Summary
Time-lapse mikroskopi er et værdifuldt værktøj til at studere meiose i spirende gær. Denne protokol beskriver en metode, der kombinerer cellecyklussynkronisering, time-lapse-mikroskopi og betinget udtømning af et målprotein for at demonstrere, hvordan man studerer funktionen af et specifikt protein under meiotisk kromosomadskillelse.
Abstract
Time-lapse fluorescensmikroskopi har revolutioneret forståelsen af meiotiske cellecyklushændelser ved at levere tidsmæssige og rumlige data, der ofte ikke ses ved billeddannelse af faste celler. Spirende gær har vist sig at være en vigtig modelorganisme til at studere meiotisk kromosomadskillelse, fordi mange meiotiske gener er stærkt bevarede. Time-lapse mikroskopi af meiose i spirende gær tillader overvågning af forskellige meiotiske mutanter for at vise, hvordan mutationen forstyrrer meiotiske processer. Imidlertid fungerer mange proteiner på flere punkter i meiose. Brugen af tab-af-funktion eller meiotiske nulmutanter kan derfor forstyrre en tidlig proces, blokere eller forstyrre den senere proces og gøre det vanskeligt at bestemme fænotyperne forbundet med hver enkelt rolle. For at omgå denne udfordring beskriver denne protokol, hvordan proteinerne kan udtømmes betinget fra kernen på bestemte stadier af meiose, mens de overvåger meiotiske begivenheder ved hjælp af time-lapse-mikroskopi. Specifikt beskriver denne protokol, hvordan cellerne synkroniseres i profase I, hvordan anker væk-teknikken bruges til at nedbryde proteiner fra kernen på specifikke meiotiske stadier, og hvordan time-lapse-billeddannelse bruges til at overvåge meiotisk kromosomadskillelse. Som et eksempel på teknikkens anvendelighed blev kinetochoreproteinet Ctf19 udtømt fra kernen på forskellige tidspunkter under meiose, og antallet af kromatinmasser blev analyseret i slutningen af meiose II. Samlet set kan denne protokol tilpasses til at nedbryde forskellige nukleare proteiner fra kernen, mens de meiotiske divisioner overvåges.
Introduction
Time-lapse fluorescensmikrokopi er et værdifuldt værktøj til at studere dynamikken i meiotisk kromosomadskillelse i spirende gær 1,2. Spirende gærceller kan induceres til at gennemgå meiose gennem sult af vigtige næringsstoffer3. Under meiose gennemgår celler en runde kromosomadskillelse efterfulgt af to divisioner for at skabe fire meiotiske produkter, der pakkes i sporer (figur 1). Individuelle celler kan visualiseres gennem hvert trin af meiose, hvilket genererer rumlige og tidsmæssige data, der let kan gå glip af fastcellebilleddannelse. Denne protokol viser, hvordan kombination af time-lapse fluorescensmikroskopi med to tidligere etablerede metoder, det inducerbare NDT80-system (NDT80-in) og anker væk-teknikken, kan bruges til at studere funktionen af specifikke proteiner i forskellige meiotiske stadier.
NDT80-in-systemet er et kraftfuldt værktøj til meiotisk cellecyklussynkronisering, der er afhængig af den inducerbare ekspression af den midterste meiosetranskriptionsfaktor NDT80 4,5. NDT80-ekspression er påkrævet for profase I frakørsel 6,7. Med NDT80-in-systemet er NDT80 under kontrol af GAL1-10-promotoren i celler, der udtrykker Gal4-transkriptionsfaktoren smeltet sammen med en østrogenreceptor (Gal4-ER)4,5. Fordi Gal4-ER kun kommer ind i kernen, når den er bundet til β-østradiol, standses NDT80-in-celler i profase I i fravær af β-østradiol, hvilket tillader synkronisering af celler i profase I (figur 1). β-østradiol-tilsætning fremmer translokationen af Gal4-ER-transkriptionsfaktoren ind i kernen, hvor den binder GAL1-10 for at drive ekspression af NDT80, hvilket fører til synkron indtræden i de meiotiske divisioner. Selvom time-lapse-mikroskopi kan udføres uden synkronisering, er fordelen ved at bruge synkronisering evnen til at tilføje en hæmmer eller et lægemiddel, mens cellerne er på et bestemt stadium af meiose.
