Summary
هنا ، نصف نظاما ميكروفيزيولوجيا موحدا سهل التنفيذ يعكس تعقيد بنية نخاع العظم البشري في الجسم الحي ، مما يوفر نموذجا مناسبا لدراسة مجموعة واسعة من الأحداث الطبيعية والمرضية بدقة.
Abstract
مكانة النخاع هي نظام بيئي معقد ضروري للحفاظ على التوازن للخلايا المقيمة. في الواقع ، فإن نخاع العظم ، الذي يتضمن مصفوفة معقدة خارج الخلية وأنواع مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا الجذعية الوسيطة ، وبانيات العظم ، والخلايا البطانية ، يشارك بعمق في تنظيم الخلايا الجذعية المكونة للدم من خلال التفاعلات المباشرة بين الخلايا والخلايا ، وكذلك إنتاج السيتوكين. لتقليد هذا عن كثب في بنية الجسم الحي وإجراء تجارب تعكس استجابات نخاع العظم البشري ، تم إنشاء العديد من نماذج 3D على أساس المواد الحيوية ، والاعتماد في المقام الأول على الخلايا اللحمية الأولية. هنا ، يتم وصف بروتوكول للحصول على نظام بسيط وموحد يسهل إعداده ويوفر ميزات بنية تشبه نخاع العظم ، والتي تجمع بين مجموعات الخلايا المختلفة بما في ذلك الخلايا البطانية ، وتعكس عدم تجانس أنسجة نخاع العظم في الجسم الحي . هذا الهيكل الشبيه بنخاع العظم 3D - الذي تم تجميعه باستخدام جزيئات فوسفات الكالسيوم وخطوط الخلايا البشرية ، ممثل البيئة المكروية لنخاع العظم - يسمح بمراقبة مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية عن طريق الجمع بين أو استبدال مجموعات الخلايا الأولية المختلفة داخل النظام. يمكن بعد ذلك حصاد هياكل 3D النهائية لتحليل الصور بعد التثبيت ، وتضمين البارافين ، والتلوين النسيجي / المناعي الكيميائي لتوطين الخلايا داخل النظام ، أو فصلها لجمع كل مكون خلوي للتوصيف الجزيئي أو الوظيفي.
Introduction
يوجد نخاع العظم (BM) داخل كل من التجاويف المركزية للعظام المحورية والطويلة والعظام المسطحة التربيقية ، ويحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات الخلوية وغير الخلوية المتميزة. على المستوى الهيكلي ، يتكون من جزر الأنسجة المكونة للدم (وتسمى أيضا "الهيماتون")1،2 والخلايا الدهنية المحاطة بالجيوب الأنفية الوعائية التي تتخللها عظم تربيقي3. في العظام الطويلة والمسطحة ، يتم ربط تدفق الدم إلى العظام ونخاع العظام من خلال شبكة من الأوعية الداخلية4. مخبأة في هذه الشبكة الواقية الصلبة ، تستضيف BM خلايا غير ناضجة للغاية مغمورة في سدى إسفنجي وتشكل موقعا للتمايز بين الخلايا الجذعية الوسيطة المقيمة (MSCs) والخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)5. في الواقع ، بصرف النظر عن تجديد أنسجة العظام من خلال إنتاج بانيات العظم ، فإن إحدى الوظائف الرئيسية المعروفة ل BM تكمن في تطوير تكون الدم6.
يتضمن النسيج المكون للدم BM مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، وهي HSCs ، والسلائف ، وخلايا الدم الأكثر تمايزا مثل الخلايا الليمفاوية ، والعدلات ، وكريات الدم الحمراء ، والخلايا المحببة ، والوحيدات ، والصفيحات7. لا يتم ترتيب الخلايا المكونة للدم بشكل عشوائي في مساحة BM ولكنها تعرض تنظيما معينا داخل منافذ المكونة للدم ، والتي تشمل العديد من أنواع الخلايا من أصول مختلفة (بانيات العظم ، ناقضات العظم ، MSCs ، الخلايا الشحمية ، البطانة الجيبية والخلايا اللحمية المحيطة بالأوعية الدموية ، الخلايا المناعية ، الخلايا العصبية ، والخلايا المكونة للدم الناضجة المتميزة) ، وتشكيل بنية معقدة لضمان تكون الدم الطبيعي8 . تشمل الوظائف البيولوجية لمكانة المكونة للدم تنظيم بقاء HSC ، والالتصاق ، والسكون ، والتوجيه ، والتمايز من خلال آليات مختلفة (تفاعلات الخلية الخلوية ومصفوفة الخلية ، وإنتاج العوامل القابلة للذوبان ، ونقص الأكسجة) استجابة لضغوط فسيولوجية أو غير فسيولوجية متعددة 3,6. على الرغم من أن هذه المنافذ المكونة للدم كان ينظر إليها في البداية على أنها كيانات متجانسة ، إلا أن التطورات التكنولوجية مثل تحليلات الخلية الواحدة والتصوير كشفت تدريجيا عن تعقيدها وديناميكياتها وخصائصها التكيفية9،10،11.
