在这里,我们描述了一个易于实施的标准化的微生理系统,该系统反映了人体骨髓 体内 结构的复杂性,为精细研究广泛的正常和病理事件提供了一个相关的模型。
髓质生态位是一个复杂的生态系统,对于维持常驻细胞的体内平衡至关重要。事实上,骨髓包括复杂的细胞外基质和各种细胞类型,如间充质干细胞、成骨细胞和内皮细胞,通过直接的细胞间相互作用以及细胞因子的产生,深入参与造血干细胞的调节。为了密切模拟这种 体内 结构并进行反映人类骨髓反应的实验,已经创建了几种基于生物材料的3D模型,主要依赖于原代基质细胞。在这里,描述了一种协议以获得易于设置并提供骨髓样结构特征的最小和标准化系统,该系统结合了包括内皮细胞在内的不同细胞群,并反映了 体内 骨髓组织的异质性。这种3D骨髓样结构 – 使用磷酸钙颗粒和人类细胞系组装而成,代表骨髓微环境 – 允许通过组合或替换系统内不同的原代细胞群来监测各种生物过程。然后,可以在固定、石蜡包埋和组织学/免疫组织化学染色后收集最终的 3D 结构以进行图像分析,以便在系统内定位细胞,或者解离以收集每个细胞成分以进行分子或功能表征。
骨髓 (BM) 存在于中轴骨和长骨以及小梁扁平骨的中央腔内,包含各种不同的细胞和非细胞成分。在结构水平上,它由造血组织岛(也称为“血细胞”)1,2 和散布在小梁骨内的血管窦包围的脂肪细胞组成3。在长而扁平的骨骼中,骨骼和骨髓的血液供应通过血管内膜网络相互连接4。隐藏在这个坚实的保护网络中,BM宿主浸泡在海绵状基质中的非常未成熟的细胞,并构成常驻间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)分化的位置5。事实上,除了通过产生成骨细胞来更新骨组织外,BM的主要已知功能之一在于造血发育6。
BM造血组织包括多种细胞类型,即HSC、前体细胞和分化的血细胞,如淋巴细胞、中性粒细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板7。造血细胞不是随机排列在BM空间中,而是在造血生态位内显示特定的组织,包括许多不同来源的细胞类型(成骨细胞,破骨细胞,MSC,脂肪细胞,正窦内皮和血管周围基质细胞,免疫细胞,神经细胞和不同的成熟造血细胞),形成复杂的结构以确保正常的造血8.造血生态位的生物学功能包括通过不同的机制(细胞-细胞和细胞-基质相互作用、可溶性因子的产生、缺氧)调节HSC存活、粘附、静止、归巢和分化,以响应多种生理或非生理应激3,6。尽管这些造血生态位最初被认为是同质实体,但单细胞和成像分析等技术进步已逐渐揭示其复杂性,动力学和适应性特性9,10,11。
更换和减少使用动物来破译人类生理和病理过程的迫切需要带来了新的机遇和挑战11,12。在新描述的体外工具中,已经提出了比经典二维(2D)培养物更好地模拟体内人类BM的三维(3D)模型13,14,15,16,17。因此,3D建模似乎是观察细胞-细胞和细胞-基质相互作用的一种有前途的方法,更接近体内发生的相互作用。使用各种这些模型,一些团队已经证明了HSC18,19的存活和增殖。有几种3D模型可用,最常见的方法是使用基于支架的3D生物材料,例如水凝胶,胶体或胶原蛋白,与MSCs相关的利用其成骨细胞谱系分化能力20,21,22。然而,尚未达成全球同意以用户友好和标准化的方式满足人类细胞研究的所有要求23,特别是因为这些当前的3D系统主要依赖于原代基质细胞,因此对原始样品的访问,组织可用性和异质性有限。
此外,应引入内皮细胞区室,因为这些细胞是细胞间相互作用的主要组成部分,并参与白血病24 和转移25中的干细胞命运和BM疾病的发展。我们之前报道过,在标准化的人类3D骨髓模型中添加病理元素概括了在患者样本中观察到的特征,例如细胞外基质(ECM)改变26。为了更好地了解人类BM微环境与常驻细胞之间的动力学和相互作用,我们为用户友好和标准化的系统提供了一个详细的协议,以建立一个最小的,组织良好的BM样结构。该系统由三种人骨髓细胞类型组成 – 代表微环境的内皮细胞和基质细胞以及HSC。通过使用特定的珠子作为支架和成骨细胞分化培养基,获得的3D结构将模仿人类髓质壁龛,从而可以方便地研究人类骨髓。
目前人类生理和相关病理问题研究面临的挑战之一是缺乏准确模拟人体器官复杂功能的模型。在人类BM 3D模型的情况下,许多模型使用水凝胶并部分复制BM,说明了与传统2D培养相比,3D培养条件在确保例如更好的成骨细胞分化方面的力量27,28。然而,尽管具有良好的可重复性和易用性,但这些系统不能模仿人类BM 3D结构和架构,这可能会对进一步的分析产生重大影响。技术进步使科学家能够使用基于灌注的生物反应器系统更好地再现天然人类成骨细胞生态位环境,以保持某些HSC特性29。微流体装置的发展导致了复制相关骨髓样结构的新方法,但迄今为止仅实现了骨髓的有限特征,因此限制了应用30,31,32,33。