Anker væk teknikken er et inducerbart system, hvormed et protein kan udtømmes fra kernen med tilsætning af rapamycin8. Denne teknik er ideel til at studere nukleare proteiner under celledeling i spirende gær, fordi gærceller gennemgår lukket mitose og meiose, hvor den nukleare kuvert ikke nedbrydes. Desuden er denne teknik meget nyttig til proteiner, der har flere funktioner gennem meiose. I modsætning til deletioner, mutante alleler eller meiotiske nullalleler kompromitterer fjernelsen af et målprotein fra kernen på et bestemt stadium ikke målproteinaktiviteten på tidligere stadier, hvilket giver mulighed for en mere nøjagtig fortolkning af resultaterne. Anker væk-systemet udnytter shuttling af ribosomale underenheder mellem kernen og cytoplasmaet, der opstår ved ribosomal modning8. For at nedbryde målproteinet fra kernen mærkes målproteinet med FKBP12-rapamycinbindingsdomænet (FRB) i en stamme, hvor den ribosomale underenhed Rpl13A er mærket med FKBP12. Uden rapamycin interagerer FRB og FKBP12 ikke, og det FRB-mærkede protein forbliver i kernen. Ved rapamycintilsætning danner rapamycin et stabilt kompleks med FKBP12 og FRB, og komplekset transporteres ud af kernen på grund af interaktionen med Rpl13A (figur 1). For at forhindre celledød ved rapamycintilsætning har celler tor1-1-mutationen af TOR1-genet . Derudover indeholder disse celler fpr1Δ , en nullallel af S. cerevisiae FKBP12-proteinet, som forhindrer endogen Fpr1 i at udkonkurrere Rpl13A-FKBP12 for FRB og rapamycinbinding. Ankeret væk baggrundsmutationer, tor1-1 og fpr1Δ, påvirker ikke meiotiske timinger eller kromosomadskillelse2.
For at demonstrere nytten af denne teknik blev kinetochore-proteinet Ctf19 udtømt på forskellige tidspunkter gennem hele meiosen. Ctf19 er en komponent i kinetochore, der kan undværes i mitose, men kræves for korrekt kromosomadskillelse i meiose 9,10,11,12,13. Ved meiose kastes kinetochore i profase I, og Ctf19 er vigtig for kinetochore genmontering 9,14. Til denne protokol blev celler med NDT80-in-systemet synkroniseret, og ankervækteknikken blev brugt til at nedbryde målproteinet Ctf19 fra kernen før og efter frigivelsen fra profase I og efter meiose I-kromosomadskillelse (figur 1). Denne protokol kan tilpasses til at nedbryde andre proteiner af interesse på ethvert stadium af meiose og mitose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af nødvendige materialer
- Forbered reagenser til vækst og sporulation af gærceller.
BEMÆRK: Hvis spirende gærstammer er ade2 - og trp1-, skal du supplere alle medier i trin 1.1.1-1.1.3 med en endelig koncentration på 0,01% adenin og 0,01% tryptophan fra 1% bestande. Hvis steriliserende medier ved autoklave, tilsættes disse aminosyrer først, efter at reagenserne er blevet autoklaveret og får lov til at afkøle til stuetemperatur.- Til vegetativ vækst fremstilles 2x syntetisk komplet + dextrosemedium (2XSC) ved at opløse 6,7 g gærkvælstofbase uden aminosyrer, 2 g komplet aminosyreblanding og 20 g dextrose i 500 ml vand. Steriliser blandingen ved autoklavering i 20 minutter ved 121 °C eller filtrering gennem et 0,2 μm filter.
- Til det første trin af sporulation fremstilles 2x syntetisk komplet + acetatmedium (2XSCA) ved at opløse 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer, 2 g komplet aminosyreblanding og 20 g kaliumacetat i 500 ml vand. Steriliser blandingen ved autoklavering i 20 minutter ved 121 °C eller filtrering gennem et 0,2 μm filter.
- Til det sidste trin af sporulation fremstilles 1% kaliumacetat (1% KAc) ved at opløse 5 g KAc i 500 ml vand. Steriliser blandingen ved autoklavering i 20 minutter ved 121 °C eller filtrering gennem et 0,2 μm filter.
- Forbered lægemidler og reagenser til mikroskopi, synkronisering og anker væk.
- For at klæbe celler til dæksedlen under time-lapse-billeddannelse fremstilles 1 mg / ml concanavalin A (ConA) i 1x PBS. Filtersteriliser med et 0,2 μm filter og opbevar små (~10 μL) alikvoter ved -20 °C.
- For at bruge NDT80-in-systemet skal du fremstille 2 ml 1 mM β-østradiol opløst i ethanol. Filtersteriliser med et 0,2 μm filter og opbevar alikvoter (~500 μL) ved -20 °C.
- Til anker væk systemet, lav 1 mg / ml rapamycin opløst i DMSO. Filtersteriliser med et 0,2 μm filter og opbevar små (~10 μL) alikvoter ved -20 °C.
BEMÆRK: Forbered små alikvoter af rapamycin for at undgå flere fryse-optøningscyklusser af lægemidlet.
- Generer gærstammer, der indeholder NDT80-in-systemet (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) og et målprotein mærket med FRB i ankerets genetiske baggrund (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Ctf19-FRB blev anvendt til denne undersøgelse. Derudover blev en kopi af histonprotein Htb2 mærket med mCherry for at muliggøre overvågning af meiotisk progression og kromatinsegregering.
- Forbered et kammer til time-lapse-billeddannelse
- Start forberedelsen af kammeret 6 h-24 timer før billeddannelse (figur 2). Skær et kammer på 18 mm x 18 mm ud af pipettespidsboksindsatsen ved hjælp af en opvarmet skalpel eller et andet skarpt blad.
- Brug en plastpipettespids til at sprede et tyndt lag silikoneforseglingsmiddel rundt om kammerets nederste kanter, der klæber til dækslippen. Tilsæt nok fugemasse, så kammerets kanter er helt dækket (se figur 2).
