Summary
タイムラプス顕微鏡は、出芽酵母の減数分裂を研究するための貴重なツールです。このプロトコルでは、細胞周期同期、タイムラプス顕微鏡、および標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせて、減数分裂染色体分配中の特定のタンパク質の機能を研究する方法を実証する方法について説明しています。
Abstract
タイムラプス蛍光顕微鏡は、固定細胞のイメージングでは見られない時間的および空間的データを提供することにより、減数分裂細胞周期イベントの理解に革命をもたらしました。出芽酵母は、多くの減数分裂遺伝子が高度に保存されているため、減数分裂染色体分配を研究するための重要なモデル生物であることが証明されています。出芽酵母の減数分裂のタイムラプス顕微鏡検査により、さまざまな減数分裂変異体をモニタリングして、突然変異が減数分裂プロセスをどのように破壊するかを示すことができます。しかし、多くのタンパク質は減数分裂の複数の点で機能します。したがって、機能喪失または減数分裂ヌル変異体の使用は、初期のプロセスを混乱させ、後のプロセスをブロックまたは妨害し、個々の役割に関連する表現型を決定することを困難にする可能性があります。この課題を回避するために、このプロトコルでは、タイムラプス顕微鏡を使用して減数分裂イベントを監視しながら、減数分裂の特定の段階でタンパク質を核から条件付きで枯渇させる方法について説明します。具体的には、このプロトコルでは、細胞が前期Iでどのように同期されるか、アンカーアウェイ技術を使用して特定の減数分裂段階で核からタンパク質を枯渇させる方法、およびタイムラプスイメージングを使用して減数分裂染色体分配を監視する方法について説明します。この技術の有用性の例として、減数分裂中の異なる時点で動原体タンパク質Ctf19が核から枯渇し、減数分裂IIの終わりにクロマチン質量の数が分析されました。全体として、このプロトコルは、減数分裂を監視しながら、核から異なる核タンパク質を枯渇させるように適合させることができる。
Introduction
タイムラプス蛍光顕微鏡は、出芽酵母における減数分裂染色体分配のダイナミクスを研究するための貴重なツールです1,2。出芽酵母細胞は、重要な栄養素の飢餓を通じて減数分裂を起こすように誘導することができます3。減数分裂の間、細胞は1ラウンドの染色体分配を受け、続いて2つの分裂を経て、胞子にパッケージ化された4つの減数分裂産物を作成します(図1)。個々の細胞は減数分裂の各段階で視覚化でき、固定細胞イメージングでは簡単に見逃すことができる空間的および時間的データを生成します。このプロトコルは、タイムラプス蛍光顕微鏡法と、以前に確立された2つの方法、誘導性NDT80システム(NDT80-in)およびアンカーアウェイ技術を組み合わせて、異なる減数分裂段階における特定のタンパク質の機能を研究する方法を示しています。
NDT80-inシステムは、中減数分裂転写因子NDT80 4,5の誘導発現に依存する減数分裂細胞周期同期のための強力なツールです。NDT80発現は、前期I出口6,7に必要である。NDT80-inシステムでは、NDT80は、エストロゲン受容体(Gal4-ER)に融合したGal4転写因子を発現する細胞において、GAL1-10プロモーターの制御下にあります4,5。Gal4-ERはβ-エストラジオールに結合した場合にのみ核に入るため、NDT80-in細胞はβ-エストラジオールの非存在下で前期Iで停止し、前期Iの細胞の同期を可能にします(図1)。β-エストラジオールの付加は、Gal4-ER転写因子の核への転座を促進し、そこでGAL1-10に結合してNDT80の発現を促進し、減数分裂への同期的な侵入をもたらします。タイムラプス顕微鏡は同期なしで実行できますが、同期を使用する利点は、細胞が減数分裂の特定の段階にある間に阻害剤または薬物を追加できることです。
アンカーアウェイ技術は、ラパマイシン8を添加することでタンパク質を核から枯渇させることができる誘導可能なシステムである。この技術は、酵母細胞が核膜が破壊されない閉鎖有糸分裂および減数分裂を経験するため、出芽酵母の細胞分裂中の核タンパク質の研究に理想的です。さらに、この技術は、減数分裂全体を通して複数の機能を有するタンパク質にとって非常に有用である。欠失、変異対立遺伝子、減数分裂ヌル対立遺伝子とは異なり、特定の段階で核から標的タンパク質を除去しても、初期段階での標的タンパク質活性が損なわれないため、結果をより正確に解釈できます。アンカーアウェイシステムは、リボソームの成熟時に発生する核と細胞質の間のリボソームサブユニットの往復を利用します8。核から標的タンパク質を枯渇させるために、リボソームサブユニットRpl13AがFKBP12でタグ付けされている株において、標的タンパク質はFKBP12-ラパマイシン結合ドメイン(FRB)でタグ付けされる。ラパマイシンがなければ、FRBとFKBP12は相互作用せず、FRBタグ付きタンパク質は核内に残る。ラパマイシンを加えると、ラパマイシンはFKBP12およびFRBと安定な複合体を形成し、複合体はRpl13Aとの相互作用により核からシャトルされます(図1)。ラパマイシン添加時の細胞死を防ぐために、細胞はTOR1遺伝子のtor1-1変異を保持している。さらに、これらの細胞には、S. cerevisiae FKBP12タンパク質のヌル対立遺伝子であるfpr1Δが含まれており、内因性Fpr1がFRBとラパマイシンの結合に関してRpl13A-FKBP12を凌駕するのを防ぎます。アンカーアウェイバックグラウンド変異であるtor1-1およびfpr1Δは、減数分裂のタイミングや染色体分配に影響を与えません2。
