Summary
Time-lapse mikroskopi är ett värdefullt verktyg för att studera meios i spirande jäst. Detta protokoll beskriver en metod som kombinerar cellcykelsynkronisering, time-lapse-mikroskopi och villkorlig utarmning av ett målprotein för att visa hur man studerar funktionen hos ett specifikt protein under meiotisk kromosomsegregering.
Abstract
Time-lapse fluorescensmikroskopi har revolutionerat förståelsen av meiotiska cellcykelhändelser genom att tillhandahålla tidsmässiga och rumsliga data som ofta inte ses genom avbildning av fasta celler. Spirande jäst har visat sig vara en viktig modellorganism för att studera meiotisk kromosomsegregering eftersom många meiotiska gener är mycket bevarade. Time-lapse-mikroskopi av meios i spirande jäst gör det möjligt att övervaka olika meiotiska mutanter för att visa hur mutationen stör meiotiska processer. Men många proteiner fungerar på flera punkter i meios. Användningen av funktionsförlust eller meiotiska nollmutanter kan därför störa en tidig process, blockera eller störa den senare processen och göra det svårt att bestämma de fenotyper som är associerade med varje enskild roll. För att kringgå denna utmaning beskriver detta protokoll hur proteinerna kan utarmas villkorligt från kärnan i specifika stadier av meios medan man övervakar meiotiska händelser med hjälp av time-lapse-mikroskopi. Specifikt beskriver detta protokoll hur cellerna synkroniseras i profas I, hur ankartekniken används för att tömma proteiner från kärnan i specifika meiotiska stadier och hur time-lapse-avbildning används för att övervaka meiotisk kromosomsegregering. Som ett exempel på användbarheten av tekniken utarmades kinetokoreproteinet Ctf19 från kärnan vid olika tidpunkter under meios, och antalet kromatinmassor analyserades i slutet av meios II. Sammantaget kan detta protokoll anpassas för att tömma olika kärnproteiner från kärnan samtidigt som de meiotiska uppdelningarna övervakas.
Introduction
Time-lapse fluorescensmikroskopi är ett värdefullt verktyg för att studera dynamiken i meiotisk kromosomsegregering i spirande jäst 1,2. Spirande jästceller kan induceras att genomgå meios genom svält av viktiga näringsämnen3. Under meios genomgår celler en omgång kromosomsegregering följt av två divisioner för att skapa fyra meiotiska produkter som förpackas i sporer (figur 1). Enskilda celler kan visualiseras under varje steg av meios, vilket genererar rumsliga och tidsmässiga data som lätt kan missas genom avbildning med fasta celler. Detta protokoll visar hur kombinationen av time-lapse fluorescensmikroskopi med två tidigare etablerade metoder, det inducerbara NDT80-systemet (NDT80-in) och anchor away-tekniken, kan användas för att studera funktionen hos specifika proteiner i distinkta meiotiska stadier.
NDT80-in-systemet är ett kraftfullt verktyg för meiotisk cellcykelsynkronisering som förlitar sig på det inducerbara uttrycket av den mellersta meiostranskriptionsfaktorn NDT80 4,5. NDT80-uttryck krävs för profas I-utgång 6,7. Med NDT80-in-systemet är NDT80 under kontroll av GAL1-10-promotorn i celler som uttrycker Gal4-transkriptionsfaktorn smält till en östrogenreceptor (Gal4-ER)4,5. Eftersom Gal4-ER endast kommer in i kärnan när den är bunden till β-östradiol, arresteras NDT80-in-celler i profas I i frånvaro av β-östradiol, vilket möjliggör synkronisering av celler i profas I (Figur 1). β-östradioladdition främjar translokationen av Gal4-ER-transkriptionsfaktorn till kärnan, där den binder GAL1-10 för att driva uttryck av NDT80, vilket leder till synkron inträde i de meiotiska divisionerna. Även om time-lapse-mikroskopi kan utföras utan synkronisering, är fördelen med att använda synkronisering möjligheten att lägga till en hämmare eller ett läkemedel medan celler befinner sig i ett specifikt stadium av meios.
Ankartekniken är ett inducerbart system genom vilket ett protein kan tömmas från kärnan med tillsats av rapamycin8. Denna teknik är idealisk för att studera kärnproteiner under celldelning i spirande jäst eftersom jästceller genomgår sluten mitos och meios, där kärnhöljet inte bryts ner. Dessutom är denna teknik mycket användbar för proteiner som har flera funktioner under meios. Till skillnad från för deletioner, mutanta alleler eller meiotiska nollalleler äventyrar avlägsnandet av ett målprotein från kärnan i ett specifikt skede inte målproteinaktiviteten i tidigare skeden, vilket möjliggör en mer exakt tolkning av resultaten. Ankaret bort systemet använder shuttling av ribosomala subenheter mellan kärnan och cytoplasman som uppstår vid ribosomal mognad8. För att tömma målproteinet från kärnan märks målproteinet med FKBP12-rapamycinbindande domän (FRB) i en stam där den ribosomala underenheten Rpl13A är märkt med FKBP12. Utan rapamycin interagerar inte FRB och FKBP12, och det FRB-märkta proteinet förblir i kärnan. Vid rapamycintillsats bildar rapamycinet ett stabilt komplex med FKBP12 och FRB, och komplexet skjutsas ut ur kärnan på grund av interaktionen med Rpl13A (Figur 1). För att förhindra celldöd vid rapamycintillsats har cellerna tor1-1-mutationen av TOR1-genen . Dessutom innehåller dessa celler fpr1Δ , en nollallel av S. cerevisiae FKBP12-proteinet, vilket förhindrar att endogen Fpr1 konkurrerar ut Rpl13A-FKBP12 för FRB- och rapamycinbindning. Ankaret bort bakgrundsmutationer, tor1-1 och fpr1Δ, påverkar inte meiotiska tidpunkter eller kromosomsegregering2.
