Summary
여기에서는 인간 골수의 생체 내 구조의 복잡성을 반영하는 구현하기 쉽고 표준화된 미세생리학적 시스템을 설명하여 광범위한 정상 및 병리학적 사건을 미세하게 연구할 수 있는 관련 모델을 제공합니다.
Abstract
수질 틈새 시장은 상주 세포의 항상성을 유지하는 데 필수적인 복잡한 생태계입니다. 실제로 복잡한 세포외 기질과 중간엽 줄기세포, 조골세포, 내피세포 등 다양한 세포 유형을 포함하는 골수는 사이토카인 생산뿐만 아니라 직접적인 세포-세포 상호작용을 통한 조혈모세포 조절에 깊이 관여합니다. 이 in vivo 구조를 밀접하게 모방하고 인간 골수의 반응을 반영하는 실험을 수행하기 위해 주로 일차 기질 세포에 의존하는 생체 재료를 기반으로 여러 3D 모델이 만들어졌습니다. 여기서, 프로토콜은 설정하기 쉽고 내피 세포를 포함한 다양한 세포 집단을 결합하고 생체 내 골수 조직의 이질성을 반영하는 골수 유사 구조의 특징을 제공하는 최소한의 표준화된 시스템을 얻기 위해 설명됩니다. 이러한 3D 골수-유사 구조-골수 미세환경을 대표하는 인산칼슘계 입자 및 인간 세포주를 사용하여 조립-시스템 내에서 상이한 일차 세포 집단을 결합하거나 대체함으로써 매우 다양한 생물학적 과정의 모니터링을 가능하게 한다. 그런 다음 최종 3D 구조는 고정 후 이미지 분석, 파라핀 임베딩 및 시스템 내 세포 국소화를 위한 조직학적/면역조직화학적 염색을 위해 수확하거나 해리하여 분자 또는 기능 특성 분석을 위해 각 세포 구성 요소를 수집할 수 있습니다.
Introduction
골수 (BM)는 축 및 긴 뼈의 중앙 구멍과 섬유주 편평한 뼈 모두에서 발견되며 다양한 별개의 세포 및 비 세포 구성 요소를 포함합니다. 구조적 수준에서, 그것은 조혈 조직 섬("헤마톤"이라고도 함)1,2과 섬유주 뼈 내에 산재된 혈관 부비동으로 둘러싸인 지방 세포로 구성됩니다.3. 길고 평평한 뼈에서, 뼈와 골수로의 혈액 공급은 혈관의 내막 네트워크를 통해 상호 연결된다4. 이 견고한 보호 네트워크에 숨겨진 BM은 해면질 기질에 잠긴 매우 미성숙 한 세포를 호스트하고 상주 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 및 조혈 줄기 세포 (HSC)5의 분화 위치를 구성합니다. 실제로, 조골 세포의 생산을 통한 뼈 조직의 재생을 제외하고, BM의 주요 알려진 기능 중 하나는 조혈 발달에 있습니다6.
BM 조혈 조직은 다양한 세포 유형, 즉 HSC, 전구체 및 림프구, 호중구, 적혈구, 과립구, 단핵구 및 혈소판과 같은 보다 분화된 혈액 세포를포함한다7. 조혈 세포는 BM 공간에 무작위로 배열되지 않지만 조혈 틈새 내에서 특정 조직을 표시하며, 여기에는 다양한 기원의 많은 세포 유형(조골세포, 파골세포, MSC, 지방세포, 정현파 내피 및 혈관주위 기질 세포, 면역 세포, 신경계 및 뚜렷한 성숙한 조혈 세포)이 포함되어 정상적인 조혈을 보장하기 위한 복잡한 구조를 형성합니다.8 . 조혈 틈새의 생물학적 기능에는 여러 생리적 또는 비생리적 스트레스에 대한 반응으로 HSC 생존, 부착, 정지, 귀환 및 다양한 메커니즘(세포-세포 및 세포-기질 상호 작용, 가용성 인자 생성, 저산소증)을 통한 분화 조절이 포함됩니다3,6. 이러한 조혈 틈새는 처음에는 균질 한 실체로 인식되었지만 단일 세포 및 이미징 분석과 같은 기술 발전은 복잡성, 역학 및 적응 특성을 점진적으로 밝혀 냈습니다 9,10,11.