この技術の有用性を実証するために、動原体タンパク質Ctf19は減数分裂を通して異なる時点で枯渇した。Ctf19は、有糸分裂には欠かせませんが、減数分裂における適切な染色体分配に必要な動原体の成分です9、10、11、12、13。減数分裂では、動原体は前期Iで脱落し、Ctf19は動原体再組み立てに重要です9,14。このプロトコルでは、NDT80-inシステムと細胞を同期させ、アンカーアウェイ技術を使用して、前期Iからの放出の前後で、および減数分裂後のI染色体分配後に標的タンパク質Ctf19を核から枯渇させました(図1)。このプロトコルは、減数分裂および有糸分裂の任意の段階で目的の他のタンパク質を枯渇させるように適合させることができる。
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Protocol
1. 必要資料の準備
- 酵母細胞の増殖と胞子形成のための試薬を準備します。
注:出芽酵母株が ade2 -および trp1-の場合は、ステップ1.1.1〜1.1.3のすべての培地に、1%ストックから0.01%のアデニンと0.01%のトリプトファンの最終濃度を補給します。オートクレーブで培地を滅菌する場合は、試薬をオートクレーブ滅菌し、室温まで放冷した後にのみ、これらのアミノ酸を添加してください。- 栄養成長のために、アミノ酸を含まない6.7 gの酵母窒素塩基、2 gの完全アミノ酸ミックス、および20 gのデキストロースを500 mLの水に溶解することにより、2x合成完全+デキストロース培地(2XSC)を調製します。121°Cで20分間オートクレーブするか、0.2 μmフィルターでろ過して、混合物を滅菌します。
- 胞子形成の最初のステップでは、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基6.7 g、完全アミノ酸ミックス2 g、酢酸カリウム20 gを500 mLの水に溶解することにより、2x合成完全+酢酸培地(2XSCA)を調製します。121°Cで20分間オートクレーブするか、0.2 μmフィルターでろ過して、混合物を滅菌します。
- 胞子形成の最終ステップとして、5 gのKAcを500 mLの水に溶解して1%酢酸カリウム(1%KAc)を調製します。121°Cで20分間オートクレーブするか、0.2 μmフィルターでろ過して、混合物を滅菌します。
- 顕微鏡検査、同期、およびアンカー用の薬物と試薬を準備します。
- タイムラプスイメージング中に細胞をカバーガラスに接着させるには、1x PBSで1 mg/mLのコンカナバリンA(ConA)を作ります。フィルターは0.2 μmフィルターを使用して滅菌し、-20°Cで少量(~10 μL)のアリコートを保存します。
- NDT80-inシステムを使用するには、エタノールに溶解した1 mM β-エストラジオール2 mLを作ります。0.2 μmのフィルターを使用してフィルター滅菌し、アリコート(~500 μL)を-20°Cで保存します。
- アンカーアウェイシステムの場合、1 mg / mLのラパマイシンをDMSOに溶解させます。フィルターは0.2 μmフィルターを使用して滅菌し、-20°Cで少量(~10 μL)のアリコートを保存します。
注:薬物の複数の凍結融解サイクルを回避するために、ラパマイシンの小さなアリコートを準備します。
- NDT80イン系(P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80;GAL4-ER / GAL4-ER)およびアンカー離れた遺伝的背景にFRBでタグ付けされた標的タンパク質(tor1-1 / tor1-1; fpr1Δ / fpr1Δ;Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8.この研究にはCtf19-FRBが使用されました。さらに、ヒストンタンパク質Htb2の1つのコピーをmCherryでタグ付けして、減数分裂の進行とクロマチン分離のモニタリングを可能にしました。
- タイムラプスイメージング用のチャンバーを準備する
- イメージングの6時間から24時間前にチャンバーの準備を開始します(図2)。加熱メスまたはその他の鋭利な刃を使用して、ピペットチップボックスインサートから18 mm x 18 mmチャンバーを切り取ります。
- プラスチック製のピペットチップを使用して、カバーガラスに付着するチャンバーの下端の周りにシリコンシーラントの薄層を広げます。チャンバーの端が完全に覆われるように、十分なシーラントを追加します ( 図2を参照)。