- Fastgør kammeret til en 24 mm x 50 mm dæksel ved forsigtigt at placere kammeret med tætningssiden nedad på dækslippen. Sørg for, at der ikke er huller i tætningsmidlet, så kammeret ikke lækker.
- Spred 8-10 μL ConA på dæksedlen. Fordel ConA på midten af dæksedlen, og brug en pipettespids til at sprede ConA i et tyndt lag, så det dækker det meste af dæksedlen, der er omgivet af kammeret.
BEMÆRK: Plastkamre kan genbruges på ubestemt tid. Når time-lapse-billeddannelsen er afsluttet, skal du fjerne kammeret fra dækslet ved hjælp af en barbermaskine, rense silikoneforseglingsmidlet fra kammeret og holde kamrene nedsænket i 95% ethanol til fremtidig brug.
2. Sporulation af gærceller
- Udfør følgende trin for sult af gærceller for at fremkalde det meiotiske program.
BEMÆRK: Disse trin er til sporulering af W303-gærstammen. Andre stammer kan kræve andre protokoller15. Sporulationseffektiviteten varierer meget mellem laboratoriestammer, hvor W303 udviser en sporulationseffektivitet på ~ 60% 16,17,18.- Tag en enkelt koloni af den passende diploide gærstamme fra en plade og pod 2 ml 2XSC og lad vokse ved 30 ° C på en rulletromle i 12-24 timer til mætning.
- Den mættede kultur fortyndes til 2XSCA ved tilsætning af 80 μL af kulturen fra trin 2.1.1 til 2 ml 2XSCA. Lad det vokse ved 30 °C på en tromle i 12-16 timer. Lad ikke være i 2XSCA i mere end 16 timer, da cellerne kan blive syge eller selvfluorescerende.
- Udfør to vaske ved at dreje kulturen ned ved 800 x g ved stuetemperatur (25 °C) i 1 min., kassere væsken og genbruge pelleten i 2 ml sterilt destilleret vand.
- Efter den anden vask fjernes væsken og pelleten genindstilles i 2 ml 1% KAc, og den lades vokse ved 25 °C på en rulletromle i 8-12 timer. Celler, der er kommet ind i meiose, vil arrestere i pachyten af profase I.
- Profase I frigivelsessystem
- Tilsæt β-østradiol direkte til sporulationskulturen til en endelig koncentration på 1 μM og hvirvel kulturrøret hurtigt. β-østradiol frigiver celler fra profase I.
3. Udtømning af målprotein fra kernen ved hjælp af anker væk-teknikken
- Tilsæt rapamycin til cellerne for at nedbryde det FRB-mærkede protein fra kernen på et bestemt stadium.
- For at nedbryde proteiner fra kernen ved profase I-udgang tilsættes rapamycin til en endelig koncentration på 1 μg / ml til sporulationskulturrøret samtidig med β-østradioltilsætning.
- For at nedbryde proteiner fra kernen på et bestemt stadium af meiose skal du overvåge cellecyklustrinnet, der starter 60 minutter efter β-østradioltilsætning. Hvert 20. minut pipetteres 5 μL kultur på en 24 mm x 40 mm dæksel, og cellerne dækkes med en 18 mm x 18 mm dæksel. Hold kulturer roterende på tromlen ved 25 °C mellem tidspunkterne.
- Billede cellerne ved hjælp af A594/mCherry-filteret og 60x-målet for et fluorescensmikroskop. Indstil den procentvise transmittans til 2% og eksponeringstiden til 250 ms. Tilstedeværelsen af en, to eller fire DNA-masser vil indikere det meiotiske stadium, hvor cellerne har udviklet sig. Der tilsættes rapamycin til en slutkoncentration på 1 μg/ml i det meiotiske stadium af interesse.
- Hold cellerne snurrende på rulletromlen ved 25 °C, indtil de er klar til billeddannelse. Nuklear udtømning af et målprotein forekommer 30-45 min efter rapamycintilsætning 2,8.
4. Time-lapse fluorescensmikroskopi
- Lav en agarpude, der skal bruges til at oprette et monolag af celler til billeddannelse (se trin 4.2).
- Skær og kassér hætten og bunden 1/3 af et 1,5 ml mikrofugerør for at skabe en cylinder. Cylinderen vil tjene som en form til agarpuden. Lav to cylindre for at få en ekstra, hvis agaren ikke polymeriserer ordentligt i den første.
- Placer den skårne mikrofugerørcylinder på et rent glasglas med toppen af røret på hovedet siddende på diaset.
- Lav 6 ml af en 5% agaropløsning (brug 1% KAc som opløsningsmiddel) i et 50 ml bægerglas og mikrobølge det, indtil agaren er helt opløst.
BEMÆRK: Agaren koger let over i mikrobølgeovnen; Se agar og start og stop mikrobølgeovnen, når agaren begynder at koge og hvirvle bægerglasset. Start og stop mikrobølgeovnen flere gange for at opløse agaren helt. Agaropløsningen fremstilles ud over den mængde, der er nødvendig for at sikre, at agaren opløses fuldstændigt. - Skær spidsen af pipetten af for at lave en større åbning og pipet ~ 500 μL smeltet agar i hver mikrofugerørcylinder. Lad det sidde ved stuetemperatur, indtil agaren størkner (~ 10-12 min).
