Summary
Покадровая микроскопия является ценным инструментом для изучения мейоза у почковых дрожжей. Этот протокол описывает метод, который сочетает в себе синхронизацию клеточного цикла, покадровую микроскопию и условное истощение целевого белка, чтобы продемонстрировать, как изучать функцию конкретного белка во время сегрегации мейотических хромосом.
Abstract
Покадровая флуоресцентная микроскопия произвела революцию в понимании событий мейотического клеточного цикла, предоставив временные и пространственные данные, которые часто не видны при визуализации фиксированных клеток. Почкование дрожжей оказалось важным модельным организмом для изучения сегрегации мейотических хромосом, потому что многие мейотические гены сильно сохраняются. Покадровая микроскопия мейоза у почковых дрожжей позволяет контролировать различные мейотические мутанты, чтобы показать, как мутация нарушает мейотические процессы. Тем не менее, многие белки функционируют в нескольких точках мейоза. Поэтому использование мутантов с потерей функции или мейотических нулевых мутантов может нарушить ранний процесс, блокируя или нарушая более поздний процесс и затрудняя определение фенотипов, связанных с каждой отдельной ролью. Чтобы обойти эту проблему, этот протокол описывает, как белки могут быть условно истощены из ядра на определенных стадиях мейоза при мониторинге мейотических событий с использованием покадровой микроскопии. В частности, этот протокол описывает, как клетки синхронизируются в профазе I, как метод удаления якоря используется для истощения белков из ядра на определенных мейотических стадиях и как покадровая визуализация используется для мониторинга сегрегации мейотических хромосом. В качестве примера полезности методики можно привести кинетохорный белок Ctf19 из ядра в разные моменты времени во время мейоза, а количество хроматиновых масс проанализировали в конце мейоза II. В целом, этот протокол может быть адаптирован для истощения различных ядерных белков из ядра при мониторинге мейотических делений.
Introduction
Покадровая флуоресцентная микроскопия является ценным инструментом для изучения динамики сегрегации мейотических хромосом у почковыхдрожжей 1,2. Почкование дрожжевых клеток может быть индуцировано подвергаться мейозу путем голодания ключевых питательных веществ3. Во время мейоза клетки подвергаются одному раунду сегрегации хромосом с последующим двумя делениями для создания четырех мейотических продуктов, которые упакованы в споры (рисунок 1). Отдельные клетки могут быть визуализированы на каждой стадии мейоза, что генерирует пространственные и временные данные, которые могут быть легко пропущены с помощью визуализации фиксированных клеток. Этот протокол показывает, как сочетание покадровой флуоресцентной микроскопии с двумя ранее установленными методами, индуцируемой системой NDT80 (NDT80-in) и методом якоря, может быть использовано для изучения функции специфических белков на различных мейотических стадиях.
Система NDT80-in является мощным инструментом для синхронизации мейотического клеточного цикла, который опирается на индуцируемую экспрессию фактора транскрипции среднего мейоза NDT80 4,5. Выражение NDT80 требуется для профазы I выхода 6,7. В системе NDT80-in NDT80 находится под контролем промотора GAL1-10 в клетках, экспрессирующих фактор транскрипции Gal4, слитый с рецептором эстрогена (Gal4-ER)4,5. Поскольку Gal4-ER попадает в ядро только при связывании с β-эстрадиолом, клетки NDT80-in останавливаются в профазе I при отсутствии β-эстрадиола, что позволяет синхронизировать клетки в профазе I (рисунок 1). β-эстрадиола способствует транслокации фактора транскрипции Gal4-ER в ядро, где он связывает GAL1-10 для стимуляции экспрессии NDT80, что приводит к синхронному проникновению в мейотические деления. Хотя покадровая микроскопия может быть выполнена без синхронизации, преимуществом использования синхронизации является возможность добавления ингибитора или лекарственного средства, пока клетки находятся на определенной стадии мейоза.
Метод удаления якоря представляет собой индуцируемую систему, с помощью которой белок может быть истощен из ядра с добавлением рапамицина8. Этот метод идеально подходит для изучения ядерных белков во время деления клеток в почковых дрожжах, поскольку дрожжевые клетки подвергаются закрытому митозу и мейозу, при которых ядерная оболочка не разрушается. Кроме того, этот метод очень полезен для белков, которые имеют несколько функций на протяжении всего мейоза. В отличие от делеций, мутантных аллелей или мейотических нулевых аллелей, удаление белка-мишени из ядра на определенной стадии не ставит под угрозу активность целевого белка на более ранних стадиях, что позволяет более точно интерпретировать результаты. Система якоря использует перемещение рибосомных субъединиц между ядром и цитоплазмой, которое происходит при рибосомном созревании8. Чтобы истощить целевой белок из ядра, целевой белок помечается FKBP12-рапамицин-связывающим доменом (FRB) в штамме, в котором рибосомная субъединица Rpl13A помечена FKBP12. Без рапамицина FRB и FKBP12 не взаимодействуют, и помеченный FRB белок остается в ядре. При добавлении рапамицина рапамицин образует стабильный комплекс с FKBP12 и FRB, и комплекс выводится из ядра за счет взаимодействия с Rpl13A (рисунок 1). Чтобы предотвратить гибель клеток при добавлении рапамицина, клетки содержат мутацию tor1-1 гена TOR1. Кроме того, эти клетки содержат fpr1Δ, нулевой аллель белка S. cerevisiae FKBP12, который не позволяет эндогенному Fpr1 превзойти конкурирующий Rpl13A-FKBP12 для FRB и связывания рапамицина. Фоновые мутации, tor1-1 и fpr1Δ, не влияют на мейотические сроки или сегрегацию хромосом2.