- チャンバーをシーラント側を下にしてカバースリップにそっと置き、チャンバーを24 mm x 50 mmのカバーガラスに接着します。チャンバーが漏れないように、シーラントに隙間がないことを確認してください。
- 8〜10μLのConAをカバーガラスに広げます。ConAをカバーガラスの中央に分注し、ピペットチップを使用してConAを薄い層に広げ、チャンバーに囲まれたカバーガラスの大部分を覆うようにします。
注:プラスチックチャンバーは無期限に再利用できます。タイムラプスイメージングが完了したら、かみそりを使用してカバーガラスからチャンバーを取り外し、チャンバーからシリコーンシーラントをきれいにし、チャンバーを将来の使用のために95%エタノールに沈めたままにします。
2.酵母細胞の胞子形成
- 減数分裂プログラムを誘導するために酵母細胞の飢餓のために以下のステップを実行する。
注:これらの手順は、酵母のW303株の胞子形成のためのものです。他の株は、異なるプロトコル15を必要とし得る。胞子形成効率はラボ株間で大きく異なり、W303は~60%の胞子形成効率を示します16,17,18。- プレートから適切な二倍体酵母株の単一コロニーを取り出し、2 mLの2XSCを接種し、ローラードラム上で30°Cで12〜24時間増殖させて飽和させます。
- ステップ2.1.1の培養液80 μLを2 mLの2XSCAに追加して、飽和培養液を2XSCAに希釈します。ローラードラム上で30°Cで12〜16時間成長させます。細胞が病気になったり、自己蛍光したりする可能性があるため、2XSCAに16時間以上放置しないでください。
- 培養液を800 x g で室温(25°C)で1分間スピンダウンし、液体を廃棄し、ペレットを2 mLの滅菌蒸留水に再懸濁して、2回の洗浄を行います。
- 2回目の洗浄後、液体を取り除き、ペレットを1%KAcの2mLに再懸濁し、ローラードラム上で25°Cで8〜12時間増殖させます。減数分裂に入った細胞は、前期Iのパキテンで停止します。
- 前期I.放出システム
- β-エストラジオールを胞子形成培養液に直接最終濃度1 μMまで添加し、培養チューブを素早くボルテックスします。β-エストラジオールは前期Iから細胞を放出します。
3. アンカーアウェイ法による核からの標的タンパク質の枯渇
- ラパマイシンを細胞に加え、特定の段階で核からFRBタグ付きタンパク質を枯渇させます。
- 前期I出口で核からタンパク質を枯渇させるには、β-エストラジオール添加と同時に、ラパマイシンを最終濃度1μg/mLまで胞子形成培養チューブに加えます。
- 減数分裂の特定の段階で核からタンパク質を枯渇させるには、β-エストラジオール添加後60分から始まる細胞周期段階をモニターします。20分ごとに、培養液5 μLを24 mm x 40 mmのカバーガラスにピペットで移し、細胞を18 mm x 18 mmのカバーガラスで覆います。ローラードラム上で培養物を回転させ、時点間で25°Cに保ちます。
- A594/mCherryフィルターと蛍光顕微鏡の60倍対物レンズを使用して細胞を画像化します。透過率を 2% に設定し、露光時間を 250 ms に設定します。1つ、2つ、または4つのDNA塊の存在は、細胞が進行した減数分裂段階を示します。目的の減数分裂段階でラパマイシンを最終濃度1μg/ mLまで添加します。
- イメージングの準備が整うまで、ローラードラム上で細胞を25°C回転させ続けます。標的タンパク質の核枯渇は、ラパマイシン添加2,8の30〜45分後に起こる。
4. タイムラプス蛍光顕微鏡
- イメージング用の細胞の単層を作成するために使用される寒天パッドを作成します(ステップ4.2を参照)。
- キャップと1.5 mLマイクロフュージチューブの底部1/3を切り取り、廃棄してシリンダーを作成します。シリンダーは寒天パッドの型として機能します。寒天が最初のもので適切に重合しない場合に備えて、余分なシリンダーを持つために2つのシリンダーを作ります。
- カットしたマイクロフュージチューブシリンダーをきれいなガラススライドの上に置き、チューブの上部を逆さまにしてスライドに置きます。
- 50 mLビーカーに6 mLの5%寒天溶液(溶媒として1%KAcを使用)を作り、寒天が完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。
注意: 寒天は電子レンジで簡単に沸騰します。寒天を見て、寒天が沸騰し始めたら電子レンジを開始および停止します ビーカーを渦巻かせます。寒天を完全に溶解するために電子レンジを数回開始および停止します。寒天溶液は、寒天が完全に溶解することを確実にするために必要な量を超えて作られる。 - ピペットの先端を切り取って開口部を大きくし、~500μLの溶融寒天を各マイクロフュージチューブシリンダーにピペットで入れます。寒天が固まるまで(~10-12分)室温で放置します。
- イメージングのための酵母細胞の準備
- ステップ3.2の胞子形成培養液200 μLを800 x g で1 mLの微量遠心チューブで2分間スピンダウンします。180 μLの上清を除去して廃棄します。チューブを旋回させてフリックすることにより、残りの上清にペレットを再懸濁します。