材料科学的进步促进了各种天然或合成生物材料的开发,可用于开发相关的3D骨培养系统。然而,这种系统有时很难在没有生物物理学内部技能的标准生物实验室中开发。此外,在大多数情况下,这些系统实现了模拟人体骨骼3D结构(包括BM微环境)的有限能力,并且使用了大量的细胞因子和生长因子,从而创建了人工丰富的培养基34。
选择诱导成骨细胞分化而不是脂肪细胞分化是基于以下事实:成骨细胞前和成骨细胞已被描述为内膜生态位的一部分35。这确定了成骨细胞作为骨和骨髓的要求成分。在骨髓的细胞成分中,内皮细胞和基质细胞占据了微环境的很大一部分。此外,这两种细胞类型产生细胞外基质的结构非细胞成分和参与调节稳态和分化的细胞因子,这里要求产生钙化结构。因此,这证明了使用内皮细胞和基质细胞以及我们选择的细胞系以允许轻松访问并提高实验室之间的可重复性。随着HMEC-1系的培养随着时间的推移更加稳定,该细胞系被保留用于3D系统的开发。对于基质细胞,我们在2D培养中比较了来自正常骨髓的基质细胞系的成骨细胞分化能力:HS5和HS27A。我们发现HS5系的分化程度不如使用任一细胞系生成的3D系统中的HS27A系。在这方面,试图用HS5系列取代HS27A电池导致生产出刚性较低的结构,这表明HS27A更合适。
HS27A和HMEC-1细胞系都以不同的培养基组合培养,其中一种引起HMEC-1的最佳刚性结构和沿成骨细胞结构的排列,从而使细胞外基质的产生为基本结构带来相对刚性。对D14分化进展的分析表明,D21分化更先进(BSP的测量,晚期成骨细胞标志物),HMEC-1:HS27A的比例为1:2,当引入2×106 HS27A时,结果更好。内皮细胞在调节稳态和分化(除其他外通过细胞因子的供应)方面也起着重要作用。HMEC-1细胞维持在这个系统中的事实表明它们至少可以发挥这一作用,这有助于我们模型的合法性。对于HMEC-1内皮系,重要的是尽早引入它,以便它可以正确地整合到结构中,并希望这些细胞能够在结构内形成对齐甚至管。HS27A和HMEC-1的共培养试验是通过在不同阶段引入后者来进行的:D0,D7,D14;无论是在基质细胞的分化还是内皮细胞的维持或定位方面,都没有观察到显着差异。因此,这些细胞是在过程开始时引入的。造血细胞是在成骨细胞分化发展到足以有利于细胞间相互作用的时候引入的。这种选择还受到这样一个事实的限制,即这种成骨细胞分化是由使用培养基决定的,根据我们的测试,培养基不能完全支持造血细胞的维持。血液学细胞可以是细胞系或原代 BM CD45 造血细胞。
从这个3D模型中,我们可以设想用正常或病理的原代细胞替换每种细胞类型,甚至可以添加其他细胞类型来增强仿生特性,例如免疫细胞,脂肪细胞或成纤维细胞26。事实上,HS27A细胞系已被低传代的原代BM MSCs所取代。同样,血液学细胞系被原代BM造血细胞取代。然而,原代内皮细胞替代HMEC-1细胞尚未经过测试。目前,该模型仍然可以在脉管系统表征方面进行改进,因为即使存在内皮细胞并与微环境中的其他细胞(例如造血细胞)正确相互作用,它们也不会形成结构化血管,从而排除了流动灌注以模拟功能性血管。总体而言,这可能会逐渐增加当前最小3D模型的复杂性和代表性。添加其他细胞类型可能有助于研究其他问题,例如局部BM炎症的重要性或对免疫疗法的耐药性。
然而,这种3D系统需要3周才能添加感兴趣的细胞,血液细胞或上皮癌细胞,如果转移过程被评估,可以添加。需要保持无菌条件,因为每周更换两次培养基有时会导致培养基污染。此外,由于一些细胞可能通过插入物的孔迁移并开始分散到孔中,导致培养基消耗增加,因此建议定期监测。
我们在这里描述了一种允许成骨细胞分化的3D支架,并开发了一种相关的体 外3D 人类BM样微环境。该系统允许 原位 分析和最终活细胞检索。该系统提供了一种新的高度灵活的工具,可重复且用户友好,具有广泛的应用,用于研究人类BM微环境中的相互作用和机制。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢来自CRCL细胞术平台的P. Battiston-Montagne和A. Jambon以及来自Léon Bérard中心转化研究与创新系研究病理学平台的N. Gadot和C. Leneve。作者感谢B. Manship的英文版。这项工作由Inserm和FI-LMC资助给V.M.S.,S.L.K.A.和L.B.得到法国Hématologie协会的赠款支持。
3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |