Summary
La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.
Abstract
La microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo ha revolucionado la comprensión de los eventos del ciclo celular meiótico al proporcionar datos temporales y espaciales que a menudo no se ven al obtener imágenes de células fijas. La levadura en ciernes ha demostrado ser un organismo modelo importante para estudiar la segregación cromosómica meiótica porque muchos genes meióticos están altamente conservados. La microscopía de lapso de tiempo de la meiosis en levaduras en ciernes permite el monitoreo de diferentes mutantes meióticos para mostrar cómo la mutación interrumpe los procesos meióticos. Sin embargo, muchas proteínas funcionan en múltiples puntos de la meiosis. Por lo tanto, el uso de mutantes nulos meióticos o de pérdida de función puede interrumpir un proceso temprano, bloqueando o perturbando el proceso posterior y dificultando la determinación de los fenotipos asociados con cada rol individual. Para eludir este desafío, este protocolo describe cómo las proteínas pueden agotarse condicionalmente del núcleo en etapas específicas de la meiosis mientras se monitorean los eventos meióticos utilizando microscopía de lapso de tiempo. Específicamente, este protocolo describe cómo se sincronizan las células en la profase I, cómo se utiliza la técnica de anclaje para agotar las proteínas del núcleo en etapas meióticas específicas y cómo se utilizan las imágenes de lapso de tiempo para monitorear la segregación cromosómica meiótica. Como ejemplo de la utilidad de la técnica, la proteína cinetocoro Ctf19 se agotó del núcleo en diferentes puntos de tiempo durante la meiosis, y el número de masas de cromatina se analizó al final de la meiosis II. En general, este protocolo se puede adaptar para agotar diferentes proteínas nucleares del núcleo mientras se monitorean las divisiones meióticas.
Introduction
La microcopia de fluorescencia time-lapse es una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de la segregación cromosómica meiótica en levaduras en ciernes 1,2. Las células de levadura en ciernes pueden ser inducidas a someterse a meiosis a través de la inanición de nutrientes clave3. Durante la meiosis, las células se someten a una ronda de segregación cromosómica seguida de dos divisiones para crear cuatro productos meióticos que se empaquetan en esporas (Figura 1). Las células individuales se pueden visualizar a lo largo de cada etapa de la meiosis, lo que genera datos espaciales y temporales que pueden pasarse por alto fácilmente mediante imágenes de células fijas. Este protocolo muestra cómo la combinación de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo con dos métodos previamente establecidos, el sistema NDT80 inducible (NDT80-in) y la técnica de anclaje, se puede utilizar para estudiar la función de proteínas específicas en distintas etapas meióticas.
El sistema NDT80-in es una poderosa herramienta para la sincronización del ciclo celular meiótico que se basa en la expresión inducible del factor de transcripción de meiosis media NDT80 4,5. La expresión de NDT80 es necesaria para la salida 6,7 de la profase I. Con el sistema NDT80-in, NDT80 está bajo el control del promotor GAL1-10 en células que expresan el factor de transcripción Gal4 fusionado a un receptor de estrógeno (Gal4-ER)4,5. Debido a que Gal4-ER solo ingresa al núcleo cuando se une al β-estradiol, las células NDT80-in se detienen en la profase I en ausencia de β-estradiol, lo que permite la sincronización de las células en la profase I (Figura 1). β-estradiol promueve la translocación del factor de transcripción Gal4-ER en el núcleo, donde se une a GAL1-10 para impulsar la expresión de NDT80, lo que lleva a la entrada sincrónica en las divisiones meióticas. Aunque la microscopía de lapso de tiempo se puede realizar sin sincronización, la ventaja de usar la sincronización es la capacidad de agregar un inhibidor o un medicamento mientras las células se encuentran en una etapa específica de la meiosis.
La técnica de anclaje es un sistema inducible por el cual una proteína puede ser agotada del núcleo con la adición de rapamicina8. Esta técnica es ideal para estudiar las proteínas nucleares durante la división celular en levadura en ciernes porque las células de levadura sufren mitosis cerrada y meiosis, en las que la envoltura nuclear no se descompone. Además, esta técnica es muy útil para proteínas que tienen múltiples funciones a lo largo de la meiosis. A diferencia de las deleciones, alelos mutantes o alelos nulos meióticos, la eliminación de una proteína diana del núcleo en una etapa específica no compromete la actividad de la proteína diana en etapas anteriores, lo que permite una interpretación más precisa de los resultados. El sistema de anclaje utiliza el desplazamiento de subunidades ribosómicas entre el núcleo y el citoplasma que ocurre en la maduración ribosómica8. Para agotar la proteína diana del núcleo, la proteína diana se marca con el dominio de unión a rapamicina FKBP12 (FRB) en una cepa en la que la subunidad ribosómica Rpl13A se marca con FKBP12. Sin rapamicina, FRB y FKBP12 no interactúan, y la proteína marcada con FRB permanece en el núcleo. Tras la adición de rapamicina, la rapamicina forma un complejo estable con FKBP12 y FRB, y el complejo es expulsado del núcleo debido a la interacción con Rpl13A (Figura 1). Para prevenir la muerte celular tras la adición de rapamicina, las células albergan la mutación tor1-1 del gen TOR1 . Además, estas células contienen fpr1Δ , un alelo nulo de la proteína FKBP12 de S. cerevisiae , que evita que Fpr1 endógeno supere a Rpl13A-FKBP12 para la unión de FRB y rapamicina. Las mutaciones de fondo de anclaje, tor1-1 y fpr1Δ, no afectan a los tiempos meióticos ni a la segregación cromosómica2.