- ステップ1.4で作ったチャンバーの中央にあるカバーガラスの上に6μLの濃縮細胞をピペットします。
- 手順4.1で作成した寒天パッドでシリンダーを持ち、スライドガラスから慎重にスライドさせます。寒天の底部が完全に平らであることを確認し、ピペットチップの底部を使用して、寒天パッドがチューブの境界の少し上に押し出されるように、マイクロフュージ型にわずかな圧力を加えます。
- 寒天パッドがチャンバーに向かって下を向くように金型を反転させます。
- 鉗子を使用して、寒天パッド(まだ微量遠心管型内)を細胞の上にそっと置きます。ピペットチップを使用して、寒天パッドをチャンバーの周りに10〜20回静かにスライドさせ、カバーガラス上に単層の細胞を作成します。
- 寒天パッドをチャンバー内に12〜15分間放置します。このステップにより、セルがカバーガラスのConAに接着できるようになります。
- ステップ3.2の胞子形成培養液2 mLを2本の微量遠心チューブに移し、15,700 x g で2分間スピンします。上清をきれいな微量遠心チューブに移し、15,700 x g で2分間再び回転させます。上清を次工程で使用する洗浄用微量遠心管に移す。
注:効率的な胞子形成と目的のタンパク質の継続的な枯渇を確実にするために、β-エストラジオールおよびラパマイシンとともに事前に調整されたKAc上清を使用することが重要です。 - 寒天パッドをチャンバー内に12〜15分間置いた後、イメージングする前に寒天パッドを浮かせて取り外します。これを行うには、ステップ4.2.7の上清2 mLをチャンバーに滴下します。液体がチャンバーの上部に到達すると、寒天パッドはおそらく浮遊します。
注意: 寒天パッドが自動的に浮かばない場合は、1〜2分待ちます。それでも寒天パッドが浮かない場合は、鉗子でそっと取り除きます。理想的には、寒天パッドは、浮遊する前にそれを取り除くと細胞の除去につながる可能性があるため、それ自体で浮遊するであろう。 - 寒天パッドが浮いたら、鉗子でそっと取り除き、廃棄します。イメージング中の蒸発を防ぐために、チャンバーの上部に24 mm x 50 mmのカバーガラスを置きます。
- 顕微鏡で動画を設定する
注意: 以下の手順は、24 mm x 50 mmのカバーガラスを収容するスライドホルダーを備えた倒立顕微鏡用です(顕微鏡、カメラ、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください)。画像取得には、60倍の油浸対物レンズが使用されます。このプロトコルは、他の顕微鏡または他のスライドホルダーを使用する場合に変更する必要があるかもしれません。ステップ4.3.2からステップ4.3.16を実行するための正確な手順は、使用する顕微鏡およびイメージングソフトウェアによって異なります。別の顕微鏡の手順については、セクション4.4を参照してください。- カバーガラスをスライドホルダーの内側に取り付けます。成形粘土をカバーガラスの側面に接着して、スライドホルダーにしっかりと固定します。
- 画像取得ソフトウェアを開きます。コースと微調整ノブを使用して、DICまたは明視野を使用してセルに焦点を合わせます。
- 画像取得ソフトウェアのメインメニューで、[ ファイル]>[取得(3Dの解決)]をクリックします。3つのウィンドウがポップアップします。
- [3Dを解決]という名前のウィンドウで、 三角フラスコ アイコンをクリックします。これにより、[ 実験の設計/実行]というタイトルのウィンドウが開き、タイムラプスムービーを設定するための実験を設定するためのコントロールが含まれています。
- [ デザイン ]タブで、[ セクショニング]というラベルの付いたタブに移動します。 [Z 断面]の横にあるボックスを選択します。zスタックを次のように設定します:光学セクション間隔= 1 μm、光学セクションの数= 5、サンプル厚さ= 5.0 μm。
- [チャンネル]タブで、[+]アイコンをクリックして、1つのチャンネルオプションを表示します。適切なチャンネルを選択します。この実験では、mCherryの画像化に使用されるA594を選択します。[参照画像] の横にあるボックスを選択し、ドロップダウン メニューから Z 位置をサンプルの中央に設定します。
- %TとExp.の横にあるドロップダウンメニューから値を選択して、透過率と露光時間をそれぞれ設定します。この実験では、A594 チャネルで 2% の透過率と 250 ミリ秒の露光時間を使用し、明視野に 10% の透過率と 500 ミリ秒の露光時間を使用します。
注:露光時間と透過率は顕微鏡によって異なります。過剰露光を避けるために、目的のタンパク質を適切に可視化できるように、可能な限り低い透過率と最短の露光時間を使用してください。 - [タイムラプス]タブで、[タイムラプス]の横にあるボックスを選択します。表示される表で、タイムラプス行の最小列に 10 を入力し、合計時間行の時間列に 10 を入力します。これにより、10分ごとに10時間画像を撮影するタイムコースが実行されます。
- 「 究極のフォーカスでフォーカスを維持 」の横にあるボックスを選択して、ムービー中のステージドリフトを防ぎます。[ ポイント ]タブで、[ ポイント リストを訪問]の横にあるボックスを選択します。
- メインメニューで、[ ポイントリストを表示]>をクリックします。ポイントリストというウィンドウがポップアップ表示されます。細胞の単層を示すチャンバーの領域にステージを移動します。ポイントリストウィンドウで ポイントマーク をクリックします。
- ステージを移動して、セルの露出オーバーを避けるために、オーバーラップせずに25〜30ポイントを選択します。各フィールドは、各タイム コース中に画像化されます。
- ポイント リスト ウィンドウで、[すべてキャリブレーション]を選択して、各ポイントの最終的なフォーカスを設定します。[設計/実験の実行]ウィンドウの[設計]タブで、[ポイント リストを表示]の横にあるボックスにポイント値の範囲(ポイント リスト ウィンドウから取得)を入力します。[ファイル名を指定して実行] タブで、コンピューター上の適切な保存先にファイルを保存します。[実験の計画/実行] ウィンドウで、[再生] ボタン (緑色の三角形のアイコン) を選択してムービーを開始します。
- オプションの方法:顕微鏡で動画を設定する
注:これらの説明書は、24 mm x 50 mmのカバーガラスを収容できるスライドホルダーを備えた倒立顕微鏡用です。使用する顕微鏡、カメラ、およびイメージングソフトウェアの仕様については、 材料表 を参照してください。画像取得には、60倍の油浸対物レンズが使用されます。- カバーガラスをスライドホルダーの内側に取り付けます。画像取得ソフトウェアを開きます。コースノブと微調整ノブを使用して、DICまたは明視野を使用してセルに焦点を合わせます。ソフトウェアの開いているウィンドウを右クリックします。ドロップダウンメニューが表示されます。
- [ 取得コントロール] > [取得] をクリックします。[ アプリケーション] をクリックし> [実験を定義/実行] をクリックします。これにより、[ ND取得]というラベルの付いたウィンドウが開きます。
- 開いたウィンドウで、[ XY]の横にあるチェックボックスをオンにします。ステージを目的の位置に移動し、[ ポイント名 ] の下のボックスをクリックして、その位置をポイントとして選択します。セルの露出オーバーを避けるために、25〜30ポイントがオーバーラップせずに選択されるまでこれを繰り返します。各フィールドは、各タイム コース中に画像化されます。
- 蛍光チャンネルごとに透過率を設定します。菌株はHtb2-mCherryを生成するため、ここではmCherryフィルターを使用します。手順 4.3.3 で開いた [取得] ウィンドウで、[555 nm] ボタンに移動します。555 nmボタンの下のスライドスケールを5%になるまで調整して、透過率を5%に設定します。
- 蛍光チャンネルごとに露光時間を設定します。 [取得 ]ウィンドウで、[露出]ドロップダウンメニューから 200ミリ秒 を選択します。
注:露光時間と透過率は顕微鏡によって異なります。過剰露光を避けるために、目的のタンパク質を適切に可視化できるように、可能な限り低い透過率と最短の露光時間を使用してください。 - ND集録ウィンドウのZの横にあるボックスをクリックします。1.2 μM離れた酵母細胞のzスタックを5つセットします。
- λの横にあるボックスをクリックします。実験に使用する適切なチャネルを選択します。DICの場合は、Z位置の下のドロップダウンメニューから[ホーム]が選択されていることを確認します。mCherryの場合は、Z位置の下のドロップダウンメニューから[すべて]が選択されていることを確認します。これにより、1 つのセクション (z スタックの中央) のみが DIC 用に取得されます。
- [ND集録]ウィンドウで[時間]の横にあるボックスを選択します。[フェーズ] の下のボックスを選択します。[間隔] の下のドロップダウン メニューで、[10 分] を選択します。[期間] で [10 時間 (s)] を選択します。これにより、画像が10分ごとに10時間撮影されるようにタイムコースが実行されます。
5. クロマチン分配の解析
- フィジーソフトウェアを開きます。一度に 1 つの視野を開きます: フィールドごとに、DIC チャンネルと mCherry チャンネルを開きます。
- 単一の画像を得るためにmCherryチャンネルの最大強度投影を取ります: Zプロジェクト>画像>スタックをクリックし、 ドロップダウンメニューから 最大強度 を選択します。
- DICチャンネルとmCherryチャンネルを1つの画像にマージする: 画像>カラー>チャンネルをマージをクリックします。
- 減数分裂を通して単一の細胞をたどります。減数分裂IIの完了後、DNA質量の数を記録します。
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Representative Results
