Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

استخدام الفحص المجهري بفاصل زمني والاستنفاد النووي للبروتينات في مرحلة محددة لدراسة الانقسام الاختزالي في S. cerevisiae

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64580
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biology, Indiana University, 2Stowers Institute for Biomedical Research
* These authors contributed equally

Summary

يعد الفحص المجهري بفاصل زمني أداة قيمة لدراسة الانقسام الاختزالي في الخميرة الناشئة. يصف هذا البروتوكول طريقة تجمع بين تزامن دورة الخلية ، والفحص المجهري بفاصل زمني ، والاستنفاد الشرطي للبروتين المستهدف لتوضيح كيفية دراسة وظيفة بروتين معين أثناء فصل الكروموسوم الاختزالي.

Abstract

أحدث الفحص المجهري الفلوري ذو الفاصل الزمني ثورة في فهم أحداث دورة الخلية الاختزالية من خلال توفير بيانات زمنية ومكانية لا يمكن رؤيتها غالبا عن طريق تصوير الخلايا الثابتة. أثبتت الخميرة الناشئة أنها كائن نموذجي مهم لدراسة فصل الكروموسومات الميوزية لأن العديد من الجينات الاختزالية محفوظة بدرجة كبيرة. يسمح الفحص المجهري بفاصل زمني للانقسام الميوزي في الخميرة الناشئة بمراقبة الطفرات الاختزالية المختلفة لإظهار كيف تعطل الطفرة العمليات الاختزالية. ومع ذلك، تعمل العديد من البروتينات في نقاط متعددة في الانقسام الميوزي. وبالتالي ، فإن استخدام فقدان الوظيفة أو الطفرات الفارغة الاختزالية يمكن أن يعطل عملية مبكرة ، مما يعرقل أو يزعج العملية اللاحقة ويجعل من الصعب تحديد الأنماط الظاهرية المرتبطة بكل دور فردي. للتحايل على هذا التحدي ، يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استنفاد البروتينات بشكل مشروط من النواة في مراحل محددة من الانقسام الاختزالي أثناء مراقبة الأحداث الاختزالية باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية مزامنة الخلايا في الطور التمهيدي الأول ، وكيف يتم استخدام تقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتينات من النواة في مراحل اختزالية محددة ، وكيف يتم استخدام التصوير بفاصل زمني لمراقبة فصل الكروموسوم الميوتي. كمثال على فائدة هذه التقنية ، تم استنفاد بروتين كينيتوكور Ctf19 من النواة في نقاط زمنية مختلفة أثناء الانقسام الاختزالي ، وتم تحليل عدد كتل الكروماتين في نهاية الانقسام الاختزالي الثاني. بشكل عام ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستنفاد البروتينات النووية المختلفة من النواة أثناء مراقبة الانقسامات الاختزالية.

Introduction

تعد النسخة المجهرية الفلورية ذات الفاصل الزمني أداة قيمة لدراسة ديناميكيات فصل الكروموسوم الاختزالي في الخميرة الناشئة 1,2. يمكن حث خلايا الخميرة الناشئة على الخضوع للانقسام الميوزي من خلال تجويع العناصر الغذائية الرئيسية3. أثناء الانقسام الميوزي، تخضع الخلايا لجولة واحدة من فصل الكروموسومات يتبعها قسمان لتكوين أربعة نواتج اختزالية يتم تعبئتها في جراثيم (الشكل 1). يمكن تصور الخلايا الفردية خلال كل مرحلة من مراحل الانقسام الاختزالي ، والتي تولد بيانات مكانية وزمانية يمكن تفويتها بسهولة عن طريق التصوير بالخلايا الثابتة. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام الجمع بين الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني مع طريقتين تم تحديدهما مسبقا ، نظام NDT80 القابل للحث (NDT80-in) وتقنية المرساة بعيدا ، لدراسة وظيفة بروتينات معينة في مراحل اختزالية متميزة.

يعد نظام NDT80-in أداة قوية لمزامنة دورة الخلية الاختزالية التي تعتمد على التعبير المستحث لعامل نسخ الانقسام الاختزالي الأوسط NDT80 4,5. تعبير NDT80 مطلوب للخروجمن الطور الأول 6,7. مع نظام NDT80-in ، يكون NDT80 تحت سيطرة مروج GAL1-10 في الخلايا التي تعبر عن عامل النسخ Gal4 المنصهر في مستقبل هرمون الاستروجين (Gal4-ER) 4,5. نظرا لأن Gal4-ER يدخل النواة فقط عندما يرتبط ب β-استراديول ، فإن خلايا NDT80-in تتوقف في الطور التمهيدي الأول في غياب β-استراديول ، مما يسمح بمزامنة الخلايا في الطور التمهيدي الأول (الشكل 1). تعزز إضافة β-استراديول نقل عامل النسخ Gal4-ER إلى النواة ، حيث تربط GAL1-10 لدفع التعبير عن NDT80 ، مما يؤدي إلى الدخول المتزامن إلى الانقسامات الاختزالية. على الرغم من أنه يمكن إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني دون تزامن ، إلا أن ميزة استخدام التزامن هي القدرة على إضافة مثبط أو دواء بينما تكون الخلايا في مرحلة معينة من الانقسام الاختزالي.

تقنية المرساة هي نظام قابل للتحريض يمكن من خلاله استنفاد البروتين من النواة مع إضافة رابامايسين8. هذه التقنية مثالية لدراسة البروتينات النووية أثناء الانقسام الخلوي في الخميرة الناشئة؛ لأن خلايا فطر الخميرة تخضع للانقسام الميتوزي المغلق والانقسام الميوزي، حيث لا يتفكك الغلاف النووي. علاوة على ذلك ، هذه التقنية مفيدة جدا للبروتينات التي لها وظائف متعددة خلال الانقسام الميوزي. على عكس عمليات الحذف أو الأليلات الطافرة أو الأليلات الفارغة الاختزالية ، فإن إزالة البروتين المستهدف من النواة في مرحلة معينة لا يضر بنشاط البروتين المستهدف في المراحل المبكرة ، مما يسمح بتفسير أكثر دقة للنتائج. يستخدم نظام المرساة بعيدا نقل الوحدات الفرعية الريبوسومية بين النواة والسيتوبلازم الذي يحدث عند نضوج الريبوسوم8. لاستنفاد البروتين المستهدف من النواة ، يتم تمييز البروتين المستهدف بمجال ربط FKBP12-rapamycin (FRB) في سلالة يتم فيها تمييز الوحدة الفرعية الريبوسومية Rpl13A ب FKBP12. بدون راباميسين ، لا يتفاعل FRB و FKBP12 ، ويبقى البروتين الموسوم ب FRB في النواة. عند إضافة rapamycin ، يشكل rapamycin مركبا مستقرا مع FKBP12 و FRB ، ويتم نقل المجمع خارج النواة بسبب التفاعل مع Rpl13A (الشكل 1). لمنع موت الخلايا عند إضافة رابامايسين ، تؤوي الخلايا طفرة TOR1-1 لجين TOR1 . بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي هذه الخلايا على fpr1Δ ، وهو أليل فارغ من بروتين S. cerevisiae FKBP12 ، والذي يمنع Fpr1 الداخلي من التفوق على Rpl13A-FKBP12 لربط FRB و rapamycin. لا تؤثر طفرات الخلفية البعيدة ، tor1-1 و fpr1Δ ، على التوقيت الاختزالي أو فصل الكروموسوم2.