인간의 생리적, 병리학적 과정을 해독하기 위해 동물의 사용을 대체하고 줄여야 할 결정적인 필요성은 새로운 기회와 도전으로 이어집니다11,12. 새롭게 기술된 시험관내 도구들 중에서, 고전적인 2차원(2D) 배양물(13,14,15,16,17)보다 생체내 인간 BM을 더 잘 모방하는 3차원(3D) 모델이 제안되었다. 따라서 3D 모델링은 생체 내에서 발생하는 상호 작용에 더 가까운 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 관찰하는 유망한 접근 방식으로 보입니다. 이러한 다양한 모델을 사용하여 일부 팀은 HSC18,19의 생존과 확산을 입증했습니다. 여러 3D 모델을 사용할 수 있으며, 가장 일반적인 접근 방식은 조골 세포 계통 분화 능력(20,21,22)을 활용하는 MSC와 관련된 하이드로 겔, 콜로이드 또는 콜라겐과 같은 스캐 폴드 기반 3D 생체 재료를 사용하는 것입니다. 그럼에도 불구하고, 사용자 친화적이고 표준화된 방식으로 인간 세포에 대한 연구를 위한 모든 요건을 충족시키기 위한 전 세계적인 동의에 도달하지 못했습니다.23, 특히 이러한 현재의 3D 시스템은 주로 1차 기질 세포에 의존하기 때문에 1차 샘플에 대한 제한된 접근, 조직 가용성 및 이질성으로 어려움을 겪고 있습니다.
또한, 내피 세포 구획은 세포-세포 상호 작용의 주요 구성 요소를 나타내고 백혈병24 및 전이25 모두에서 줄기 세포 운명 및 BM 질환 발달에 관여하기 때문에 도입되어야합니다. 우리는 이전에 표준화된 인간 3D 골수 모델에서 병리학적 요소의 추가가 세포외 기질(ECM) 변경과 같은 환자 샘플에서 관찰된 특징을 요약한다고 보고했습니다(26). 인간 BM 미세 환경과 상주 세포 간의 역학 및 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 당사는 사용자 친화적이고 표준화된 시스템을 위한 상세한 프로토콜을 제공하여 최소한의, 잘 조직된 BM과 유사한 구조를 구축합니다. 이 시스템은 미세 환경을 대표하는 내피 세포와 기질 세포의 세 가지 인간 골수 세포 유형과 HSC로 구성됩니다. 특정 비드를 스캐폴드 및 조골세포 분화 배지로 사용함으로써 얻어진 3D 구조는 인간 수질 틈새를 모방하여 인간 골수에 대한 편리한 연구를 가능하게 합니다.
Protocol
참고: 골수와 유사한 백본 구조를 준비하기 위해 이 프로토콜은 중상 인산칼슘(BCP) 비드에 비드를 HMEC-1 내피 세포 및 HS27A 기질 세포와 결합하는 데 의존합니다. BCP 비드는 특정 매체와 함께 3D 구조 성형을 허용하는 스캐폴드 역할을 합니다.
1. 비드 준비 및 살균
- 1.5mL 튜브에 각 삽입물(바닥에 폴리카보네이트 멤브레인이 있는 작은 원통형 플라스틱 접시)에 대해 35-40mg의 BCP 비드(HA/β-TCP 60/40; 45-75μm)의 무게를 잰다( 재료 표 참조). 비드의 무게를 측정한 후, 오토클레이브 사이클(121°C에서 60분) 동안 뚜껑이 열리지 않도록 1.5mL 튜브의 상단을 통해 깨끗한 바늘로 작은 구멍을 뚫고 튜브를 닫힌 멸균 상자에 수직 위치에 놓습니다.
2.3D 멸균 후드 아래에 제제 삽입
- 멸균 폴리카보네이트 세포 배양 삽입물을 6-웰 플레이트의 웰 내에 넣는다. 1.5mL 튜브의 멸균 BCP 비드를 인서트에 붓습니다. 삽입물 안에 350μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 떨어뜨려 비드를 조심스럽게 세척한 다음 4.5mL의 1x PBS를 웰에 추가합니다. 팁을 웰 구석에 놓고 진공 또는 5mL 피펫을 사용하여 PBS를 제거하고 폐기합니다. 세척 단계를 두 번 반복하십시오.