Para demostrar la utilidad de esta técnica, la proteína cinetocoro Ctf19 se agotó en diferentes puntos de tiempo a lo largo de la meiosis. Ctf19 es un componente del cinetocoro que es prescindible en la mitosis pero necesario para la segregación cromosómica adecuada en la meiosis 9,10,11,12,13. En la meiosis, el cinetocoro se desprende en la profase I, y Ctf19 es importante para el reensamblaje del cinetocoro 9,14. Para este protocolo, las células con el sistema NDT80-in se sincronizaron, y se utilizó la técnica de anclaje para agotar la proteína diana Ctf19 del núcleo antes y después de la liberación de la profase I, y después de la segregación del cromosoma I de la meiosis (Figura 1). Este protocolo se puede adaptar para agotar otras proteínas de interés en cualquier etapa de la meiosis y la mitosis.
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Protocol
1. Preparación de los materiales necesarios
- Preparar reactivos para el crecimiento y la esporulación de las células de levadura.
NOTA: Si las cepas de levadura en ciernes son ade2- y trp1-, complemente todos los medios en los pasos 1.1.1-1.1.3 con una concentración final de 0,01% de adenina y 0,01% de triptófano de 1% de cepas. Si esteriliza los medios en autoclave, agregue estos aminoácidos solo después de que los reactivos hayan sido esterilizados en autoclave y se hayan dejado enfriar a temperatura ambiente.- Para el crecimiento vegetativo, prepare 2x medio sintético completo + dextrosa (2XSC) disolviendo 6.7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 2 g de mezcla completa de aminoácidos y 20 g de dextrosa en 500 mL de agua. Esterilizar la mezcla en autoclave durante 20 min a 121 °C o filtrando a través de un filtro de 0,2 μm.
- Para el primer paso de la esporulación, prepare 2x medio sintético completo + acetato (2XSCA) disolviendo 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 2 g de mezcla completa de aminoácidos y 20 g de acetato de potasio en 500 mL de agua. Esterilizar la mezcla en autoclave durante 20 min a 121 °C o filtrando a través de un filtro de 0,2 μm.
- Para el paso final de la esporulación, prepare acetato de potasio al 1% (1% de KAc) disolviendo 5 g de KAc en 500 ml de agua. Esterilizar la mezcla en autoclave durante 20 min a 121 °C o filtrando a través de un filtro de 0,2 μm.
- Preparar medicamentos y reactivos para microscopía, sincronización y anclaje.
- Para adherir las células al cubreobjetos durante las imágenes de lapso de tiempo, produzca 1 mg / ml de concanavalina A (ConA) en 1x PBS. Esterilizar el filtro con un filtro de 0,2 μm y almacenar alícuotas pequeñas (~10 μL) a -20 °C.
- Para usar el sistema NDT80-in, haga 2 ml de 1 mM β-estradiol disuelto en etanol. Esterilizar el filtro con un filtro de 0,2 μm y almacenar las alícuotas (~500 μL) a -20 °C.
- Para el sistema de anclaje, hacer 1 mg/ml de rapamicina disuelta en DMSO. Esterilizar el filtro con un filtro de 0,2 μm y almacenar alícuotas pequeñas (~10 μL) a -20 °C.
NOTA: Prepare pequeñas alícuotas de rapamicina para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación del medicamento.
- Generar cepas de levadura que contengan el sistema NDT80-in (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) y una proteína diana marcada con FRB en el fondo genético de anclaje (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Para este estudio se utilizó Ctf19-FRB. Además, una copia de la proteína histona Htb2 se marcó con mCherry para permitir el monitoreo de la progresión meiótica y la segregación de la cromatina.
- Preparar una cámara para imágenes de lapso de tiempo
- Comience a preparar la cámara 6 h-24 h antes de la obtención de imágenes (Figura 2). Corte una cámara de 18 mm x 18 mm del inserto de la caja de punta de pipeta con un bisturí caliente u otra cuchilla afilada.
- Use una punta de pipeta de plástico para extender una capa delgada de sellador de silicona alrededor de los bordes inferiores de la cámara que se adherirá al cubreobjetos. Agregue suficiente sellador para que los bordes de la cámara estén completamente cubiertos (ver Figura 2).
- Adhiera la cámara a un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm colocando suavemente la cámara, con el sellador hacia abajo, sobre el cubreobjetos. Asegúrese de que no haya huecos en el sellador para que la cámara no tenga fugas.
- Extienda 8-10 μL de ConA sobre el cubreobjetos. Dispense ConA en el centro del cubreobjetos y use una punta de pipeta para extender el ConA en una capa delgada tal que cubra la mayor parte del cubreobjetos que está rodeado por la cámara.
