में साइटोकेराटिन 5 को व्यक्त करने वाली वायुमार्ग पूर्वज कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, और नीला नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 50 μm. (D-F) निचला पैनल (D) DAPI और (E) Alexa 488 फिल्टर में दो साइड-बाय-साइड ऑर्गेनोइड्स की त्रि-आयामी छवि दिखाता है, साथ ही (F) मर्ज की गई छवि भी दिखाता है। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 6: कोशिकाओं के जीवित कोशिका झिल्ली पर लेबलिंग घनत्व की तुलना। ग्राफ पारंपरिक और वर्तमान में अपनाए गए वर्कफ़्लो का उपयोग करके ठंड से पहले और बाद में स्फेरॉइड की तुलना करता है। विश्लेषण छवि जे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप: IntDen = एकीकृत घनत्व (चयनित स्फेरॉइड में प्रतिदीप्ति तीव्रता)। सीटीसीएफ = सही कुल सेल फ्लोरेसेंस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एमडी, यहां वर्णित योगों और प्रोटोकॉल का पूरक है, अधिक नियंत्रित वातावरण में ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के तेजी से और सहज 3 डी विकास की सुविधा प्रदान करता है और उसी स्थिति में प्रयोग जारी रखता है। नमूना पूरी प्रक्रिया के दौरान एक ही वातावरण में रहता है, और कंटेनर में 3 डी बढ़ते आर्किटेक्चर का लगभग 100% बरकरार रहता है। यह अनुक्रमिक प्रयोगों के दौरान समरूपता में सुधार करता है और एक विस्तारित संस्कृति अवधि के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, पारंपरिक वर्कफ़्लोज़ (चित्रा 4) की तुलना में ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड प्रोसेसिंग के दौरान चरणों की संख्या में भारी कमी आई है, जो बदले में हैंडलिंग समय और मानव त्रुटियों को कम करता है और संदूषण जोखिम को कम करता है। इसके अलावा, यह विश्वसनीयता और वैधता में सुधार करता है क्योंकि प्रयोगात्मक स्थितियां एक ही वातावरण में 3 डी बढ़ती संरचनाओं की रक्षा करते हुए स्थिर रहती हैं। यह सटीकता, विश्वसनीयता और वैधता में सुधार करते हुए प्रयोगशाला में समय और श्रम बचाने में मदद करता है। इसके अलावा, यह पूरी अनुक्रमिक प्रक्रिया के दौरान व्यक्तिगत 3 डी बढ़ती संरचनाओं की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। संस्कृति के दौरान आकार और स्थिति में परिवर्तन की परीक्षा और डिवाइस में विभिन्न यौगिकों के लिए उनकी प्रतिक्रिया संभव है। यह मानव शरीर और रोगों के विकास के पुनर्मूल्यांकन के लिए एक उत्कृष्ट इन विट्रो प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है। शोधकर्ता स्फेरॉइड और ऑर्गेनोइड के संलयन के दौरान चरणों की जांच कर सकते हैं, जो बीमारियों में प्रवास और सामान्य विकास के लिए एक आवश्यक तंत्रहै। प्रयोगशाला में संलयन के मॉडलिंग के उद्देश्य से हाल के अध्ययन ऑर्गेनॉइड और स्फेरॉइड मॉडल44,45,46,47 का उपयोग करना पसंद करते हैं।

यह उपकरण शोधकर्ताओं को उनकी वर्तमान स्थिति में उन्हें फ्रीज करके एक तत्काल स्थिति में जांच को रोकने की अनुमति देता है और फिर बिना किसी नुकसान के जारी रखता है जब स्थितियां नए प्रयोगों की अनुमति देती हैं। उदाहरण के लिए, कोविड महामारी के कारण, शोधकर्ताओं को अपनी कीमती सामग्री और डेटा खोते हुए प्रयोगों को तुरंत रोकने की आवश्यकता थी। परिस्थितियों में बदलाव के कारण अध्ययन में अचानक रुकावट आने पर प्रयोग को सुरक्षित करने के लिए कोई वर्तमान समाधान नहीं है।

तकनीक की सीमाएं
यहां वर्णित तकनीकों को ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के सहज विकास की जांच करने के लिए विकसित किया गया है, जो सामान्य मानव शरीर और बीमारियों के विकास को समझने के लिए एक मॉडल है। इसलिए, वर्तमान डिवाइस और पद्धतियों का उपयोग समान आकार के स्फेरॉइड या ऑर्गेनोइड विकसित करने के लिए नहीं किया जा सकता है जिन्हें दवा स्क्रीनिंग परीक्षणों के लिए पसंद किया गया है। एक और सीमा स्फेरॉइड और ऑर्गेनोइड के आकार से संबंधित है। पूर्ण ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड बहुत घने हो सकते हैं, कई सेल परतों को अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है जो नमूनों को अपने कोर में प्रवेश करने के लिए संरक्षित या लेबल करते हैं। हालांकि, सभी प्रोटोकॉल के लिए इनक्यूबेशन अवधि, जिसमें धुंधलापन, लेबलिंग और ठंड शामिल है, नमूने के आकार और नमूने के आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट जेल के अनुसार भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, बड़े ऑर्गेनोइड्स और स्टिफर जैल को नमूने के केंद्र में प्रवेश की अनुमति देने के लिए अधिक विस्तारित इनक्यूबेशन अवधि की आवश्यकता होती है।