تؤدي الحاجة الماسة لاستبدال وتقليل استخدام الحيوانات لفك رموز العمليات الفسيولوجية والمرضية البشرية إلى فرص وتحديات جديدة11,12. من بين الأدوات الموصوفة حديثا في المختبر ، تم اقتراح نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) تحاكي BM البشري في الجسم الحي بشكل أفضل من الثقافات الكلاسيكية ثنائية الأبعاد (2D)13،14،15،16،17. وهكذا يبدو أن نمذجة 3D هي نهج واعد لمراقبة تفاعلات الخلية الخلوية ومصفوفة الخلية ، أقرب إلى تلك التي تحدث في الجسم الحي. باستخدام مجموعة متنوعة من هذه النماذج ، أثبتت بعض الفرق بقاء وانتشار HSCs18,19. تتوفر العديد من النماذج ثلاثية الأبعاد ، والنهج الأكثر شيوعا هو استخدام المواد الحيوية ثلاثية الأبعاد القائمة على السقالات مثل الهلاميات المائية أو الغرويات أو الكولاجين ، المرتبطة ب MSCs التي تستفيد من قدرات تمايز النسب العظمي20،21،22. ومع ذلك ، لم يتم التوصل إلى موافقة عالمية لتلبية جميع متطلبات الدراسات على الخلايا البشرية بطريقة سهلة الاستخدام وموحدة23 ، خاصة وأن هذه الأنظمة ثلاثية الأبعاد الحالية تعتمد بشكل أساسي على الخلايا اللحمية الأولية ، وبالتالي تعاني من محدودية الوصول إلى العينات الأولية ، وتوافر الأنسجة ، وعدم التجانس.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب إدخال حجرة الخلايا البطانية لأن هذه الخلايا تمثل مكونا رئيسيا في تفاعلات الخلايا الخلوية وتشارك في مصير الخلايا الجذعية وتطور مرض BM ، سواء في سرطان الدم24 أو ورم خبيث25. لقد أبلغنا سابقا أن إضافة العناصر المرضية في نموذج نخاع العظم البشري 3D الموحد يلخص الميزات التي لوحظت في عينات المرضى مثل تعديلات المصفوفة خارج الخلية (ECM)26. لفهم الديناميكيات والتفاعلات بين البيئة المكروية BM البشرية والخلايا المقيمة بشكل أفضل ، نقدم بروتوكولا مفصلا لنظام سهل الاستخدام وموحد لبناء هيكل بسيط ومنظم جيدا يشبه BM. يتكون هذا النظام من ثلاثة أنواع من خلايا نخاع العظم البشري - الخلايا البطانية والخلايا اللحمية ، والتي تمثل البيئة المكروية ، و HSCs. باستخدام حبات محددة كسقالة ووسيط تمايز عظمي ، فإن بنية 3D التي تم الحصول عليها تحاكي مكانة النخاع البشري ، مما يسمح بإجراء دراسة مفيدة لنخاع العظم البشري.
Protocol
ملاحظة: لتحضير بنية العمود الفقري الشبيه بالنخاع العظمي ، يعتمد هذا البروتوكول على الجمع بين الخرز والخلايا البطانية HMEC-1 والخلايا اللحمية HS27A على حبات فوسفات الكالسيوم ثنائية الطور (BCP). سوف حبات BCP بمثابة سقالة تسمح ، مع وسيط معين ، تشكيل هيكلي 3D.
1. إعداد حبة والتعقيم
- تزن 35-40 ملغ من حبات BCP (HA / β-TCP 60/40 ؛ 45-75 ميكرومتر) لكل ملحق (طبق بلاستيكي صغير أسطواني مع غشاء بولي كربونات في الأسفل) في أنبوب سعة 1.5 مل (انظر جدول المواد). بعد وزن الخرز ، قم بتجويف ثقب صغير بإبرة نظيفة من خلال الجزء العلوي من الأنبوب سعة 1.5 مل لتجنب فتح الغطاء أثناء دورة الأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة) ، وضع الأنابيب في وضع عمودي في صندوق معقم مغلق.
2.3D أدخل التحضير تحت غطاء معقم
- ضع إدخالات زراعة خلايا البولي كربونات المعقمة داخل آبار لوحة 6 آبار. صب حبات BCP المعقمة من أنبوب 1.5 مل في الملحق. اغسل الخرز بعناية عن طريق تقطير 350 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) داخل الملحق ثم أضف 4.5 مل من 1x PBS إلى البئر. قم بإزالة وتجاهل PBS إما باستخدام فراغ أو ماصة 5 مل عن طريق وضع الطرف في زاوية من البئر. كرر خطوة الغسيل مرتين.