- 비드가 세척되면 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 1x PBS를 사용하여 시스템을 차단합니다. 블로킹 용액 350 μL를 삽입물에 조심스럽게 첨가하고 웰에 4.5 mL를 첨가하고 전체 플레이트를 밤새 37°C, 5%CO2 의 인큐베이터에 넣었다.
참고: 2.1단계와 2.2단계는 세포 파종 전에 BCP 비드에서 이온 방출을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
3. 세포주 수확 및 3D 유지 보수
참고: 이 배양 단계 후에 미세 환경 세포가 추가되어 3D 구조 백본을 형성합니다. 이 시스템은 SV40의 큰 T 항원으로 불멸화 된 인간 미세 혈관 내피 세포 인 HMEC-1 및 인간 유두종 바이러스로 불멸화 된 인간 골수 기질 세포 인 HS27A의 사용을 기반으로하며, 이는 견고한 BM 유사 구조를 형성하는 능력과 내피 세포의 포함과의 호환성으로 인해 발생합니다.
- 시스템에 세포를 추가하기 전에 다음 배양 배지를 준비하십시오.
- 완전한 골분화배지(ODM) 50mL의 경우, 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM) 45mL + FBS 5mL + 페니실린-스트렙토마이신 0.5mL + 덱사메타손 8× 10-4mg/L + 베타-글리세로포스페이트 2.16g/L + 아스코르브산 44mg /L를 섞습니다.
- 완전한 HMEC-1 배지 50mL의 경우, 45mL의 MCDB 131 + 5mL의 FBS + 0.5mL의 페니실린-스트렙토마이신 + 1%의 글루타민 대체물 + 1mg/L의 하이드로코르티손 + 10μg/L의 EGF를 혼합합니다.
- 시스템에서 차단 솔루션을 제거합니다. 15mL 튜브에 1 × 10 6 HMEC-1 세포 (혈관 구획을 나타냄)와 2 × 106 HS27A 세포 (중간엽 기질 세포 구획을 나타냄)를 혼합하고 실온에서 1,575 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 175μL의 HMEC-1 배지(HMEC-1 세포 성장을 위한 특정 배지)와 175μL의 ODM(HS27A 골분화를 위한 특정 배지)을 추가합니다.
- 각 삽입물 내부에 3 × 106 개의 총 세포를 포함하는이 현탁액 350 μL를 붓습니다. 그런 다음 세포가 없는 4.5mL의 혼합 배지(HMEC-1 배지 2.25mL + ODM 2.25mL)를 플레이트의 웰에 붓습니다. 혼합물을 부드럽게 흡인하고 1mL 마이크로피펫으로 여러 번 분주하여 삽입물 내에서 세포와 BCP 비드를 균질화합니다. 인서트 바닥에 정착하기 위해 전체 믹스를 할당하십시오.
알림: 여러 개의 삽입물을 배양하는 경우 하나의 데드 볼륨이 있는 혼합 준비가 권장됩니다. 예를 들어, 4개의 인서트가 배양되는 경우 항상 5개의 인서트에 필요한 부피를 준비하십시오. - 일단 내피 및 중간엽 세포가 삽입물 내부에서 균질화되면, 6-웰 플레이트를 37°C, 5%CO2 의 배양기 내부에 3주 동안 보관한다. 1mL 마이크로피펫을 사용하여 인서트에서 배지를 조심스럽게 제거하고 인서트 모서리를 방해하지 않도록 팁을 내부 인서트 벽에 배치하여 인서트 내부의 배지와 웰을 일주일에 2번 교체합니다.
참고: 검색된 상청액은 추후 단백질 정량화를 위해 모든 단계에서 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
4. 시스템에 관심 셀 추가
참고: HMEC-1 및 HS27A 배양 3주 후, HS27A 세포의 골분화는 시스템의 강성을 가능하게 했습니다. 이 단계에서 삽입물 내에 관심 있는 혈액학적 세포(추가된 세포의 수는 1 × 104 에서 1 × 106까지 다양할 수 있음)를 추가합니다. 추가된 세포는 BCR-ABL 종양유전자로 형질감염된 TF1 세포와 급성 골수성 백혈병 환자 또는 건강한 기증자로부터 오는 1차 단핵 CD34+ 세포였습니다.