För att demonstrera användbarheten av denna teknik utarmades kinetokoreproteinet Ctf19 vid olika tidpunkter under meios. Ctf19 är en komponent i kinetokor som är dispenserbar vid mitos men krävs för korrekt kromosomsegregering vid meios 9,10,11,12,13. Vid meios kastas kinetokoren i profas I, och Ctf19 är viktigt för kinetokore-återmontering 9,14. För detta protokoll synkroniserades celler med NDT80-in-systemet, och ankartekniken användes för att tömma målproteinet Ctf19 från kärnan före och efter frisättningen från profas I och efter meios I-kromosomsegregering (figur 1). Detta protokoll kan anpassas för att tömma andra proteiner av intresse vid varje stadium av meios och mitos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av nödvändiga material
- Förbered reagenser för tillväxt och sporulering av jästceller.
OBS: Om spirande jäststammar är ade2 - och trp1-, komplettera alla medier i steg 1.1.1-1.1.3 med en slutlig koncentration av 0,01% adenin och 0,01% tryptofan från 1% lager. Om du steriliserar media med autoklav, tillsätt dessa aminosyror först efter att reagenserna har autoklaverats och fått svalna till rumstemperatur.- För vegetativ tillväxt, förbered 2x syntetiskt komplett + dextrosmedium (2XSC) genom att lösa 6,7 g jästkvävebas utan aminosyror, 2 g komplett aminosyrablandning och 20 g dextros i 500 ml vatten. Sterilisera blandningen genom autoklavering i 20 min vid 121 °C eller filtrering genom ett 0,2 μm filter.
- För det första steget av sporulering, förbered 2x syntetiskt komplett + acetatmedium (2XSCA) genom att lösa 6,7 g jästkvävebas utan aminosyror, 2 g fullständig aminosyrablandning och 20 g kaliumacetat i 500 ml vatten. Sterilisera blandningen genom autoklavering i 20 min vid 121 °C eller filtrering genom ett 0,2 μm filter.
- För det sista steget av sporulering, förbered 1% kaliumacetat (1% KAc) genom att lösa 5 g KAc i 500 ml vatten. Sterilisera blandningen genom autoklavering i 20 min vid 121 °C eller filtrering genom ett 0,2 μm filter.
- Förbered läkemedel och reagenser för mikroskopi, synkronisering och förankra bort.
- För vidhäftande celler till täckglaset under time-lapse-avbildning, gör 1 mg / ml concanavalin A (ConA) i 1x PBS. Filtrera sterilisera med ett 0,2 μm filter och förvara små (~10 μl) alikvoter vid -20 °C.
- För att använda NDT80-in-systemet, gör 2 ml 1 mM β-östradiol upplöst i etanol. Filtrera sterilisera med ett 0,2 μm filter och förvara alikvoter (~500 μL) vid -20 °C.
- För ankarbortfallssystemet, gör 1 mg / ml rapamycin upplöst i DMSO. Filtrera sterilisera med ett 0,2 μm filter och förvara små (~10 μl) alikvoter vid -20 °C.
OBS: Förbered små alikvoter av rapamycin för att undvika flera frys-tina cykler av läkemedlet.
- Generera jäststammar som innehåller NDT80-in-systemet (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) och ett målprotein märkt med FRB i ankaret bort genetisk bakgrund (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Ctf19-FRB användes för denna studie. Dessutom märktes en kopia av histonproteinet Htb2 med mCherry för att möjliggöra övervakning av meiotisk progression och kromatinsegregering.
- Förbered en kammare för time-lapse-avbildning
- Börja förbereda kammaren 6 h-24 h före avbildning (figur 2). Skär en 18 mm x 18 mm kammare från pipettspetsboxinsatsen med en uppvärmd skalpell eller annat vasst blad.
- Använd en plastpipettspets för att sprida ett tunt lager silikontätningsmedel runt kammarens nedre kanter som kommer att fästa vid täckglaset. Lägg till tillräckligt med tätningsmedel så att kammarens kanter är helt täckta (se figur 2).