- Forberedelse af gærceller til billeddannelse
- Drej 200 μL af sporulationskulturen ned fra trin 3.2 ved 800 x g i 2 min i 1 ml mikrocentrifugerør. 180 μL af supernatanten fjernes og kasseres. Pellet i den resterende supernatant resuspenderes ved hvirvlende og svirpende med tuben.
- 6 μL af de koncentrerede celler pipetteres på dæksedlen midt i kammeret i trin 1.4.
- Hold cylinderen med agarpuden lavet i trin 4.1, og skub den forsigtigt af glasglasset. Sørg for, at agaren er helt flad i bunden, og brug bunden af en pipettespids til at lægge et let tryk på mikrofugeformen, så agarpuden skubbes lidt ud over rørets kant.
- Vend formen om, så agarpuden vender nedad mod kammeret.
- Brug tang til forsigtigt at placere agarpuden (stadig i mikrofugerørformen) oven på cellerne. Brug en pipettespids til forsigtigt at skubbe agarpuden rundt om kammeret 10-20 gange for at skabe et monolag af celler på dæksedlen.
- Lad agarpuden stå i kammeret i 12-15 min. Dette trin gør det muligt for cellerne at klæbe til ConA på dæksedlen.
- Overfør 2 ml sporulationskultur fra trin 3.2 til to mikrocentrifugeglas og drej ved 15.700 x g i 2 min. Overfør supernatanten til rene mikrofugerør og drej igen ved 15.700 x g i 2 min. Overfør supernatanten til rene mikrocentrifugerør, der skal bruges i næste trin.
BEMÆRK: Det er vigtigt at anvende den prækonditionerede KAc-supernatant sammen med β-østradiol og rapamycin for at sikre effektiv sporulation og fortsat nedbrydning af det pågældende protein. - Når agarpuden har siddet i kammeret i 12-15 min, flyder og fjerner agarpuden inden billeddannelse. Derefter tilsættes 2 ml supernatant fra trin 4.2.7 dråbevis til kammeret. Når væsken har nået toppen af kammeret, vil agarpuden højst sandsynligt flyde.
BEMÆRK: Hvis agarpuden ikke flyder automatisk, skal du vente 1-2 min. Hvis agarpuden stadig ikke flyder, skal du fjerne den forsigtigt med tang. Ideelt set ville agarpuden flyde alene, fordi fjernelse af den før flydende kunne føre til fjernelse af cellerne. - Når agarpuden er flydt, skal du fjerne den forsigtigt med tang og kassere den. Placer en 24 mm x 50 mm dæksel på toppen af kammeret for at forhindre fordampning under billeddannelse.
- Opsætning af en film på mikroskopet
BEMÆRK: Instruktionerne nedenfor er til et omvendt mikroskop udstyret med en diasholder, der kan rumme 24 mm x 50 mm dæksel (Se materialetabel for mikroskop, kamera og softwaredetaljer). Et 60x olienedsænkningsmål bruges til billedoptagelse. Denne protokol skal muligvis ændres, når du bruger andre mikroskoper eller andre diasholdere. De nøjagtige trin til udførelse af trin 4.3.2 til trin 4.3.16 varierer afhængigt af det anvendte mikroskop og billedbehandlingssoftware. Se pkt. 4.4 for instruktioner til et andet mikroskop.- Sæt dækslet i glideholderen. Fastgør støbeleret på siden af dækslikket for at holde det sikkert i glideholderen.
- Åbn billedoptagelsessoftwaren. Brug kurs- og finjusteringsknapper til at fokusere cellerne ved hjælp af DIC eller brightfield.
- I hovedmenuen i billedoptagelsessoftwaren skal du klikke på Filer > erhverve (løs 3D). Tre vinduer vises.
- I vinduet med navnet Resolve 3D skal du klikke på ikonet Erlenmeyerkolbe . Dette åbner et vindue med titlen Design/kør eksperiment, som indeholder kontrolelementerne til opsætning af et eksperiment til opsætning af en timelapse-film.
- Under fanen Design skal du navigere til fanen mærket Sektionering. Markér afkrydsningsfeltet ud for Z-sektionering. Indstil z-stablerne som følger: Optisk sektionsafstand = 1 μm, Antal optiske sektioner = 5, Prøvetykkelse = 5,0 μm.
- Under fanen Kanaler skal du klikke på + ikonet, så en kanalindstilling vises. Vælg den relevante kanal. Til dette eksperiment vælger vi A594, som bruges til at afbilde mCherry. Markér feltet ud for Referencebillede, og indstil Z-positionen til midten af eksemplet i rullemenuen.
- Vælg en værdi i rullemenuen ved siden af %T og Exp. for at indstille henholdsvis procent transmission og eksponeringstid. Til dette eksperiment anvendes 2 % transmittans og 250 ms eksponeringstid i A594-kanalen, og 10 % transmittans og 500 ms eksponeringstid bruges til brightfield.
BEMÆRK: Eksponeringstiden og den procentvise transmittans varierer med forskellige mikroskoper. For at undgå overeksponering skal du bruge den laveste procent transmission og kortest mulige eksponeringstid, der giver mulighed for korrekt visualisering af proteinet af interesse. - Under fanen Time-lapse skal du markere feltet ud for Time-lapse. I den tabel, der vises, skal du angive 10 under kolonnen Min i rækken Time-lapse og 10 under kolonnen timer i rækken Total Time. Dette vil køre et tidskursus, der tager billeder hvert 10. minut i 10 timer.