- ODM 화합물은 혈액 세포에 독성이 있고 시스템 강성이 완료되면 계속 추가할 필요가 없으므로 이 단계에서 배지 구성을 변경합니다. 예를 들어, 조혈 유지를 지원하려면 ODM 배지를 조혈 세포주(FBS 10% 및 페니실린-스트렙토마이신 1%가 보충된 RPMI)에 대해 완전한 RPMI로 대체하거나 1차 조혈 세포에 IMDM으로 대체합니다. 매주 3D 변경 사항을 위해 50% 완전한 HMEC-1 배지 및 50% 완전한 RPMI/IMDM 배지의 배치를 준비합니다.
- 이 조합 배지에 관심있는 혈액 세포를 다시 부유시키고 삽입물 내에 추가하십시오. 약물 치료 프로토콜이 필요한 경우 치료하기 전에 관심 세포를 추가한 후 24시간 동안 기다렸다가 뼈와 같은 구조에 부착할 시간을 줍니다.
- 요구 사항에 따라 3D 세포 배양 기간을 조정합니다. 일주일에 두 번 배지(50% HMEC-1 완전 배지 + 50% RPMI 완전 중간)를 새로 고칩니다.
참고: 3D 세포 배양 과정에서 일부 부착 세포가 삽입물 외부에서 웰 바닥으로 누출되어 배지 소비가 증가할 수 있습니다. 현미경으로 인서트 너머의 세포 분산을 확인하고 필요한 경우 멸균 후드 아래의 새 6웰 플레이트에 인서트를 교체합니다.
5.3D 골수 유사 실험 결과
참고: 3D 배양 후 실험 목적에 따라 여러 결과를 얻을 수 있습니다.
- 단백질 분석
참고: 3D 실험 과정에서 골수 유사 구조에 존재하는 세포에서 분비되는 단백질을 수집하여 추가 분석을 수행할 수 있습니다.- 배양 배지가 일주일에 2회 변경되면 삽입물 내부에서 회수된 상청액을 -80°C에 보관하여 시스템 내에서 관심 단백질의 생산을 평가합니다.
- 3D 구조에서 세포 분리(세포를 분류해야 하는 경우 멸균 후드 아래)
참고: 3D 골수 유사 시스템에서 배양된 세포를 검색, 정렬 및 추가 분석할 수 있습니다.- 실험이 끝나면 15mL 튜브에 4.5mL의 RPMI와 0.4mg/mL의 콜라게나제가 보충된 0.5mL의 FBS를 혼합하고 용액을 37°C에서 10분 동안 따뜻하게 합니다.
- 멸균된 6웰 플레이트 덮개에 삽입물을 거꾸로(위쪽의 흰색 멤브레인 쪽) 놓아 멤브레인을 적절하게 잘라냅니다. 멸균 메스를 사용하여 측면에서 막을 절단하여 흰색 고체 디스크를 검색합니다. 15단계에서 준비한 따뜻한 5.2.1mL 튜브 안에 디스크를 넣습니다.
- 튜브를 37°C 인큐베이터의 활성 휠에 놓고 소화가 가능하도록 10분 동안 배양합니다(콜라게나제와 접촉). 왜곡된 분석을 피하기 위해 모든 멤브레인에 동일한 배양 시간을 적용합니다.
- 10분 후, 실온에서 1,575× g 에서 5분 동안 15mL 튜브를 원심분리하고, 상청액을 버리고, 펠릿을 따뜻한 1x PBS 5mL에 재현탁합니다. 참고: 이 단계에서 폴리카보네이트 멤브레인은 일반적으로 상청액 분획에 부유하기 때문에 멸균 피펫 팁을 사용하여 폐기할 수 있습니다. 멤브레인이 여전히 펠릿에 포함되어 있으면 그대로 두고 다음 단계가 끝날 때 제거하십시오.
- 펠릿을 따뜻한 트립신 300μL에 재현탁하고 튜브를 10초 동안 휘젓고 37°C 수조에 1분 동안 둡니다.
- 따뜻한 순수 FBS 1mL를 추가하여 효소 소화를 중단합니다. 1mL 마이크로피펫으로 배지를 기계적으로 흡입하고 분배하여 디스크를 완전히 해리합니다.