- بمجرد غسل الخرز ، استخدم 1x PBS المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) لمنع النظام. أضف بعناية 350 ميكرولتر من محلول الحجب إلى الملحق و 4.5 مل إلى البئر وضع اللوحة بأكملها في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
ملاحظة: تساعد الخطوتان 2.1 و 2.2 على تقليل إطلاق الأيونات من حبات BCP قبل بذر الخلية.
3. حصاد خط الخلية وصيانة ثلاثية الأبعاد
ملاحظة: بعد خطوة الحضانة هذه ، تتم إضافة خلايا بيئية دقيقة لتشكيل العمود الفقري لهيكل 3D. يعتمد هذا النظام على استخدام HMEC-1 ، الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية التي خلدت بمستضد T كبير من SV40 ، و HS27A ، خلايا انسجة نخاع العظم البشري التي خلدت بفيروس الورم الحليمي البشري ، نظرا لقدرتها على تكوين بنية صلبة تشبه BM وتوافقها مع تضمين الخلايا البطانية.
- قبل إضافة الخلايا إلى النظام ، قم بإعداد وسائط الحضانة التالية:
- للحصول على 50 مل من وسط تمايز العظم الكامل (ODM) ، امزج 45 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) + 5 مل من FBS + 0.5 مل من البنسلين ستربتومايسين + 8 × 10-4 مجم / لتر من ديكساميثازون + 2.16 جم / لتر من بيتا جليسيروفوسفات + 44 مجم / لتر من حمض الأسكوربيك.
- للحصول على 50 مل من وسط HMEC-1 الكامل ، امزج 45 مل من MCDB 131 + 5 مل من FBS + 0.5 مل من البنسلين ستربتومايسين + 1٪ من بديل الجلوتامين + 1 مجم / لتر من الهيدروكورتيزون + 10 ميكروغرام / لتر من EGF.
- قم بإزالة حل الحظر من النظام. امزج 1 × 10 6 خلايا HMEC-1 (تمثل حجرة الأوعية الدموية) و 2 × 106 خلايا HS27A (تمثل حجرة الخلايا اللحمية المتوسطة) في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1575 × جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأضف 175 ميكرولتر من وسط HMEC-1 (وسط محدد لنمو خلايا HMEC-1) مع 175 ميكرولتر من ODM (وسط محدد لتمايز العظم HS27A).
- صب 350 ميكرولتر من هذا التعليق الذي يحتوي على 3 × 106 خلايا إجمالية داخل كل إدخال. ثم ، صب 4.5 مل من الوسائط المدمجة (2.25 مل من HMEC-1 المتوسطة + 2.25 مل من ODM) بدون خلايا في آبار اللوحة. قم بشفط الخليط برفق وتوزيعه عدة مرات باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل لتجانس الخلايا وحبات BCP داخل الملحق. خصص المزيج بالكامل ليستقر في الجزء السفلي من الإدخال.
ملاحظة: يوصى بإعداد مزيج بكمية ميتة واحدة إذا تم استزراع عدة إدخالات. على سبيل المثال ، إذا تم استزراع أربعة إدخالات ، فقم دائما بإعداد وحدة التخزين المطلوبة لخمس إدخالات. - بمجرد تجانس الخلايا البطانية والوسيطة داخل الملحق ، احتفظ بلوحة 6 آبار داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 3 أسابيع. قم بتغيير الوسيط داخل الملحق والبئر 2x في الأسبوع عن طريق إزالة الوسيط بعناية من الملحق باستخدام ماصة صغيرة سعة 1 مل ووضع الطرف على جدار الإدخال الداخلي لتجنب إزعاج زاوية الإدخال.
ملاحظة: يمكن تخزين المادة الطافية المسترجعة عند -80 درجة مئوية في أي خطوة لتحديد كمية البروتين لاحقا.
4. إضافة الخلايا ذات الأهمية إلى النظام
ملاحظة: بعد 3 أسابيع من زراعة HMEC-1 و HS27A ، مكن التمايز العظمي لخلايا HS27A من تصلب النظام. في هذه الخطوة ، أضف خلايا دموية ذات أهمية (يمكن أن يختلف عدد الخلايا المضافة من 1 × 104 إلى 1 × 106) داخل الإدخال. كانت الخلايا المضافة عبارة عن خلايا TF1 منقولة مع الجين الورمي BCR-ABL وخلايا CD34 + الأولية أحادية النواة القادمة إما من مرضى سرطان الدم النخاعي الحاد أو المتبرعين الأصحاء.
- قم بتغيير التركيبة المتوسطة في هذه الخطوة ، حيث أن مركب ODM سام للخلايا الدموية وليس هناك حاجة لمواصلة إضافته بمجرد الانتهاء من تصلب النظام. على سبيل المثال ، لدعم صيانة المكونة للدم ، استبدل وسيط ODM ب RPMI الكامل لخطوط الخلايا المكونة للدم (RPMI المكمل بنسبة 10٪ من FBS و 1٪ من البنسلين الستربتومايسين) أو IMDM للخلايا المكونة للدم الأولية. قم بإعداد دفعة من 50٪ كاملة HMEC-1 المتوسطة و 50٪ كاملة RPMI / IMDM المتوسطة للتغييرات الأسبوعية 3D المتوسطة (مرتين).