クロマチン分離をモニターするために、ヒストンタンパク質Htb2をmCherryでタグ付けした。前期Iでは、クロマチンは単一のHtb2塊として現れる。相同染色体が最初の減数分裂で分離した後、クロマチンは2つの異なる塊として現れます(図3A)。姉妹染色分体が分離した後、クロマチンは4つの塊として現れる。一部の染色体が紡錘体微小管に付着しない場合、減数分裂Iまたは減数分裂IIの後に追加の腫瘤が見られます。
上記の方法は、出芽酵母減数分裂における適切な染色体分配を確実にする上での動原体成分Ctf19の役割を研究するために使用された。FRBでタグ付けされたCtf19を発現するアンカーアウェイ酵母株を、NDT80-inシステム(tor1-1;fpr1Δ;RPL13A-FKBP12;CTF19-FRB;GAL1-10はNDT80をプロモートしました。GAL4-ER)。対照として、アンカーアウェイ株をバックグラウンドでFRBタグ付きタンパク質を含まないNDT80イン株を用いた(tor1-1;fpr1Δ;RPL13A-FKBP12;GAL1-10はNDT80をプロモートしました。GAL4-ER)。細胞は、β-エストラジオールの添加によって前期I停止から放出された。ラパマイシンは、放出時(動原体再構成前)、放出後45分(動原体再集合後、減数分裂Iの前)、または放出後3時間(減数分裂II直前)のいずれかで核からCtf19-FRBを枯渇させるために添加された(図3A-F)。ラパマイシンの添加に続いて、タイムラプス蛍光顕微鏡検査を行い、減数分裂の残りの持続時間について10分ごとに画像を取得しました。
イメージング後、オープンアクセスソフトウェアフィジーを使用して画像を開き、時間の進行を示す図の分析を実行しました(図3A-F)。減数分裂II後のDNA質量の数は、条件ごとに減数分裂を起こしていた少なくとも100個の細胞でカウントされました。アンカーアウェイバックグラウンドを有する野生型細胞では、減数分裂IIの末端に典型的には4つのDNA塊が存在し、減数分裂の4つの産物を表す(図3A)。細胞のごく一部では、減数分裂IIの後に3つの腫瘤しか見えません(図3B、G)。しかし、3つの腫瘤は減数分裂の4つの産物を持つ細胞の結果である可能性がありますが、これらの塊のうちの2つは減数分裂IIの後に一緒に現れます。
前期I出口の放出時(t = 0時間)にCtf19-FRBが固定されている場合、減数分裂の完了時に約47%の細胞が4つ以上のDNA塊を示し、動原体と微小管の付着に欠陥があることを示唆しています(図3C、G)。動原体集合後、減数分裂Iの前(t = 45分)または減数分裂II(t = 3時間)のいずれかでCtf19-FRBを固定すると、細胞の約16%が追加のDNA量を示します。これらの結果は、Ctf19は前期I放出時の動原体再集合に重要であるが、動原体が再集合されると染色体分配においてはそれほど重要ではないという仮説を支持している。
ここで得られた結果は、細胞周期の同期と標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせたタイムラプス顕微鏡法により、特定の減数分裂段階におけるタンパク質の研究を可能にすることを示しています。Ctf19は有糸分裂に必須ではありませんが、減数分裂動原体は広範囲に再編成されており、Ctf19は前期I出口9,11,12後の動原体再集合に重要な役割を果たします。図3の結果は、動原体再集合前にCtf19が枯渇すると、減数分裂II後に細胞の大部分が追加のDNA量を示すことを示しています。Ctf19が動原体再構成後、減数分裂Iまたは減数分裂IIのいずれかの前に核から枯渇すると、追加のDNA質量を示す細胞が少なくなります。これらの結果は、Ctf19の最も重要な役割は前期Iの終わりにあることを示唆しています。さまざまな段階でのCtf19の枯渇に伴う染色体分配の忠実度のこの違いは、減数分裂Iまたは減数分裂IIにおけるタンパク質の機能を研究するためにステージ特異的条件付き対立遺伝子を使用することの重要性を強調しています。減数分裂のヌル変異体は深刻な欠陥を示し、各段階でのCtf19の役割に関する情報を提供しなかったでしょう。
さらに、CTF19は必須遺伝子ではありませんが、 CTF19 変異体の栄養成長中に染色体伝達忠実度( CTF )表現型があります19。ヌル対立遺伝子または変異 CTF19 対立遺伝子を使用すると、減数分裂を適切に受けない可能性のある異数体細胞の集団が作成される可能性があります。アンカーアウェイ技術と NDT80-in同期システムの使用は、減数分裂Iまたは減数分裂IIの直前に核からCtf19を正確に枯渇させることによってこの問題を回避し、分析された細胞が異数体であるという懸念を軽減します。