भविष्य के अनुप्रयोग
डिवाइस और ये पद्धतियां प्रजनन क्षमता, विश्वसनीयता और सटीकता में सुधार करते हुए ऑर्गेनोजेनेसिस, ऊतक मोर्फोजेनेसिस और बीमारियों को समझने के लिए 3 डी बढ़ते ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड की दीर्घकालिक परीक्षा की अनुमति देती हैं। एमडी में लेबल किए गए ऑर्गेनोइड या स्फेरॉइड की जांच उच्च तकनीक माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके की जा सकती है, जिसमें मल्टीफोटॉन लेजर स्कैनिंग और लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, शोधकर्ता एक कोररिलेटिव अध्ययन, सीएलईएम (कोररिलेटिव लाइट इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) बनाने के लिए एक कॉन्फोकल और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप दोनों के तहत एक ही डिवाइस में एक ही नमूने की जांच कर सकते हैं। डिवाइस और कार्यप्रणाली का उपयोग 3 डी आर्किटेक्चर की रक्षा करते हुए बायोबैंकिंग ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

रनन गुल्हन अकतास एमडी, एस-आईएचसी, एस-आईएफ और एफएस पेटेंट आवेदनों के मालिक हैं। ओल्गु एनिस टॉक इन उत्पादों के विकास में शामिल था। ओल्गु एनिस टॉक और गामज़े डेमिरेल सेलोरमा नामक कंपनी के आर एंड डी टीम के सदस्य हैं। यूसुफ मुस्तफा सात्सी, ज़ेनेप अकबुलुत और ओज़गेकन कयालर के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम आरेख तैयार करने के लिए शिकागो विश्वविद्यालय से डेल मर्टेस के आभारी हैं, इस्तांबुल मेडिपोल यूनिवर्सिटी रिसर्च इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ साइंसेज एंड टेक्नोलॉजीज में तकनीकी सहायता के लिए डॉ मेहमत सेरिफ आयदीन के लिए और पांडुलिपि के संपादन के लिए माल्टेप विश्वविद्यालय के डॉ राणा काज़ेमी के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol (EtOH) Merck 8187602500 Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone Merck 8222512500 Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)   Invitrogen I34406 Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody Biocare Medical CP 028 A Store at +4 °C
Anti-albumin antibody Abcam EPR20195 Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal Abcam 134435 Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5 Abcam 53121 Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody Biocare Medical ACI 3058 A, B Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C1016-500G Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) Abcam ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL  Nest 601051
Centrifuge tubes, 50 mL  Nest 602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus Telstar EN12469
CO2 Incubator Panasonic KM-CC17RU2
Copper Grids Electron Microscopy Sciences G100-Cu Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture   Sigma Aldrich AEC101 Store at +4 °C
Diamond knife Diatome Ultra 45°, 40-US Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology Biofroxx 67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes Nest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41966-029 Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic Bright Slide 2.BS01-105-1000
Epon resin  Sigma 45359-1EA-F Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier Pan Biotech P30-3304 Store at +4 °C
Freezing Solution (FS) Cellorama CellO-F Store at +4 °C
Glass knife maker Leica EM KMR3 For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) Leica 7890-08 Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%  Electron Microscopy Sciences 16210 Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution Sigma Aldrich 56-81-5 Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 Invitrogen A32933 Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35502 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84540 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35552 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84541 Store at +4 °C
Hematoxylin Harris  Bright Slide 2.BS01-104-1000
HepG2 cells ATCC HB-8065 Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 R&D Systems MAB2020 Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354248 Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354234 Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel ThermoFischer Scientific A1413201 Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel Biotechne, R&D Systems BME001-01 Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid Sigma 11189-100G Store at RT
Lead aspartate solution Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate Electron Microscopy Sciences 17900 Store at RT
Leica Confocal Microscope Leica DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss
Microplate reader Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD) Cellorama CellO-M
Nuclear-DNA stain Invitrogen H3569 Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain ThermoFischer Scientific 62248 DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% Electron Microscopy Sciences 19190 Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody R&D systems MAB2020 Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%  Sigma 1.04005.1000 Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets MP Biomedicals, LLC 2810305
Post-fixative solution %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%  Electron Microscopy Sciences 26603-01 Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS Zeiss Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL Nest 620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment Zeiss GeminiSEM 500 We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack ScyTek Laboratories SHP125 Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 Electron Microscopy Sciences 11655 Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] GeneTex GTX22871 Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) Cellorama CellO-IF Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) Cellorama CellO-P Store at +4 °C
Specimen trimming device Leica EM TRIM2 For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater Leica EM ACE200 Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH) Sigma 223220-5G Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Ultra gel super glue Pattex PSG2C For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome Leica EM UC7 For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL Nest 171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL Isolab L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL  Nest 110919HA01
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

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References

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जीव विज्ञान अंक 190
हाइड्रोजेल में रहते हुए पूरे ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड की संवर्धन, ठंड, प्रसंस्करण और इमेजिंग
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Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., … More

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., Akbulut, Z., Kayalar, O., Aktas, R. G. Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel. J. Vis. Exp. (190), e64563, doi:10.3791/64563 (2022).

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