- أعد تعليق الخلايا الدموية ذات الأهمية في هذا الوسط المركب وأضفه داخل الإدخال. إذا كان بروتوكول العلاج الدوائي مطلوبا ، فانتظر 24 ساعة بعد إضافة الخلايا محل الاهتمام قبل العلاج ، مما يمنحها الوقت للالتزام بالبنية الشبيهة بالعظام.
- تكييف فترة ثقافة الخلايا 3D وفقا للمتطلبات. قم بتحديث الوسيط (50٪ HMEC-1 وسيط كامل + 50٪ RPMI متوسط كامل) مرتين في الأسبوع.
ملاحظة: على مدار ثقافة الخلايا 3D ، قد تتسرب بعض الخلايا الملتصقة خارج الإدخال إلى قاع الآبار ، مما يزيد من الاستهلاك المتوسط. تحقق تحت المجهر من تشتت الخلايا خارج الملحق واستبدل الملحق في لوحة جديدة من 6 آبار تحت غطاء معقم إذا لزم الأمر.
5.3D نتائج تجريبية تشبه نخاع العظم
ملاحظة: بعد زراعة 3D ، يمكن تحقيق العديد من النتائج وفقا لأهداف التجربة.
- تحليل البروتين
ملاحظة: على مدار تجربة 3D ، يمكن جمع البروتينات التي تفرزها الخلايا الموجودة في بنية تشبه نخاع العظم لمزيد من التحليلات.- عندما يتم تغيير وسط الاستزراع 2x في الأسبوع ، قم بتخزين المادة الطافية المسترجعة من داخل الملحق عند -80 درجة مئوية لتقييم إنتاج البروتينات ذات الأهمية داخل النظام.
- فصل الخلايا عن بنية 3D (تحت غطاء معقم إذا كانت الخلايا بحاجة إلى فرز)
ملاحظة: يمكن استرجاع الخلايا المستزرعة في نظام 3D الشبيه بنخاع العظم وفرزها وتحليلها بشكل أكبر.- في نهاية التجربة، في أنبوب سعة 15 مل، امزج 4.5 مل من RPMI مع 0.5 مل من FBS المكمل ب 0.4 ملغم/مل من الكولاجيناز، وقم بتسخين المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- ضع الملحق رأسا على عقب (جانب الغشاء الأبيض في الأعلى) على غطاء لوحة معقمة من 6 آبار لقطع الغشاء بشكل صحيح. استخدم مشرطا معقما لقطع الغشاء من الجانبين ، وبالتالي استرداد قرص صلب أبيض. ضع القرص داخل الأنبوب الدافئ سعة 15 مل المحضر في الخطوة 5.2.1.
- ضع الأنبوب في عجلة نشطة في حاضنة 37 درجة مئوية واحتضنها لمدة 10 دقائق للسماح بالهضم (عند ملامسته للكولاجيناز). ضع نفس وقت الحضانة لجميع الأغشية لتجنب التحليل المنحرف.
- بعد 10 دقائق ، قم بجهاز طرد مركزي لأنبوب 15 مل لمدة 5 دقائق عند 1,575 × جم في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من 1x PBS الدافئ. ملاحظة: في هذه الخطوة ، نظرا لأن غشاء البولي كربونات يطفو بشكل عام في الجزء الطافي ، يمكن التخلص منه باستخدام طرف ماصة معقم. إذا كان الغشاء لا يزال مدرجا في الحبيبات ، فاتركه وقم بإزالته في نهاية الخطوة التالية.
- أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من التربسين الدافئ ، وقم بتدوير الأنبوب لمدة 10 ثوان ، وضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- أوقف الهضم الأنزيمي بإضافة 1 مل من FBS النقي الدافئ. باستخدام ماصة صغيرة سعة 1 مل ، قم بشفط الوسط ميكانيكيا وتوزيعه لفصل القرص تماما.
تنبيه: يجب أن تكون خطوة الشفط / التوزيع سريعة جدا ، وإلا فإن الخرز سوف يترسب داخل الحافة. - جهاز طرد مركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 1575 × جم. أعد تعليق الحبيبات في 3 مل من 1x PBS مكملة بنسبة 10٪ FBS.
- اترك الخرزات للرواسب لمدة 5 ثوان قبل جمع المادة الطافية وترشيحها من خلال مصفاة خلية 35 ميكرومتر موضوعة على أنبوب تجميع. جهاز طرد مركزي للمرشح المسترد لمدة 5 دقائق عند 1,575 × جم. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق لتقييم الجدوى والمضي قدما في تحليل قياس التدفق الخلوي.