- Markér afkrydsningsfeltet ud for Bevar fokus med ultimativ fokus for at forhindre sceneforskydning under filmen. Under fanen Point skal du markere feltet ud for Visit Point List.
- I hovedmenuen skal du klikke på Vis > punktliste. Et vindue kaldet punktliste vises. Flyt scenen til et område af kammeret, der viser et monolag af celler. Klik på Punktmærke i punktlistevinduet.
- Flyt scenen for at vælge 25-30 punkter uden overlapning for at undgå overeksponering af cellerne. Hvert felt vil blive afbildet under hvert tidskursus.
- I punktlistevinduet skal du vælge Kalibrer alle for at indstille det ultimative fokus for hvert punkt. Under fanen Design i vinduet Desgin/Kør eksperiment skal du indtaste intervallet af punktværdier (hentet fra punktlistevinduet) i feltet ud for Besøgspunktliste. Under fanen Kør skal du gemme filen på den relevante destination på computeren. I vinduet Design/Kør eksperiment skal du vælge knappen Afspil (ikon for den grønne trekant) for at starte filmen.
- Valgfri metode: Opsætning af en film på et mikroskop
BEMÆRK: Disse instruktioner er til et omvendt mikroskop udstyret med en glideholder, der kan rumme en 24 mm x 50 mm coverslip. Se Materialefortegnelsen for specifikationer om det anvendte mikroskop, kamera og billedbehandlingssoftware. Et 60x olienedsænkningsmål bruges til billedoptagelse.- Sæt dækslet i glideholderen. Åbn billedoptagelsessoftwaren. Brug kurs- og finjusteringsknapper til at fokusere celler ved hjælp af DIC eller brightfield. Højreklik i softwarens åbne vindue. En rullemenu vises.
- Klik på Anskaffelseskontrol > anskaffelse. Klik på Applikation > Definer/kør eksperiment. Dette åbner et vindue mærket ND Acquisition.
- I vinduet, der åbnes, skal du markere afkrydsningsfeltet ud for XY. Flyt fasen til den ønskede placering, og klik på feltet under Punktnavn for at vælge denne placering som et punkt. Gentag dette, indtil 25-30 punkter er markeret uden overlapning for at undgå overeksponering af cellerne. Hvert felt vil blive afbildet under hvert tidskursus.
- Indstil procentvis transmission for hver fluorescerende kanal. Fordi stammerne producerer Htb2-mCherry, bruges mCherry-filteret her. Under vinduet Anskaffelse, der åbnede i trin 4.3.3, skal du navigere til knappen 555 nm. Indstil den procentvise transmittans til 5% ved at justere glideskalaen under 555 nm-knappen, indtil den læser 5%.
- Indstil eksponeringstiden for hver fluorescerende kanal. Under vinduet Anskaffelse skal du vælge 200 ms i rullemenuen Eksponering.
BEMÆRK: Eksponeringstiden og den procentvise transmittans varierer med forskellige mikroskoper. For at undgå overeksponering skal du bruge den laveste procentvise transmittans og kortest mulige eksponeringstid, der giver mulighed for korrekt visualisering af proteinet af interesse. - Klik på feltet ud for Z i vinduet ND Acquisition . Indstil fem z-stakke af gærcellerne, der er 1,2 μM fra hinanden.
- Klik på boksen ved siden af λ. Vælg de relevante kanaler, der skal bruges til eksperimentet. For DIC skal du sikre dig, at Hjem er valgt i rullemenuen under Z pos. For mCherry skal du sikre dig, at Alle er valgt i rullemenuen under Z pos. Dette sikrer, at kun en enkelt sektion (midt i z-stakken) tages til DIC.
- Markér afkrydsningsfeltet ud for Tid i vinduet ND-anskaffelse . Markér afkrydsningsfeltet under Fase. I rullemenuen under Interval skal du vælge 10 min. Under Varighed skal du vælge 10 timer. Dette vil køre tidsforløbet, således at der tages billeder hvert 10. minut i 10 timer.
5. Analyse af kromatinadskillelse
- Åbn Fiji-softwaren. Åbn et synsfelt ad gangen: Åbn DIC- og mCherry-kanalerne for hvert felt.
- Tag den maksimale intensitetsprojektion af mCherry-kanalen for at få et enkelt billede: klik på Image > Stacks > Z Project, vælg Max intensitet i rullemenuen.
- Flet DIC- og mCherry-kanalerne i ét billede: klik på Billede > farve > Flet kanaler.
- Følg en enkelt celle gennem meiose. Efter meiose II-færdiggørelsen registreres antallet af DNA-masser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at overvåge kromatinadskillelse blev histonprotein Htb2 mærket med mCherry. I profase I fremstår kromatinet som en enkelt Htb2-masse. Efter at homologe kromosomer adskilles i den første meiotiske division, fremstår kromatinet som to forskellige masser (figur 3A). Efter at søsterkromatiderne adskilles, fremstår kromatinet som fire masser. Hvis nogle kromosomer ikke fastgøres til spindelmikrotubuli, kan yderligere masser ses efter meiose I eller meiose II.