NOTA: Las cámaras de plástico se pueden reutilizar indefinidamente. Después de completar las imágenes de lapso de tiempo, retire la cámara del cubreobjetos con una navaja de afeitar, limpie el sellador de silicona de la cámara y mantenga las cámaras sumergidas en etanol al 95% para su uso futuro.
2. Espporulación de las células de levadura
- Realice los siguientes pasos para la inanición de las células de levadura para inducir el programa meiótico.
NOTA: Estos pasos son para la esporulación de la cepa de levadura W303. Otras cepas pueden requerir protocolos diferentes15. La eficiencia de esporulación es muy variable entre las cepas de laboratorio, con W303 exhibiendo una eficiencia de esporulación de ~ 60%16,17,18.- Tomar una sola colonia de la cepa de levadura diploide apropiada de una placa e inocular 2 mL de 2XSC y dejar crecer a 30 °C en un tambor de rodillos durante 12-24 h hasta la saturación.
- Diluir el cultivo saturado en 2XSCA añadiendo 80 μL del cultivo desde el paso 2.1.1 hasta 2 ml de 2XSCA. Dejar crecer a 30 °C en un tambor de rodillos durante 12-16 h. No lo deje en 2XSCA por más de 16 h porque las células pueden enfermarse o autofluorescentes.
- Realice dos lavados haciendo girar el cultivo a 800 x g a temperatura ambiente (25 °C) durante 1 min, desechando el líquido y resuspendiendo el pellet en 2 ml de agua destilada estéril.
- Después del segundo lavado, retire el líquido y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de KAc al 1% y déjelo crecer a 25 °C en un tambor de rodillos durante 8-12 h. Las células que han entrado en la meiosis se detendrán en paquiteno de la profase I.
- Sistema de liberación Prophase I
- Añadir β-estradiol directamente al cultivo de esporulación hasta una concentración final de 1 μM y vortex el tubo de cultivo rápidamente. El β-estradiol liberará células de la profase I.
3. Agotamiento de la proteína diana del núcleo mediante la técnica de anclaje
- Agregue rapamicina a las células para agotar la proteína marcada con FRB del núcleo en una etapa particular.
- Para agotar las proteínas del núcleo en la salida de la profase I, agregue rapamicina a una concentración final de 1 μg/ml al tubo de cultivo de esporulación al mismo tiempo que se agrega β-estradiol.
- Para agotar las proteínas del núcleo en una etapa particular de la meiosis, monitoree la etapa del ciclo celular comenzando a los 60 minutos después de la adición de β-estradiol. Cada 20 min, pipetear 5 μL de cultivo sobre un cubreobjetos de 24 mm x 40 mm y cubrir las células con un cubreobjetos de 18 mm x 18 mm. Mantenga los cultivos girando en el tambor de rodillos a 25 °C entre puntos de tiempo.
- Imagen de las células utilizando el filtro A594/mCherry y el objetivo 60x de un microscopio de fluorescencia. Establezca el porcentaje de transmitancia en 2% y el tiempo de exposición en 250 ms. La presencia de una, dos o cuatro masas de ADN indicará la etapa meiótica en la que las células han progresado. Añadir rapamicina a una concentración final de 1 μg/ml en la etapa meiótica de interés.
- Mantenga las células girando en el tambor de rodillos a 25 °C hasta que estén listas para la obtención de imágenes. El agotamiento nuclear de una proteína diana ocurre 30-45 min después de la adición de rapamicina 2,8.
4. Microscopía de fluorescencia time-lapse
- Haga una almohadilla de agar que se utilizará para crear una monocapa de células para obtener imágenes (consulte el paso 4.2).
- Corte y deseche la tapa y el 1/3 inferior de un tubo de microfuga de 1,5 ml para crear un cilindro. El cilindro servirá como molde para la almohadilla de agar. Hacer dos cilindros para tener un extra en caso de que el agar no polimerice correctamente en el primero.
- Coloque el cilindro del tubo de microfuga cortado en un portaobjetos de vidrio limpio con la parte superior del tubo boca abajo sobre el portaobjetos.
- Haga 6 ml de una solución de agar al 5% (use KAc al 1% como solvente) en un vaso de precipitados al 50 ml y microondas hasta que el agar esté completamente disuelto.
NOTA: El agar se evaporará fácilmente en el microondas; Observe el agar y encienda y detenga el microondas cuando el agar comience a hervir y gire el vaso de precipitados. Inicie y detenga el microondas varias veces para disolver completamente el agar. La solución de agar se hace en exceso de la cantidad necesaria para asegurar que el agar se disuelva completamente. - Corte la punta de la pipeta para hacer una abertura más grande y pipete ~ 500 μL de agar fundido en cada cilindro de tubo de microfuga. Déjelo reposar a temperatura ambiente hasta que el agar se solidifique (~10-12 min).
- Preparación de células de levadura para la obtención de imágenes
- Girar 200 μL del cultivo de esporulación desde el paso 3.2 a 800 x g durante 2 min en tubos de microcentrífuga de 1 ml. Retirar y desechar 180 μL del sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en el sobrenadante restante girando y moviendo el tubo.
- Pipeta 6 μL de las células concentradas en el cubreobjetos del centro de la cámara realizada en el paso 1.4.