لإثبات فائدة هذه التقنية ، تم استنفاد بروتين كينيتوخور Ctf19 في نقاط زمنية مختلفة طوال الانقسام الاختزالي. Ctf19 هو أحد مكونات الحركية التي يمكن الاستغناء عنها في الانقسام الميتوزي ولكنها مطلوبة لفصل الكروموسومات بشكل صحيح في الانقسام الميوزي9،10،11،12،13. في الانقسام الاختزالي ، يتم إلقاء الحركية في الطور التمهيدي الأول ، و Ctf19 مهم لإعادة تجميع الحركية 9,14. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تمت مزامنة الخلايا مع نظام NDT80-in ، وتم استخدام تقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتين المستهدف Ctf19 من النواة قبل وبعد الإطلاق من الطور الأولي الأول ، وبعد فصل كروموسوم الانقسام الاختزالي الأول (الشكل 1). يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستنفاد البروتينات الأخرى ذات الأهمية في أي مرحلة من مراحل الانقسام الميوزي والانقسام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المواد اللازمة

  1. تحضير الكواشف لنمو وتبويض خلايا الخميرة.
    ملاحظة: إذا كانت سلالات الخميرة الناشئة هي ade2 - و trp1- ، استكمل جميع الوسائط في الخطوات 1.1.1-1.1.3 بتركيز نهائي قدره 0.01٪ أدينين و 0.01٪ تريبتوفان من مخزون 1٪. في حالة تعقيم الوسائط بواسطة الأوتوكلاف ، أضف هذه الأحماض الأمينية فقط بعد تعقيم الكواشف والسماح لها بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة.
    1. للنمو الخضري ، قم بإعداد 2x اصطناعي كامل + وسط سكر العنب (2XSC) عن طريق إذابة 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 2 جم من مزيج الأحماض الأمينية الكامل ، و 20 جم من سكر العنب في 500 مل من الماء. تعقيم الخليط عن طريق التعقيم لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية أو التصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
    2. للخطوة الأولى من sporulation ، قم بإعداد 2x اصطناعي كامل + وسط أسيتات (2XSCA) عن طريق إذابة 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 2 جم من مزيج الأحماض الأمينية الكامل ، و 20 جم من أسيتات البوتاسيوم في 500 مل من الماء. تعقيم الخليط عن طريق التعقيم لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية أو التصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
    3. للخطوة الأخيرة من sporulation ، تحضير 1٪ أسيتات البوتاسيوم (1٪ KAc) عن طريق إذابة 5 g من KAc في 500 مل من الماء. تعقيم الخليط عن طريق التعقيم لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية أو التصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
  2. تحضير الأدوية والكواشف للفحص المجهري والمزامنة والمرساة بعيدا.
    1. لالتصاق الخلايا بالغطاء أثناء التصوير بفاصل زمني ، اصنع 1 مجم / مل من كونكانافالين أ (ConA) في 1x PBS. قم بتعقيم المرشح باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزين القسمة الصغيرة (~ 10 ميكرولتر) عند -20 درجة مئوية.
    2. لاستخدام نظام NDT80-in ، اصنع 2 مل من 1 mM β-استراديول مذاب في الإيثانول. تعقيم المرشح باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزين القسمة (~ 500 ميكرولتر) عند -20 درجة مئوية.
    3. بالنسبة لنظام المرساة بعيدا ، اصنع 1 مجم / مل من الرابامايسين المذاب في DMSO. قم بتعقيم المرشح باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزين القسمة الصغيرة (~ 10 ميكرولتر) عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: تحضير حصص صغيرة من rapamycin لتجنب دورات تجميد وذوبان متعددة من المخدرات.
  3. توليد سلالات الخميرة التي تحتوي على نظام NDT80-in (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER / GAL4-ER) وبروتين مستهدف موسوم ب FRB في الخلفية الجينية للمرساة (tor1-1 / tor1-1 ؛ fpr1Δ / fpr1Δ ؛ Rpl13A-FKBP12 / Rpl13A-FKBP12)4,8. تم استخدام Ctf19-FRB لهذه الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، تم وضع علامة على نسخة واحدة من بروتين هيستون Htb2 ب mCherry للسماح بمراقبة التقدم الاختزالي وفصل الكروماتين.
  4. تحضير حجرة للتصوير بفاصل زمني
    1. ابدأ في تحضير الغرفة قبل 6 ساعات إلى 24 ساعة من التصوير (الشكل 2). اقطع حجرة مقاس 18 مم × 18 مم من ملحق صندوق طرف الماصة باستخدام مشرط ساخن أو شفرة حادة أخرى.
    2. استخدم طرف ماصة بلاستيكي لنشر طبقة رقيقة من مانع التسرب السيليكوني حول الحواف السفلية للغرفة التي ستلتصق بغطاء الغطاء. أضف مادة مانعة للتسرب كافية بحيث يتم تغطية حواف الغرفة بالكامل (انظر الشكل 2).
    3. قم بلصق الحجرة بغطاء 24 مم × 50 مم عن طريق وضع الحجرة برفق ، بحيث يكون جانب مانع التسرب لأسفل ، على غطاء الغطاء. تأكد من عدم وجود فجوات في المادة المانعة للتسرب حتى لا تتسرب الغرفة.
    4. انشر 8-10 ميكرولتر من ConA على غطاء الغطاء. قم بتوزيع ConA على منتصف غطاء الغطاء واستخدم طرف ماصة لنشر ConA في طبقة رقيقة بحيث تغطي معظم غطاء الغطاء المحاط بالغرفة.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الغرف البلاستيكية إلى أجل غير مسمى. بعد اكتمال التصوير بفاصل زمني ، قم بإزالة الحجرة من غطاء الغطاء باستخدام ماكينة حلاقة ، ونظف مانع تسرب السيليكون من الغرفة ، واحتفظ بالغرف مغمورة في 95٪ من الإيثانول للاستخدام في المستقبل.