Чтобы продемонстрировать полезность этого метода, кинетохорный белок Ctf19 был истощен в разные моменты времени на протяжении всего мейоза. Ctf19 является компонентом кинетохора, который не нужен при митозе, но необходим для правильной сегрегации хромосом при мейозе 9,10,11,12,13. При мейозе кинетохора выделяется в профазе I, а Ctf19 важен для повторной сборки кинетохора 9,14. Для этого протокола клетки с системой NDT80-in были синхронизированы, и метод удаления якоря был использован для истощения целевого белка Ctf19 из ядра до и после высвобождения из профазы I и после сегрегации хромосом мейоза I (рисунок 1). Этот протокол может быть адаптирован для истощения других белков, представляющих интерес на любой стадии мейоза и митоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка необходимых материалов
- Подготовьте реагенты для роста и споруляции дрожжевых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если начинающиеся штаммы дрожжей представляют собой аде2- и trp1-, дополните все среды на этапах 1.1.1-1.1.3 конечной концентрацией 0,01% аденина и 0,01% триптофана из 1% запасов. Если стерилизующие среды автоклавом, добавляют эти аминокислоты только после того, как реагенты будут автоклавированы и дадут остыть до комнатной температуры.- Для вегетативного роста приготовьте 2x синтетическую полную + декстрозную среду (2XSC), растворив 6,7 г азотистого основания дрожжей без аминокислот, 2 г полной аминокислотной смеси и 20 г декстрозы в 500 мл воды. Стерилизуют смесь путем автоклавирования в течение 20 мин при 121 °C или фильтрации через фильтр 0,2 мкм.
- Для первой стадии споруляции приготовьте 2x синтетическую полную + ацетатную среду (2XSCA), растворив 6,7 г основания дрожжевого азота без аминокислот, 2 г полной аминокислотной смеси и 20 г ацетата калия в 500 мл воды. Стерилизуют смесь путем автоклавирования в течение 20 мин при 121 °C или фильтрации через фильтр 0,2 мкм.
- Для заключительной стадии споруляции приготовьте 1% ацетата калия (1% KAc), растворив 5 г KAc в 500 мл воды. Стерилизуют смесь путем автоклавирования в течение 20 мин при 121 °C или фильтрации через фильтр 0,2 мкм.
- Подготовьте лекарства и реагенты для микроскопии, синхронизации и закрепления.
- Для прилипания клеток к покровному листу во время покадровой визуализации вводят 1 мг/мл конканавалина А (ConA) в 1x PBS. Фильтр стерилизуют с помощью фильтра 0,2 мкм и хранят небольшие (~10 мкл) аликвоты при -20 °C.
- Чтобы использовать систему NDT80-in, сделайте 2 мл 1 мМ β-эстрадиола, растворенного в этаноле. Фильтр стерилизуют с помощью фильтра 0,2 мкм и сохраняют аликвоты (~500 мкл) при -20 °C.
- Для анкерной системы вводят 1 мг/мл рапамицина, растворенного в ДМСО. Фильтр стерилизуют с помощью фильтра 0,2 мкм и хранят небольшие (~10 мкл) аликвоты при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте небольшие аликвоты рапамицина, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания препарата.
- Генерация штаммов дрожжей, содержащих систему NDT80-in (PGAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) и белок-мишень, помеченный FRB в генетическом фоне якоря (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/fpr1Δ; Рпл13А-ФКБП12/РПЛ13А-ФКБП12)4,8. Для этого исследования был использован Ctf19-FRB. Кроме того, одна копия гистонового белка Htb2 была помечена mCherry, чтобы обеспечить мониторинг мейотической прогрессии и сегрегации хроматина.
- Подготовка камеры для покадровой визуализации
- Начинают подготовку камеры за 6 ч-24 ч до получения изображения (рисунок 2). Вырежьте камеру размером 18 мм x 18 мм из вставки наконечника пипетки с помощью нагретого скальпеля или другого острого лезвия.
- Используйте пластиковый наконечник пипетки, чтобы распределить тонкий слой силиконового герметика вокруг нижних краев камеры, который будет прилипать к крышке. Добавьте достаточное количество герметика, чтобы края камеры были полностью покрыты (см. Рисунок 2).
- Прикрепите камеру к крышке размером 24 мм x 50 мм, аккуратно поместив камеру с герметиком вниз на крышку. Убедитесь, что в герметике нет зазоров, чтобы камера не протекала.