ملاحظة: عدد الخلايا القابلة للحياة التي تم استردادها بعد حضانة تريبان الزرقاء هو ~ 1-2 × 105 خلايا لكل إدراج مهضوم.
- وسم قياس التدفق الخلوي للخلايا المستردة
ملاحظة: يمكن تسمية الخلايا التي تم استردادها من بنية تشبه نخاع العظم 3D وتحليلها بشكل أكبر عن طريق قياس التدفق الخلوي. استخدم مزيجا من الأجسام المضادة للكشف عن المقصورات المختلفة بعد تفكك 3D. هنا ، تم استخدام CD45 (تلطيخ الخلايا الدموية ذات الأهمية) ، CD31 (تلطيخ حجرة الأوعية الدموية) ، و CD73 (تلطيخ المقصورة العظمية) عند 1 ميكرولتر في 50 ميكرولتر من PBS + 2٪ FBS. احتفظ بجميع الخلايا والأجسام المضادة المحضرة على الجليد (4 درجات مئوية) بعيدا عن الضوء أثناء العملية برمتها.- أعد تعليق الكريات في مزيج الأجسام المضادة واحتضانها لمدة 30-40 دقيقة على الجليد بعيدا عن الضوء.
- أضف 1 مل من PBS + 2٪ FBS لغسل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1575 × جم.
- أعد تعليق الحبيبات المستردة في 200 ميكرولتر من 1x PBS + 10٪ FBS مكملة ب 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، مخفف 1: 2,000).
- تحليل الأنابيب في مقياس خلوي باستخدام المعلمات التالية: FSC 297 PnV ؛ SSC 220 PnV ؛ DAPI 400 PnV ؛ CD45 APC 505 PnV. استخدم مخطط الرسم البياني FSC-H مقابل FSC-W لبوابة السكان المفردة. في الكسر المفرد ، استخدم مخطط الرسم البياني DAPI-A مقابل FSC-A لتحديد عدد الخلايا القابلة للحياة (DAPI-سلبي). مع السكان سلبي DAPI سابقا ، استخدم مخطط الرسم البياني APC-A مقابل FSC-A لتحديد السكان الإيجابيين CD45.
- تثبيت هيكل يشبه نخاع العظم 3D
ملاحظة: يتم إجراء تثبيت الهيكل الشبيه ب 3D BM بشكل عام للكيمياء المناعية أو التألق المناعي لتصور الخلايا في الموقع ولمزيد من التلوين المحدد.- لإصلاح الهيكل الشبيه ب BM ، انقل الإدخال (الخطوة 4.3) من اللوحة القديمة إلى لوحة جديدة ذات 6 آبار مملوءة ب 1x PBS. بعد ذلك ، استبدل الوسيط الموجود داخل الملحق برفق ب 1x PBS.
ملاحظة: لا تغسل الهيكل المشكل باستخدام PBS ؛ ضغط السائل قد يضعف هيكل 3D. - بمجرد غسل الملحق ، ضعه داخل لوحة جديدة من 6 آبار واملأ كل من البئر والإدراج ببارافورمالدهيد المفتوح حديثا (PFA) 4٪ (مخفف 16٪ في 1x PBS).
- اسمح لعملية التثبيت بالمضي قدما لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء.
- في نهاية عملية التثبيت ، اغسل الملحق مرة واحدة باستخدام 1x PBS وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
- قطع الغشاء في الجزء السفلي من إدراج كما هو موضح في الخطوة 5.2.2 لاسترداد القرص الصلب.
- احتضان القرص 4x لمدة 48 ساعة في EDTA (0.5 م ، درجة الحموضة 8) من أجل إزالة الكلس من الهيكل.
- قم بتضمين الهيكل في البارافين وشريحة أقسام بسمك 4 ميكرومتر.
- باستخدام جهاز مناعي آلي ، احتضن الأقسام بأجسام مضادة ل CD45 و CD73 و Ki67. تصور تلطيخ مع بيروكسيديز الفجل الحصان المضادة للأرانب أو الفأر (HRP) ومع 3،3'-diaminobenzidine كركيزة كروموجينية ومضاد مع جيل-هيماتوكسيلين.