2. أبواغ خلايا الخميرة

  1. نفذ الخطوات التالية لتجويع خلايا الخميرة لتحفيز البرنامج الميوتيكي.
    ملاحظة: هذه الخطوات هي لsporulation من سلالة W303 من الخميرة. قد تتطلب السلالات الأخرى بروتوكولات مختلفة15. كفاءة التبويض متغيرة للغاية بين سلالات المختبر ، حيث يظهر W303 كفاءة أبواغ ~ 60٪ 16،17،18.
    1. خذ مستعمرة واحدة من سلالة الخميرة ثنائية الصيغة الصبغية المناسبة من صفيحة وقم بتلقيح 2 مل من 2XSC واتركها تنمو عند 30 درجة مئوية على أسطوانة الأسطوانة لمدة 12-24 ساعة حتى التشبع.
    2. تمييع الثقافة المشبعة في 2XSCA عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من الثقافة من الخطوة 2.1.1 إلى 2 مل من 2XSCA. دعها تنمو عند 30 درجة مئوية على أسطوانة أسطوانية لمدة 12-16 ساعة. لا تترك في 2XSCA لمدة تزيد عن 16 ساعة لأن الخلايا يمكن أن تصبح مريضة أو الفلورسنت التلقائي.
    3. قم بإجراء غسلتين عن طريق تدوير المزرعة عند 800 × جم في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة ، والتخلص من السائل ، وإعادة تعليق الحبيبات في 2 مل من الماء المقطر المعقم.
    4. بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة السائل وإعادة تعليق الحبيبات في 2 مل من 1٪ KAc واتركها تنمو عند 25 درجة مئوية على أسطوانة أسطوانية لمدة 8-12 ساعة. تتوقف الخلايا التي دخلت الانقسام الميوزي في الباكيتين من الطور التمهيدي الأول.
  2. نظام إطلاق الطور الأول
    1. أضف β-استراديول مباشرة إلى ثقافة التبويض إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر ودوامة أنبوب الاستزراع بسرعة. سيطلق β-استراديول خلايا من الطور التمهيدي الأول.

3. استنزاف البروتين المستهدف من النواة باستخدام تقنية المرساة بعيدا

  1. أضف رابامايسين إلى الخلايا لاستنفاد البروتين الموسوم ب FRB من النواة في مرحلة معينة.
    1. لاستنفاد البروتينات من النواة عند خروج الطور الأول، أضف رابامايسين إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام/مل إلى أنبوب زراعة الأبواغ في نفس الوقت الذي تضاف فيه β-استراديول.
    2. لاستنفاد البروتينات من النواة في مرحلة معينة من الانقسام الاختزالي ، راقب مرحلة دورة الخلية بدءا من 60 دقيقة بعد إضافة β-استراديول. كل 20 دقيقة ، ماصة 5 ميكرولتر من الثقافة على غطاء 24 مم × 40 مم وقم بتغطية الخلايا بغطاء 18 مم × 18 مم. حافظ على الثقافات تدور على الأسطوانة عند 25 درجة مئوية بين النقاط الزمنية.
    3. قم بتصوير الخلايا باستخدام مرشح A594 / mCherry وهدف 60x لمجهر مضان. اضبط النسبة المئوية للنفاذية على 2٪ ووقت التعرض على 250 مللي ثانية. سيشير وجود كتلة أو كتلتين أو أربع كتل من الحمض النووي (DNA) إلى المرحلة الاختزالية التي تقدمت فيها الخلايا. أضف رابامايسين إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل في المرحلة الاختزالية من الاهتمام.
  2. حافظ على دوران الخلايا على أسطوانة الأسطوانة عند 25 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتصوير. يحدث النضوب النووي للبروتين المستهدف بعد 30-45 دقيقة من إضافة رابامايسين 2,8.