Metoden beskrevet ovenfor blev brugt til at studere kinetochore-komponenten Ctf19's rolle for at sikre korrekt kromosomadskillelse i spirende gærmeiose. Anker væk gærstammer, der udtrykker Ctf19 mærket med FRB, blev synkroniseret i profase I ved hjælp af NDT80-in-systemet (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 promoverede NDT80; GAL4-ER). Som kontrol blev der anvendt en NDT80-in stamme med anker væk stamme baggrund, men uden FRB-mærket protein (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10 promoveret NDT80; GAL4-ER). Celler blev frigivet fra profase I-arrestationen ved tilsætning af β-østradiol. Rapamycin blev tilsat for at nedbryde Ctf19-FRB fra kernen enten ved frigivelse (før kinetochore genmontering), 45 minutter efter frigivelse (efter kinetochore genmontering, men før meiose I) eller 3 timer efter frigivelse (lige før meiose II) (figur 3A-F). Efter tilsætning af rapamycin blev time-lapse fluorescensmikroskopi udført, og billeder blev erhvervet hvert 10. minut i den resterende varighed af meiose.
Efter billeddannelse blev open access-softwaren Fiji brugt til at åbne billederne og udføre analyse for figurer, der viser tidsprogression (figur 3A-F). Antallet af DNA-masser efter meiose II blev talt i mindst 100 celler, der gennemgik meiose pr. Tilstand. I vildtypeceller med ankeret væk baggrund er der typisk fire DNA-masser i slutningen af meiose II, der repræsenterer de fire produkter af meiose (figur 3A). I en lille brøkdel af cellerne er kun tre masser synlige efter meiose II (figur 3B, G). Det er imidlertid sandsynligt, at tre masser er resultatet af en celle, der har fire produkter af meiose, men to af disse masser vises sammen efter meiose II.
Når Ctf19-FRB er forankret væk på tidspunktet for frigivelse af profase I-udgang (t = 0 h), viser ca. 47% af cellerne mere end fire DNA-masser efter afslutning af meiose, hvilket tyder på en defekt i fastgørelsen af kinetochores og mikrotubuli (figur 3C, G). Ved forankring væk af Ctf19-FRB enten efter kinetochore-samling, men før meiose I (t = 45 min) eller før meiose II (t = 3 timer), viser ca. 16% af cellerne yderligere DNA-masser. Disse resultater understøtter hypotesen om, at Ctf19 er vigtig for kinetochore genmontering ved profase I-frigivelse, men er mindre vigtig i kromosomadskillelse, når kinetochore er blevet samlet igen.
De resultater, der opnås her, viser, at time-lapse-mikroskopi kombineret med cellecyklussynkronisering og betinget udtømning af et målprotein giver mulighed for undersøgelse af et protein i et specifikt meiotisk stadium. Selvom Ctf19 ikke er afgørende for mitose, er den meiotiske kinetochore omfattende omorganiseret, og Ctf19 har en afgørende rolle i kinetochore genmontering efter profase I exit 9,11,12. Resultaterne i figur 3 viser, at når Ctf19 er udtømt før kinetochore genmontering, viser en stor brøkdel af cellerne yderligere DNA-masser efter meiose II. Når Ctf19 er udtømt fra kernen efter kinetochre-samling, men før enten meiose I eller meiose II, er der færre celler, der viser yderligere DNA-masser. Disse resultater tyder på, at den vigtigste rolle for Ctf19 er i slutningen af profase I. Denne forskel i kromosomadskillelsestroskab med udtømning af Ctf19 på forskellige stadier fremhæver vigtigheden af at bruge fasespecifikke betingede alleler til at studere funktionen af proteiner specifikt i meiose I eller meiose II. En meiotisk nullmutant ville have udvist en alvorlig defekt og ville ikke have givet oplysninger om Ctf19's rolle på hvert trin.
Derudover, selvom CTF19 ikke er et essentielt gen, er der en kromosomtransmissionsfidelitet (ctf) fænotype under vegetativ vækst af CTF19-mutanter 19. Anvendelse af en nullallel eller mutant CTF19-allel kan skabe en population af aneuploide celler, der muligvis ikke gennemgår meiose korrekt. Brug af anker væk teknik og NDT80-in synkroniseringssystem omgå dette problem ved præcist at nedbryde Ctf19 fra kernen lige før meiose I eller meiose II, hvilket reducerer bekymringen for, at de analyserede celler var aneuploide.