- Fäst kammaren på en 24 mm x 50 mm täckskiva genom att försiktigt placera kammaren, tätningsmedel-sidan-nedåt, på täckglaset. Se till att det inte finns några luckor i tätningsmedlet så att kammaren inte läcker.
- Sprid 8-10 μL ConA på täckglaset. Fördela ConA på mitten av täckglaset och använd en pipettspets för att sprida ConA i ett tunt lager så att det täcker det mesta av täckglaset som omges av kammaren.
OBS: Plastkammare kan återanvändas på obestämd tid. När time-lapse-avbildningen är klar, ta bort kammaren från täckglaset med en rakhyvel, rengör silikontätningen från kammaren och håll kamrarna nedsänkta i 95% etanol för framtida bruk.
2. Sporulering av jästceller
- Utför följande steg för svält av jästceller för att inducera det meiotiska programmet.
OBS: Dessa steg är för sporulering av W303-stammen av jäst. Andra stammar kan kräva andra protokoll15. Sporuleringseffektiviteten är mycket varierande mellan laboratoriestammar, med W303 som uppvisar en sporuleringseffektivitet på ~ 60% 16,17,18.- Ta en enda koloni av lämplig diploid jäststam från en platta och inokulera 2 ml 2XSC och låt växa vid 30 ° C på en rulltrumma i 12-24 timmar till mättnad.
- Späd den mättade kulturen till 2XSCA genom att tillsätta 80 μL av kulturen från steg 2.1.1 till 2 ml 2XSCA. Låt den växa vid 30 °C på en rulltrumma i 12-16 timmar. Lämna inte i 2XSCA längre än 16 timmar eftersom celler kan bli sjuka eller autofluorescerande.
- Utför två tvättar genom att snurra ner kulturen vid 800 x g vid rumstemperatur (25 °C) i 1 min, kasta vätskan och återsuspendera pelleten i 2 ml sterilt destillerat vatten.
- Efter den andra tvätten, ta bort vätskan och återsuspendera pelleten i 2 ml 1% KAc och låt den växa vid 25 ° C på en rulltrumma i 8-12 timmar. Celler som har gått in i meios kommer att arrestera i pachyten av profas I.
- Profas I-frigöringssystem
- Tillsätt β-östradiol direkt till sporuleringskulturen till en slutlig koncentration av 1 μM och virvla odlingsröret snabbt. Den β-östradiol kommer att frigöra celler från profas I.
3. Utarmning av målprotein från kärnan med hjälp av ankarbort-tekniken
- Tillsätt rapamycin till cellerna för att tömma det FRB-märkta proteinet från kärnan i ett visst skede.
- För att tömma proteiner från kärnan vid profas I-utgång, tillsätt rapamycin till en slutlig koncentration av 1 μg / ml till sporuleringsodlingsröret samtidigt som β-östradioltillsats.
- För att tömma proteiner från kärnan vid ett visst stadium av meios, övervaka cellcykelsteget som börjar vid 60 minuter efter tillsats av β-östradiol. Var 20:e minut, pipettera 5 μL kultur på en 24 mm x 40 mm täckglas och täck cellerna med en 18 mm x 18 mm täckslip. Håll kulturerna snurrande på rulltrumman vid 25 °C mellan tidpunkterna.
- Avbilda cellerna med A594 / mCherry-filtret och 60x-målet för ett fluorescensmikroskop. Ställ in procenttransmittansen på 2% och exponeringstiden på 250 ms. Närvaron av en, två eller fyra DNA-massor kommer att indikera det meiotiska stadiet där cellerna har utvecklats. Tillsätt rapamycin till en slutlig koncentration på 1 μg/ml i det meiotiska stadiet av intresse.
- Låt cellerna snurra på rulltrumman vid 25 °C tills de är redo för avbildning. Nukleär utarmning av ett målprotein sker 30-45 min efter rapamycintillsats 2,8.
4. Time-lapse fluorescensmikroskopi
- Gör en agarplatta som ska användas för att skapa ett monolager av celler för avbildning (se steg 4.2).
- Klipp av och kassera locket och botten 1/3 av ett 1,5 ml mikrofugerör för att skapa en cylinder. Cylindern kommer att fungera som en form för agardynan. Gör två cylindrar för att få en extra om agar inte polymeriseras ordentligt i den första.
- Placera den skurna mikrofugerörcylindern på en ren glasskiva med toppen av röret upp och ner sittande på bilden.
- Gör 6 ml av en 5% agarlösning (använd 1% KAc som lösningsmedel) i en 50 ml bägare och mikrovågsugn tills agarn är helt upplöst.
OBS: Agar kommer lätt att koka över i mikrovågsugnen; Titta på agar och starta och stoppa mikrovågsugnen när agar börjar koka och virvla bägaren. Starta och stoppa mikrovågsugnen flera gånger för att helt lösa upp agar. Agarlösningen görs utöver den mängd som behövs för att säkerställa att agaren löser sig helt. - Skär av pipettens spets för att göra en större öppning och pipett ~ 500 μL smält agar i varje mikrofugerörcylinder. Låt den sitta i rumstemperatur tills agarn stelnat (~10-12 min).