4. الفحص المجهري مضان الفاصل الزمني

  1. اصنع وسادة أجار سيتم استخدامها لإنشاء طبقة أحادية من الخلايا للتصوير (انظر الخطوة 4.2).
    1. اقطع وتخلص من الغطاء والجزء السفلي 1/3 من أنبوب microfuge سعة 1.5 مل لإنشاء أسطوانة. ستكون الأسطوانة بمثابة قالب لوسادة أجار. اصنع أسطوانتين للحصول على أسطوانة إضافية في حالة عدم بلمرة الآجار بشكل صحيح في الأولى.
    2. ضع أسطوانة أنبوب microfuge المقطوعة على شريحة زجاجية نظيفة بحيث يكون الجزء العلوي من الأنبوب مقلوبا على الشريحة.
    3. اصنع 6 مل من محلول أجار 5٪ (استخدم 1٪ KAc كمذيب) في دورق سعة 50 مل وقم بوضعه في الميكروويف حتى يذوب الآجار تماما.
      ملاحظة: سوف يغلي الآجار بسهولة في الميكروويف ؛ راقب الآجار وابدأ وأوقف الميكروويف عندما يبدأ الآجار في الغليان ويدور الدورق. ابدأ وأوقف الميكروويف عدة مرات لإذابة الأجار بالكامل. يتكون محلول أجار بما يزيد عن الكمية اللازمة لضمان ذوبان الآجار بالكامل.
    4. اقطع طرف الماصة لعمل فتحة أكبر وماصة ~ 500 ميكرولتر من الآجار المذاب في كل أسطوانة أنبوب microfuge. اتركه في درجة حرارة الغرفة حتى يتجمد الآجار (~ 10-12 دقيقة).
  2. تحضير خلايا الخميرة للتصوير
    1. قم بتدوير 200 ميكرولتر من ثقافة الأبواغ من الخطوة 3.2 عند 800 × جم لمدة دقيقتين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1 مل. إزالة وتجاهل 180 ميكرولتر من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في المادة الطافية المتبقية عن طريق تحريك الأنبوب ونفضه.
    2. ماصة 6 ميكرولتر من الخلايا المركزة على غطاء في منتصف الغرفة مصنوعة في الخطوة 1.4.
    3. امسك الأسطوانة بوسادة أجار مصنوعة في الخطوة 4.1 وحركها بعناية عن الشريحة الزجاجية. تأكد من أن الآجار مسطح تماما في الأسفل وباستخدام الجزء السفلي من طرف الماصة ، ضع قدرا طفيفا من الضغط على قالب microfuge بحيث يتم دفع وسادة أجار للخارج قليلا فوق حدود الأنبوب.
    4. اقلب القالب بحيث تكون وسادة الآجار متجهة لأسفل نحو الغرفة.
    5. باستخدام الملقط ، ضع وسادة أجار برفق (لا تزال في قالب أنبوب microfuge) أعلى الخلايا. استخدم طرف ماصة لتحريك وسادة الآجار برفق حول الحجرة 10-20 مرة لإنشاء طبقة أحادية من الخلايا على غطاء الغطاء.
    6. اترك وسادة أجار في الحجرة لمدة 12-15 دقيقة. ستسمح هذه الخطوة للخلايا بالالتصاق ب ConA على غطاء الغطاء.
    7. انقل 2 مل من مزرعة الأبواغ من الخطوة 3.2 إلى أنبوبي طرد مركزي دقيقين وقم بالدوران بسرعة 15700 × جم لمدة دقيقتين. انقل المادة الطافية إلى أنابيب microfuge نظيفة وقم بتدويرها مرة أخرى بسرعة 15700 × جم لمدة 2 دقيقة. انقل المادة الطافية لتنظيف أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لاستخدامها في الخطوة التالية.
      ملاحظة: من المهم استخدام طافي KAc المكيف مسبقا مع β-استراديول وراباميسين لضمان التبويض الفعال والنضوب المستمر للبروتين محل الاهتمام.
    8. بعد أن تجلس وسادة أجار في الغرفة لمدة 12-15 دقيقة ، تطفو وتزيل وسادة أجار قبل التصوير. للقيام بذلك ، أضف 2 مل من المادة الطافية من الخطوة 4.2.7 بالتنقيط إلى الغرفة. بمجرد وصول السائل إلى الجزء العلوي من الغرفة ، من المرجح أن تطفو وسادة أجار.
      ملاحظة: إذا لم تطفو وسادة أجار تلقائيا ، فانتظر 1-2 دقيقة. إذا كانت وسادة أجار لا تزال لا تطفو ، فقم بإزالتها برفق بالملقط. من الناحية المثالية ، ستطفو وسادة الآجار من تلقاء نفسها لأن إزالتها قبل الطفو قد تؤدي إلى إزالة الخلايا.
    9. بعد أن تطفو وسادة أجار ، قم بإزالتها برفق بالملقط وتخلص منها. ضع غطاء 24 مم × 50 مم على الجزء العلوي من الحجرة لمنع التبخر أثناء التصوير.
  3. إعداد فيلم على المجهر
    ملاحظة: الإرشادات أدناه خاصة بالمجهر المقلوب المزود بحامل منزلق يستوعب غطاء الغطاء مقاس 24 مم × 50 مم (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المجهر والكاميرا والبرامج). يتم استخدام هدف الغمر بالزيت 60x للحصول على الصور. قد يلزم تغيير هذا البروتوكول عند استخدام مجاهر أخرى أو حوامل شرائح أخرى. ستختلف الخطوات الدقيقة لتنفيذ الخطوة 4.3.2 حتى الخطوة 4.3.16 اعتمادا على المجهر وبرنامج التصوير المستخدم. انظر القسم 4.4 للحصول على تعليمات لمجهر مختلف.
    1. قم بتركيب غطاء الغطاء داخل حامل الانزلاق. قم بلصق طين التشكيل على جانب غطاء الغطاء لإبقائه آمنا في حامل الشريحة.
    2. افتح برنامج الحصول على الصور. استخدم مقابض الدورة التدريبية والضبط الدقيق لتركيز الخلايا باستخدام DIC أو brightfield.
    3. في القائمة الرئيسية لبرنامج الحصول على الصور ، انقر فوق ملف > اكتساب (حل 3D). ستظهر ثلاث نوافذ.
    4. في النافذة المسماة Resolve 3D ، انقر فوق رمز Erlenmeyer Flask . سيؤدي هذا إلى فتح نافذة بعنوان تصميم / تشغيل التجربة ، والتي تحتوي على عناصر التحكم لإعداد تجربة لإعداد فيلم بفاصل زمني.
    5. ضمن علامة التبويب تصميم ، انتقل إلى علامة التبويب المسماة تقسيم. حدد المربع بجوار Z Sectioning. اضبط مكدسات z على النحو التالي: تباعد المقطع البصري = 1 ميكرومتر ، عدد الأقسام البصرية = 5 ، سمك العينة = 5.0 ميكرومتر.
    6. ضمن علامة التبويب القنوات ، انقر فوق الرمز + بحيث يظهر خيار قناة واحدة. حدد القناة المناسبة. في هذه التجربة ، نختار A594 ، والذي يستخدم لتصوير mCherry. حدد المربع بجوار الصورة المرجعية واضبط الموضع Z على منتصف العينة من القائمة المنسدلة.
    7. حدد قيمة من القائمة المنسدلة المجاورة ل ٪T و Exp. لتعيين النسبة المئوية للنفاذية ووقت التعرض ، على التوالي. بالنسبة لهذه التجربة ، يتم استخدام نفاذية 2٪ ووقت تعرض 250 مللي ثانية في قناة A594 ، ويتم استخدام نفاذية 10٪ ووقت تعرض 500 مللي ثانية لحقل ساطع.
      ملاحظة: سيختلف وقت التعرض والنسبة المئوية للنفاذية باختلاف المجاهر. لتجنب التعرض المفرط ، استخدم أقل نسبة نفاذية وأقصر وقت تعرض ممكن يسمح بالتصور السليم للبروتين محل الاهتمام.
    8. ضمن علامة التبويب الفاصل الزمني، حدد المربع بجوار الفاصل الزمني. في الجدول الذي يظهر، أدخل 10 أسفل عمود min في صف الفاصل الزمني و10 أسفل عمود الساعات في صف إجمالي الوقت. سيؤدي هذا إلى تشغيل دورة زمنية لالتقاط الصور كل 10 دقائق لمدة 10 ساعات.
    9. حدد المربع بجوار الحفاظ على التركيز مع التركيز البؤري النهائي لمنع انحراف المسرح أثناء الفيلم. ضمن علامة التبويب النقاط ، حدد المربع بجوار زيارة قائمة النقاط.
    10. في القائمة الرئيسية ، انقر فوق عرض > قائمة النقاط. ستظهر نافذة تسمى قائمة النقاط. انقل المسرح إلى منطقة من الحجرة تظهر طبقة أحادية من الخلايا. انقر فوق علامة النقطة في نافذة قائمة النقاط.
    11. حرك المرحلة لتحديد 25-30 نقطة دون أي تداخل لتجنب الإفراط في تعريض الخلايا. سيتم تصوير كل حقل خلال كل دورة زمنية.
    12. في نافذة قائمة النقاط، حدد معايرة الكل لتعيين التركيز البؤري النهائي لكل نقطة. ضمن علامة التبويب تصميم في نافذة Desgin/Run Experiment ، أدخل نطاق قيم النقاط (التي تم الحصول عليها من نافذة قائمة النقاط) في المربع بجوار زيارة قائمة النقاط. ضمن علامة التبويب " تشغيل" ، احفظ الملف إلى الوجهة المناسبة على الكمبيوتر. في نافذة تصميم/تشغيل التجربة ، حدد الزر تشغيل (أيقونة مثلث أخضر) لبدء تشغيل الفيلم.
  4. طريقة اختيارية: إعداد فيلم على المجهر
    ملاحظة: هذه التعليمات خاصة بالمجهر المقلوب المزود بحامل منزلق يمكنه استيعاب غطاء 24 مم × 50 مم. راجع جدول المواد للحصول على مواصفات حول المجهر والكاميرا وبرامج التصوير المستخدمة. يتم استخدام هدف الغمر بالزيت 60x للحصول على الصور.
    1. قم بتركيب غطاء الغطاء داخل حامل الانزلاق. افتح برنامج الحصول على الصور. استخدم مقابض الدورة التدريبية والضبط الدقيق لتركيز الخلايا باستخدام DIC أو Brightfield. انقر بزر الماوس الأيمن في النافذة المفتوحة للبرنامج. ستظهر قائمة منسدلة.
    2. انقر فوق ضوابط الاستحواذ > الاستحواذ. انقر فوق التطبيق > تحديد / تشغيل التجربة. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة تسمى اكتساب ND.
    3. في النافذة التي تفتح ، حدد المربع بجوار XY. انقل المرحلة إلى الموقع المطلوب وانقر فوق المربع الموجود أسفل اسم النقطة لتحديد هذا الموقع كنقطة. كرر هذا حتى يتم تحديد 25-30 نقطة دون أي تداخل لتجنب الإفراط في تعريض الخلايا. سيتم تصوير كل حقل خلال كل دورة زمنية.
    4. تعيين نفاذية النسبة المئوية لكل قناة فلورسنت. نظرا لأن السلالات تنتج Htb2-mCherry ، يتم استخدام مرشح mCherry هنا. ضمن نافذة الاستحواذ التي فتحت في الخطوة 4.3.3 ، انتقل إلى زر 555 نانومتر. اضبط النسبة المئوية للنفاذية على 5٪ عن طريق ضبط المقياس المنزلق أسفل زر 555 نانومتر حتى يقرأ 5٪.
    5. اضبط وقت التعرض لكل قناة فلورسنت. ضمن نافذة الاستحواذ ، حدد 200 مللي ثانية من القائمة المنسدلة التعرض.
      ملاحظة: سيختلف وقت التعرض والنسبة المئوية للنفاذية باختلاف المجاهر. لتجنب التعرض المفرط ، استخدم أقل نسبة نفاذية وأقصر وقت تعرض ممكن يسمح بالتصور السليم للبروتين محل الاهتمام.
    6. انقر فوق المربع بجوار Z في نافذة اكتساب ND . ضع خمسة أكوام z من خلايا الخميرة التي تفصل بينها 1.2 ميكرومتر.
    7. انقر فوق المربع بجوار λ. حدد القنوات المناسبة لاستخدامها في التجربة. بالنسبة إلى مدينة دبي للإنترنت ، تأكد من تحديد الصفحة الرئيسية من القائمة المنسدلة ضمن Z pos. بالنسبة إلى mCherry ، تأكد من تحديد الكل من القائمة المنسدلة ضمن Z pos. هذا يضمن أنه يتم أخذ قسم واحد فقط (في منتصف z-stack) لمدينة دبي للإنترنت.
    8. حدد المربع بجوار الوقت في نافذة اكتساب ND . حدد المربع ضمن المرحلة. في القائمة المنسدلة ضمن الفاصل الزمني، حدد 10 دقائق. ضمن المدة، حدد 10 ساعات (ساعات). سيؤدي هذا إلى تشغيل الدورة الزمنية بحيث يتم التقاط الصور كل 10 دقائق لمدة 10 ساعات.

5. تحليل فصل الكروماتين

  1. افتح برنامج فيجي. افتح مجال رؤية واحدا في كل مرة: لكل حقل ، افتح قنوات DIC و mChery.
  2. خذ أقصى إسقاط كثافة لقناة mCherry للحصول على صورة واحدة: انقر فوق Image > Stacks > Z Project ، وحدد الحد الأقصى للكثافة من القائمة المنسدلة.
  3. دمج قنوات DIC و mCherry في صورة واحدة: انقر فوق > الصورة > اللون دمج القنوات.
  4. اتبع خلية واحدة من خلال الانقسام الاختزالي. بعد اكتمال الانقسام الميوزي الثاني، سجل عدد كتل الحمض النووي (DNA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لمراقبة فصل الكروماتين ، تم وضع علامة على بروتين هيستون Htb2 باستخدام mCherry. في الطور التمهيدي الأول، يظهر الكروماتين في صورة كتلة Htb2 واحدة. بعد انفصال الكروموسومات المتماثلة في الانقسام الميوتي الأول، يظهر الكروماتين في صورة كتلتين متميزتين (الشكل 3 أ). بعد فصل الكروماتيدات الشقيقة ، يظهر الكروماتين في صورة أربع كتل. إذا فشلت بعض الكروموسومات في الالتصاق بالأنابيب الدقيقة المغزلية، فيمكن رؤية كتل إضافية بعد الانقسام الميوزي الأول أو الانقسام الميوزي الثاني.

تم استخدام الطريقة الموضحة أعلاه لدراسة دور مكون الحركية Ctf19 في ضمان الفصل السليم للكروموسومات في الانقسام الاختزالي للخميرة الناشئة. تمت مزامنة سلالات الخميرة المرساة التي تعبر عن Ctf19 الموسومة ب FRB في الطور التمهيدي الأول باستخدام نظام NDT80-in (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12 ؛ CTF19-FRB ؛ GAL1-10 روج NDT80 ؛ GAL4-ER). كعنصر تحكم ، تم استخدام سلالة NDT80-in مع خلفية سلالة المرساة ولكن بدون البروتين الموسوم ب FRB (tor1-1 ؛ fpr1Δ; RPL13A-FKBP12 ؛ GAL1-10 روج NDT80 ؛ GAL4-ER). تم إطلاق الخلايا من اعتقال الطور الأول بإضافة β-استراديول. تمت إضافة راباميسين لاستنفاد Ctf19-FRB من النواة إما عند الإطلاق (قبل إعادة تجميع كينيتوخور) ، أو بعد 45 دقيقة من الإطلاق (بعد إعادة تجميع كينيتوخور ولكن قبل الانقسام الاختزالي الأول) ، أو 3 ساعات بعد الإطلاق (قبل الانقسام الاختزالي الثاني مباشرة) (الشكل 3A-F). بعد إضافة rapamycin ، تم إجراء الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني ، وتم الحصول على الصور كل 10 دقائق طوال المدة المتبقية من الانقسام الاختزالي.