주의 : 흡인 / 분배 단계는 매우 빨라야하며, 그렇지 않으면 비드가 팁 내부에 침전됩니다. - 튜브를 1,575 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 10% FBS가 보충된 1x PBS 3mL에 펠릿을 재현탁합니다.
- 상청액을 수집하고 수집 튜브에 놓인 35μm 세포 스트레이너를 통해 여과하기 전에 비드를 5초 동안 침전물에 그대로 두십시오. 회수된 여과액을 1,575 × g에서 5분 동안 원심분리한다. 트리판 블루로 세포를 계수하여 생존력을 평가하고 유세포분석 분석을 진행합니다.
참고: 트리판 블루 배양 후 회수된 생존 세포의 수는 소화된 삽입물당 ~1-2 × 105 세포입니다.
- 회수된 세포의 유세포분석 표지
참고: 3D 골수 유사 구조에서 검색된 세포는 유세포분석으로 표지하고 추가로 분석할 수 있습니다. 3D 해리 후 다른 구획을 검출하기 위해 항체 혼합물을 사용하십시오. 여기서, CD45 (관심있는 혈액 세포 염색), CD31 (혈관 구획 염색) 및 CD73 (조골 세포 구획 염색)을 50 μL의 PBS + 2% FBS 중 1 μL로 사용하였다. 준비된 모든 세포와 항체를 전체 과정 동안 빛으로부터 멀리 떨어진 얼음 (4 ° C)에 보관하십시오.- 항체 혼합물에 펠릿을 다시 현탁하고 빛이 없는 얼음 위에서 30-40분 동안 배양합니다.
- PBS + 2% FBS 1mL를 추가하여 세포를 세척하고 1,575×g에서 5분간 원심분리합니다.
- 검색된 펠릿을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 희석 1:2,000)이 보충된 1x PBS + 10% FBS 200μL에 재현탁합니다.
- 다음 매개 변수를 사용하여 세포 분석기의 튜브를 분석하십시오 : FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; 다피 400 PNV; CD45 APC 505 PnV. FSC-H 대 FSC-W 그래프 플롯을 사용하여 일중항 모집단을 게이트합니다. 일중항 분획에서 DAPI-A 대 FSC-A 그래프 플롯을 사용하여 생존 세포 집단(DAPI 음성)을 확인합니다. 이전에 게이트된 DAPI 음성 모집단에서 APC-A 대 FSC-A 그래프 플롯을 사용하여 CD45 양성 모집단을 확인합니다.
- 3D 골수와 같은 구조의 고정
참고: 3D BM 유사 구조의 고정은 일반적으로 제 자리에서 세포를 시각화하고 추가 특정 염색을 위해 면역조직화학 또는 면역형광법을 위해 수행됩니다.- BM과 같은 구조를 고정하려면 기존 플레이트의 인서트(단계 4.3)를 1x PBS로 채워진 새 6웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 인서트 내부의 배지를 1x PBS로 조심스럽게 교체합니다.
알림: 형성된 구조물을 PBS로 세척하지 마십시오. 액체의 압력은 3D 구조를 손상시킬 수 있습니다. - 인서트가 세척되면 새 6웰 플레이트 내에 넣고 웰과 인서트 모두를 새로 개봉한 파라포름알데히드(PFA) 4%(1x PBS에서 16% 희석)로 채웁니다.
- 고정 과정이 빛에서 떨어진 실온에서 4시간 동안 진행되도록 합니다.
- 고정 과정이 끝나면 1x PBS로 인서트를 한 번 세척하고 빛으로부터 떨어진 4 ° C에서 보관하십시오.
- 5.2.2단계에서 설명한 대로 인서트 하단의 멤브레인을 절단하여 솔리드 디스크를 검색합니다.
- 구조를 석회질화하기 위해 디스크를 EDTA(0.5M, pH 8)에서 48시간 동안 4x 배양합니다.
- 구조를 파라핀에 삽입하고 4μm 두께의 섹션을 슬라이스합니다.
- 자동화된 면역염색기를 사용하여 항-CD45, 항-CD73 및 Ki67 항체로 절편을 배양합니다. 항토끼 또는 -마우스 말 무 과산화효소(HRP)와 발색 기질로 3,3'-디아미노벤지딘을 사용한 염색을 시각화하고 Gill's-헤마톡실린으로 대조염색합니다.