- لإصلاح الهيكل الشبيه ب BM ، انقل الإدخال (الخطوة 4.3) من اللوحة القديمة إلى لوحة جديدة ذات 6 آبار مملوءة ب 1x PBS. بعد ذلك ، استبدل الوسيط الموجود داخل الملحق برفق ب 1x PBS.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن تلخيص الحد الأدنى ، في المختبر ، 3D ، بيئة بشرية تشبه BM ، والتي يمكن من خلالها استرداد خلايا قابلة للحياة من ثلاث حجرات خلايا مختلفة (الشكل 1). في الواقع ، بعد التعرض المطلوب ، يمكن فصل الهياكل الشبيهة ب 3D BM ويمكن تقييم / تمييز MSCs والخلايا البطانية والخلايا المكونة للدم باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 2 أ). حتى الآن ، تشير النتائج إلى أنه من الممكن الحفاظ على خلايا الدم لمدة 6 أسابيع على الأقل ضمن نموذج 3D ، قبل استرجاع الخلايا القابلة للحياة (الشكل 2B). ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تحقيقات مستقبلية لتقدير الحد الأقصى لهذا النموذج 3D. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لزم الأمر ، من الممكن استبدال خط الخلية HS27A بنخاع العظم الطبيعي الأساسي (NBM) MSC أو سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) MSC في هذا النموذج الشبيه ب 3D BM (الشكل 2C) أو استبدال خط الخلايا المكونة للدم ب HSCs الأولية (الشكل 2D). علاوة على ذلك ، عند تحليل التفاعلات بين مقصورات الخلايا أو توطين علامات محددة ذات أهمية ، يمكن إصلاح الهياكل الشبيهة ب 3D BM ومعالجتها بشكل أكبر باستخدام تضمين البارافين والكيمياء المناعية. على سبيل المثال ، تم إجراء تحليل محتويات CD45 (الدموية) أو CD73 (MSC) باستخدام هذه النماذج ثلاثية الأبعاد (الشكل 3).
الشكل 1: رسم تخطيطي للإعداد الأولي للنظام البشري الشبيه ب 3D BM. بعد 3 أسابيع من الزراعة المشتركة ، يمكن جمع الأنسجة الصلبة الشبيهة ب BM أو بذرها بخلايا المكونة للدم (كما في المثال) أو أنواع الخلايا الأخرى. إذا لزم الأمر ، بمجرد التصاق الخلايا ، يمكن إضافة العلاج وإجراء تغييرات متوسطة مرتين في الأسبوع. في نهاية التجربة ، يمكن إما إصلاح الهياكل الشبيهة ب BM ومعالجتها بشكل أكبر لدراسات التوطين أو فصلها لتقييم محتويات الخلية. الاختصارات: BCP = فوسفات الكالسيوم ثنائي الطور. BM = نخاع العظام. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: استعادة الخلايا القابلة للحياة من مقصورات مختلفة بعد الزراعة في نموذج 3D الشبيه ب BM. (أ) النمط النموذجي لاستعادة الخلايا من بنية واحدة منفصلة تشبه BM مع 9.84٪ من الخلايا القابلة للحياة (DAPI-). تم استرداد المؤامرات التمثيلية المكونة للدم (66.6٪ CD45 +) ، وخلايا MSC / بانيات العظم (88.6٪ خلايا CD73 + داخل مجتمع CD45) ، والخلايا البطانية (22.1٪ خلايا CD31 + داخل مجتمع CD45) بعد تفكك ثلاثي الأبعاد. (ب) يسمح نظام 3D بصيانة الخلايا المكونة للدم القابلة للحياة (CD45 +) حتى 6 أسابيع بعد الاستزراع. (C) يمكن للأنظمة ثلاثية الأبعاد المصنوعة من MSCs الأولية من NBM أو AML جنبا إلى جنب مع HMEC-1 (الملونة ب Kusabira-Orange في هذا المثال) الحفاظ على HSCs (3.88٪ CD45 + DAPI-cells) في الموقع (D). الاختصارات: BM = نخاع العظام. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ MSC = الخلايا الجذعية الوسيطة ؛ NBM = نخاع العظم الطبيعي ؛ AML = سرطان الدم النخاعي الحاد. HSCs = الخلايا الجذعية المكونة للدم. FSC = مبعثر إلى الأمام. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تصور تفاعلات الخلايا وانتشارها داخل نموذج ثلاثي الأبعاد يشبه BM. تم جمع الأنظمة بعد 3 أسابيع من الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد مع HS27A و HMEC-1 وإضافة الخلايا المكونة للدم بعد أسبوع واحد. تم تصور تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية النموذجية (المرئي باللون البني) بواسطة IHC باستخدام بيروكسيديز الفجل الحصان المضاد للأرانب أو الفأر وتصوره باستخدام 3،3′-diaminobenzidine كركيزة كروموجينية وملطخ بجيل-هيماتوكسيلين ويظهر وجود إما خلايا المكونة للدم مع CD45 (اللوحة اليسرى) ، أو الخلايا اللحمية مع CD73 (اللوحة الوسطى) ، أو تكاثر جميع الخلايا مع KI67 (اللوحة اليمنى). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: BM = نخاع العظام. IHC = الكيمياء الهيستولوجية المناعية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
أحد التحديات الحالية التي تواجهها الدراسات حول القضايا الفسيولوجية البشرية والقضايا المرضية المرتبطة بها هو عدم وجود نماذج تحاكي بدقة الوظائف المعقدة للأعضاء البشرية. في حالة نماذج BM 3D البشرية ، تستخدم العديد من النماذج الهلاميات المائية وتعيد إنتاج BM جزئيا ، مما يوضح قوة ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد مقارنة بالثقافات ثنائية الأبعاد الكلاسيكية في ضمان ، على سبيل المثال ، تمايز عظمي أفضل27,28. ومع ذلك ، على الرغم من قابلية التكرار الجيدة وسهولة الاستخدام ، فإن هذه الأنظمة لا تحاكي بنية وبنية BM 3D البشرية ، مما قد يؤثر بشكل كبير على المزيد من التحليلات. مكنت التطورات التكنولوجية العلماء من إعادة إنتاج بيئة متخصصة أرومات عظمية بشرية أصلية بشكل أفضل باستخدام نظام مفاعل حيوي قائم على التروية للحفاظ على بعض خصائص HSC29. أدى تطوير أجهزة الموائع الدقيقة إلى أساليب جديدة لإعادة إنتاج بنية تشبه نخاع العظم ذات الصلة ، ولكنها لم تحقق حتى الآن سوى ميزات محدودة لنخاع العظام ، وبالتالي قيدت التطبيقات30،31،32،33.
