Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Summary

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l’esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Abstract

La microscopia a fluorescenza time-lapse ha rivoluzionato la comprensione degli eventi del ciclo cellulare meiotico fornendo dati temporali e spaziali che spesso non vengono visualizzati dalle cellule fisse di imaging. Il lievito in erba ha dimostrato di essere un importante organismo modello per studiare la segregazione cromosomica meiotica perché molti geni meiotici sono altamente conservati. La microscopia time-lapse della meiosi nel lievito in erba consente il monitoraggio di diversi mutanti meiotici per mostrare come la mutazione interrompe i processi meiotici. Tuttavia, molte proteine funzionano in più punti della meiosi. L’uso di mutanti nulli meiotici o con perdita di funzione può quindi interrompere un processo precoce, bloccando o disturbando il processo successivo e rendendo difficile determinare i fenotipi associati a ciascun singolo ruolo. Per aggirare questa sfida, questo protocollo descrive come le proteine possono essere impoverite condizionatamente dal nucleo in fasi specifiche della meiosi mentre monitorano gli eventi meiotici usando la microscopia time-lapse. In particolare, questo protocollo descrive come le cellule sono sincronizzate nella profase I, come la tecnica dell’ancoraggio viene utilizzata per esaurire le proteine dal nucleo in specifici stadi meiotici e come l’imaging time-lapse viene utilizzato per monitorare la segregazione cromosomica meiotica. Come esempio dell’utilità della tecnica, la proteina cinetocoora Ctf19 è stata impoverita dal nucleo in diversi punti temporali durante la meiosi e il numero di masse di cromatina è stato analizzato alla fine della meiosi II. Nel complesso, questo protocollo può essere adattato per esaurire diverse proteine nucleari dal nucleo mentre si monitorano le divisioni meiotiche.

Introduction

La microscopia a fluorescenza time-lapse è un valido strumento per studiare la dinamica della segregazione cromosomica meiotica nel lievito in erba ^1,2. Le cellule di lievito in erba possono essere indotte a subire meiosi attraverso la fame di nutrienti chiave³. Durante la meiosi, le cellule subiscono un ciclo di segregazione cromosomica seguito da due divisioni per creare quattro prodotti meiotici che vengono confezionati in spore (Figura 1). Le singole cellule possono essere visualizzate durante ogni fase della meiosi, che genera dati spaziali e temporali che possono essere facilmente ignorati dall’imaging a cellule fisse. Questo protocollo mostra come la combinazione della microscopia a fluorescenza time-lapse con due metodi precedentemente stabiliti, il sistema inducibile NDT80 (NDT80-in) e la tecnica anchor away, può essere utilizzata per studiare la funzione di proteine specifiche in fasi meiotiche distinte.

Il sistema NDT80-in è un potente strumento per la sincronizzazione del ciclo cellulare meiotico che si basa sull’espressione inducibile del fattore di trascrizione della meiosi media NDT80 ^4,5. L’espressione di NDT80 è richiesta per^{l’uscita 6,7} della profase I. Con il sistema NDT80-in, NDT80 è sotto il controllo del promotore GAL1-10 nelle cellule che esprimono il fattore di trascrizione Gal4 fuso in un recettore degli estrogeni (Gal4-ER)^4,5. Poiché Gal4-ER entra nel nucleo solo quando è legato al β-estradiolo, le cellule NDT80-in si arrestano nella profase I in assenza di β-estradiolo, che consente la sincronizzazione delle cellule nella profase I (Figura 1). β-estradiolo promuove la traslocazione del fattore di trascrizione Gal4-ER nel nucleo, dove lega GAL1-10 per guidare l’espressione di NDT80, portando all’ingresso sincrono nelle divisioni meiotiche. Sebbene la microscopia time-lapse possa essere eseguita senza sincronizzazione, il vantaggio di utilizzare la sincronizzazione è la possibilità di aggiungere un inibitore o un farmaco mentre le cellule si trovano in una fase specifica della meiosi.

La tecnica dell’ancoraggio è un sistema inducibile mediante il quale una proteina può essere impoverita dal nucleo con l’aggiunta di rapamicina⁸. Questa tecnica è ideale per studiare le proteine nucleari durante la divisione cellulare nel lievito in erba perché le cellule di lievito subiscono mitosi chiusa e meiosi, in cui l’involucro nucleare non si rompe. Inoltre, questa tecnica è molto utile per le proteine che hanno molteplici funzioni durante la meiosi. A differenza delle delezioni, degli alleli mutanti o degli alleli meiotici nulli, la rimozione di una proteina bersaglio dal nucleo in uno stadio specifico non compromette l’attività della proteina bersaglio nelle fasi precedenti, consentendo un’interpretazione più accurata dei risultati. Il sistema di ancoraggio utilizza la spola delle subunità ribosomiali tra il nucleo e il citoplasma che si verifica alla maturazione ribosomiale⁸. Per esaurire la proteina bersaglio dal nucleo, la proteina bersaglio viene marcata con il dominio di legame della rapamicina FKBP12 (FRB) in un ceppo in cui la subunità ribosomiale Rpl13A è marcata con FKBP12. Senza rapamicina, FRB e FKBP12 non interagiscono e la proteina marcata con FRB rimane nel nucleo. Dopo l’aggiunta di rapamicina, la rapamicina forma un complesso stabile con FKBP12 e FRB, e il complesso viene espulso dal nucleo a causa dell’interazione con Rpl13A (Figura 1). Per prevenire la morte cellulare dopo l’aggiunta di rapamicina, le cellule ospitano la mutazione tor1-1 del gene TOR1 . Inoltre, queste cellule contengono fpr1Δ , un allele nullo della proteina FKBP12 di S. cerevisiae , che impedisce a Fpr1 endogeno di superare Rpl13A-FKBP12 per il legame con FRB e rapamicina. Le mutazioni di fondo di ancoraggio, tor1-1 e fpr1Δ, non influenzano i tempi meiotici o la segregazione cromosomica².

Per dimostrare l’utilità di questa tecnica, la proteina cinetocoro Ctf19 è stata esaurita in diversi punti temporali durante la meiosi. Ctf19 è un componente del cinetocore che è superfluo nella mitosi ma richiesto per una corretta segregazione cromosomica nella meiosi 9,10,11,12,13. Nella meiosi, il cinetocoro viene eliminato nella profase I e Ctf19 è importante per il riassemblaggio dei cinetochi ^9,14. Per questo protocollo, le cellule con il sistema NDT80-in sono state sincronizzate e la tecnica dell’ancoraggio è stata utilizzata per esaurire la proteina bersaglio Ctf19 dal nucleo prima e dopo il rilascio dalla profase I e dopo la segregazione cromosomica della meiosi I (Figura 1). Questo protocollo può essere adattato per esaurire altre proteine di interesse in qualsiasi fase della meiosi e della mitosi.

Protocol

1. Preparazione dei materiali necessari Preparare i reagenti per la crescita e la sporulazione delle cellule di lievito.NOTA: Se i ceppi di lievito in erba sono ade2- e trp1-, integrare tutti i terreni nei punti 1.1.1-1.1.3 con una concentrazione finale dello 0,01% di adenina e dello 0,01% di triptofano dall’1% di stock. Se i mezzi di sterilizzazione in autoclave, aggiungere questi aminoacidi solo dopo che i reagenti sono stati autoclavati e lasciati raffreddare a temperat…

Representative Results

Per monitorare la segregazione della cromatina, la proteina istonica Htb2 è stata etichettata con mCherry. Nella profase I, la cromatina appare come una singola massa di Htb2. Dopo che i cromosomi omologhi si segregano nella prima divisione meiotica, la cromatina appare come due masse distinte (Figura 3A). Dopo che i cromatidi fratelli si separano, la cromatina appare come quattro masse. Se alcuni cromosomi non riescono ad attaccarsi ai microtubuli del fuso, si possono vedere masse aggiunti…

Discussion

Questo protocollo combina il sistema NDT80-in per sincronizzare le cellule, la tecnica di ancoraggio per esaurire le proteine dal nucleo e la microscopia time-lapse a fluorescenza per visualizzare le cellule di lievito in erba durante la meiosi. Il sistema NDT80-in è un metodo per la sincronizzazione del ciclo cellulare meiotico che utilizza un arresto e rilascio di profase I ^4,8. Sebbene le singole cellule varino leggermente nella quantità di…

Materials

β-estradiol	Millipore Sigma	E8875	Make 1mM stocks in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter	Millipore Sigma	S2GPT02RE
100% EtOH	Fisher Scientific	22-032-601
10X PBS	Fisher Scientific	BP399500	Dilute 1:10 to use as solvent for ConA
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5	VWR North American	48393241
25 mm x 75 mm microscope slides	VWR North American	48300-026
Adenine hemisulfate salt	Millipore Sigma	A9126	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Bacto Agar	BD	214030
Concanavialin A	Mllipore Sigma	C2010	Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera	Photometrics		Used in Section 4.3
D-glucose	Fisher Scientific	D16-10
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD	291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	D5879
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope	Nikon		Used in Section 4.4
Fiji	NIH		Download from https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope	Applied Precision		Used in Section 4.3
L-Tryptophan	Millipore Sigma	T0254	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Modeling Clay	Crayola	2302880000	To secure coverslip in slide holder
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software	Nikon		Used in Section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera	Hamamatsu	C15440-20UP	Used in Section 4.4
Plastic pipette tip holder	Dot Scientific	LTS1000-HR	Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.
Pottassium Acetate	Fisher Scientific	BP264
Rapamycin	Fisher Scientific	BP29631	Make 1mg/mL stocks in DMSO
Silicone Sealant	Aqueon	100165001	Also known as aquarium glue.
SoftWorx7.0.0  Imaging Software	Applied Precision		Used in Section 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser)	Formedium	DSCK2500
Type N immersion oil	Nikon	MXA22166