- Нанесите 8-10 мкл ConA на крышку. Распределите ConA на середину крышки и используйте наконечник пипетки, чтобы распределить ConA тонким слоем таким образом, чтобы он покрывал большую часть крышки, которая окружена камерой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковые камеры могут быть повторно использованы на неопределенный срок. После завершения покадровой визуализации извлеките камеру из крышки с помощью бритвы, очистите силиконовый герметик из камеры и держите камеры погруженными в 95% этанол для будущего использования.
2. Споруляция дрожжевых клеток
- Выполните следующие шаги для голодания дрожжевых клеток, чтобы вызвать мейотическую программу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги предназначены для споруляции штамма дрожжей W303. Для других штаммов могут потребоваться другие протоколы15. Эффективность споруляции сильно варьируется между лабораторными штаммами, при этом W303 демонстрирует эффективность споруляции ~ 60% 16,17,18.- Возьмите одну колонию соответствующего диплоидного штамма дрожжей из тарелки и привите 2 мл 2XSC и дайте нарасти при 30 °C на роликовом барабане в течение 12-24 ч до насыщения.
- Разбавляют насыщенную культуру в 2XSCA путем добавления 80 мкл культуры со стадии 2.1.1 до 2 мл 2XSCA. Дайте ему вырасти при 30 °C на роликовом барабане в течение 12-16 ч. Не оставляйте в 2XSCA дольше 16 ч, потому что клетки могут заболеть или автофлуоресцентными.
- Выполните две промывки, вращая культуру при 800 х г при комнатной температуре (25 °C) в течение 1 мин, отбрасывая жидкость и повторно используя гранулу в 2 мл стерильной дистиллированной воды.
- После второй промывки вынуть жидкость и повторно суспендировать гранулу в 2 мл 1% КАч и дать ей вырасти при 25 °С на роликовом барабане в течение 8-12 ч. Клетки, вошедшие в мейоз, будут останавливаться в пахитене профазы I.
- Система высвобождения Prophase I
- Добавляют β-эстрадиол непосредственно в культуру споруляции до конечной концентрации 1 мкМ и быстро вращают культуральную трубку. Β-эстрадиол высвобождает клетки из профазы I.
3. Истощение целевого белка из ядра с помощью метода anchor away
- Добавьте рапамицин в клетки, чтобы истощить помеченный FRB белок из ядра на определенном этапе.
- Чтобы истощить белки из ядра на выходе из профазы I, добавляют рапамицин до конечной концентрации 1 мкг/мл в культуральную трубку споруляции одновременно с добавлением β-эстрадиола.
- Чтобы истощить белки из ядра на определенной стадии мейоза, контролируют стадию клеточного цикла, начиная с 60 мин после добавления β-эстрадиола. Каждые 20 мин пипетку 5 мкл культуры на крышку размером 24 мм x 40 мм и накрывают клетки крышкой размером 18 мм x 18 мм. Держите культуры вращающимися на роликовом барабане при 25 °C между временными точками.
- Визуализируйте клетки с помощью фильтра A594/mCherry и 60-кратного объектива флуоресцентного микроскопа. Установите процент пропускания на 2%, а время экспозиции на 250 мс. Наличие одной, двух или четырех масс ДНК будет указывать на мейотическую стадию, на которой клетки прогрессировали. Добавьте рапамицин до конечной концентрации 1 мкг/мл на интересующей мейотической стадии.
- Держите клетки вращающимися на роликовом барабане при 25 °C, пока они не будут готовы к визуализации. Ядерное истощение белка-мишени происходит через 30-45 мин после добавления рапамицина 2,8.
4. Покадровая флуоресцентная микроскопия
- Сделайте агаровую прокладку, которая будет использоваться для создания монослоя клеток для визуализации (см. шаг 4.2).
- Отрежьте и выбросьте колпачок и нижнюю часть 1/3 микрофрагменной трубки объемом 1,5 мл, чтобы создать цилиндр. Цилиндр будет служить формой для агаровой прокладки. Сделайте два цилиндра, чтобы иметь дополнительный на случай, если агар не полимеризуется должным образом в первом.
- Поместите цилиндр с вырезанной микротопливной трубкой на чистую стеклянную горку, а верхняя часть трубки перевернута, сидя на слайде.
- Сделайте 6 мл 5% раствора агара (используйте 1% KAc в качестве растворителя) в стакане емкостью 50 мл и разогрейте его в микроволновой печи до полного растворения агара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агар легко закипит в микроволновой печи; наблюдайте за агаром и запускайте и останавливайте микроволновую печь, когда агар начинает кипеть и закручивать стакан. Запустите и остановите микроволновую печь несколько раз, чтобы полностью растворить агар. Раствор агара производится сверх количества, необходимого для обеспечения полного растворения агара. - Отрежьте наконечник пипетки, чтобы сделать большее отверстие, и испелите ~ 500 мкл расплавленного агара в каждый цилиндр микрофьюжетной трубки. Дайте ему постоять при комнатной температуре, пока агар не затвердеет (~10-12 мин).