ساهم التقدم في علوم المواد في تطوير مجموعة واسعة من المواد الحيوية الطبيعية أو الاصطناعية ، والتي يمكن استخدامها لتطوير أنظمة زراعة العظام 3D ذات الصلة. ومع ذلك ، يصعب أحيانا تطوير مثل هذه الأنظمة في المختبرات البيولوجية القياسية مع عدم وجود مهارات داخلية في الفيزياء الحيوية. علاوة على ذلك ، في معظم الحالات ، تحقق هذه الأنظمة قدرة محدودة على تقليد البنية ثلاثية الأبعاد للعظام البشرية ، بما في ذلك البيئة المكروية BM ، وقد استخدمت كميات كبيرة من السيتوكينات وعوامل النمو ، مما أدى إلى إنشاء وسيط ثقافة غني بشكل مصطنع34.
استند اختيار الحث على تمايز بانيات العظم بدلا من تمايز الخلايا الشحمية إلى حقيقة أن الأرومات العظمية وبانيات العظم قد وصفت كجزء من مكانة endosteal35. حدد هذا الخلايا العظمية كمكونات مطلوبة لكل من نخاع العظام والعظام. من بين المكونات الخلوية لنخاع العظم ، تشغل الخلايا البطانية واللحمية نسبة كبيرة من البيئة المكروية. بالإضافة إلى ذلك ، ينتج هذان النوعان من الخلايا مكونات هيكلية غير خلوية للمصفوفة خارج الخلية والسيتوكينات المشاركة في تنظيم التوازن والتمايز ، المطلوب هنا لإنشاء بنية متكلسة. وبالتالي ، فإن هذا يبرر استخدام الخلايا البطانية واللحمية ، واختيارنا لخطوط الخلايا للسماح بسهولة الوصول وزيادة التكاثر بين المختبرات. مع كون ثقافة خط HMEC-1 أكثر استقرارا بمرور الوقت ، تم الاحتفاظ بخط الخلية هذا لتطوير نظام 3D. بالنسبة للخلايا اللحمية ، قارنا في ثقافة 2D قدرة تمايز بانيات العظم لخطوط الخلايا اللحمية المشتقة من نخاع العظم الطبيعي: HS5 و HS27A. وجدنا أن خط HS5 لم يفرق بقدر خط HS27A في النظام ثلاثي الأبعاد الذي تم إنشاؤه باستخدام أي من خطي الخلية. في هذا الصدد ، أدت محاولات استبدال خلايا HS27A بخط HS5 إلى إنتاج بنية أقل صلابة ، مما يشير إلى أن HS27A أكثر ملاءمة.
تم استزراع كل من خطوط الخلايا HS27A و HMEC-1 في مجموعات وسائط مختلفة ، حيث يستنبط المرء أفضل بنية صلبة ومحاذاة HMEC-1 على طول هياكل بانيات العظم بحيث يجلب إنتاج المصفوفة خارج الخلية صلابة نسبية للهيكل الأساسي. أظهر تحليل تقدم التمايز في D14 أن التمايز كان أكثر تقدما عند D21 (قياس BSP ، علامة الأرومات العظمية المتأخرة) ، بنسبة 1: 2 ل HMEC-1: HS27A وبنتائج أفضل عند إدخال 2 × 106 HS27A. تلعب الخلايا البطانية أيضا دورا مهما في تنظيم التوازن والتمايز (من بين أمور أخرى من خلال إمداد السيتوكينات). تشير حقيقة الحفاظ على خلايا HMEC-1 في هذا النظام إلى أنها تستطيع على الأقل أداء هذا الدور ، وهذا يساهم في شرعية نموذجنا. بالنسبة للخط البطاني HMEC-1 ، كان من المهم إدخاله في وقت مبكر بما فيه الكفاية حتى يمكن دمجه بشكل صحيح في الهيكل وعلى أمل أن تتمكن هذه الخلايا من تشكيل محاذاة أو حتى أنابيب داخل الهيكل. تم إجراء اختبارات الاستزراع المشترك ل HS27A و HMEC-1 عن طريق إدخال الأخير في مراحل مختلفة: D0 و D7 و D14 ؛ لم يلاحظ أي فرق ملحوظ ، لا في تمايز الخلايا اللحمية ولا في صيانة أو وضع الخلايا البطانية. وهكذا ، تم إدخال هذه الخلايا في بداية العملية. تم إدخال الخلايا المكونة للدم في وقت كان فيه تمايز الأرومات العظمية متقدما بما يكفي لصالح تفاعلات الخلايا والخلايا. كان هذا الاختيار مشروطا أيضا بحقيقة أن هذا التمايز العظمي مشروط باستخدام وسيط ، والذي وفقا لاختباراتنا ، لا يدعم بشكل كامل صيانة الخلايا المكونة للدم. يمكن أن تكون الخلايا الدموية إما خطوط خلايا أو خلايا مكونة للدم BM CD45 أولية.