- Sujete el cilindro con la almohadilla de agar hecha en el paso 4.1 y deslícelo con cuidado fuera del portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que el agar esté completamente plano en la parte inferior y, utilizando la parte inferior de la punta de una pipeta, aplique una ligera cantidad de presión al molde de microfuga de modo que la almohadilla de agar se empuje ligeramente por encima del límite del tubo.
- Invierta el molde de tal manera que la almohadilla de agar esté mirando hacia abajo hacia la cámara.
- Con fórceps, coloque suavemente la almohadilla de agar (todavía en el molde del tubo de microfuga) en la parte superior de las celdas. Use una punta de pipeta para deslizar suavemente la almohadilla de agar alrededor de la cámara 10-20 veces para crear una monocapa de células en el cubreobjetos.
- Deje la almohadilla de agar en la cámara durante 12-15 min. Este paso permitirá que las células se adhieran al ConA en el cubreobjetos.
- Transfiera 2 ml de cultivo de esporulación del paso 3.2 a dos tubos de microcentrífuga y gire a 15.700 x g durante 2 min. Transfiera el sobrenadante a tubos de microfuga limpios y gire de nuevo a 15.700 x g durante 2 min. Transfiera el sobrenadante a los tubos de microcentrífuga limpios que se utilizarán en el siguiente paso.
NOTA: Es importante utilizar el sobrenadante KAc preacondicionado con el β-estradiol y la rapamicina para asegurar una esporulación eficiente y el agotamiento continuo de la proteína de interés. - Después de que la almohadilla de agar se haya asentado en la cámara durante 12-15 minutos, flote y retire la almohadilla de agar antes de obtener la imagen. Para ello, añadir 2 ml del sobrenadante desde el paso 4.2.7 gota a gota a la cámara. Una vez que el líquido ha alcanzado la parte superior de la cámara, lo más probable es que la almohadilla de agar flote.
NOTA: Si la almohadilla de agar no flota automáticamente, espere 1-2 minutos. Si la almohadilla de agar aún no flota, retírela suavemente con fórceps. Idealmente, la almohadilla de agar flotaría por sí sola porque eliminarla antes de flotar podría llevar a la eliminación de las células. - Después de que la almohadilla de agar haya flotado, retírela suavemente con fórceps y deséchela. Coloque un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en la parte superior de la cámara para evitar la evaporación durante la obtención de imágenes.
- Configuración de una película en el microscopio
NOTA: Las instrucciones a continuación son para un microscopio invertido equipado con un portaportaobjetos que acomoda el cubreobjetos de 24 mm x 50 mm (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre microscopio, cámara y software). Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite de 60x para la adquisición de imágenes. Es posible que sea necesario modificar este protocolo cuando se usan otros microscopios u otros portaportaobjetos. Los pasos exactos para ejecutar los pasos 4.3.2 a 4.3.16 variarán según el microscopio y el software de imágenes utilizado. Ver sección 4.4 para obtener instrucciones para un microscopio diferente.- Coloque el cubreobjetos dentro del portaobjetos. Adhiera la arcilla de moldeo al costado del cubreobjetos para mantenerla segura en el soporte de la corredera.
- Abra el software de adquisición de imágenes. Utilice perillas de ajuste fino y de rumbo para enfocar las celdas mediante DIC o campo claro.
- En el menú principal del software de adquisición de imágenes, haga clic en Archivo > Adquirir (Resolver 3D). Aparecerán tres ventanas.
- En la ventana llamada Resolve 3D, haga clic en el icono del matraz Erlenmeyer . Esto abrirá una ventana titulada Experimento de diseño/ejecución, que contiene los controles para configurar un experimento para configurar una película de lapso de tiempo.
- En la pestaña Diseño , navegue hasta la pestaña etiquetada Secciones. Seleccione la casilla situada junto a Sección Z. Establezca las pilas z de la siguiente manera: Espaciado de sección óptica = 1 μm, Número de secciones ópticas = 5, Espesor de muestra = 5,0 μm.
- En la pestaña Canales , haga clic en el icono + para que aparezca una opción de canal. Seleccione el canal adecuado. Para este experimento, seleccionamos A594, que se utiliza para obtener imágenes de mCherry. Seleccione la casilla situada junto a Imagen de referencia y establezca la posición Z en el centro de la muestra en el menú desplegable.
- Seleccione un valor del menú desplegable adyacente a %T y Exp. para establecer el porcentaje de transmitancia y el tiempo de exposición, respectivamente. Para este experimento, se utiliza una transmitancia del 2% y un tiempo de exposición de 250 ms en el canal A594, y una transmitancia del 10% y un tiempo de exposición de 500 ms para el campo claro.
NOTA: El tiempo de exposición y el porcentaje de transmitancia variarán con diferentes microscopios. Para evitar la sobreexposición, utilice el porcentaje de transmitancia más bajo y el tiempo de exposición más corto posible que permita una visualización adecuada de la proteína de interés. - En la pestaña Time-lapse, seleccione la casilla junto a Time-lapse. En la tabla que aparece, escriba 10 en la columna min en la fila time-lapse y 10 en la columna horas en la fila de tiempo total. Esto ejecutará un curso de tiempo tomando imágenes cada 10 minutos durante 10 h.