- Подготовка дрожжевых клеток к визуализации
- Открутите 200 мкл культуры споруляции со стадии 3,2 при 800 х г в течение 2 мин в микроцентрифужных пробирках по 1 мл. Удалите и выбросьте 180 мкл супернатанта. Повторно суспендируйте гранулу в оставшемся супернатанте, закручивая и щелкая трубкой.
- Пипетку 6 мкл концентрированных ячеек на крышку в середине камеры производится на стадии 1.4.
- Удерживайте цилиндр с помощью агаровой прокладки, сделанной на шаге 4.1, и осторожно соскользните его со стеклянной горки. Убедитесь, что агар полностью плоский на дне и, используя нижнюю часть наконечника пипетки, приложите небольшое давление к микротопливной форме, чтобы прокладка агара была немного вытолкнута над границей трубки.
- Переверните форму таким образом, чтобы агаровая прокладка была обращена вниз к камере.
- Используя щипцы, аккуратно поместите агаровую прокладку (все еще в форму микрофьюжной трубки) поверх клеток. Используйте наконечник пипетки, чтобы осторожно скользить агаровой прокладкой вокруг камеры 10-20 раз, чтобы создать монослой клеток на крышке.
- Оставьте агаровую прокладку в камере на 12-15 мин. Этот шаг позволит клеткам прилипать к ConA на крышке.
- Переложить 2 мл культуры споруляции со стадии 3,2 на две микроцентрифужные трубки и открутить при 15 700 х г в течение 2 мин. Переложите супернатант в чистые микрофрагменные трубки и снова вращайте при 15 700 х г в течение 2 мин. Перенесите супернатант в чистые микроцентрифужные трубки для использования на следующем этапе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать предварительно кондиционированный супернатант KAc с β-эстрадиолом и рапамицином для обеспечения эффективной споруляции и дальнейшего истощения интересующего белка. - После того, как агаровая прокладка просидит в камере в течение 12-15 минут, плавайте и снимите агаровую прокладку перед визуализацией. Для этого добавьте в камеру 2 мл супернатанта с шага 4.2.7 по каплям. Как только жидкость достигнет верхней части камеры, агаровая подушка, скорее всего, будет плавать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если агаровая прокладка не плавает автоматически, подождите 1-2 мин. Если агаровая прокладка все еще не плавает, аккуратно снимите ее щипцами. В идеале, агаровая подушка должна плавать сама по себе, потому что ее удаление перед плаванием может привести к удалению клеток. - После того, как подушечка агара всплыла, аккуратно снимите ее щипцами и выбросьте. Поместите крышку размером 24 мм x 50 мм в верхнюю часть камеры, чтобы предотвратить испарение во время визуализации.
- Настройка фильма на микроскопе
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже инструкции относятся к перевернутому микроскопу, оснащенному держателем для слайдов, который вмещает крышку размером 24 мм x 50 мм (см. Таблицу материалов для микроскопа, камеры и программного обеспечения). Для получения изображения используется 60-кратный масляный объектив. Этот протокол, возможно, потребуется изменить при использовании других микроскопов или других держателей слайдов. Точные шаги для выполнения шагов с 4.3.2 по шаг 4.3.16 будут варьироваться в зависимости от используемого микроскопа и программного обеспечения для визуализации. Инструкции для другого микроскопа см. в разделе 4.4.- Поместите крышку внутрь держателя слайда. Прикрепите формовочную глину к боковой стороне крышки, чтобы она была надежно закреплена в держателе слайда.
- Откройте программное обеспечение для получения изображений. Используйте ручки курсовой и тонкой регулировки, чтобы сфокусировать ячейки с помощью DIC или brightfield.
- В главном меню программного обеспечения для получения изображений выберите Файл > Получить (Resolve 3D). Появятся три окна.
- В окне с именем Resolve 3D нажмите на значок Erlenmeyer Flask . Откроется окно под названием «Проектирование/запуск эксперимента», содержащее элементы управления для настройки эксперимента по настройке покадрового фильма.
- На вкладке Конструктор перейдите на вкладку Секционирование. Установите флажок Z Sectioning (Секционирование Z). Установите z стеков следующим образом: Расстояние между оптическими секциями = 1 мкм, Количество оптических секций = 5, Толщина образца = 5,0 мкм.
- На вкладке Каналы нажмите на значок + , чтобы появился один из вариантов канала. Выберите соответствующий канал. Для этого эксперимента мы выбираем A594, который используется для изображения mCherry. Установите флажок Рядом со ссылочным изображением и установите положение Z в середину образца в раскрывающемся меню.
- Выберите значение в раскрывающемся меню рядом с %T и Exp., чтобы задать процент пропускания и время экспозиции соответственно. Для этого эксперимента в канале A594 используется коэффициент пропускания 2% и время экспозиции 250 мс, а для brightfield используется коэффициент пропускания 10% и время экспозиции 500 мс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции и процент пропускания будут варьироваться в зависимости от микроскопа. Чтобы избежать передержки, используйте самый низкий процент пропускания и кратчайшее время воздействия, что позволяет правильно визуализировать интересующий белок. - На вкладке Покадровая съемка установите флажок Таймлапс. В появившейся таблице введите 10 в столбце min в строке time-lapse и 10 в столбце часов в строке общего времени. Это будет запускать временной курс, делая снимки каждые 10 минут в течение 10 часов.