- Beredning av jästceller för avbildning
- Snurra ner 200 μl av sporuleringskulturen från steg 3.2 vid 800 x g i 2 min i 1 ml mikrocentrifugrör. Ta bort och kassera 180 μL av supernatanten. Återsuspendera pelleten i den återstående supernatanten genom att virvla och snärta röret.
- Pipett 6 μl av de koncentrerade cellerna på täckglaset i mitten av kammaren i steg 1.4.
- Håll cylindern med agardynan i steg 4.1 och skjut försiktigt av glasskivan. Se till att agaren är helt platt i botten och använd botten av en pipettspets, applicera en liten mängd tryck på mikrofugeformen så att agardynan skjuts ut något ovanför rörets gräns.
- Vänd formen så att agardynan är vänd nedåt mot kammaren.
- Använd pincett och placera försiktigt agardynan (fortfarande i mikrofugerörformen) ovanpå cellerna. Använd en pipettspets för att försiktigt skjuta agardynan runt kammaren 10-20 gånger för att skapa ett monolager av celler på täckglaset.
- Lämna agardynan i kammaren i 12-15 min. Detta steg gör att cellerna kan fästa vid ConA på täckglaset.
- Överför 2 ml sporuleringskultur från steg 3.2 till två mikrocentrifugrör och snurra vid 15 700 x g i 2 minuter. Överför supernatanten till rena mikrofugerör och snurra igen vid 15 700 x g i 2 minuter. Överför supernatanten till rena mikrocentrifugrör som ska användas i nästa steg.
OBS: Det är viktigt att använda den förkonditionerade KAc-supernatanten med β-östradiol och rapamycin för att säkerställa effektiv sporulering och fortsatt utarmning av proteinet av intresse. - Efter att agardynan har suttit i kammaren i 12-15 min, flyt och ta bort agardynan innan du bildar. För att göra det, lägg till 2 ml av supernatanten från steg 4.2.7 droppvis till kammaren. När vätskan har nått toppen av kammaren kommer agardynan sannolikt att flyta.
OBS: Om agardynan inte flyter automatiskt, vänta 1-2 min. Om agardynan fortfarande inte flyter, ta bort den försiktigt med pincett. Helst skulle agarplattan flyta på egen hand eftersom avlägsnande av den före flytande kan leda till att cellerna tas bort. - När agarplattan har flytit, ta bort den försiktigt med pincett och kassera den. Placera en 24 mm x 50 mm täckglas på toppen av kammaren för att förhindra avdunstning under avbildning.
- Ställa in en film på mikroskopet
OBS: Instruktionerna nedan är för ett inverterat mikroskop utrustat med en diabildhållare som rymmer 24 mm x 50 mm täckglas (se materialtabell för mikroskop, kamera och programvarudetaljer). Ett 60x oljefördjupningsmål används för bildförvärv. Detta protokoll kan behöva ändras när du använder andra mikroskop eller andra diabildhållare. De exakta stegen för att utföra steg 4.3.2 till steg 4.3.16 varierar beroende på vilket mikroskop och bildbehandlingsprogram som används. Se avsnitt 4.4 för instruktioner för ett annat mikroskop.- Montera täckglaset inuti glidhållaren. Fäst gjutleran på sidan av täckglaset för att hålla den fast i glidhållaren.
- Öppna programvaran för bildförvärv. Använd kurs- och finjusteringsknappar för att fokusera cellerna med DIC eller ljusfält.
- På huvudmenyn i bildförvärvsprogramvaran klickar du på File > Acquire (Resolve 3D). Tre fönster dyker upp.
- I fönstret som heter Resolve 3D, klicka på Erlenmeyer Flask-ikonen . Då öppnas ett fönster med titeln Design/Run Experiment, som innehåller kontrollerna för att konfigurera ett experiment för att konfigurera en time-lapse-film.
- Under fliken Design navigerar du till fliken Avsnitt. Markera rutan bredvid Z-avsnitt. Ställ in z-staplarna enligt följande: Optiskt sektionsavstånd = 1 μm, Antal optiska sektioner = 5, Provtjocklek = 5,0 μm.
- Under fliken Kanaler klickar du på + -ikonen så att ett kanalalternativ visas. Välj lämplig kanal. För detta experiment väljer vi A594, som används för att avbilda mCherry. Markera rutan bredvid Referensbild och ställ in Z-positionen till mitten av exemplet från rullgardinsmenyn.
- Välj ett värde i listrutan intill %T och Exp. för att ställa in procentuell transmittans respektive exponeringstid. För detta experiment används 2% transmittans och 250 ms exponeringstid i A594-kanalen, och 10% transmittans och 500 ms exponeringstid används för ljusfält.