- BM과 같은 구조를 고정하려면 기존 플레이트의 인서트(단계 4.3)를 1x PBS로 채워진 새 6웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 인서트 내부의 배지를 1x PBS로 조심스럽게 교체합니다.
Representative Results
이 프로토콜을 사용하면 3개의 서로 다른 세포 구획에서 생존 가능한 세포를 검색할 수 있는 최소한의 시험관 내 3D 인간 BM 유사 미세 환경을 요약할 수 있습니다(그림 1). 실제로, 원하는 노출 후, 3D BM-유사 구조가 해리될 수 있고, 중간엽, 내피 세포 및 조혈 세포가 유세포분석을 사용하여 평가/특성화될 수 있다(도 2A). 지금까지의 결과는 생존 세포를 회수하기 전에 3D 모델 내에서 최소 6주 동안 혈액학적 세포를 유지할 수 있음을 시사합니다(그림 2B). 그러나이 3D 모델의 한계를 추정하려면 향후 조사가 필요합니다. 또한 필요한 경우 이 3D BM 유사 모델에서 HS27A 세포주를 1차 정상 골수(NBM) MSC 또는 급성 골수성 백혈병(AML) MSC로 대체하거나(그림 2C) 조혈 세포주를 1차 HSC로 대체할 수 있습니다(그림 2D). 또한 세포 구획 간의 상호 작용 또는 관심 있는 특정 마커의 국소화를 분석할 때 3D BM 유사 구조를 고정하고 파라핀 임베딩 및 면역화학으로 추가로 처리할 수 있습니다. 예를 들어, CD45(혈액학적) 또는 CD73(MSC) 함량의 분석은 이러한 3D 모델을 사용하여 수행되었습니다(그림 3).
그림 1: 인간 3D BM 유사 시스템의 초기 설정에 대한 개략도. 3주간의 공동 배양 후, 고형 BM-유사 조직을 수집하거나 조혈 세포(예에서와 같이) 또는 다른 세포 유형으로 시딩할 수 있다. 필요한 경우 세포가 부착되면 치료를 추가하고 일주일에 두 번 배지 변경을 수행할 수 있습니다. 실험이 끝나면 BM 유사 구조를 고정하고 국소화 연구를 위해 추가로 처리하거나 세포 내용물을 평가하기 위해 해리 할 수 있습니다. 약어 : BCP = 이상성 인산 칼슘; BM = 골수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: BM 유사 3D 모델에서 배양 후 다른 구획에서 생존 세포 회수. (A) 생존 세포의 9.84%를 갖는 하나의 해리된 BM-유사 구조로부터 세포 회수의 전형적인 패턴(DAPI-). 조혈 (66.6 % CD45 +), MSC / 조골 세포 세포 (CD45- 집단 내 88.6 % CD73 + 세포) 및 내피 세포 (CD45- 집단 내 22.1 % CD31 + 세포)의 대표적인 플롯은 3D 해리 후 회복되었다. (B) 3D 시스템을 사용하면 배양 후 최대 6주까지 생존 가능한 조혈 세포(CD45+)를 유지할 수 있습니다. (C) HMEC-1(이 예에서는 쿠사비라-오렌지로 착색됨)과 함께 NBM 또는 AML의 1차 MSC로 만들어진 3D 시스템은 제자리(D)에서 HSC(3.88% CD45+ DAPI-세포)를 유지할 수 있습니다. 약어 : BM = 골수; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌; MSC = 중간엽 줄기세포; NBM = 정상 골수; AML = 급성 골수성 백혈병; HSCs = 조혈모세포; FSC = 순방향 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: BM 유사 3D 모델 내에서 세포 상호 작용 및 증식의 시각화. 