- Установите флажок Поддерживать фокус с конечным фокусом, чтобы предотвратить дрейф сцены во время фильма. На вкладке Точки установите флажок Список точек посещения.
- В главном меню выберите Вид > Список точек. Появится окно, называемое списком точек. Переместите сцену в область камеры, которая показывает монослой клеток. Нажмите на Отметку точки в окне списка точек.
- Переместите рабочую область, чтобы выделить 25-30 точек без какого-либо перекрытия, чтобы избежать переэкспонирования ячеек. Каждое поле будет отображаться во время каждого временного курса.
- В окне списка точек выберите Откалибровать все , чтобы задать конечный фокус для каждой точки. На вкладке Конструктор в окне Desgin/Run Experiment введите диапазон значений точек (полученных из окна списка точек) в поле Рядом со списком точек посещения. На вкладке Выполнить сохраните файл в соответствующем месте назначения на компьютере. В окне Конструктор/Запуск эксперимента нажмите кнопку Воспроизвести (значок зеленого треугольника), чтобы запустить фильм.
- Дополнительный метод: Настройка фильма на микроскопе
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти инструкции предназначены для инвертированного микроскопа, оснащенного держателем слайда, который может вместить крышку размером 24 мм x 50 мм. В таблице материалов приведены спецификации используемого микроскопа, камеры и программного обеспечения для обработки изображений. Для получения изображения используется 60-кратный масляный объектив.- Поместите крышку внутрь держателя слайда. Откройте программное обеспечение для получения изображений. Используйте ручки курсовой и тонкой регулировки для фокусировки ячеек с помощью DIC или brightfield. Щелкните правой кнопкой мыши в открытом окне программы. Появится раскрывающееся меню.
- Нажмите На Элементы управления приобретением > Приобретение. Щелкните Приложение > Определить/Запустить эксперимент. Откроется окно с надписью ND Acquisition.
- В открывшемся окне установите флажок XY. Переместите рабочую область в нужное место и щелкните поле в разделе Имя точки , чтобы выбрать это место в качестве точки. Повторяйте это до тех пор, пока не будут выбраны 25-30 точек без какого-либо перекрытия, чтобы избежать переэкспонирования ячеек. Каждое поле будет отображаться во время каждого временного курса.
- Установите процент пропускания для каждого флуоресцентного канала. Поскольку штаммы производят Htb2-mCherry, здесь используется фильтр mCherry. В окне Приобретение, открывшемся на шаге 4.3.3, перейдите к кнопке 555 нм. Установите процент пропускания на 5%, отрегулировав скользящую шкалу под кнопкой 555 нм, пока она не прочитает 5%.
- Установите время экспозиции для каждого флуоресцентного канала. В окне Получение выберите 200 мс в раскрывающемся меню Экспозиция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции и процент пропускания будут варьироваться в зависимости от микроскопа. Чтобы избежать передержки, используйте самый низкий процент пропускания и кратчайшее время воздействия, что позволяет правильно визуализировать интересующий белок. - Нажмите на поле рядом с Z в окне ND Acquisition . Установите пять z-стеков дрожжевых клеток, которые находятся на расстоянии 1,2 мкМ друг от друга.
- Нажмите на поле рядом с λ. Выберите соответствующие каналы, которые будут использоваться для эксперимента. Для DIC убедитесь, что в раскрывающемся меню в разделе Z pos выбран пункт Главная. Для mCherry убедитесь, что в раскрывающемся меню Z pos выбран пункт Все . Это гарантирует, что для DIC будет взят только один участок (в середине z-стека).
- Установите флажок Время в окне Сбор ND . Установите флажок в разделе Этап. В раскрывающемся меню в разделе Интервал выберите 10 минут. В разделе Длительность выберите 10 часов.(s). Это будет выполняться таким образом, что изображения будут делаться каждые 10 минут в течение 10 часов.
5. Анализ сегрегации хроматина
- Откройте программное обеспечение Fiji. Открывайте одно поле зрения за раз: для каждого поля откройте каналы DIC и mCherry.
- Возьмите проекцию максимальной интенсивности канала mCherry для получения одного изображения: нажмите на Image > Stacks > Z Project, выберите Max Intensity из выпадающего меню.
- Объедините каналы DIC и mCherry в одном изображении: нажмите на Image > Color > Объединить каналы.
- Следуйте за одной клеткой через мейоз. После завершения мейоза II регистрируют количество масс ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы контролировать сегрегацию хроматина, гистоновый белок Htb2 был помечен mCherry. В профазе I хроматин появляется в виде одной массы Htb2. После сегрегации гомологичных хромосом в первом мейотическом делении хроматин появляется в виде двух различных масс (рисунок 3А). После того, как сестринские хроматиды отделяются, хроматин появляется в виде четырех масс. Если некоторые хромосомы не прикрепляются к веретенообразным микротрубочкам, дополнительные массы могут быть замечены после мейоза I или мейоза II.