- Selecciona la casilla situada junto a Mantener el enfoque con Ultimate Focus para evitar la desviación del escenario durante la película. En la pestaña Puntos , seleccione la casilla junto a Lista de puntos de visita.
- En el menú principal, haga clic en Ver > lista de puntos. Aparecerá una ventana llamada lista de puntos. Mueva el escenario a un área de la cámara que muestre una monocapa de celdas. Haga clic en Marca de punto en la ventana de lista de puntos.
- Mueva el escenario para seleccionar 25-30 puntos sin ninguna superposición para evitar la sobreexposición de las celdas. Cada campo será fotografiado durante cada curso de tiempo.
- En la ventana de lista de puntos, seleccione Calibrar todo para establecer el enfoque definitivo para cada punto. En la pestaña Diseño de la ventana Experimento de diseño/ejecución , introduzca el rango de valores de puntos (obtenidos de la ventana de lista de puntos) en el cuadro situado junto a Lista de puntos de visita. En la pestaña Ejecutar , guarde el archivo en el destino apropiado en el equipo. En la ventana Diseñar/Ejecutar experimento , seleccione el botón Reproducir (icono de triángulo verde) para iniciar la película.
- Método opcional: configurar una película en un microscopio
NOTA: Estas instrucciones son para un microscopio invertido equipado con un portaportaobjetos que puede acomodar un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm. Consulte la Tabla de materiales para obtener especificaciones sobre el microscopio, la cámara y el software de imágenes utilizado. Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite de 60x para la adquisición de imágenes.- Coloque el cubreobjetos dentro del portaobjetos. Abra el software de adquisición de imágenes. Utilice perillas de ajuste fino y de rumbo para enfocar las celdas mediante DIC o campo claro. Haga clic derecho en la ventana abierta del software. Aparecerá un menú desplegable.
- Haga clic en Controles de adquisición > Adquisición. Haga clic en Aplicación > Definir/Ejecutar experimento. Esto abrirá una ventana etiquetada ND Acquisition.
- En la ventana que se abre, marca la casilla situada junto a XY. Mueva el escenario a la ubicación deseada y haga clic en el cuadro debajo de Nombre de punto para seleccionar esa ubicación como punto . Repita esto hasta que se seleccionen 25-30 puntos sin ninguna superposición para evitar sobreexponer las celdas. Cada campo será fotografiado durante cada curso de tiempo.
- Establezca el porcentaje de transmitancia para cada canal fluorescente. Debido a que las cepas producen Htb2-mCherry, aquí se utiliza el filtro mCherry. En la ventana Adquisición que se abrió en el paso 4.3.3, navegue hasta el botón de 555 nm. Establezca el porcentaje de transmitancia en 5% ajustando la escala móvil debajo del botón de 555 nm hasta que lea 5%.
- Establezca el tiempo de exposición para cada canal fluorescente. En la ventana Adquisición , seleccione 200 ms en el menú desplegable Exposición.
NOTA: El tiempo de exposición y el porcentaje de transmitancia variarán con diferentes microscopios. Para evitar la sobreexposición, utilice el porcentaje de transmitancia más bajo y el tiempo de exposición más corto posible que permita una visualización adecuada de la proteína de interés. - Haga clic en el cuadro junto a Z en la ventana ND Acquisition . Coloque cinco pilas z de las células de levadura que están separadas por 1.2 μM.
- Haga clic en el cuadro junto a λ. Seleccione los canales apropiados que se utilizarán para el experimento. Para DIC, asegúrese de que Inicio esté seleccionado en el menú desplegable en Z pos. Para mCherry, asegúrese de que Todo esté seleccionado en el menú desplegable en Z pos. Esto asegura que solo se tome una sección (en el medio de la pila z) para DIC.
- Seleccione la casilla situada junto a Hora en la ventana Adquisición de ND . Seleccione la casilla debajo de Fase. En el menú desplegable de Intervalo, seleccione 10 min. En Duración, seleccione 10 horas (s). Esto ejecutará el curso de tiempo de tal manera que las imágenes se tomen cada 10 minutos durante 10 h.
5. Análisis de la segregación de cromatina
- Abra el software Fiji. Abra un campo de visión a la vez: para cada campo, abra los canales DIC y mCherry.
- Tome la proyección de máxima intensidad del canal mCherry para obtener una sola imagen: haga clic en Image > Stacks > Z Project, seleccione Max Intensity en el menú desplegable.
- Fusione los canales DIC y mCherry en una sola imagen: haga clic en Imagen > Color > Combinar canales.
- Siga una sola célula a través de la meiosis. Después de completar la meiosis II, registre el número de masas de ADN.
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Representative Results
Para controlar la segregación de la cromatina, la proteína histona Htb2 se marcó con mCherry. En la profase I, la cromatina aparece como una sola masa Htb2. Después de que los cromosomas homólogos se segregan en la primera división meiótica, la cromatina aparece como dos masas distintas (Figura 3A). Después de que las cromátidas hermanas se segregan, la cromatina aparece como cuatro masas. Si algunos cromosomas no se adhieren a los microtúbulos fusiformes, se pueden ver masas adicionales después de la meiosis I o la meiosis II.