시스템은 HS27A 및 HMEC-1과 3D 공동 배양 후 1주 후에 조혈 세포를 첨가하여 수집하였다. IHC에 의한 전형적인 면역조직화학 염색(갈색으로 시각화됨)을 항-토끼 또는 -마우스 말 무 과산화효소를 사용하여 시각화하고 발색 기질로서 3,3'-디아미노벤지딘으로 시각화하고 Gill's-헤마톡실린으로 대조염색하여 CD45가 있는 조혈 세포(왼쪽 패널), CD73이 있는 기질 세포(중간 패널) 또는 KI67이 있는 모든 세포의 증식(오른쪽 패널)의 존재를 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : BM = 골수; IHC = 면역 조직 화학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
인간의 생리적 및 관련 병리학 적 문제에 대한 연구가 직면 한 현재 과제 중 하나는 인간 장기의 복잡한 기능을 정확하게 모방하는 모델이 없다는 것입니다. 인간 BM 3D 모델의 경우, 많은 모델이 하이드로겔을 사용하고 BM을 부분적으로 재현하여, 예를 들어 더 나은 조골 세포 분화를 보장하는 데 있어 고전적인 2D 배양과 비교하여 3D 배양 조건의 힘을 보여줍니다(27,28). 그럼에도 불구하고 우수한 재현성과 사용 편의성에도 불구하고 이러한 시스템은 인간 BM 3D 구조 및 아키텍처를 모방하지 않아 추가 분석에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 기술 발전으로 과학자들은 일부 HSC 특성을 유지하기 위해 관류 기반 생물 반응기 시스템을 사용하여 천연 인간 조골 세포 틈새 환경을 더 잘 재현 할 수있었습니다29. 미세유체 장치의 개발은 관련 골수 유사 구조를 재현하기 위한 새로운 접근법을 가져왔지만, 지금까지는 골수의 제한된 특징만을 달성하였으므로, 제한된 적용을 가졌다30,31,32,33.
재료 과학의 발전은 관련 3D 뼈 배양 시스템을 개발하는 데 사용할 수 있는 광범위한 천연 또는 합성 생체 재료의 개발에 기여했습니다. 그러나 이러한 시스템은 때때로 생물 물리학에 대한 사내 기술이없는 표준 생물학 실험실에서 개발하기가 어렵습니다. 더욱이, 대부분의 경우, 이들 시스템은 BM 미세환경을 포함하는 인간 뼈의 3D 구조를 모방하는 제한된 능력을 달성하고, 다량의 사이토카인 및 성장 인자를 사용하여, 인위적으로 풍부한 배양 배지(34)를 생성한다.
지방 세포 분화보다는 조골 세포 분화를 유도하기위한 선택은 전 조골 세포 및 조골 세포가 내막 틈새35의 일부로 기술되었다는 사실에 근거했다. 이것은 조골 세포를 뼈와 골수 모두의 요청 된 구성 요소로 확인했습니다. 골수의 세포 구성 요소 중 내피 및 기질 세포는 미세 환경의 많은 부분을 차지합니다. 또한, 이들 두 세포 유형은 항상성 및 분화의 조절에 관여하는 세포외 매트릭스 및 사이토카인의 구조적 비세포 성분을 생성하며, 석회화된 구조를 생성하도록 여기에서 요청된다. 따라서 이는 내피 및 기질 세포의 사용과 실험실 간의 쉬운 접근을 허용하고 재현성을 높이기 위한 세포주 선택을 정당화합니다. 시간이 지남에 따라 HMEC-1 라인의 배양이 더 안정적이어서 이 세포주는 3D 시스템 개발을 위해 유지되었습니다. 기질 세포의 경우 2D 배양에서 정상 골수에서 유래한 기질 세포주인 HS5 및 HS27A의 조골세포 분화 능력을 비교했습니다. 우리는 HS5 라인이 두 세포주로 생성된 3D 시스템에서 HS27A 라인만큼 분화되지 않는다는 것을 발견했습니다. 이와 관련하여 HS27A 셀을 HS5 라인으로 대체하려는 시도는 덜 단단한 구조의 생산을 초래하여 HS27A가 더 적합하다는 것을 시사합니다.