بعد التصوير ، تم استخدام برنامج الوصول المفتوح فيجي لفتح الصور وإجراء تحليل للأرقام التي توضح التقدم الزمني (الشكل 3A-F). تم حساب عدد كتل الحمض النووي بعد الانقسام الميوزي الثاني في 100 خلية على الأقل كانت تخضع للانقسام الميوزي لكل حالة. في خلايا النوع البري ذات الخلفية المرساة البعيدة، توجد عادة أربع كتل من الحمض النووي (DNA) في نهاية الانقسام الميوزي الثاني، تمثل النواتج الأربعة للانقسام الميوزي (الشكل 3 أ). في جزء صغير من الخلايا ، تظهر ثلاث كتل فقط بعد الانقسام الميوزي الثاني (الشكل 3B ، G). لكن من المحتمل أن تكون ثلاث كتل ناتجة عن خلية بها أربعة نواتج من الانقسام الميوزي، لكن اثنتين من هذه الكتل تظهر معا بعد الانقسام الميوزي الثاني.

عندما يتم تثبيت Ctf19-FRB بعيدا في وقت إطلاق خروج الطور الأولي (t = 0 h) ، فإن ما يقرب من 47٪ من الخلايا تعرض أكثر من أربع كتل DNA عند الانتهاء من الانقسام الاختزالي ، مما يشير إلى وجود خلل في ارتباط الحركية والأنابيب الدقيقة (الشكل 3C ، G). مع التثبيت بعيدا عن Ctf19-FRB إما بعد تجميع الحركية ولكن قبل الانقسام الاختزالي الأول (t = 45 دقيقة) أو قبل الانقسام الاختزالي الثاني (t = 3 h) ، يعرض ما يقرب من 16٪ من الخلايا كتل DNA إضافية. تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن Ctf19 مهم لإعادة تجميع الحركية عند إطلاق الطور الأولي ولكنه أقل أهمية في فصل الكروموسومات بمجرد إعادة تجميع الحركية.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها هنا أن الفحص المجهري بفاصل زمني جنبا إلى جنب مع تزامن دورة الخلية والاستنفاد الشرطي للبروتين المستهدف يسمح بدراسة البروتين في مرحلة اختزالية محددة. على الرغم من أن Ctf19 ليس ضروريا للانقسام الميتوزي ، إلا أن حركية الانقسام الاختزالي يتم إعادة تنظيمها على نطاق واسع ، و Ctf19 له دور حاسم في إعادة تجميع الحركية بعد خروج الطور الأول9،11،12. توضح النتائج في الشكل 3 أنه عند استنفاد Ctf19 قبل إعادة تجميع كينيتوكور ، يظهر جزء كبير من الخلايا كتل DNA إضافية بعد الانقسام الميوزي الثاني. عند استنفاد Ctf19 من النواة بعد إعادة تجميع حركية التوازن، ولكن قبل الانقسام الميوزي الأول أو الانقسام الميوزي الثاني، يكون هناك عدد أقل من الخلايا التي تعرض كتل إضافية من الحمض النووي (DNA) . تشير هذه النتائج إلى أن الدور الأكثر أهمية ل Ctf19 هو في نهاية المرحلة الأولى. يسلط هذا الاختلاف في دقة فصل الكروموسومات مع استنفاد Ctf19 في مراحل مختلفة الضوء على أهمية استخدام الأليلات الشرطية الخاصة بالمرحلة لدراسة وظيفة البروتينات على وجه التحديد في الانقسام الميوزي الأول أو الانقسام الميوزي الثاني. كان من الممكن أن يظهر الطافر الفارغ الاختزالي عيبا شديدا ولن يقدم معلومات حول دور Ctf19 في كل مرحلة.

بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن CTF19 ليس جينا أساسيا ، إلا أن هناك نمطا ظاهريا لدقة انتقال الكروموسوم (ctf) أثناء النمو الخضري لمتحولات CTF19 19. يمكن أن يؤدي استخدام أليل فارغ أو أليل CTF19 الطافر إلى تكوين مجموعة من الخلايا غير المتجانسة الصيغة الصبغية التي قد لا تخضع للانقسام الميوزي بشكل صحيح. يؤدي استخدام تقنية المرساة ونظام التزامن NDT80 إلى التحايل على هذه المشكلة عن طريق استنفاد Ctf19 بدقة من النواة قبل الانقسام الاختزالي الأول أو الانقسام الاختزالي الثاني ، مما يقلل من القلق من أن الخلايا التي تم تحليلها كانت اختلال الصيغة الصبغية.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على التجربة. رسم كاريكاتوري لخلية الخميرة يظهر زوجا واحدا من الكروموسومات المتماثلة. تدخل الخلايا التي تحتوي على NDT80 في الانقسام الميوزي وتتوقف عند الطور الأول. بعد إضافة β-استراديول ، تدخل الخلايا في الانقسامات الاختزالية بشكل متزامن. تحدد إضافة الرابامايسين متى يتم تثبيت البروتين المستهدف (المميز بنجمة) بعيدا. في هذه التجربة ، تم تثبيت البروتين المستهدف Ctf19 بعيدا في ثلاث نقاط زمنية مختلفة عن طريق إضافة رابامايسين (RAP) في نفس الوقت مع الطور التمهيدي الأول (إضافة RAP عند t = 0 دقيقة) ، بعد إطلاق الطور الأولي (إضافة RAP عند t = 45 دقيقة) ، وبعد فصل كروموسوم الانقسام الاختزالي I (إضافة RAP عند t = 3 h). تشير الأسهم السوداء السميكة إلى مرحلة دورة الخلية لإضافة رابامايسين ، وبالتالي ، تستهدف استنفاد البروتين. الاختصارات: RAP = راباميسين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: إعداد الغرفة لتجارب التصوير بفاصل زمني. (أ) حجرة قابلة لإعادة الاستخدام (يمين) مقطوعة من ملحق حامل طرف ماصة (يسار). يتم قطع ملحق حامل طرف الماصة بشفرة حمراء ساخنة لإزالة جزء 4 مربع × 4 مربع من الملحق. تشير الخطوط المتقطعة إلى قسم عينة من حامل الطرف يمكن قصه لإنشاء غرفة. يتم قطع الفواصل البلاستيكية المتبقية داخل الفتحة 4 مربعة × 4 مربعة وتبقى غرفة مجوفة (يمين). (ب) لإنشاء الحجرة النهائية ، يضاف مانع التسرب السيليكوني إلى الحواف الموجودة على جانب واحد من الحجرة ، ثم يوضع فوق زلة الغطاء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: يؤثر الوقت الذي يتم فيه تثبيت Ctf19 بعيدا على فصل الكروماتين. (أ-و) صور الفاصل الزمني التمثيلية للخلايا التي تعبر عن Htb2-mCherry أثناء الانقسام الاختزالي. تم التقاط الصور كل 10 دقائق ، مباشرة بعد إضافة β-استراديول. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. تشير الأرقام الموجودة في الزاوية العلوية اليمنى من كل إطار إلى الوقت المنقضي بين كل إطار ، ويشير الوقت 0 إلى الإطار الذي ينفصل فيه الكروماتين في الانقسام الميوزي الأول. تم حساب الخلايا التي أكملت الانقسامات الاختزالية فقط. (أ) خلية من النوع البري (لا يوجد بروتين موسوم ب FRB) حيث تمت إضافة β-استراديول بعد 12 ساعة من نقل KAc. تحتوي الخلية على أربع كتل من الحمض النووي (DNA) بعد اكتمال الانقسام الميوزي الثاني. (ب) خلية Ctf19-FRB التي أضيف فيها رابامايسين عند t = 0 (بالتزامن مع إضافة β-استراديول). تظهر هذه الخلية ثلاث كتل من الحمض النووي (DNA) بعد الانقسام الميوزي الثاني. (C) خلية Ctf19-FRB التي أضيف فيها رابامايسين عند t = 0 (بالتزامن مع إضافة β-استراديول). تظهر هذه الخلية خمس كتل من الحمض النووي (DNA) بعد الانقسام الميوزي الثاني. (د) خلية Ctf19-FRB التي أضيف فيها رابامايسين عند t = 0 (بالتزامن مع إضافة β-استراديول). تموت هذه الخلية بعد إكمال الانقسام الميوزي الثاني. ه: خلية Ctf19-FRB التي أضيف فيها الرابامايسين بعد 45 دقيقة من إضافة β-استراديول. تظهر هذه الخلية خمس كتل من الحمض النووي (DNA) بعد الانقسام الميوزي الثاني. (F) خلية Ctf19-FRB التي أضيف فيها الرابامايسين بعد 45 دقيقة من إضافة β-استراديول. بعد الانقسام الميوزي الثاني، توجد ست كتل من الحمض النووي (DNA). (ز) التحديد الكمي لعدد كتل الحمض النووي في 100 خلية على الأقل لكل حالة (تم تحليل فيلمين لكل حالة). t = تحت كل شريط يشير إلى الوقت الذي تمت فيه إضافة رابامايسين بالنسبة إلى إضافة β-استراديول. الاختصارات: MII = الانقسام الاختزالي الثاني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يجمع هذا البروتوكول بين نظام NDT80-in لمزامنة الخلايا ، وتقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتينات من النواة ، والفحص المجهري الفاصل الزمني الفلوري لتصوير خلايا الخميرة الناشئة أثناء الانقسام الاختزالي. نظام NDT80-in هو طريقة لمزامنة دورة الخلية الاختزالية التي تستخدم الطور الأولي للقبض والإفراج 4,8. على الرغم من أن الخلايا المنفردة ستختلف قليلا في مقدار الوقت المستغرق في كل مرحلة من المراحل الاختزالية اللاحقة، فإن معظم الخلايا ستحافظ على درجة عالية من التزامن خلال الانقسامات الميوتيكية.