図1:実験の概要。 相同染色体の一対を示す酵母細胞の漫画。 NDT80-in細胞は減数分裂に入り、前期Iで停止します。β-エストラジオールの添加後、細胞は同期して減数分裂に入る。ラパマイシンの添加は、標的タンパク質(星印でマークされた)がいつ固定されるかを決定する。この実験では、標的タンパク質Ctf19を、前期Iと同時にラパマイシン(RAP)を添加すること(t = 0分でのRAP添加)、前期I放出後(t = 45分でのRAP添加)、および減数分裂後I染色体分配後(t = 3時間でのRAP添加)によって、3つの異なる時点で固定された。太い黒い矢印は、ラパマイシン添加の細胞周期段階を示し、したがって、標的タンパク質枯渇を示す。略語:RAP =ラパマイシン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:タイムラプスイメージング実験用のチャンバーセットアップ。 (A)ピペットチップホルダーインサート(左)から切り取った再利用可能なチャンバー(右)。ピペットチップホルダーインサートを赤熱ブレードで切断し、インサートの4平方 x 4平方部分を除去します。破線は、チャンバーを作るために切断できるチップホルダーのサンプルセクションを示しています。4 正方形 x 4 正方形の切り欠き内の残りのプラスチック製の仕切りはトリミングされ、中空のチャンバーが残ります(右)。(B)最終的なチャンバーを作成するには、チャンバーの片側のエッジにシリコーンシーラントを追加し、カバースリップの上に配置します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Ctf19が固定された時間がクロマチン分配に影響する。 (A-F)減数分裂中にHtb2-mCherryを発現する細胞の代表的なタイムラプス画像。画像は、β-エストラジオールの添加直後に10分ごとに撮影した。スケールバー= 5 μm。各フレームの右上隅の数字は、各フレーム間の経過時間を示し、時間0は、減数分裂Iでクロマチンが分離するフレームを示します。減数分裂を完了した細胞のみをカウントした。(A)KAc転写の12時間後にβ-エストラジオールを添加した野生型細胞(FRBでタグ付けされたタンパク質なし)。細胞は減数分裂IIの完了後に4つのDNA塊を含む。(b)ラパマイシンをt=0で添加したCtf19-FRB細胞(β-エストラジオール添加と同時に)。この細胞は減数分裂IIの後に3つのDNA塊を示す。(c)ラパマイシンをt=0で添加したCtf19-FRB細胞(β-エストラジオール添加と同時に)。この細胞は減数分裂IIの後に5つのDNA塊を示す。(d)ラパマイシンがt=0で添加されたCtf19-FRB細胞(β-エストラジオール添加と同時に)。この細胞は減数分裂IIを完了した後に死にます。(e)β-エストラジオール添加後45分にラパマイシンを添加したCtf19-FRB細胞。この細胞は減数分裂IIの後に5つのDNA塊を示す。(f)β-エストラジオール添加後45分にラパマイシンを添加したCtf19-FRB細胞。減数分裂IIの後、6つのDNA塊が存在します。(g)各条件について少なくとも100個の細胞におけるDNA質量の数を定量する(各条件について分析された2つの動画)。t=各バーの下には、β−エストラジオール添加に対してラパマイシンが添加された時間を示す。略語:MII =減数分裂II。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、細胞を同期させるNDT80-inシステム、核からタンパク質を枯渇させるアンカーアウェイ技術、および減数分裂中の出芽酵母細胞を画像化する蛍光タイムラプス顕微鏡を組み合わせたものです。NDT80-inシステムは、前期Iの停止と放出を利用する減数分裂細胞周期同期のための方法です4,8。個々の細胞は、その後の減数分裂の各段階で費やされる時間量がわずかに異なりますが、ほとんどの細胞は減数分裂全体を通して高度な同期を維持します。
アンカーアウェイ技術は、有糸分裂および減数分裂研究に適応可能なツールです。ラパマイシン添加のアンカーアウェイ標的タンパク質および時間を変更することにより、この方法は、出芽酵母減数分裂の任意の段階における様々なタンパク質を研究するように適合させることができる。出芽酵母有糸分裂を研究するために条件付き変異体を作製するための一般的な方法は、減数分裂研究に必ずしも適していない。例えば、抑制可能なプロモーターの使用は、標的タンパク質の発現を変化させるために炭素源の変更を必要とすることが多く、減数分裂20を破壊する可能性がある。温度感受性変異体は、標的タンパク質の活性を低下または消失させるために温度の変化に依存している。これらの条件付き変異体の多くは、栄養条件や温度の変化が減数分裂を混乱させる可能性があるため、減数分裂研究には使用できません21、22、23。さらに、減数分裂の初期に変異タンパク質を発現すると、後の段階がブロックまたは悪影響を与える可能性があるため、欠失または変異体は減数分裂の研究を制限する可能性があります。アンカーアウェイ技術は、栄養や温度の変化に依存しないため、これらの課題を回避できます8。さらに、タンパク質の枯渇は、ラパマイシン添加の時間がタンパク質がいつ固定されるかを決定するように時間的に調節することができる。