OBS: Exponeringstiden och procenttransmittansen varierar med olika mikroskop. För att undvika överexponering, använd den lägsta procenttransmittansen och kortast möjliga exponeringstid som möjliggör korrekt visualisering av proteinet av intresse. - Under fliken Time-lapse markerar du rutan bredvid Time-lapse. I tabellen som visas anger du 10 under kolumnen min i tidsfördröjningsraden och 10 under kolumnen timmar i raden för total tid. Detta kommer att köra en tidskurs som tar bilder var 10: e minut i 10 timmar.
- Markera rutan bredvid Behåll fokus med ultimat fokus för att förhindra scenavdrift under filmen. Under fliken Punkter markerar du rutan bredvid Besök punktlista.
- I huvudmenyn klickar du på Visa > punktlista. Ett fönster som heter punktlista dyker upp. Flytta scenen till ett område i kammaren som visar ett monolager av celler. Klicka på Punktmarkering i punktlistefönstret.
- Flytta scenen för att markera 25–30 punkter utan överlappning för att undvika att cellerna exponeras för mycket. Varje fält kommer att avbildas under varje tidskurs.
- I punktlistfönstret väljer du Kalibrera alla för att ställa in ultimat fokus för varje punkt. Under fliken Design i fönstret Desgin/Kör experiment anger du intervallet med punktvärden (erhållna från punktlistefönstret) i rutan bredvid Besök punktlista. Under fliken Kör sparar du filen till lämplig destination på datorn. I fönstret Design/Kör experiment väljer du knappen Spela upp (grön triangelikon) för att starta filmen.
- Valfri metod: Ställa in en film i mikroskop
OBS: Dessa instruktioner är för ett inverterat mikroskop utrustat med en glidhållare som rymmer en 24 mm x 50 mm täckglas. Se Materialförteckning för specifikationer om mikroskopet, kameran och bildbehandlingsprogrammet som används. Ett 60x oljefördjupningsmål används för bildförvärv.- Montera täckglaset inuti glidhållaren. Öppna programvaran för bildförvärv. Använd kurs- och finjusteringsknappar för att fokusera celler med DIC eller ljusfält. Högerklicka i det öppna fönstret i programvaran. En rullgardinsmeny visas.
- Klicka på Förvärvskontroller > förvärv. Klicka på Application > Define/Run Experiment. Detta öppnar ett fönster märkt ND Acquisition.
- I fönstret som öppnas markerar du rutan bredvid XY. Flytta scenen till önskad plats och klicka på rutan under Punktnamn för att välja den platsen som en punkt. Upprepa detta tills 25-30 punkter är markerade utan överlappning för att undvika överexponering av cellerna. Varje fält kommer att avbildas under varje tidskurs.
- Ställ in procenttransmittans för varje fluorescerande kanal. Eftersom stammarna producerar Htb2-mCherry används mCherry-filtret här. Under fönstret Förvärv som öppnades i steg 4.3.3 navigerar du till knappen 555 nm. Ställ in procenttransmittansen på 5% genom att justera glidskalan under 555 nm-knappen tills den läser 5%.
- Ställ in exponeringstiden för varje fluorescerande kanal. Under fönstret Förvärv väljer du 200 ms i listrutan Exponering.
OBS: Exponeringstiden och procenttransmittansen varierar med olika mikroskop. För att undvika överexponering, använd den lägsta procenttransmittansen och kortast möjliga exponeringstid som möjliggör korrekt visualisering av proteinet av intresse. - Klicka på rutan bredvid Z i fönstret ND Acquisition . Ställ in fem z-stackar av jästcellerna som är 1,2 μM från varandra.
- Klicka på rutan bredvid λ. Välj lämpliga kanaler som ska användas för experimentet. För DIC, se till att Hem är valt från rullgardinsmenyn under Z pos. För mCherry, se till att Alla är valt från rullgardinsmenyn under Z pos. Detta säkerställer att endast en enda sektion (i mitten av z-stacken) tas för DIC.
- Markera rutan bredvid Tid i fönstret ND-förvärv . Markera rutan under Fas. I rullgardinsmenyn under Intervall väljer du 10 min. Under Varaktighet väljer du 10 timmar. Detta kommer att köras så att bilder tas var 10: e minut i 10 timmar.
5. Analys av kromatinsegregering
- Öppna Fiji-programvaran. Öppna ett synfält i taget: för varje fält öppnar du DIC- och mCherry-kanalerna.
- Ta projektionen med maximal intensitet för mCherry-kanalen för att få en enda bild: klicka på Bild > staplar > Z-projekt, välj Max intensitet i rullgardinsmenyn.
- Slå samman DIC- och mCherry-kanalerna i en bild: klicka på Bild > färg > Slå samman kanaler.
- Följ en enda cell genom meios. Efter avslutad meios II, registrera antalet DNA-massor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att övervaka kromatinsegregeringen märktes histonproteinet Htb2 med mCherry. I profas I framträder kromatinet som en enda Htb2-massa. Efter att homologa kromosomer segregerar i den första meiotiska uppdelningen framträder kromatinet som två distinkta massor (figur 3A). Efter att systerkromatiderna segregerar uppträder kromatinet som fyra massor. Om vissa kromosomer inte fäster vid spindelmikrotubuli kan ytterligare massor ses efter meios I eller meios II.