El método descrito anteriormente se utilizó para estudiar el papel del componente cinetocoro Ctf19 para garantizar la segregación cromosómica adecuada en la meiosis de levadura en ciernes. Las cepas de levadura de anclaje que expresan Ctf19 marcadas con FRB se sincronizaron en la profase I utilizando el sistema NDT80-in (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 promovió NDT80; GAL4-ER). Como control, se utilizó una cepa NDT80-in con el fondo de la cepa de anclaje pero sin la proteína marcada con FRB (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10 promovió NDT80; GAL4-ER). Las células fueron liberadas de la detención de la profase I mediante la adición de β-estradiol. Se agregó rapamicina para agotar Ctf19-FRB del núcleo ya sea en el momento de la liberación (antes del reensamblaje del cinetocoro), 45 min después de la liberación (después del reensamblaje del cinetocoro pero antes de la meiosis I) o 3 h después del lanzamiento (justo antes de la meiosis II) (Figura 3A-F). Después de la adición de rapamicina, se realizó una microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo y se adquirieron imágenes cada 10 minutos durante el resto de la meiosis.
Después de la obtención de imágenes, se utilizó el software de acceso abierto Fiji para abrir las imágenes y realizar análisis para las figuras que muestran la progresión del tiempo (Figura 3A-F). El número de masas de ADN después de la meiosis II se contó en al menos 100 células que estaban sometidas a meiosis por condición. En las células de tipo salvaje con el fondo de anclaje, hay típicamente cuatro masas de ADN al final de la meiosis II, que representan los cuatro productos de la meiosis (Figura 3A). En una pequeña fracción de las células, sólo tres masas son visibles después de la meiosis II (Figura 3B, G). Sin embargo, es probable que tres masas sean el resultado de una célula que tiene cuatro productos de meiosis, pero dos de estas masas aparecen juntas después de la meiosis II.
Cuando Ctf19-FRB se ancla en el momento de la liberación de la salida de la profase I (t = 0 h), aproximadamente el 47% de las células muestran más de cuatro masas de ADN al finalizar la meiosis, lo que sugiere un defecto en la unión de cinetocoros y microtúbulos (Figura 3C, G). Con el anclaje de Ctf19-FRB después del ensamblaje del cinetocoro pero antes de la meiosis I (t = 45 min) o antes de la meiosis II (t = 3 h), aproximadamente el 16% de las células muestran masas de ADN adicionales. Estos resultados apoyan la hipótesis de que Ctf19 es importante para el reensamblaje del cinetocoro en la liberación de la profase I, pero es menos importante en la segregación cromosómica una vez que el cinetocoro se ha vuelto a ensamblar.
Los resultados obtenidos aquí muestran que la microscopía de lapso de tiempo combinada con la sincronización del ciclo celular y el agotamiento condicional de una proteína diana permiten el estudio de una proteína en una etapa meiótica específica. Aunque Ctf19 no es esencial para la mitosis, el cinetocoro meiótico se reorganiza ampliamente, y Ctf19 tiene un papel crucial en el reensamblaje del cinetocoro después de la salida 9,11,12 de la profase I. Los resultados de la Figura 3 muestran que cuando Ctf19 se agota antes del reensamblaje del cinetocoro, una gran fracción de células muestra masas de ADN adicionales después de la meiosis II. Cuando Ctf19 se agota del núcleo después del reensamblaje del cinetocoro, pero antes de la meiosis I o la meiosis II, hay menos células que muestran masas de ADN adicionales. Estos resultados sugieren que el papel más importante para Ctf19 es al final de la profase I. Esta diferencia en la fidelidad de la segregación cromosómica con el agotamiento de Ctf19 en varias etapas destaca la importancia de usar alelos condicionales específicos de la etapa para estudiar la función de las proteínas específicamente en la meiosis I o la meiosis II. Un mutante nulo meiótico habría mostrado un defecto grave y no habría proporcionado información sobre el papel de Ctf19 en cada etapa.
Además, aunque CTF19 no es un gen esencial, existe un fenotipo de fidelidad de transmisión cromosómica (ctf) durante el crecimiento vegetativo de los mutantes CTF19 19. El uso de un alelo nulo o alelo CTF19 mutante podría crear una población de células aneuploides que pueden no someterse a la meiosis correctamente. El uso de la técnica de anclaje y el sistema de sincronización NDT80-in evitan este problema al agotar precisamente Ctf19 del núcleo justo antes de la meiosis I o la meiosis II, reduciendo la preocupación de que las células analizadas fueran aneuploides.
Figura 1: Descripción general del experimento. Caricatura de células de levadura que muestra un solo par de cromosomas homólogos. Las células NDT80-in entran en meiosis y detención en la profase I. Después de la adición de β-estradiol, las células entran en las divisiones meióticas sincrónicamente. La adición de rapamicina determina cuándo la proteína diana (marcada con una estrella) está anclada. En este experimento, la proteína diana Ctf19 se ancló en tres puntos de tiempo diferentes mediante la adición de rapamicina (RAP) al mismo tiempo que la profase I (adición de RAP a t = 0 min), después de la liberación de la profase I (adición de RAP a t = 45 min) y después de la segregación del cromosoma I de la meiosis (adición de RAP a t = 3 h). Las gruesas flechas negras indican la etapa del ciclo celular de la adición de rapamicina y, por lo tanto, el agotamiento de la proteína objetivo. Abreviaturas: RAP = rapamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de la cámara para experimentos de imágenes de lapso de tiempo. (A) Cámara reutilizable (derecha) cortada de un inserto de soporte de punta de pipeta (izquierda). El inserto del soporte de la punta de la pipeta se corta con una cuchilla al rojo vivo para eliminar una porción cuadrada de 4 x 4 cuadrados del inserto. Las líneas discontinuas indican una sección de muestra del soporte de la punta que se puede cortar para hacer una cámara. Los divisores de plástico restantes dentro del recorte cuadrado de 4 x 4 cuadrados se recortan y queda una cámara hueca (derecha). (B) Para crear la cámara final, se agrega sellador de silicona a los bordes en un lado de la cámara y luego se coloca encima de un cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El tiempo en que se ancla Ctf19 afecta la segregación de la cromatina. (A-F) Imágenes representativas de lapso de tiempo de células que expresan Htb2-mCherry durante la meiosis. Las imágenes se tomaron cada 10 minutos, inmediatamente después de la adición de β-estradiol. Barras de escala = 5 μm. Los números en la esquina superior derecha de cada fotograma etiquetan el tiempo transcurrido entre cada fotograma, y el tiempo 0 indica el fotograma en el que la cromatina se segrega en la meiosis I. Solo se contaron las células que completaron las divisiones meióticas. (A) Célula de tipo salvaje (sin proteína marcada con FRB) en la que se añadió β-estradiol 12 h después de la transferencia de KAc. La célula contiene cuatro masas de ADN después de la finalización de la meiosis II. (B) Célula Ctf19-FRB en la que se añadió rapamicina a t = 0 (simultáneamente con la adición de β-estradiol). Esta célula muestra tres masas de ADN después de la meiosis II. (C) Célula Ctf19-FRB en la que se añadió rapamicina a t = 0 (simultáneamente con la adición de β-estradiol). Esta célula muestra cinco masas de ADN después de la meiosis II. (D) Célula Ctf19-FRB en la que se añadió rapamicina a t = 0 (simultáneamente con adición de β-estradiol). Esta célula muere después de completar la meiosis II. (E) Célula Ctf19-FRB en la que se agregó rapamicina 45 min después de la adición de β-estradiol. Esta célula muestra cinco masas de ADN después de la meiosis II. (F) Célula Ctf19-FRB en la que se añadió rapamicina 45 min después de la adición de β-estradiol. Después de la meiosis II, seis masas de ADN están presentes. (G) Cuantificación del número de masas de ADN en al menos 100 células para cada condición (dos películas analizadas para cada condición). t = debajo de cada barra indica el momento en que se añadió rapamicina en relación con la adición de β-estradiol. Abreviaturas: MII = meiosis II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo combina el sistema NDT80-in para sincronizar células, la técnica de anclaje para agotar las proteínas del núcleo y la microscopía de lapso de tiempo de fluorescencia para obtener imágenes de las células de levadura en ciernes durante la meiosis. El sistema NDT80-in es un método para la sincronización del ciclo celular meiótico que utiliza una profase I de detención y liberación 4,8. Aunque las células individuales variarán ligeramente en la cantidad de tiempo dedicado a cada una de las etapas meióticas posteriores, la mayoría de las células mantendrán un alto grado de sincronía a lo largo de las divisiones meióticas.
La técnica anchor away es una herramienta adaptable para estudios mitóticos y meióticos. Al alterar la proteína diana de anclaje y el tiempo de adición de rapamicina, este método se puede adaptar para estudiar varias proteínas durante cualquier etapa de la meiosis de levadura en ciernes. Los métodos comunes para hacer mutantes condicionales para estudiar la mitosis de levadura en ciernes no siempre son adecuados para estudios meióticos. Por ejemplo, el uso de un promotor represible a menudo requiere un cambio en la fuente de carbono para alterar la expresión de la proteína diana, lo que puede interrumpir la meiosis20. Los mutantes sensibles a la temperatura dependen de un cambio de temperatura para reducir o abolir la actividad de la proteína diana. Muchos de estos mutantes condicionales no se pueden usar en estudios meióticos porque las condiciones cambiantes de nutrientes o la temperatura pueden interrumpir la meiosis21,22,23. Además, las deleciones o mutantes pueden limitar los estudios de meiosis porque la expresión de una proteína mutante al principio de la meiosis podría bloquear o afectar negativamente las etapas posteriores. La técnica de anclaje puede eludir estos desafíos porque no depende de cambios en la nutrición o la temperatura8. Además, el agotamiento de la proteína puede regularse temporalmente de tal manera que el tiempo de adición de rapamicina determine cuándo se anclará la proteína.