Описанный выше метод был использован для изучения роли кинетохорового компонента Ctf19 в обеспечении правильной сегрегации хромосом при почковом дрожжевом мейозе. Анкерные штаммы дрожжей, экспрессирующие Ctf19, помеченные FRB, были синхронизированы в профазе I с использованием системы NDT80-in (tor1-1; fpr1Δ; РПЛ13А-ФКБП12; CTF19-FRB; GAL1-10 продвигал NDT80; GAL4-ER). В качестве контроля использовался штамм NDT80-in с фоном деформации анкера, но без белка, помеченного FRB (tor1-1; fpr1Δ; РПЛ13А-ФКБП12; GAL1-10 продвигал NDT80; GAL4-ER). Клетки освобождались от профазы I ареста путем добавления β-эстрадиола. Рапамицин добавляли для истощения Ctf19-FRB из ядра либо при высвобождении (до повторной сборки кинетохора), либо через 45 мин после высвобождения (после повторной сборки кинетохора, но до мейоза I), либо через 3 ч после высвобождения (непосредственно перед мейозом II) (рисунок 3A-F). После добавления рапамицина проводилась покадровая флуоресцентная микроскопия, и изображения получались каждые 10 мин в течение оставшейся продолжительности мейоза.
После получения изображений программное обеспечение открытого доступа Fiji использовалось для открытия изображений и выполнения анализа для рисунков, показывающих прогрессию времени (рисунок 3A-F). Количество масс ДНК после мейоза II было подсчитано, по крайней мере, в 100 клетках, которые подвергались мейозу в каждом состоянии. В клетках дикого типа с фоном якоря обычно есть четыре массы ДНК в конце мейоза II, представляющие четыре продукта мейоза (рисунок 3A). В небольшой части клеток после мейоза II видны только три массы (рисунок 3B,G). Тем не менее, вполне вероятно, что три массы являются результатом клетки, которая имеет четыре продукта мейоза, но две из этих масс появляются вместе после мейоза II.
Когда Ctf19-FRB закрепляется в момент высвобождения профазы I выхода (t = 0 h), примерно 47% клеток демонстрируют более четырех масс ДНК по завершении мейоза, что свидетельствует о дефекте прикрепления кинетохоров и микротрубочек (рисунок 3C, G). При закреплении Ctf19-FRB либо после сборки кинетохора, но до мейоза I (t = 45 мин) или до мейоза II (t = 3 ч), примерно 16% клеток демонстрируют дополнительные массы ДНК. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что Ctf19 важен для повторной сборки кинетохор при высвобождении профазы I, но менее важен при сегрегации хромосом после повторной сборки кинетохора.
Полученные здесь результаты показывают, что покадровая микроскопия в сочетании с синхронизацией клеточного цикла и условным истощением белка-мишени позволяет изучать белок в определенной мейотической стадии. Хотя Ctf19 не является существенным для митоза, мейотическая кинетохора широко реорганизована, и Ctf19 играет решающую роль в повторной сборке кинетохора после профазы I выхода 9,11,12. Результаты на рисунке 3 показывают, что когда Ctf19 истощается до повторной сборки кинетохор, большая часть клеток демонстрирует дополнительные массы ДНК после мейоза II. Когда Ctf19 истощается из ядра после повторной сборки кинетохор, но до мейоза I или мейоза II, появляется меньше клеток, которые демонстрируют дополнительные массы ДНК. Эти результаты свидетельствуют о том, что наиболее важная роль ctf19 находится в конце профазы I. Эта разница в точности сегрегации хромосом с истощением Ctf19 на разных стадиях подчеркивает важность использования специфических для стадии условных аллелей для изучения функции белков конкретно при мейозе I или мейозе II. Мейотический нулевой мутант показал бы серьезный дефект и не предоставил бы информацию о роли Ctf19 на каждом этапе.
Кроме того, хотя CTF19 не является существенным геном, существует фенотип точности передачи хромосом (ctf) во время вегетативного роста мутантов CTF19 19. Использование нулевого аллеля или мутантного аллеля CTF19 может создать популяцию анеуплоидных клеток, которые могут не подвергаться мейозу должным образом. Использование метода удаления якоря и системы синхронизации NDT80-in обходит эту проблему, точно истощая Ctf19 из ядра непосредственно перед мейозом I или мейозом II, уменьшая беспокойство о том, что анализируемые клетки были анеуплоидными.
Рисунок 1: Обзор эксперимента. Карикатура дрожжевой клетки, показывающая одну пару гомологичных хромосом. NDT80-в клетках входят в мейоз и останавливаются при профазе I. После добавления β-эстрадиола клетки входят в мейотические деления синхронно. Добавление рапамицина определяет, когда целевой белок (отмеченный звездой) закрепляется. В этом эксперименте целевой белок Ctf19 закреплялся в трех разных временных точках путем добавления рапамицина (RAP) одновременно с профазой I (добавление RAP при t = 0 мин), после высвобождения профазы I (добавление RAP при t = 45 мин) и после сегрегации хромосомы I мейоза (добавление RAP при t = 3 ч). Толстые черные стрелки указывают на стадию клеточного цикла добавления рапамицина и, следовательно, целевое истощение белка. Сокращения: RAP = рапамицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Установка камеры для экспериментов с покадровой визуализацией. (A) Многоразовая камера (справа), вырезанная из вставки держателя наконечника пипетки (слева). Вставка держателя наконечника пипетки вырезается раскаленным лезвием, чтобы удалить часть вставки размером 4 квадрата x 4 квадрата. Пунктирные линии указывают на образец секции держателя наконечника, которую можно разрезать, чтобы сделать камеру. Оставшиеся пластиковые разделители в пределах квадратного выреза 4 квадрата х 4 обрезаются, а полая камера остается (справа). (B) Для создания конечной камеры силиконовый герметик добавляют к краям с одной стороны камеры, а затем помещают поверх крышки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Время, в которое Ctf19 закрепляется, влияет на сегрегацию хроматина. (A-F) Репрезентативные покадровые изображения клеток, экспрессирующих Htb2-mCherry во время мейоза. Снимки делали каждые 10 мин, сразу после добавления β-эстрадиола. Шкала баров = 5 мкм. Числа в правом верхнем углу каждого кадра обозначают время, прошедшее между каждым кадром, а время 0 указывает на кадр, в котором хроматин отделяется при мейозе I. Подсчитывались только клетки, завершившие мейотические деления. (A) Клетка дикого типа (без белка, помеченного FRB), в которую β-эстрадиол добавляли через 12 ч после переноса KAc. Клетка содержит четыре массы ДНК после завершения мейоза II. (B) Ctf19-FRB клетка, в которую добавляли рапамицин при t = 0 (одновременно с добавлением β-эстрадиола). Эта клетка показывает три массы ДНК после мейоза II. (C) Ctf19-FRB клетка, в которую добавляли рапамицин при t = 0 (одновременно с добавлением β-эстрадиола). Эта клетка показывает пять масс ДНК после мейоза II. (D) Ctf19-FRB клетка, в которую добавляли рапамицин при t = 0 (одновременно с добавлением β-эстрадиола). Эта клетка погибает после завершения мейоза II. (E) Ctf19-FRB клетка, в которую добавляли рапамицин через 45 мин после β-эстрадиола. Эта клетка показывает пять масс ДНК после мейоза II. (F) Ctf19-FRB клетка, в которую добавляли рапамицин через 45 мин после β-эстрадиола. После мейоза II присутствует шесть масс ДНК. (G) Количественная оценка количества масс ДНК по меньшей мере в 100 клетках для каждого состояния (два фильма анализируются для каждого состояния). t = под каждым столбиком указывает время, когда рапамицин был добавлен относительно добавления β-эстрадиола. Сокращения: MII = meiosis II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол сочетает в себе систему NDT80-in для синхронизации клеток, технику якоря для истощения белков из ядра и флуоресцентную покадровую микроскопию для изображения появляющихся дрожжевых клеток во время мейоза. Система NDT80-in - это метод синхронизации мейотического клеточного цикла, который использует профазу I ареста и высвобождения 4,8. Хотя отдельные клетки будут немного различаться по количеству времени, проведенного на каждой из последующих мейотических стадий, большинство клеток будут поддерживать высокую степень синхронности во всех мейотических делениях.
Техника удаления якоря является адаптируемым инструментом для митотических и мейотических исследований. Изменяя якорь целевого белка и время добавления рапамицина, этот метод может быть адаптирован для изучения различных белков на любой стадии бутонизации дрожжевого мейоза. Распространенные методы получения условных мутантов для изучения почкового дрожжевого митоза не всегда подходят для мейотических исследований. Например, использование репрессивного промотора часто требует изменения источника углерода для изменения экспрессии целевого белка, что может нарушить мейоз20. Чувствительные к температуре мутанты полагаются на изменение температуры, чтобы уменьшить или отменить активность целевого белка. Многие из этих условных мутантов не могут быть использованы в мейотических исследованиях, потому что изменение условий питательных веществ или температуры может нарушить мейоз 21,22,23. Кроме того, делеции или мутанты могут ограничивать исследования мейоза, потому что экспрессия мутантного белка на ранней стадии мейоза может блокировать или отрицательно влиять на более поздние стадии. Техника удаления якоря может обойти эти проблемы, потому что она не зависит от изменений в питании или температуре8. Более того, истощение белка может регулироваться во времени таким образом, что время добавления рапамицина определяет, когда белок будет закреплен.