Metoden som beskrivs ovan användes för att studera kinetokorekomponenten Ctf19 roll för att säkerställa korrekt kromosomsegregering i spirande jästmeios. Ankare bort jäststammar som uttrycker Ctf19 märkta med FRB synkroniserades i profas I med hjälp av NDT80-in-systemet (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 främjade NDT80; GAL4-ER). Som kontroll användes en NDT80-in-stam med ankaret bort stambakgrund men utan det FRB-märkta proteinet (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10 främjade NDT80; GAL4-ER). Celler frigjordes från profas I-arresteringen genom tillsats av β-östradiol. Rapamycin tillsattes för att tömma Ctf19-FRB från kärnan antingen vid frisättning (före kinetokore-återmontering), 45 minuter efter frisättning (efter kinetokore-återmontering men före meios I) eller 3 timmar efter frisättning (strax före meios II) (figur 3A-F). Efter tillsats av rapamycin utfördes fluorescensmikroskopi med tidsfördröjning och bilder förvärvades var 10: e minut under den återstående varaktigheten av meios.
Efter avbildning användes den öppna programvaran Fiji för att öppna bilderna och utföra analyser för figurer som visar tidsprogression (figur 3A-F). Antalet DNA-massor efter meios II räknades i minst 100 celler som genomgick meios per tillstånd. I vildtypsceller med ankaret borta bakgrund finns det vanligtvis fyra DNA-massor i slutet av meios II, som representerar de fyra produkterna av meios (figur 3A). I en liten del av cellerna är endast tre massor synliga efter meios II (figur 3B,G). Det är emellertid troligt att tre massor är resultatet av en cell som har fyra produkter av meios men två av dessa massor uppträder tillsammans efter meios II.
När Ctf19-FRB förankras bort vid tidpunkten för frisättning av profas I-utgång (t = 0 h), visar cirka 47% av cellerna mer än fyra DNA-massor vid slutförandet av meios, vilket tyder på en defekt i bindningen av kinetokorer och mikrotubuli (figur 3C, G). Med förankring bort av Ctf19-FRB antingen efter kinetokoremontering men före meios I (t = 45 min) eller före meios II (t = 3 h) visar cirka 16% av cellerna ytterligare DNA-massor. Dessa resultat stöder hypotesen att Ctf19 är viktigt för kinetokore-återmontering vid profas I-frisättning men är mindre viktigt vid kromosomsegregering när kinetokoren har återmonterats.
Resultaten som erhållits här visar att time-lapse-mikroskopi i kombination med cellcykelsynkronisering och villkorlig utarmning av ett målprotein möjliggör studier av ett protein i ett specifikt meiotiskt stadium. Även om Ctf19 inte är nödvändigt för mitos, är den meiotiska kinetokoren omfattande omorganiserad, och Ctf19 har en avgörande roll i kinetokore-återmontering efter profas I-utgång 9,11,12. Resultaten i figur 3 visar att när Ctf19 är utarmat före kinetochore-återmontering, visar en stor del av cellerna ytterligare DNA-massor efter meios II. När Ctf19 tappas från kärnan efter kinetokoremontering men före antingen meios I eller meios II, finns det färre celler som visar ytterligare DNA-massor. Dessa resultat tyder på att den viktigaste rollen för Ctf19 är i slutet av profas I. Denna skillnad i kromosomsegregeringstrohet med utarmning av Ctf19 i olika steg belyser vikten av att använda stegspecifika villkorliga alleler för att studera proteinernas funktion specifikt i meios I eller meios II. En meiotisk nollmutant skulle ha visat en allvarlig defekt och skulle inte ha gett information om rollen för Ctf19 i varje steg.
Dessutom, även om CTF19 inte är en väsentlig gen, finns det en kromosomöverföringstrohet (ctf) fenotyp under vegetativ tillväxt av CTF19-mutanter 19. Användning av en nollallel eller mutant CTF19-allel kan skapa en population av aneuploida celler som kanske inte genomgår meios ordentligt. Användning av ankarbortfallstekniken och NDT80-in-synkroniseringssystemet kringgår detta problem genom att exakt tömma Ctf19 från kärnan strax före meios I eller meios II, vilket minskar oron för att de analyserade cellerna var aneuploida.