من هذا النموذج ثلاثي الأبعاد ، يمكننا أن نتصور استبدال كل نوع من الخلايا بالخلايا الأولية ، العادية أو المرضية ، أو حتى لإضافة أنواع أخرى من الخلايا لتعزيز خصائص المحاكاة الحيوية ، مثل الخلايا المناعية أو الخلايا الشحمية أو الخلايا الليفية26. في الواقع ، تم استبدال خط الخلية HS27A ب BM MSCs الأساسي مع تمرير منخفض. وبالمثل ، تم استبدال خطوط الخلايا الدموية بخلايا المكونة للدم BM الأولية. ومع ذلك ، لم يتم اختبار استبدال خلايا HMEC-1 بالخلايا البطانية الأولية بعد. في الوقت الحالي ، لا يزال من الممكن تحسين هذا النموذج من حيث تمثيل الأوعية الدموية ، لأنه على الرغم من وجود الخلايا البطانية وتفاعلها بشكل صحيح مع الخلايا الأخرى من البيئة المكروية (على سبيل المثال ، الخلايا المكونة للدم) ، فإنها لا تشكل أوعية منظمة ، وبالتالي تمنع نضح التدفق لتقليد الأوعية الدموية الوظيفية. بشكل عام ، يمكن أن يؤدي ذلك إلى زيادة تعقيد وتمثيل نموذج 3D الأدنى الحالي. قد تسهل إضافة أنواع أخرى من الخلايا الدراسات التي تبحث في مشكلات أخرى ، مثل أهمية التهاب BM المحلي أو مقاومة العلاج المناعي.
ومع ذلك ، يحتاج هذا النظام ثلاثي الأبعاد إلى 3 أسابيع قبل إضافة الخلايا ذات الأهمية أو الخلايا الدموية أو خلايا السرطان الظهارية إذا تم تقييم عملية ورم خبيث. يجب الحفاظ على الظروف المعقمة ، لأن التغييرات المتوسطة مرتين أسبوعيا يمكن أن تؤدي في بعض الأحيان إلى تلوث متوسط. علاوة على ذلك ، نظرا لأن بعض الخلايا قد تهاجر عبر مسام الملحق وتبدأ في الانتشار في البئر ، مما يؤدي إلى زيادة الاستهلاك المتوسط ، يوصى بالمراقبة المنتظمة.
وصفنا هنا سقالة ثلاثية الأبعاد تسمح بالتمايز العظمي وطورنا بيئة دقيقة ذات صلة ، في المختبر ، 3D ، تشبه BM البشرية. يسمح هذا النظام بالتحليل في الموقع واسترجاع الخلايا الحية في نهاية المطاف. يوفر هذا النظام أداة جديدة ومرنة للغاية ، قابلة للتكرار وسهلة الاستخدام ، مع مجموعة واسعة من التطبيقات لدراسة التفاعلات والآليات داخل البيئة المكروية ل BM البشرية.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر P. Battiston-Montagne و A. Jambon من منصة قياس الخلايا CRCL و N. Gadot و C. Leneve من منصة علم الأمراض البحثية ، قسم البحث والابتكار الانتقالي ، مركز ليون بيرارد. المؤلفون ممتنون ل B. Manship على الطبعة الإنجليزية. تم تمويل هذا العمل من قبل Inserm و FI-LMC إلى V. M. S. ، وتم دعم S. L. K. A. و L. B. بمنحة من Société Française d'Hématologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
- Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
- Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
- Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S. Hematopoietic stem cells. Methods in Enzymology. 419, 149-179 (2006).
- Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
- Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
- Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462 (2022).
- Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (5), 345-361 (2021).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
- Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
- Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
- Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77 (2018).
- Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
- Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
- Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002 (2016).
- Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
- Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
- Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
- de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796 (2021).
- Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683 (2021).
- Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).