تقنية المرساة بعيدا هي أداة قابلة للتكيف للدراسات الانقسامية والاختزالية. عن طريق تغيير مرساة البروتين المستهدف بعيدا ووقت rapamycin بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة البروتينات المختلفة خلال أي مرحلة من مراحل الانقسام الاختزالي الخميرة الناشئة. الطرق الشائعة لصنع طفرات شرطية لدراسة انقسام الخميرة الناشئ ليست مناسبة دائما للدراسات الاختزالية. على سبيل المثال ، غالبا ما يتطلب استخدام محفز قابل للقمع تغييرا في مصدر الكربون لتغيير التعبير عن البروتين المستهدف ، مما قد يعطل الانقسام الاختزالي20. تعتمد الطفرات الحساسة لدرجة الحرارة على تغير في درجة الحرارة لتقليل أو إلغاء نشاط البروتين المستهدف. لا يمكن استخدام العديد من هذه الطفرات الشرطية في الدراسات الاختزالية لأن تغير ظروف المغذيات أو درجة الحرارة يمكن أن يعطل الانقسام الاختزالي21،22،23. علاوة على ذلك ، قد تحد عمليات الحذف أو الطفرات من دراسات الانقسام الاختزالي لأن التعبير عن بروتين متحور في وقت مبكر من الانقسام الاختزالي قد يمنع أو يؤثر سلبا على المراحل اللاحقة. يمكن لتقنية المرساة بعيدا التحايل على هذه التحديات لأنها لا تعتمد على التغيرات في التغذية أو درجة الحرارة8. علاوة على ذلك ، يمكن تنظيم استنفاد البروتين مؤقتا بحيث يحدد وقت إضافة rapamycin متى سيتم تثبيت البروتين بعيدا.

أحد قيود تقنية المرساة هو أنها قد لا تكون مناسبة للبروتينات غير النووية لأنها تعتمد على الوحدة الفرعية الريبوسومية Rpl13A كمرساة لنقل البروتين المستهدف خارج النواة. ومع ذلك ، هناك تطبيقات أخرى لتقنية المرساة بعيدا عن طريق تغيير تفاعلات البروتين والبروتين التي قد تكون مفيدة أيضا أثناء الانقسام الاختزالي ، مثل تثبيت البروتينات على المعقدات أو ربطها بالأغشية8. تظهر الدراسات السابقة أن النضوب النووي للبروتينات المستهدفة يحدث في غضون 30 دقيقة من إضافة رابامايسين 2,8. ومع ذلك ، فمن الممكن أن تحتاج بعض البروتينات إلى فترة أطول أو أقصر ليتم نقلها خارج النواة. لضمان نقل البروتين المستهدف خارج النواة ، يمكن تمييز البروتين المستهدف ب FRB المنصهر في GFP (FRB-GFP) لمراقبة طول الفترة الزمنية بين إضافة الرابامايسين والاستنفاد النووي. هناك قيد آخر لنظام المرساة بعيدا وهو أن بعض البروتينات حساسة لعلامات FRB و FRB-GFP في المحطة C. على هذا النحو ، فإن وضع علامات N-terminal للبروتين المستهدف باستخدام FRB هو استراتيجية بديلة لترسيخ البروتين المستهدف.