Bild 1: Översikt över experimentet. Tecknad film av jästcell som visar ett enda par homologa kromosomer. NDT80-in-celler går in i meios och arresterar vid profas I. Efter tillsats av β-östradiol kommer celler in i de meiotiska uppdelningarna synkront. Tillsats av rapamycin avgör när målproteinet (markerat med en stjärna) förankras bort. I detta experiment förankrades målproteinet Ctf19 bort vid tre olika tidpunkter genom att tillsätta rapamycin (RAP) samtidigt som profas I (RAP-tillsats vid t = 0 min), efter profas I-frisättning (RAP-addition vid t = 45 min) och efter meios I kromosomsegregering (RAP-addition vid t = 3 h). De tjocka svarta pilarna indikerar cellcykelstadiet av rapamycintillsats och därmed målproteinutarmning. Förkortningar: RAP = rapamycin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kammarinställning för time-lapse-avbildningsexperiment. (A) Återanvändbar kammare (höger) skuren från en pipettspetshållare (vänster). Pipettspetshållarinsatsen skärs med ett glödhett blad för att ta bort en 4 kvadrat x 4 kvadratisk del av insatsen. De streckade linjerna indikerar en provdel av spetshållaren som kan skäras för att skapa en kammare. De återstående plastavdelarna inom 4 kvadrat x 4 kvadratutskärningen trimmas bort och en ihålig kammare kvarstår (höger). (B) För att skapa den slutliga kammaren läggs silikontätningsmedel till kanterna på ena sidan av kammaren och placeras sedan ovanpå en täckglidning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tid då Ctf19 förankras bort påverkar kromatinsegregeringen. (A-F) Representativa tidsfördröjningsbilder av celler som uttrycker Htb2-mCherry under meios. Bilder togs var 10: e minut, omedelbart efter tillsats av β-östradiol. Skalstreck= 5 μm. Siffror i det övre högra hörnet av varje bildruta anger den tid som har förflutit mellan varje bildruta och tiden 0 anger den ram där kromatin separerar i meios I. Endast celler som slutförde de meiotiska uppdelningarna räknades. (A) Vildtypscell (inget protein märkt med FRB) i vilken β-östradiol tillsattes 12 timmar efter kac-överföring. Cell innehåller fyra DNA-massor efter avslutad meios II. (B) Ctf19-FRB-cell i vilken rapamycin tillsattes vid t = 0 (samtidigt med β-östradioltillsats). Denna cell visar tre DNA-massor efter meios II. (C) Ctf19-FRB-cell i vilken rapamycin tillsattes vid t = 0 (samtidigt med β-östradioltillsats). Denna cell visar fem DNA-massor efter meios II. (D) Ctf19-FRB-cell i vilken rapamycin tillsattes vid t = 0 (samtidigt med β-östradioltillsats). Denna cell dör efter avslutad meios II. (E) Ctf19-FRB-cell i vilken rapamycin tillsattes 45 minuter efter tillsats av β-östradiol. Denna cell visar fem DNA-massor efter meios II. (F) Ctf19-FRB-cell i vilken rapamycin tillsattes 45 minuter efter tillsats av β-östradiol. Efter meios II är sex DNA-massor närvarande. (G) Kvantifiering av antalet DNA-massor i minst 100 celler för varje tillstånd (två filmer analyserade för varje tillstånd). t = under varje stapel anges den tidpunkt då rapamycin tillsattes i förhållande till β-östradioltillsats. Förkortningar: MII = meios II. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll kombinerar NDT80-in-systemet för att synkronisera celler, ankartekniken för att tömma proteiner från kärnan och fluorescenstidsfördröjningsmikroskopi för att avbilda spirande jästceller under meios. NDT80-in-systemet är en metod för meiotisk cellcykelsynkronisering som använder en profas I-arrestering och frisättning 4,8. Även om enskilda celler kommer att variera något i hur mycket tid som spenderas i vart och ett av de efterföljande meiotiska stadierna, kommer de flesta celler att upprätthålla en hög grad av synkronisering genom de meiotiska divisionerna.
Ankartekniken är ett anpassningsbart verktyg för mitotiska och meiotiska studier. Genom att ändra ankaret bort målproteinet och tiden för rapamycintillsats kan denna metod anpassas för att studera olika proteiner under alla stadier av spirande jästmeios. Vanliga metoder för att göra villkorliga mutanter för att studera spirande jästmitos är inte alltid lämpliga för meiotiska studier. Till exempel kräver användning av en undertryckbar promotor ofta en förändring av kolkällan för att ändra uttrycket av målproteinet, vilket kan störa meios20. Temperaturkänsliga mutanter förlitar sig på en temperaturförändring för att minska eller avskaffa målproteinets aktivitet. Många av dessa villkorliga mutanter kan inte användas i meiotiska studier eftersom skiftande näringsförhållanden eller temperatur kan störa meios21,22,23. Dessutom kan deletioner eller mutanter begränsa studier av meios eftersom uttryck för ett mutantprotein tidigt i meios kan blockera eller negativt påverka senare stadier. Ankartekniken kan kringgå dessa utmaningar eftersom den inte är beroende av förändringar i näring eller temperatur8. Dessutom kan utarmningen av proteinet regleras tidsmässigt så att tiden för rapamycintillsats avgör när proteinet kommer att förankras bort.
En begränsning med ankarbortfallstekniken är att den kanske inte är lämplig för icke-nukleära proteiner eftersom den förlitar sig på Rpl13A ribosomala underenhet som ett ankare för att transportera målproteinet ut ur kärnan. Det finns emellertid andra tillämpningar av ankarbortfallstekniken genom att ändra protein-proteininteraktionerna som också kan vara användbara under meios, såsom att förankra proteiner till komplex eller binda dem till membran8. Tidigare studier visar att nukleär utarmning av målproteiner sker inom 30 min efter rapamycin tillsats 2,8. Det är emellertid möjligt att vissa proteiner behöver en längre eller kortare period för att skjutas ut ur kärnan. För att säkerställa att målproteinet skjutsas ut ur kärnan kan målproteinet märkas med FRB smält till GFP (FRB-GFP) för att övervaka tiden mellan rapamycintillsats och kärnutarmning. En annan begränsning av ankarsystemet är att vissa proteiner är känsliga för FRB- och FRB-GFP-taggarna vid C-terminalen. Som sådan är N-terminal märkning av målproteinet med FRB en alternativ strategi för att förankra bort ett målprotein.
För att övervaka kromatinsegregering uttryckte spirande jästceller Htb2-mCherry. I denna stam är Htb2-proteinet märkt vid dess endogena locus, vilket säkerställer att Htb2 uttrycks normalt. Andra fluorescerande märkta proteiner kan också användas för att övervaka olika aspekter av meios. När man konstruerar en stam för time-lapse-avbildning är det viktigt att tänka på att vissa proteiner är känsliga för C-terminala fluorescerande taggar. Tillväxt- och sporuleringsanalyser av stammen som innehåller det fluorescerande märkta proteinet säkerställer att taggen inte förändrar proteinets funktion. En utmaning med time-lapse fluorescensmikroskopi är att utsätta celler för tillräckligt fluorescens så att de fluorescerande proteinerna detekteras samtidigt som celldöd undviks eller långsammare meios från överdriven exponering. Ett viktigt felsökningssteg är att hitta lämpliga mikroskop- och kamerainställningar för att uppnå denna balans. Den erforderliga exponeringstiden varierar något mellan proteiner, så flera iterationer av ett experiment bör utföras för att bestämma lämplig exponeringstid. När man använder kammarmetoden som beskrivs här för time-lapse-avbildningsexperiment är ett särskilt känsligt steg att uppnå ett monolager av celler som ska avbildas. Utan ett monolager ackumuleras celler ovanpå varandra, vilket utgör en utmaning för korrekt avbildning och dataanalys. Att använda en agarkudde, som hjälper celler att hålla sig till ConA och sprider celler runt kammaren, är ett billigt och effektivt sätt att få monolager. Att flytta agardynan för att sprida celler runt kammaren så att ett monolager uppnås kan vara utmanande. Att se till att agardynan gör mycket små rörelser under flyttprocessen kan hjälpa till att skapa ett monolager. Att göra en återanvändbar kammare möjliggör billig generering av time-lapse-bilddata. Med korrekt rengöring och desinfektion kan plastkamrarna som beskrivs här återanvändas på obestämd tid. Det är bästa praxis att kamrar avlägsnas från täckglaset omedelbart efter time-lapse-avbildning och lagras i 95% etanol till nästa användning.
Time-lapse-avbildning ger information om cellcykeln som kan missas från avbildning av fasta celler 1,2. Till exempel, när man övervakar varaktigheten av de meiotiska stadierna, kan variationer mellan enskilda celler undersökas mer exakt vid avbildning av levande celler jämfört med populationer av fasta celler. Eftersom jästproteiner lätt kan märkas med fluorescerande proteiner kan koppling av fluorescenstidsfördröjningsavbildning med NDT80-in-systemet och ankartekniken anpassas för ytterligare studier, såsom övervakning av individuell kromosomsegregering och tidpunkten för specifika meiotiska stadier. Vid övervakning av cellcykelprogression efter profas I-frisättning i NDT80-in-celler är det viktigt att ha ett protein märkt med en fluorescerande molekyl som kommer att markera stadierna av meios. Enskilda kromosomer kan övervakas under hela meios genom att integrera upprepningar av lacoperonen (LacO) nära centromeren hos en kromosom i celler som uttrycker LacI-GFP. LacI-GFP binder tätt till LacO och visualiseras som ett ljust fokus, som kan följas genom de meiotiska divisionerna med time-lapse-mikroskopi24,25. Olika proteiner med fluorescerande taggar har använts för att övervaka varaktigheten av meiotiska stadier. Dessa inkluderar Tub1, underenheten α-tubulin som ingår i mikrotubuli; Zip1, en komponent i det synaptonemala komplexet; och Spc42, en spindelpolkroppskomponent 1,2,26,27.
Sammanfattningsvis innehåller denna metod meiotisk cellcykelsynkronisering, villkorlig utarmning av ett målprotein och time-lapse fluorescensmikroskopi för att studera meiotisk kromosomsegregering. Genom att avbilda spirande jästceller under meios och använda villkorliga mutanter som endast påverkar de avsedda stadierna av meios, kan denna metod ge exakta data om den meiotiska cellcykeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Light Microscopy Imaging Center vid Indiana University. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (GM105755).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A.
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