Figur 1: Oversigt over eksperimentet. Tegneserie af gærcelle, der viser et enkelt par homologe kromosomer. NDT80-in celler går ind i meiose og arresteres ved profase I. Efter tilsætning af β-østradiol kommer celler synkront ind i de meiotiske divisioner. Tilsætning af rapamycin bestemmer, hvornår målproteinet (markeret med en stjerne) er forankret væk. I dette eksperiment blev målproteinet Ctf19 forankret væk på tre forskellige tidspunkter ved at tilføje rapamycin (RAP) på samme tid som profase I (RAP-tilsætning ved t = 0 min), efter profase I-frigivelse (RAP-tilsætning ved t = 45 min) og efter meiose I-kromosomadskillelse (RAP-addition ved t = 3 timer). De tykke sorte pile angiver cellecyklusstadiet for rapamycintilsætning og målretter derfor proteinudtømning. Forkortelser: RAP = rapamycin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kammeropsætning til time-lapse-billeddannelseseksperimenter. (A) Genanvendeligt kammer (højre) skåret fra en pipettespidsholderindsats (venstre). Pipettespidsholderindsatsen skæres med et rødglødende blad for at fjerne en 4 kvadrat x 4 kvadratdel af indsatsen. De stiplede linjer angiver en prøvesektion af tipholderen, der kan skæres for at lave et kammer. De resterende plastskillevægge inden for den 4 kvadratiske x 4 firkantede udskæring trimmes væk, og der forbliver et hult kammer (højre). (B) For at skabe det endelige kammer tilsættes silikoneforseglingsmiddel til kanterne på den ene side af kammeret og placeres derefter oven på en dæksel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tidspunkt, hvor Ctf19 er forankret væk, påvirker kromatinsegregering. (A-F) Repræsentative tidsforløbsbilleder af celler, der udtrykker Htb2-mCherry under meiose. Billeder blev taget hvert 10. minut, umiddelbart efter tilsætning af β-østradiol. Skalabjælker = 5 μm. Tal i øverste højre hjørne af hver ramme mærker den tid, der er gået mellem hver ramme, og tid 0 angiver den ramme, hvor kromatin adskilles i meiose I. Kun celler, der afsluttede de meiotiske divisioner, blev talt. (A) Vildtypecelle (intet protein mærket med FRB), hvor β-østradiol blev tilsat 12 timer efter overførsel af KAc. Celle indeholder fire DNA-masser efter afslutning af meiose II. (B) Ctf19-FRB-celle, hvori rapamycin blev tilsat ved t = 0 (samtidig med β-østradioltilsætning). Denne celle viser tre DNA-masser efter meiose II. (C) Ctf19-FRB-celle, hvori rapamycin blev tilsat ved t = 0 (samtidig med β-østradioltilsætning). Denne celle viser fem DNA-masser efter meiose II. (D) Ctf19-FRB-celle, hvori rapamycin blev tilsat ved t = 0 (samtidig med β-østradioltilsætning). Denne celle dør efter at have afsluttet meiose II. (E) Ctf19-FRB-celle, hvori rapamycin blev tilsat 45 minutter efter β-østradioltilsætning. Denne celle viser fem DNA-masser efter meiose II. (F) Ctf19-FRB-celle, hvori rapamycin blev tilsat 45 minutter efter β-østradioltilsætning. Efter meiose II er seks DNA-masser til stede. (G) Kvantificering af antallet af DNA-masser i mindst 100 celler for hver tilstand (to film analyseret for hver tilstand). t = under hver søjle angiver det tidspunkt, hvor rapamycin blev tilsat i forhold til β-østradioltilsætning. Forkortelser: MII = meiose II. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol kombinerer NDT80-in-systemet til at synkronisere celler, anker-væk-teknikken til at nedbryde proteiner fra kernen og fluorescens time-lapse-mikroskopi til at afbilde spirende gærceller under meiose. NDT80-in-systemet er en metode til meiotisk cellecyklussynkronisering, der bruger en profase I-arrestation og frigivelseaf 4,8. Selvom individuelle celler vil variere lidt i mængden af tid brugt i hvert af de efterfølgende meiotiske stadier, vil de fleste celler opretholde en høj grad af synkronisering gennem de meiotiske divisioner.
Anker væk teknikken er et tilpasningsdygtigt værktøj til mitotiske og meiotiske undersøgelser. Ved at ændre ankeret væk målprotein og tidspunktet for rapamycintilsætning kan denne metode tilpasses til at studere forskellige proteiner under ethvert stadium af spirende gærmeiose. Almindelige metoder til fremstilling af betingede mutanter til undersøgelse af spirende gærmitose er ikke altid egnede til meiotiske undersøgelser. For eksempel kræver brug af en repressibel promotor ofte en ændring i kulstofkilden for at ændre ekspressionen af målproteinet, hvilket kan forstyrre meiose20. Temperaturfølsomme mutanter er afhængige af en temperaturændring for at reducere eller afskaffe målproteinets aktivitet. Mange af disse betingede mutanter kan ikke bruges i meiotiske undersøgelser, fordi skiftende næringsstofforhold eller temperatur kan forstyrre meiose21,22,23. Desuden kan deletioner eller mutanter begrænse undersøgelser af meiose, fordi det at udtrykke et mutantprotein tidligt i meiose kan blokere eller påvirke senere stadier negativt. Anker væk-teknikken kan omgå disse udfordringer, fordi den ikke er afhængig af ændringer i ernæring eller temperatur8. Desuden kan udtømningen af proteinet reguleres tidsmæssigt, således at tidspunktet for rapamycintilsætning bestemmer, hvornår proteinet vil blive forankret væk.