HS27A 및 HMEC-1 세포주는 서로 다른 배지 조합으로 배양되었으며, 여기서 하나는 조골 세포 구조를 따라 HMEC-1의 최상의 강성 구조 및 정렬을 유도하여 세포 외 매트릭스의 생성이 기본 구조에 상대적 강성을 가져옵니다. D14에서의 분화 진행에 대한 분석은 분화가 D21 (BSP 측정, 후기 조골 세포 마커)에서 HMEC-1 : HS27A에 대해 1 : 2의 비율로 더 진행되었으며 2 × 106 HS27A가 도입되었을 때 더 나은 결과를 보였다. 내피 세포는 또한 항상성과 분화를 조절하는 데 중요한 역할을합니다 (무엇보다도 사이토 카인 공급을 통해). HMEC-1 세포가 이 시스템에서 유지된다는 사실은 그들이 적어도 이 역할을 수행할 수 있음을 나타내며, 이는 우리 모델의 합법성에 기여합니다. HMEC-1 내피 라인의 경우 구조에 적절하게 통합될 수 있고 이러한 세포가 구조 내에서 정렬 또는 튜브를 형성할 수 있기를 희망하면서 충분히 일찍 도입하는 것이 중요했습니다. HS27A 및 HMEC-1의 공동 배양 시험은 후자를 상이한 단계에서 도입함으로써 수행되었다 : D0, D7, D14; 기질 세포의 분화나 내피 세포의 유지 또는 위치 지정에서 눈에 띄는 차이는 관찰되지 않았습니다. 따라서, 이들 세포는 공정의 초기에 도입되었다. 조혈 세포는 조골 세포 분화가 세포-세포 상호 작용을 선호 할만큼 충분히 진행되는시기에 도입되었습니다. 이 선택은 또한이 조골 세포 분화가 우리의 테스트에 따르면 조혈 세포의 유지를 완전히 지원하지 않는 배지의 사용에 의해 조절된다는 사실에 의해 조절되었습니다. 혈액학적 세포는 세포주 또는 1차 BM CD45 조혈 세포일 수 있다.
이 3D 모델로부터, 우리는 각 세포 유형을 정상 또는 병리학 적 일차 세포로 대체하거나 면역 세포, 지방 세포 또는 섬유 아세포26와 같은 생체 모방 특성을 향상시키기 위해 다른 세포 유형을 추가하는 것을 상상할 수 있습니다. 실제로 HS27A 세포주는 계대가 낮은 1차 BM MSC로 대체되었습니다. 유사하게, 혈액학적 세포주는 일차 BM 조혈 세포로 대체되었다. 그러나, HMEC-1 세포를 일차 내피 세포로 대체하는 것은 아직 시험되지 않았다. 현재이 모델은 내피 세포가 존재하고 미세 환경의 다른 세포 (예 : 조혈 세포)와 올바르게 상호 작용하더라도 구조화 된 혈관을 형성하지 않으므로 기능적 혈관을 모방하기위한 흐름 관류를 배제하기 때문에 혈관 표현 측면에서 여전히 개선 될 수 있습니다. 전반적으로 이것은 현재의 최소 3D 모델의 복잡성과 대표성을 점진적으로 증가시킬 수 있습니다. 다른 세포 유형의 추가는 국소 BM 염증의 중요성 또는 면역 요법에 대한 내성과 같은 다른 문제를 조사하는 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
그러나, 이러한 3D 시스템은 관심 세포, 혈액학적 세포 또는 상피암 세포가 전이 과정이 평가되기 3주 전에 필요하며, 추가될 수 있다. 매주 두 번 배지를 변경하면 때때로 배지 오염이 발생할 수 있으므로 멸균 상태를 유지해야합니다. 또한 일부 세포는 삽입물의 기공을 통해 이동하여 우물로 분산되기 시작하여 배지 소비를 증가시킬 수 있으므로 정기적 인 모니터링이 권장됩니다.
우리는 여기에서 조골 세포 분화를 허용하는 3D 스캐 폴드를 설명하고 관련 시험 관 내 3D 인간 BM과 유사한 미세 환경을 개발했습니다. 이 시스템은 현장 분석 및 궁극적인 라이브 셀 검색을 가능하게 합니다. 이 시스템은 인간 BM 미세 환경 내에서 상호 작용 및 메커니즘을 연구하기 위한 광범위한 응용 프로그램과 함께 재현 가능하고 사용자 친화적인 새롭고 매우 유연한 도구를 제공합니다.
Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
CRCL 세포분석 플랫폼의 P. Battiston-Montagne과 A. Jambon, Léon Bérard 센터 중개 연구 및 혁신 부서의 Research Pathology Platform의 N. Gadot과 C. Leneve에게 감사드립니다. 저자는 영어판에 대한 B. Manship에게 감사합니다. 이 작업은 Inserm과 FI-LMC가 V. M. S.에 자금을 지원했으며 S. L. K. A. 및 L. B.는 Société Française d' Hématologie의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
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