Una limitación de la técnica de anclaje es que puede no ser adecuada para proteínas no nucleares porque se basa en la subunidad ribosómica Rpl13A como ancla para transportar la proteína diana fuera del núcleo. Sin embargo, existen otras aplicaciones de la técnica de anclaje al cambiar las interacciones proteína-proteína que también pueden ser útiles durante la meiosis, como anclar proteínas a complejos o amarrarlas a membranas8. Estudios previos muestran que el agotamiento nuclear de las proteínas diana ocurre dentro de los 30 min de la adición de rapamicina 2,8. Sin embargo, es posible que algunas proteínas necesiten un período más largo o más corto para ser expulsadas del núcleo. Para garantizar que la proteína diana se transporta fuera del núcleo, la proteína diana se puede marcar con FRB fusionado a GFP (FRB-GFP) para controlar el tiempo transcurrido entre la adición de rapamicina y el agotamiento nuclear. Otra limitación del sistema de anclaje es que algunas proteínas son sensibles a las etiquetas FRB y FRB-GFP en el extremo C. Como tal, el marcado N-terminal de la proteína diana con FRB es una estrategia alternativa para anclar una proteína diana.
Para controlar la segregación de la cromatina, las células de levadura en ciernes expresaron Htb2-mCherry. En esta cepa, la proteína Htb2 se marca en su locus endógeno, lo que garantiza que Htb2 se exprese normalmente. Otras proteínas marcadas con fluorescencia también podrían usarse para monitorear diferentes aspectos de la meiosis. Al construir una cepa para imágenes de lapso de tiempo, es importante considerar que algunas proteínas son sensibles a las etiquetas fluorescentes C-terminales. Los ensayos de crecimiento y esporulación de la cepa que alberga la proteína marcada con fluorescencia aseguran que la etiqueta no altere la función de la proteína. Un desafío de la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo es exponer las células a suficiente fluorescencia para que las proteínas fluorescentes se detecten mientras se evita la muerte celular o la desaceleración de la meiosis por exposición excesiva. Un paso importante para la solución de problemas es encontrar la configuración adecuada del microscopio y la cámara para lograr este equilibrio. El tiempo de exposición requerido variará ligeramente entre las proteínas, por lo que se deben realizar múltiples iteraciones de un experimento para determinar el tiempo de exposición apropiado. Cuando se utiliza el método de cámara descrito aquí para experimentos de imágenes de lapso de tiempo, un paso especialmente sensible es lograr una monocapa de células para obtener imágenes. Sin una monocapa, las células se acumulan una encima de la otra, lo que presenta un desafío para el análisis adecuado de imágenes y datos. El uso de una almohadilla de agar, que ayuda a las células a adherirse al ConA y extiende las células alrededor de la cámara, es una forma económica y eficiente de obtener monocapas. Mover la almohadilla de agar para extender las células alrededor de la cámara de tal manera que se logre una monocapa puede ser un desafío. Asegurarse de que la almohadilla de agar está haciendo movimientos muy pequeños durante el proceso de movimiento puede ayudar a crear una monocapa. La fabricación de una cámara reutilizable permite la generación económica de datos de imágenes de lapso de tiempo. Con una limpieza y desinfección adecuadas, las cámaras de plástico descritas aquí se pueden reutilizar indefinidamente. Es una buena práctica que las cámaras se retiren del cubreobjetos inmediatamente después de las imágenes de lapso de tiempo y se almacenen en etanol al 95% hasta el próximo uso.
Las imágenes de lapso de tiempo proporcionan información sobre el ciclo celular que se puede pasar por alto al obtener imágenes de células fijas 1,2. Por ejemplo, cuando se monitorea la duración de las etapas meióticas, las variaciones entre células individuales se pueden examinar con mayor precisión al obtener imágenes de células vivas en comparación con las poblaciones de células fijas. Debido a que las proteínas de levadura se pueden marcar fácilmente con proteínas fluorescentes, el acoplamiento de imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia con el sistema NDT80-in y la técnica de anclaje se puede adaptar para estudios adicionales, como el monitoreo de la segregación cromosómica individual y el momento de etapas meióticas específicas. Al monitorear la progresión del ciclo celular después de la liberación de la profase I en las células NDT80, es crucial tener una proteína marcada con una molécula fluorescente que marcará las etapas de la meiosis. Los cromosomas individuales pueden ser monitoreados a lo largo de la meiosis integrando repeticiones del operón lac (LacO) cerca del centrómero de un cromosoma en células que expresan LacI-GFP. LacI-GFP se une fuertemente a LacO y se visualiza como un foco brillante, que puede ser seguido a través de las divisiones meióticas por microscopía de lapso de tiempo24,25. Se han utilizado varias proteínas con etiquetas fluorescentes para controlar la duración de las etapas meióticas. Estos incluyen Tub1, la subunidad α-tubulina que se incorpora a los microtúbulos; Zip1, un componente del complejo sinaptonémico; y Spc42, un componente del cuerpo del poste del huso 1,2,26,27.
En conclusión, este método incorpora la sincronización del ciclo celular meiótico, el agotamiento condicional de una proteína diana y la microscopía de fluorescencia time-lapse para estudiar la segregación cromosómica meiótica. Al obtener imágenes de las células de levadura en ciernes durante la meiosis y usar mutantes condicionales que afectan solo las etapas previstas de la meiosis, este método puede proporcionar datos precisos sobre el ciclo celular meiótico.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos al Centro de Imágenes de Microscopía Óptica de la Universidad de Indiana. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (GM105755).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
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