En begrænsning af anker væk teknikken er, at den måske ikke er egnet til ikke-nukleare proteiner, fordi den er afhængig af Rpl13A ribosomal underenhed som et anker til at transportere målproteinet ud af kernen. Der er dog andre anvendelser af anker væk-teknikken ved at ændre protein-proteininteraktionerne, der også kan være nyttige under meiose, såsom forankring af proteiner til komplekser eller tøjring af dem til membraner8. Tidligere undersøgelser viser, at nuklear udtømning af målproteiner forekommer inden for 30 minutter efter rapamycintilsætning 2,8. Det er dog muligt, at nogle proteiner har brug for en længere eller kortere periode for at blive transporteret ud af kernen. For at sikre, at målproteinet transporteres ud af kernen, kan målproteinet mærkes med FRB smeltet til GFP (FRB-GFP) for at overvåge længden af tiden mellem rapamycintilsætning og nuklear udtømning. En anden begrænsning af anker væk systemet er, at nogle proteiner er følsomme over for FRB og FRB-GFP tags ved C-terminalen. Som sådan er N-terminal mærkning af målproteinet med FRB en alternativ strategi til forankring af et målprotein.
For at overvåge kromatinadskillelse udtrykte spirende gærceller Htb2-mCherry. I denne stamme mærkes Htb2-proteinet på dets endogene locus, hvilket sikrer, at Htb2 udtrykkes normalt. Andre fluorescerende mærkede proteiner kan også bruges til at overvåge forskellige aspekter af meiose. Når man konstruerer en stamme til time-lapse-billeddannelse, er det vigtigt at overveje, at nogle proteiner er følsomme over for C-terminale fluorescerende tags. Vækst- og sporulationsanalyser af stammen, der indeholder det fluorescerende mærkede protein, sikrer, at mærket ikke ændrer proteinets funktion. En udfordring ved time-lapse fluorescensmikroskopi er at udsætte celler for tilstrækkelig fluorescens, så de fluorescerende proteiner detekteres, samtidig med at celledød undgås eller bremselse af meiose fra overskydende eksponering. Et vigtigt fejlfindingstrin er at finde de relevante mikroskop- og kameraindstillinger for at opnå denne balance. Den krævede eksponeringstid vil variere lidt mellem proteiner, så flere iterationer af et eksperiment skal udføres for at bestemme den passende eksponeringstid. Når man bruger kammermetoden beskrevet her til time-lapse-billeddannelseseksperimenter, er et særligt følsomt trin at opnå et monolag af celler, der skal afbildes. Uden et monolag akkumuleres celler oven på hinanden, hvilket udgør en udfordring for korrekt billeddannelse og dataanalyse. Brug af en agarpude, som hjælper celler med at klæbe til ConA og spreder celler rundt i kammeret, er en billig og effektiv måde at opnå monolag på. Det kan være udfordrende at flytte agarpuden for at sprede celler rundt i kammeret, så der opnås et monolag. At sikre, at agarpuden foretager meget små bevægelser under bevægelsesprocessen, kan hjælpe med at skabe et monolag. At lave et genanvendeligt kammer giver mulighed for billig generering af time-lapse-billeddata. Ved korrekt rengøring og desinficering kan de plastkamre, der er beskrevet her, genbruges på ubestemt tid. Det er bedste praksis, at kamre fjernes fra dækslen umiddelbart efter time-lapse-billeddannelse og opbevares i 95% ethanol indtil næste brug.
Time-lapse-billeddannelse giver information om cellecyklussen, der kan gå glip af fra billeddannelse af faste celler 1,2. For eksempel, når man overvåger varigheden af de meiotiske stadier, kan variationer mellem enkeltceller undersøges mere nøjagtigt, når man forestiller levende celler sammenlignet med populationer af faste celler. Fordi gærproteiner let kan mærkes med fluorescerende proteiner, kan kobling af fluorescens time-lapse-billeddannelse med NDT80-in-systemet og anker væk-teknikken tilpasses til yderligere undersøgelser, såsom overvågning af individuel kromosomadskillelse og timing af specifikke meiotiske stadier. Når man overvåger cellecyklusprogression efter profase I-frigivelse i NDT80-in-celler, er det afgørende at have et protein mærket med et fluorescerende molekyle, der markerer stadierne af meiose. Individuelle kromosomer kan overvåges gennem meiose ved at integrere gentagelser af lac operon (LacO) nær centromeren af et kromosom i celler, der udtrykker LacI-GFP. LacI-GFP binder tæt til LacO og visualiseres som et lyst fokus, der kan følges gennem de meiotiske divisioner ved time-lapse mikroskopi24,25. Forskellige proteiner med fluorescerende mærker er blevet brugt til at overvåge varigheden af meiotiske stadier. Disse omfatter Tub1, α-tubulin-underenheden, der inkorporerer i mikrotubuli; Zip1, en komponent i det synaptonemale kompleks; og Spc42, en spindelstangskropskomponent 1,2,26,27.
Afslutningsvis inkorporerer denne metode meiotisk cellecyklussynkronisering, betinget udtømning af et målprotein og time-lapse fluorescensmikroskopi for at studere meiotisk kromosomadskillelse. Ved at afbilde spirende gærceller under meiose og anvende betingede mutanter, der kun påvirker de tilsigtede stadier af meiose, kan denne metode give nøjagtige data om den meiotiske cellecyklus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Light Microscopy Imaging Center ved Indiana University. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health (GM105755).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