アンカーアウェイ法の1つの制限は、標的タンパク質を核外に輸送するためのアンカーとしてRpl13Aリボソームサブユニットに依存するため、非核タンパク質には適さない可能性があることです。しかしながら、減数分裂の間にも有用であり得るタンパク質間相互作用を変えることによるアンカーアウェイ技術の他の用途があり、例えばタンパク質を複合体に固定するか、またはそれらを膜8につなぎ合わせる。以前の研究では、標的タンパク質の核枯渇は、ラパマイシン添加2,8の30分以内に起こることが示されている。ただし、一部のタンパク質は、核からシャトルアウトするためにより長いまたはより短い期間を必要とする可能性があります。標的タンパク質が核から確実にシャトルアウトされるように、標的タンパク質をGFPに融合したFRB(FRB-GFP)でタグ付けして、ラパマイシンの添加から核枯渇までの時間の長さをモニタリングすることができます。アンカーアウェイシステムの別の制限は、一部のタンパク質がC末端のFRBおよびFRB-GFPタグに敏感であることです。そのため、FRBによる標的タンパク質のN末端タグ付けは、標的タンパク質を固定するための代替戦略です。
クロマチン分離をモニターするために、出芽酵母細胞はHtb2-mCherryを発現した。この株では、Htb2タンパク質はその内因性遺伝子座でタグ付けされており、これによりHtb2が正常に発現することを保証します。他の蛍光タグ付きタンパク質も、減数分裂のさまざまな側面をモニターするために使用できます。タイムラプスイメージング用の株を構築する場合、一部のタンパク質はC末端蛍光タグに敏感であることを考慮することが重要です。蛍光タグ付きタンパク質を有する株の増殖および胞子形成アッセイは、タグがタンパク質の機能を変えていないことを保証します。タイムラプス蛍光顕微鏡法の課題の1つは、細胞を十分な蛍光にさらして蛍光タンパク質を検出し、細胞死や過剰な曝露による減数分裂の減速を回避することです。重要なトラブルシューティング手順は、このバランスを実現するための適切な顕微鏡とカメラの設定を見つけることです。必要な曝露時間はタンパク質によってわずかに異なるため、適切な曝露時間を決定するために実験を複数回繰り返す必要があります。ここで説明するチャンバー法をタイムラプスイメージング実験に使用する場合、特に感度の高いステップは、イメージングされる細胞の単層を達成することである。単層がないと、細胞が互いに重なり合うため、適切なイメージングとデータ解析が課題となります。細胞がConAに接着し、チャンバーの周りに細胞を広げるのを助け、単層を得るための安価で効率的な寒天パッドを使用することは、安価で効率的な方法です。寒天パッドを動かしてチャンバーの周りに細胞を広げ、単層が達成されるようにすることは困難な場合があります。移動プロセス中に寒天パッドが非常に小さな動きをしていることを確認すると、単層の作成に役立ちます。再利用可能なチャンバーを作ることで、タイムラプスイメージングデータを安価に生成できます。適切な洗浄と消毒を行うことで、ここで説明されているプラスチックチャンバーは無期限に再利用できます。タイムラプスイメージングの直後にチャンバーをカバーガラスから取り外し、次の使用まで95%エタノールに保存することがベストプラクティスです。
タイムラプス画像化は、固定細胞1、2の画像化から見逃し得る細胞周期に関する情報を提供する。例えば、減数分裂期の持続時間をモニタリングする場合、固定細胞の集団と比較して生細胞を画像化するときに、単一細胞間の変動をより正確に調べることができる。酵母タンパク質は蛍光タンパク質で簡単にタグ付けできるため、蛍光タイムラプスイメージングとNDT80-inシステムおよびアンカーアウェイ技術を組み合わせることで、個々の染色体分配や特定の減数分裂段階のタイミングのモニタリングなどの追加研究に適応させることができます。NDT80細胞における前期I放出後の細胞周期の進行をモニタリングする場合、減数分裂の段階を示す蛍光分子でタグ付けされたタンパク質を持つことが重要です。個々の染色体は、LacI-GFPを発現する細胞において染色体のセントロメア付近のlacオペロン(LacO)の繰り返しを組み込むことによって、減数分裂を通してモニターすることができる。LacI−GFPはLacOに強固に結合し、明るい焦点として視覚化され、これはタイムラプス顕微鏡24,25によって減数分裂全体にわたって追跡することができる。蛍光タグを有する様々なタンパク質が、減数分裂段階の持続時間を監視するために使用されてきた。これらには、微小管に組み込まれるαチューブリンサブユニットであるTub1が含まれます。Zip1、シナプトン複合体の成分;Spc42は、スピンドルポール本体コンポーネント1、2、26、27です。
結論として、この方法は、減数分裂細胞周期の同期、標的タンパク質の条件付き枯渇、およびタイムラプス蛍光顕微鏡法を組み込んで、減数分裂染色体分配を研究します。減数分裂中の出芽酵母細胞をイメージングし、減数分裂の意図された段階にのみ影響を与える条件付き変異体を使用することにより、この方法は減数分裂細胞周期に関する正確なデータを提供することができます。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
インディアナ大学の光学顕微鏡イメージングセンターに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(GM105755)からの助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
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