Одним из ограничений метода удаления якоря является то, что он может не подходить для неядерных белков, поскольку он полагается на рибосомную субъединицу Rpl13A в качестве якоря для транспортировки целевого белка из ядра. Тем не менее, существуют и другие применения метода удаления якоря путем изменения белково-белковых взаимодействий, которые также могут быть полезны во время мейоза, такие как закрепление белков в комплексах или привязка их к мембранам8. Предыдущие исследования показывают, что ядерное истощение белков-мишеней происходит в течение 30 мин после добавления рапамицина 2,8. Тем не менее, возможно, что некоторые белки нуждаются в более длительном или более коротком периоде, чтобы быть выведенными из ядра. Чтобы гарантировать, что целевой белок выводится из ядра, целевой белок может быть помечен FRB, сплавленным с GFP (FRB-GFP) для мониторинга промежутка времени между добавлением рапамицина и истощением ядра. Другим ограничением системы якоря является то, что некоторые белки чувствительны к меткам FRB и FRB-GFP на C-конце. Таким образом, N-концевая маркировка целевого белка с помощью FRB является альтернативной стратегией для закрепления целевого белка.
Для контроля сегрегации хроматина почкование дрожжевых клеток экспрессируют Htb2-mCherry. В этом штамме белок Htb2 помечается в его эндогенном локусе, что гарантирует, что Htb2 экспрессируется нормально. Другие флуоресцентно помеченные белки также могут быть использованы для мониторинга различных аспектов мейоза. При построении штамма для покадровой визуализации важно учитывать, что некоторые белки чувствительны к С-концевым флуоресцентным меткам. Анализы роста и споруляции штамма, содержащего флуоресцентно помеченный белок, гарантируют, что метка не изменяет функцию белка. Одной из проблем покадровой флуоресцентной микроскопии является подвергание клеток достаточной флуоресценции, чтобы флуоресцентные белки обнаруживались, избегая гибели клеток или замедления мейоза от избыточного воздействия. Важным шагом по устранению неполадок является поиск соответствующих настроек микроскопа и камеры для достижения этого баланса. Требуемое время воздействия будет немного варьироваться между белками, поэтому следует выполнить несколько итераций эксперимента, чтобы определить соответствующее время воздействия. При использовании камерного метода, описанного здесь для экспериментов с покадровой визуализацией, особенно чувствительным шагом является достижение монослоя клеток, подлежащих изображению. Без монослоя клетки накапливаются друг на друге, что представляет собой проблему для правильной визуализации и анализа данных. Использование агаровой прокладки, которая помогает клеткам прилипать к ConA и распределяет клетки по всей камере, является недорогим и эффективным способом получения монослоев. Перемещение агаровой прокладки для распространения клеток вокруг камеры таким образом, чтобы был достигнут монослой, может быть сложной задачей. Обеспечение того, чтобы агаровая подушка делала очень маленькие движения во время процесса перемещения, может помочь в создании монослоя. Создание многоразовой камеры позволяет недорого генерировать покадровые данные визуализации. При правильной очистке и дезинфекции пластиковые камеры, описанные здесь, могут быть повторно использованы на неопределенный срок. Рекомендуется, чтобы камеры удалялись из крышки сразу после покадровой визуализации и хранились в 95% этанола до следующего использования.
Покадровая визуализация предоставляет информацию о клеточном цикле, которая может быть пропущена при визуализации фиксированных клеток 1,2. Например, при мониторинге продолжительности мейотических стадий вариации между одиночными клетками могут быть более точно изучены при визуализации живых клеток по сравнению с популяциями фиксированных клеток. Поскольку дрожжевые белки могут быть легко помечены флуоресцентными белками, связь флуоресцентной покадровой визуализации с системой NDT80-in и методом удаления привязки может быть адаптирована для дополнительных исследований, таких как мониторинг сегрегации отдельных хромосом и сроков конкретных мейотических стадий. При мониторинге прогрессирования клеточного цикла после высвобождения профазы I в клетках NDT80-in крайне важно иметь белок, помеченный флуоресцентной молекулой, которая будет отмечать стадии мейоза. Отдельные хромосомы можно контролировать на протяжении всего мейоза путем интеграции повторов лакоперона (LacO) вблизи центромеры хромосомы в клетках, экспрессирующих LacI-GFP. LacI-GFP плотно связывается с LacO и визуализируется как яркий фокус, который может быть продолжен во всех мейотических делениях с помощью покадровой микроскопии24,25. Различные белки с флуоресцентными метками использовались для мониторинга продолжительности мейотических стадий. К ним относятся Tub1, субъединица α-тубулина, которая включается в микротрубочки; Zip1, компонент синаптонемного комплекса; и Spc42, компонент корпуса шпинделя 1,2,26,27.
В заключение, этот метод включает в себя синхронизацию мейотического клеточного цикла, условное истощение целевого белка и покадровую флуоресцентную микроскопию для изучения сегрегации мейотических хромосом. Визуализируя появляющиеся дрожжевые клетки во время мейоза и используя условные мутанты, которые влияют только на предполагаемые стадии мейоза, этот метод может обеспечить точные данные о мейотическом клеточном цикле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Центр визуализации световой микроскопии в Университете Индианы. Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения (GM105755).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