لمراقبة فصل الكروماتين ، عبرت خلايا الخميرة الناشئة عن Htb2-mCherry. في هذه السلالة ، يتم تمييز بروتين Htb2 في موضعه الداخلي ، مما يضمن التعبير عن Htb2 بشكل طبيعي. يمكن أيضا استخدام بروتينات أخرى موسومة بالفلورسنت لمراقبة الجوانب المختلفة للانقسام الميوزي. عند بناء سلالة للتصوير بفاصل زمني ، من المهم مراعاة أن بعض البروتينات حساسة لعلامات الفلورسنت الطرفية C. تضمن فحوصات النمو والأبواغ للسلالة التي تؤوي البروتين الموسوم بالفلورسنت أن العلامة لا تغير وظيفة البروتين. يتمثل أحد تحديات الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني في تعريض الخلايا لما يكفي من التألق بحيث يتم اكتشاف البروتينات الفلورية مع تجنب موت الخلايا أو إبطاء الانقسام الاختزالي من التعرض الزائد. تتمثل إحدى الخطوات المهمة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في العثور على إعدادات المجهر والكاميرا المناسبة لتحقيق هذا التوازن. سيختلف وقت التعرض المطلوب قليلا بين البروتينات ، لذلك يجب إجراء تكرارات متعددة للتجربة لتحديد وقت التعرض المناسب. عند استخدام طريقة الغرفة الموضحة هنا لتجارب التصوير بفاصل زمني ، فإن الخطوة الحساسة بشكل خاص هي تحقيق طبقة أحادية من الخلايا المراد تصويرها. بدون طبقة أحادية ، تتراكم الخلايا فوق بعضها البعض ، مما يمثل تحديا للتصوير المناسب وتحليل البيانات. يعد استخدام وسادة أجار ، التي تساعد الخلايا على الالتصاق ب ConA ونشر الخلايا حول الغرفة ، طريقة غير مكلفة وفعالة للحصول على طبقات أحادية. قد يكون تحريك وسادة الآجار لنشر الخلايا حول الغرفة بحيث يتم تحقيق طبقة أحادية أمرا صعبا. يمكن أن يساعد التأكد من أن وسادة الآجار تقوم بحركات صغيرة جدا أثناء عملية النقل في إنشاء طبقة أحادية. يسمح إنشاء غرفة قابلة لإعادة الاستخدام بتوليد بيانات تصوير الفاصل الزمني غير المكلفة. مع التنظيف والتطهير المناسبين ، يمكن إعادة استخدام الغرف البلاستيكية الموصوفة هنا إلى أجل غير مسمى. من أفضل الممارسات إزالة الغرف من الغطاء مباشرة بعد التصوير بفاصل زمني وتخزينها في 95٪ من الإيثانول حتى الاستخدام التالي.

يوفر التصوير بفاصل زمني معلومات حول دورة الخلية التي يمكن تفويتها من تصوير الخلايا الثابتة 1,2. على سبيل المثال ، عند مراقبة مدة المراحل الاختزالية ، يمكن فحص الاختلافات بين الخلايا المفردة بشكل أكثر دقة عند تصوير الخلايا الحية مقارنة بمجموعات الخلايا الثابتة. نظرا لأنه يمكن تمييز بروتينات الخميرة بسهولة ببروتينات الفلورسنت ، يمكن تكييف تصوير الفاصل الزمني الفلوري مع نظام NDT80-in وتقنية المرساة بعيدا لإجراء دراسات إضافية ، مثل مراقبة فصل الكروموسومات الفردية وتوقيت مراحل الانقسام الاختزالي المحددة. عند مراقبة تقدم دورة الخلية بعد إطلاق الطور الأول في خلايا NDT80 ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك بروتين موسوم بجزيء فلوري يحدد مراحل الانقسام الاختزالي. يمكن مراقبة الكروموسومات الفردية طوال الانقسام الاختزالي من خلال دمج تكرارات لاك أوبرون (LacO) بالقرب من سنترومير الكروموسوم في الخلايا التي تعبر عن LacI-GFP. يرتبط LacI-GFP بإحكام ب LacO ويتم تصوره على أنه تركيز ساطع ، والذي يمكن اتباعه في جميع أنحاء الأقسام الاختزالية بواسطة الفحص المجهري بفاصل زمني24,25. تم استخدام بروتينات مختلفة مع علامات الفلورسنت لمراقبة مدة المراحل الاختزالية. وتشمل هذه Tub1 ، الوحدة الفرعية α-tubulin التي تدمج في الأنابيب الدقيقة. Zip1 ، أحد مكونات مجمع المشابك ؛ و Spc42 ، مكون جسم عمود المغزل1،2،26،27.

في الختام ، تتضمن هذه الطريقة مزامنة دورة الخلية الاختزالية ، والنضوب الشرطي للبروتين المستهدف ، والفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني لدراسة فصل الكروموسوم الاختزالي. من خلال تصوير خلايا فطر الخميرة الناشئة أثناء الانقسام الميوزي واستخدام الطفرات الشرطية التي تؤثر فقط على المراحل المقصودة من الانقسام الميوزي، يمكن أن توفر هذه الطريقة بيانات دقيقة عن دورة الخلية الميوتيكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر مركز التصوير المجهري الضوئي في جامعة إنديانا. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (GM105755).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-estradiol Millipore Sigma E8875 Make 1mM stocks in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter Millipore Sigma S2GPT02RE
100% EtOH Fisher Scientific 22-032-601
10X PBS Fisher Scientific BP399500 Dilute 1:10 to use as solvent for ConA
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 VWR North American 48393241
25 mm x 75 mm microscope slides VWR North American 48300-026
Adenine hemisulfate salt Millipore Sigma A9126 To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Bacto Agar BD 214030
Concanavialin A Mllipore Sigma C2010 Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera Photometrics Used in Section 4.3
D-glucose Fisher Scientific D16-10
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids BD 291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma D5879
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope Nikon Used in Section 4.4
Fiji NIH Download from https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope Applied Precision Used in Section 4.3
L-Tryptophan  Millipore Sigma T0254 To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Modeling Clay Crayola  2302880000 To secure coverslip in slide holder
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software Nikon Used in Section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera Hamamatsu C15440-20UP Used in Section 4.4
Plastic pipette tip holder Dot Scientific LTS1000-HR Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. 
Pottassium Acetate Fisher Scientific BP264
Rapamycin Fisher Scientific BP29631 Make 1mg/mL stocks in DMSO
Silicone Sealant Aqueon 100165001 Also known as aquarium glue.
SoftWorx7.0.0  Imaging Software Applied Precision Used in Section 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser)  Formedium DSCK2500
Type N immersion oil  Nikon MXA22166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
  2. Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
  3. van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
  4. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  5. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  6. Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
  7. Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
  8. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  9. Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
  10. Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
  11. Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
  12. Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
  13. Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
  14. Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
  15. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
  16. Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
  17. Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
  18. Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
  19. Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
  20. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  21. Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
  22. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
  23. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  24. Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
  25. Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
  26. Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
  27. Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).

Tags

علم الأحياء، العدد 188،
استخدام الفحص المجهري بفاصل زمني والاستنفاد النووي للبروتينات في مرحلة محددة لدراسة الانقسام الاختزالي في <em>S. cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cairo, G., MacKenzie, A., Tsuchiya,… More

Cairo, G., MacKenzie, A., Tsuchiya, D., Lacefield, S. Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64580, doi:10.3791/64580 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter