Summary
Hier beschrijven we een eenvoudig te implementeren, gestandaardiseerd, microfysiologisch systeem dat de complexiteit van de in vivo structuur van het menselijk beenmerg weerspiegelt en een relevant model biedt om een breed scala aan normale en pathologische gebeurtenissen nauwkeurig te bestuderen.
Abstract
De medullaire niche is een complex ecosysteem dat essentieel is om homeostase voor residente cellen te behouden. Inderdaad, het beenmerg, dat een complexe extracellulaire matrix en verschillende celtypen omvat, zoals mesenchymale stamcellen, osteoblasten en endotheelcellen, is diep betrokken bij hematopoëtische stamcelregulatie door directe cel-celinteracties, evenals cytokineproductie. Om deze in vivo structuur nauw na te bootsen en experimenten uit te voeren die de reacties van het menselijk beenmerg weerspiegelen, zijn verschillende 3D-modellen gemaakt op basis van biomaterialen, voornamelijk gebaseerd op primaire stromale cellen. Hier wordt een protocol beschreven om een minimaal en gestandaardiseerd systeem te verkrijgen dat eenvoudig op te zetten is en kenmerken biedt van een beenmergachtige structuur, die verschillende celpopulaties combineert, inclusief endotheelcellen, en de heterogeniteit van in vivo beenmergweefsel weerspiegelt. Deze 3D-beenmergachtige structuur - geassembleerd met behulp van op calciumfosfaat gebaseerde deeltjes en menselijke cellijnen, representatief voor de micro-omgeving van het beenmerg - maakt de monitoring van een breed scala aan biologische processen mogelijk door verschillende primaire celpopulaties binnen het systeem te combineren of te vervangen. De uiteindelijke 3D-structuren kunnen vervolgens worden geoogst voor beeldanalyse na fixatie, paraffine-inbedding en histologische / immunohistochemische kleuring voor cellokalisatie binnen het systeem, of gedissocieerd om elke cellulaire component te verzamelen voor moleculaire of functionele karakterisering.
Introduction
Beenmerg (BM) wordt gevonden in zowel de centrale holtes van axiale als lange botten en trabeculaire platte botten en bevat een verscheidenheid aan verschillende cellulaire en niet-cellulaire componenten. Op structureel niveau bestaat het uit hematopoëtische weefseleilanden (ook wel "hematonen" genoemd)1,2 en vetcellen omgeven door vasculaire sinussen afgewisseld in trabeculair bot3. Bij lange en platte botten is de bloedtoevoer naar het bot en beenmerg met elkaar verbonden via een endsteaal netwerk van bloedvaten4. Verborgen in dit solide beschermende netwerk, herbergt de BM zeer onrijpe cellen ondergedompeld in een sponsachtig stroma en vormt de locatie voor de differentiatie van residente mesenchymale stamcellen (MSC's) en hematopoëtische stamcellen (HSC's)5. Inderdaad, afgezien van de vernieuwing van botweefsels door de productie van osteoblasten, bevindt een van de belangrijkste bekende functies van de BM zich in de ontwikkeling van hematopoëse6.
Het BM-hematopoietische weefsel omvat een verscheidenheid aan celtypen, namelijk HSC's, voorlopers en meer gedifferentieerde bloedcellen zoals lymfocyten, neutrofielen, erytrocyten, granulocyten, monocyten en trombocyten7. Hematopoietische cellen zijn niet willekeurig gerangschikt in de BM-ruimte, maar vertonen een bepaalde organisatie binnen de hematopoietische niches, die veel celtypen van verschillende oorsprong omvatten (osteoblasten, osteoclasten, MSC's, adipocyten, sinusoïdaal endotheel en perivasculair stromale cellen, immuuncellen, zenuwcellen en verschillende volwassen hematopoietische cellen), die een complexe structuur vormen om normale hematopoiese te garanderen8 . De biologische functies van de hematopoëtische niche omvatten regulatie van HSC-overleving, adhesie, rust, homing en differentiatie door middel van verschillende mechanismen (cel-cel- en cel-matrixinteracties, productie van oplosbare factoren, hypoxie) als reactie op meerdere fysiologische of niet-fysiologische stress 3,6. Hoewel deze hematopoietische niches aanvankelijk werden gezien als homogene entiteiten, hebben technologische ontwikkelingen zoals eencellige en beeldvormingsanalyses geleidelijk hun complexiteit, dynamiek en adaptieve eigenschappen onthuld 9,10,11.
De cruciale noodzaak om het gebruik van dieren voor het ontcijferen van menselijke fysiologische en pathologische processen te vervangen en te verminderen, leidt tot nieuwe kansen en uitdagingen11,12. Onder nieuw beschreven in vitro tools zijn driedimensionale (3D) modellen voorgesteld die de in vivo menselijke BM beter nabootsen dan klassieke tweedimensionale (2D) culturen 13,14,15,16,17. 3D-modellering lijkt dus een veelbelovende benadering om cel-cel- en cel-matrixinteracties te observeren, dichter bij die welke in vivo plaatsvinden. Met behulp van verschillende van deze modellen hebben sommige teams de overleving en proliferatie van HSC's18,19 aangetoond. Er zijn verschillende 3D-modellen beschikbaar, de meest gebruikelijke aanpak is het gebruik van op steigers gebaseerde 3D-biomaterialen zoals hydrogels, colloïden of collageen, geassocieerd met MSC's die profiteren van hun osteoblastische afstammingsdifferentiatiecapaciteiten 20,21,22. Niettemin is er geen wereldwijde toestemming bereikt om te voldoen aan alle vereisten voor studies op menselijke cellen op een gebruiksvriendelijke en gestandaardiseerde manier23, vooral omdat deze huidige 3D-systemen voornamelijk afhankelijk zijn van primaire stromale cellen en dus lijden aan beperkte toegang tot primaire monsters, weefselbeschikbaarheid en heterogeniteit.
Bovendien moet het endotheelcelcompartiment worden geïntroduceerd, omdat deze cellen een belangrijk onderdeel vormen van cel-celinteracties en betrokken zijn bij het lot van stamcellen en de ontwikkeling van BM-ziekten, zowel bij leukemie24 als bij metastase25. We hebben eerder gemeld dat de toevoeging van pathologische elementen in een gestandaardiseerd humaan 3D-beenmergmodel kenmerken recapituuleert die zijn waargenomen in patiëntmonsters, zoals extracellulaire matrix (ECM) -veranderingen26. Om de dynamiek en interacties tussen de menselijke BM-micro-omgeving en de residente cellen beter te begrijpen, bieden we een gedetailleerd protocol voor een gebruiksvriendelijk en gestandaardiseerd systeem om een minimale, goed georganiseerde, BM-achtige structuur te bouwen. Dit systeem bestaat uit drie menselijke beenmergceltypen- endotheelcellen en stromale cellen, die de micro-omgeving vertegenwoordigen, en HSC's. Door specifieke kralen te gebruiken als een steiger en een osteoblastisch differentiatiemedium, zal de verkregen 3D-structuur de menselijke medullaire niche nabootsen, waardoor een handige studie van menselijk beenmerg mogelijk is.
Protocol
OPMERKING: Om de beenmergachtige ruggengraatstructuur voor te bereiden, vertrouwt dit protocol op het combineren van kralen met HMEC-1 endotheelcellen en HS27A stromale cellen op bifasisch calciumfosfaat (BCP) kralen. De BCP-kralen zullen dienen als een steiger die, met een specifiek medium, de 3D-structurele vormgeving mogelijk maakt.
1. Kraalbereiding en sterilisatie
- Weeg 35-40 mg BCP-kralen (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) voor elke insert (kleine, cilindrische, plastic schaal met een polycarbonaatmembraan aan de onderkant) in een buis van 1,5 ml (zie materiaaltabel). Na het wegen van de kralen, boor een klein gat met een schone naald door de bovenkant van de buis van 1,5 ml om te voorkomen dat het deksel openspringt tijdens de autoclaafcyclus (121 ° C gedurende 60 minuten) en plaats de buizen in een verticale positie in een gesloten steriele doos .
2.3D insertvoorbereiding onder een steriele kap
- Plaats steriele polycarbonaat celkweekinzetstukken in de putten van een 6-wells plaat. Giet steriele BCP-kralen uit een buis van 1,5 ml in de insert. Was de kralen zorgvuldig door 350 μL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in de insert te druppelen en voeg vervolgens 4,5 ml 1x PBS toe aan de put. Verwijder en gooi de PBS weg met behulp van vacuüm of een pipet van 5 ml door de punt in een hoek van de put te plaatsen. Herhaal de wasstap twee keer.
- Zodra de kralen zijn gewassen, gebruikt u 1x PBS aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) om het systeem te blokkeren. Voeg voorzichtig 350 μL van de blokkerende oplossing toe aan de insert en 4,5 ml aan de put en plaats de hele plaat in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
OPMERKING: Stappen 2.1 en 2.2 helpen om het vrijkomen van ionen van BCP-kralen vóór het zaaien van cellen te minimaliseren.
3. Cellijn oogsten en 3D onderhoud
OPMERKING: Na deze incubatiestap worden micromilieucellen toegevoegd om de ruggengraat van de 3D-structuur te vormen. Dit systeem is gebaseerd op het gebruik van HMEC-1, menselijke microvasculaire endotheelcellen vereeuwigd met groot T-antigeen van SV40, en HS27A, menselijke beenmergstromale cellen vereeuwigd met humaan papillomavirus, vanwege hun vermogen om een solide BM-achtige structuur te vormen en hun compatibiliteit met de opname van endotheelcellen.
- Voordat u cellen aan het systeem toevoegt, bereidt u de volgende incubatiemedia voor:
- Meng voor 50 ml volledig Osteo Differentiation Medium (ODM) 45 ml Dulbecco's gemodificeerde eagle medium (DMEM) + 5 ml FBS + 0,5 ml penicilline-streptomycine + 8 × 10-4 mg / l dexamethason + 2,16 g / l bèta-glycerofosfaat + 44 mg / l ascorbinezuur.
- Meng voor 50 ml compleet HMEC-1-medium 45 ml MCDB 131 + 5 ml FBS + 0,5 ml penicilline-streptomycine + 1% glutaminevervanger + 1 mg / l hydrocortison + 10 μg / l EGF.
- Verwijder de blokkeringsoplossing uit het systeem. Meng 1 × 106 HMEC-1-cellen (die het vasculaire compartiment vertegenwoordigen) en 2 × 106 HS27A-cellen (die het mesenchymale stromale celcompartiment vertegenwoordigen) in een buis van 15 ml en centrifuge gedurende 5 minuten bij 1.575 × g bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en voeg 175 μL HMEC-1-medium (specifiek medium voor HMEC-1-celgroei) toe met 175 μL ODM (specifiek medium voor HS27A-osteodifferentiatie).
- Giet 350 μL van deze suspensie met 3 × 106 totale cellen in elke insert. Giet vervolgens 4,5 ml van de gecombineerde media (2,25 ml HMEC-1 medium + 2,25 ml ODM) zonder cellen in de putten van de plaat. Zuig het mengsel voorzichtig meerdere keren op en doseer het met een micropipette van 1 ml om de cellen en BCP-kralen in de insert te homogeniseren. Wijs de hele mix toe om zich onderaan de insert te nestelen.
OPMERKING: Een mixpreparaat met één dood volume wordt aanbevolen als er meerdere inserts worden gekweekt. Als er bijvoorbeeld vier inserts worden gekweekt, bereid dan altijd het volume voor dat nodig is voor vijf inserts. - Zodra de endotheel- en mesenchymale cellen in de insert zijn gehomogeniseerd, houdt u de 6-well plate in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3 weken. Verander het medium in de insert en de put 2x per week door het medium voorzichtig van de insert te verwijderen met behulp van een 1 ml micropipette en de punt bij de binnenste insertwand te plaatsen om te voorkomen dat de hoek van de insert wordt verstoord.
OPMERKING: Het opgehaalde supernatant kan bij elke stap bij -80 °C worden bewaard voor latere eiwitkwantificering.
4. Toevoeging van interessante cellen aan het systeem
OPMERKING: Na 3 weken HMEC-1 en HS27A kweken, maakte de osteodifferentiatie van HS27A-cellen de rigidificatie van het systeem mogelijk. Voeg in deze stap hematologische cellen van belang (het aantal toegevoegde cellen kan variëren van 1 × 104 tot 1 × 106) toe aan de insert. De toegevoegde cellen waren TF1-cellen getransfecteerd met BCR-ABL-oncogen en primaire mononucleaire CD34+ cellen afkomstig van acute myeloïde leukemiepatiënten of gezonde donoren.
- Verander de mediumsamenstelling in deze stap, omdat de ODM-verbinding giftig is voor hematologische cellen en het niet nodig is om het toe te voegen zodra de systeemstijfheid is voltooid. Om bijvoorbeeld hematopoietisch onderhoud te ondersteunen, vervangt u ODM-medium met volledige RPMI voor hematopoëtische cellijnen (RPMI aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine) of IMDM voor primaire hematopoëtische cellen. Bereid een batch van 50% compleet HMEC-1 medium en 50% compleet RPMI/IMDM medium voor de 3D medium (tweemaal) wekelijkse veranderingen voor.
- Resuspendeer de hematologische cellen van belang in dit combinatiemedium en voeg het toe aan de insert. Als een medicijnbehandelingsprotocol vereist is, wacht dan 24 uur na het toevoegen van de cellen van belang voor de behandeling, zodat ze de tijd hebben om zich aan de botachtige structuur te hechten.
- Pas de periode van 3D-celcultuur aan volgens de vereisten. Ververs het medium (50% HMEC-1 compleet medium + 50% RPMI compleet medium) twee keer per week.
OPMERKING: In de loop van de 3D-celcultuur kunnen sommige aanhangende cellen buiten de insert in de bodem van de putten lekken, waardoor het mediumverbruik toeneemt. Controleer onder de microscoop op celdispersie voorbij het inzetstuk en vervang het inzetstuk indien nodig in een nieuwe 6-wellsplaat onder een steriele kap.
5.3D beenmergachtige experimentele resultaten
OPMERKING: Na 3D-kweken kunnen verschillende resultaten worden bereikt volgens de doelstellingen van het experiment.
- Eiwitanalyse
OPMERKING: In de loop van het 3D-experiment kunnen de eiwitten die worden uitgescheiden door de cellen die aanwezig zijn in de beenmergachtige structuur worden verzameld voor verdere analyses.- Wanneer het kweekmedium 2x per week wordt vervangen, bewaar het opgehaalde supernatant aan de binnenkant van de insert bij -80 °C om de productie van interessante eiwitten in het systeem te evalueren.
- Cellen loskoppelen van de 3D-structuur (onder een steriele kap als cellen moeten worden gesorteerd)
OPMERKING: De cellen gekweekt in het 3D-beenmergachtige systeem kunnen worden opgehaald, gesorteerd en verder geanalyseerd.- Meng aan het einde van het experiment in een buis van 15 ml 4,5 ml RPMI met 0,5 ml FBS aangevuld met 0,4 mg / ml collagenase en verwarm de oplossing gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Plaats de insert ondersteboven (witte membraanzijde bovenop) op een steriel 6-wells plaatdeksel om het membraan goed uit te snijden. Gebruik een steriel scalpel om het membraan vanaf de zijkanten te snijden en zo een witte vaste schijf op te halen. Plaats de schijf in de warme buis van 15 ml die in stap 5.2.1 is bereid.
- Plaats de buis in een actief wiel in een incubator van 37 °C en incubeer gedurende 10 minuten om de spijsvertering mogelijk te maken (in contact met collagenase). Pas dezelfde incubatietijd toe voor alle membranen om een scheve analyse te voorkomen.
- Na 10 minuten centrifugeer je de buis van 15 ml gedurende 5 minuten bij 1.575 × g bij kamertemperatuur, gooi je het supernatant weg en resuspenseer je de pellet in 5 ml warme 1x PBS. OPMERKING: Bij deze stap, omdat het polycarbonaatmembraan over het algemeen drijft in de supernatantfractie, kan het worden weggegooid met behulp van een steriele pipetpunt. Als het membraan nog steeds in de pellet zit, laat het dan staan en verwijder het aan het einde van de volgende stap.
- Resuspendeer de pellet in 300 μL warm trypsine, vortex de buis gedurende 10 s en plaats het in een waterbad van 37 °C gedurende 1 min.
- Stop de enzymatische spijsvertering door 1 ml warme pure FBS toe te voegen. Met een micropipette van 1 ml, mechanisch aspirateren en doseren van het medium om de schijf volledig te dissociëren.
LET OP: De aspiratie/doseerstap moet zeer snel zijn, anders zullen de kralen in de punt bezinken. - Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 1.575 × g. Resuspendeer de pellet in 3 ml 1x PBS aangevuld met 10% FBS.
- Laat de kralen 5 s aan sediment voordat u het supernatant verzamelt en filtert door een celzeef van 35 μm die op een verzamelbuis is geplaatst. Centrifugeer het opgehaalde filtraat gedurende 5 minuten bij 1.575 × g. Tel de cellen met trypan blue om de levensvatbaarheid te evalueren en ga verder met flowcytometrieanalyses.
OPMERKING: Het aantal levensvatbare cellen dat wordt opgehaald na trypan blue incubatie is ~ 1-2 × 105 cellen per verteerde insert.
- Flowcytometrie labeling van opgehaalde cellen
OPMERKING: De cellen die uit de 3D-beenmergachtige structuur worden opgehaald, kunnen worden gelabeld en verder worden geanalyseerd door flowcytometrie. Gebruik een mix van antilichamen om de verschillende compartimenten na 3D-dissociatie te detecteren. Hier werden CD45 (vlekken op de hematologische cellen van belang), CD31 (vlekken in het vasculaire compartiment) en CD73 (vlekken op het osteoblastische compartiment) gebruikt bij 1 μL in 50 μL PBS + 2% FBS. Houd alle bereide cellen en antilichamen op ijs (4 °C) uit de buurt van licht tijdens het hele proces.- Resuspenseer de pellets in het antilichaammengsel en incubeer gedurende 30-40 minuten op ijs uit de buurt van licht.
- Voeg 1 ml PBS + 2% FBS toe om de cellen te wassen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.575 × g.
- Resuspendeer de opgehaalde pellet in 200 μL van 1x PBS + 10% FBS aangevuld met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, verdund 1:2.000).
- Analyseer de buizen in een cytometer met behulp van de volgende parameters: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Gebruik een FSC-H versus FSC-W grafiek om de singletpopulatie te beschermen. Gebruik in de singletfractie een DAPI-A versus FSC-A grafiek om de populatie levensvatbare cellen (DAPI-negatief) te bepalen. Met de DAPI-negatieve populatie eerder omheind, gebruik een APC-A versus FSC-A grafiek plot om de CD45-positieve populatie te bepalen.
- Fixatie van de 3D beenmergachtige structuur
OPMERKING: Fixatie van de 3D BM-achtige structuur wordt over het algemeen uitgevoerd voor immunohistochemie of immunofluorescentie om cellen in situ te visualiseren en voor verdere specifieke kleuring.- Om de BM-achtige structuur te bevestigen, brengt u de insert (stap 4.3) over van de oude plaat naar een nieuwe 6-well plaat gevuld met 1x PBS. Vervang vervolgens voorzichtig het medium in de insert door 1x PBS.
OPMERKING: Spoel de gevormde structuur niet met PBS; de druk van de vloeistof kan de 3D-structuur aantasten. - Zodra de insert is gewassen, plaatst u deze in een nieuwe 6-wells plaat en vult u zowel de put als de insert met vers geopende paraformaldehyde (PFA) 4% (verdund 16% in 1x PBS).
- Laat het fixatieproces 4 uur doorgaan bij kamertemperatuur uit de buurt van licht.
- Was de insert aan het einde van het fixatieproces eenmaal met 1x PBS en bewaar deze op 4 °C uit de buurt van licht.
- Knip het membraan aan de onderkant van het inzetstuk zoals beschreven in stap 5.2.2 om de vaste schijf op te halen.
- Incubeer de schijf 4x gedurende 48 uur in EDTA (0,5 M, pH 8) om de structuur te ontkalken.
- Integreer de structuur in paraffine en snijd 4 μm dikke secties.
- Gebruik een geautomatiseerd immunostainer om de secties te incuberen met anti-CD45-, anti-CD73- en Ki67-antilichamen. Visualiseer de kleuring met een anti-konijn of -muis paardenradijsperoxidase (HRP) en met 3,3'-diaminobenzidine als een chromogeen substraat en counterstain met Gill's-hematoxyline.
- Om de BM-achtige structuur te bevestigen, brengt u de insert (stap 4.3) over van de oude plaat naar een nieuwe 6-well plaat gevuld met 1x PBS. Vervang vervolgens voorzichtig het medium in de insert door 1x PBS.
Representative Results
Met behulp van dit protocol is het mogelijk om een minimale, in vitro, 3D, menselijke BM-achtige micro-omgeving samen te vatten, waaruit levensvatbare cellen uit drie verschillende celcompartimenten kunnen worden gehaald (figuur 1). Inderdaad, na de gewenste blootstelling kunnen 3D BM-achtige structuren worden gedissocieerd en kunnen de MSC's, endotheelcellen en hematopoëtische cellen worden geëvalueerd / gekarakteriseerd met behulp van flowcytometrie (figuur 2A). Tot nu toe suggereren de resultaten dat het mogelijk is om hematologische cellen gedurende ten minste 6 weken binnen het 3D-model te behouden, voordat levensvatbare cellen worden opgehaald (figuur 2B). Er zijn echter toekomstige onderzoeken nodig om de limiet van dit 3D-model in te schatten. Daarnaast is het, indien nodig, mogelijk om de HS27A cellijn te vervangen door primair Normaal Beenmerg (NBM) MSC of Acute Myeloïde Leukemie (AML) MSC in dit 3D BM-achtige model (Figuur 2C) of de hematopoëtische cellijn te vervangen door primaire HSC's (Figuur 2D). Bovendien kunnen bij het analyseren van de interacties tussen celcompartimenten of de lokalisatie van specifieke markers van belang, 3D BM-achtige structuren worden gefixeerd en verder worden verwerkt met paraffine-inbedding en immunochemie. De analyse van cd45(hematologische) of cd73(MSC)-inhoud werd bijvoorbeeld uitgevoerd met behulp van deze 3D-modellen (figuur 3).
Figuur 1: Schematisch diagram van de eerste opstelling van het menselijke 3D BM-achtige systeem. Na 3 weken co-kweek kan vast BM-achtig weefsel worden verzameld of bezaaid met hematopoëtische cellen (zoals in het voorbeeld) of andere celtypen. Indien nodig, zodra cellen aanhangend zijn, kan de behandeling worden toegevoegd en kunnen twee keer per week gemiddelde veranderingen worden uitgevoerd. Aan het einde van het experiment kunnen BM-achtige structuren worden gefixeerd en verder worden verwerkt voor lokalisatiestudies of worden gedissocieerd om de celinhoud te evalueren. Afkortingen: BCP = bifasisch calciumfosfaat; BM = beenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Herstel van levensvatbare cellen uit verschillende compartimenten na kweek in het BM-achtige 3D-model. (A) Typisch patroon van celherstel van één gedissocieerde BM-achtige structuur met 9,84% levensvatbare cellen (DAPI-). Representatieve plots van hematopoietische (66,6% CD45+), MSC/osteoblastcellen (88,6% CD73+ cellen binnen de CD45-populatie) en endotheelcellen (22,1% CD31+ cellen binnen de CD45-populatie) hersteld na 3D-dissociatie. (B) Het 3D-systeem maakt het onderhoud van levensvatbare hematopoëtische cellen (CD45+) mogelijk tot 6 weken na de kweek. (C) 3D-systemen gemaakt van primaire MSC's van NBM of AML naast HMEC-1 (gekleurd met Kusabira-Orange in dit voorbeeld) kunnen HSC's (3,88% CD45+ DAPI-cellen) in situ (D) handhaven. Afkortingen: BM = beenmerg; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; MSC = mesenchymale stamcel; NBM = normaal beenmerg; AML = acute myeloïde leukemie; HSC's = hematopoëtische stamcellen; FSC = voorwaartse verstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Visualisatie van celinteracties en proliferatie binnen het BM-achtige 3D-model. Systemen werden verzameld na 3 weken 3D-cocultuur met HS27A en HMEC-1 en de toevoeging van hematopoëtische cellen na 1 week. Typische immunohistochemische kleuring (gevisualiseerd in bruin) door IHC werd gevisualiseerd met behulp van een anti-konijn of -muis paardenradijsperoxidase en gevisualiseerd met 3,3′-diaminobenzidine als een chromogeen substraat en gecounterd met Gill's-hematoxyline en toont de aanwezigheid van hematopoëtische cellen met CD45 (linkerpaneel), stromale cellen met CD73 (middenpaneel) of proliferatie van alle cellen met KI67 (rechterpaneel). Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: BM = beenmerg; IHC = immunohistochemie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Een van de huidige uitdagingen waarmee studies over menselijke fysiologische en bijbehorende pathologische problemen worden geconfronteerd, is het gebrek aan modellen die de complexe functies van menselijke organen nauwkeurig nabootsen. In het geval van menselijke BM 3D-modellen gebruiken veel modellen hydrogels en reproduceren ze gedeeltelijk de BM, wat de kracht van 3D-cultuurcondities illustreert in vergelijking met klassieke 2D-culturen om bijvoorbeeld een betere osteoblastische differentiatiete garanderen 27,28. Ondanks de goede reproduceerbaarheid en het gebruiksgemak bootsen deze systemen echter niet de menselijke BM 3D-structuur en -architectuur na, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op verdere analyses. Technologische vooruitgang heeft wetenschappers in staat gesteld om de inheemse menselijke osteoblastische niche-omgeving beter te reproduceren met behulp van een op perfusie gebaseerd bioreactorsysteem om sommige HSC-eigenschappen te behouden29. De ontwikkeling van microfluïdische apparaten heeft geleid tot nieuwe benaderingen om een relevante beenmergachtige structuur te reproduceren, maar hebben tot nu toe slechts beperkte kenmerken van het beenmerg bereikt en hebben daarom toepassingen beperkt 30,31,32,33.
Vooruitgang in de materiaalwetenschappen heeft bijgedragen aan de ontwikkeling van een breed scala aan natuurlijke of synthetische biomaterialen, die kunnen worden gebruikt om relevante 3D-botkweeksystemen te ontwikkelen. Dergelijke systemen zijn echter soms moeilijk te ontwikkelen in standaard biologische laboratoria zonder interne vaardigheden in de biofysica. Bovendien bereiken deze systemen in de meeste gevallen een beperkt vermogen om de 3D-structuur van het menselijk bot na te bootsen, inclusief de BM-micro-omgeving, en hebben ze grote hoeveelheden cytokines en groeifactoren gebruikt, waardoor een kunstmatig rijk kweekmedium is ontstaan34.
De keuze om osteoblastische differentiatie te induceren in plaats van adipocytische differentiatie was gebaseerd op het feit dat preosteoblasten en osteoblasten zijn beschreven als onderdeel van de endosteale niche35. Dit identificeerde osteoblastische cellen als gevraagde componenten van zowel bot als beenmerg. Onder de cellulaire componenten van het beenmerg bezetten endotheel- en stromale cellen een groot deel van de micro-omgeving. Bovendien produceren deze twee celtypen structurele niet-cellulaire componenten van de extracellulaire matrix en cytokines die betrokken zijn bij de regulatie van homeostase en differentiatie, hier gevraagd om een verkalkte structuur te genereren. Dit rechtvaardigt dus het gebruik van endotheel- en stromale cellen en onze keuze van cellijnen om gemakkelijke toegang mogelijk te maken en de reproduceerbaarheid tussen laboratoria te vergroten. Omdat de cultuur van de HMEC-1-lijn in de loop van de tijd stabieler werd, werd deze cellijn behouden voor de ontwikkeling van het 3D-systeem. Voor stromale cellen vergeleken we in 2D-cultuur de osteoblastdifferentiatiecapaciteit van de stromale cellijnen afgeleid van normaal beenmerg: HS5 en HS27A. We ontdekten dat de HS5-lijn niet zoveel onderscheid maakte als de HS27A-lijn in het 3D-systeem dat met een van beide cellijnen werd gegenereerd. In dit opzicht hebben pogingen om HS27A-cellen te vervangen door de HS5-lijn geresulteerd in de productie van een minder rigide structuur, wat suggereert dat HS27A meer geschikt is.
Zowel HS27A- als HMEC-1-cellijnen werden gekweekt in verschillende mediacombinaties, waarbij men de beste rigide structuur en uitlijningen van HMEC-1 langs osteoblaststructuren uitlokt, zodat de productie van de extracellulaire matrix een relatieve stijfheid aan de basisstructuur toevoegt. Analyse van de vooruitgang van differentiatie bij D14 toonde aan dat de differentiatie geavanceerder was bij D21 (meting van BSP, late osteoblastische marker), met een verhouding 1:2 voor HMEC-1:HS27A en met betere resultaten wanneer 2 × 106 HS27A werden geïntroduceerd. Endotheelcellen hebben ook een belangrijke rol bij het reguleren van homeostase en differentiatie (onder andere door de toevoer van cytokines). Het feit dat HMEC-1-cellen in dit systeem worden onderhouden, geeft aan dat ze op zijn minst deze rol kunnen vervullen, en dit draagt bij aan de legitimiteit van ons model. Voor de HMEC-1 endotheellijn was het belangrijk om deze vroeg genoeg te introduceren, zodat deze goed in de structuur kon worden geïntegreerd en in de hoop dat deze cellen uitlijningen of zelfs buizen in de structuur konden vormen. Co-kweektests van HS27A en HMEC-1 werden uitgevoerd door de laatste in verschillende stadia te introduceren: D0, D7, D14; er werd geen opmerkelijk verschil waargenomen, noch in de differentiatie van de stromale cellen, noch in het onderhoud of de positionering van de endotheelcellen. Deze cellen werden dus aan het begin van het proces geïntroduceerd. Hematopoietische cellen werden geïntroduceerd in een tijd waarin osteoblastische differentiatie geavanceerd genoeg zou zijn om cel-celinteracties te bevorderen. Deze keuze werd ook bepaald door het feit dat deze osteoblastische differentiatie wordt geconditioneerd door het gebruik van een medium, dat volgens onze tests het onderhoud van de hematopoëtische cellen niet volledig ondersteunt. Hematologische cellen kunnen cellijnen of primaire BM CD45 hematopoietische cellen zijn.
Vanuit dit 3D-model zouden we kunnen overwegen om elk celtype te vervangen door primaire cellen, normaal of pathologisch, of zelfs om andere celtypen toe te voegen om biomimetische eigenschappen te stimuleren, zoals immuuncellen, adipocyten of fibroblasten26. In feite is de HS27A-cellijn vervangen door primaire BM MSC's met een lage passaging. Evenzo werden hematologische cellijnen vervangen door primaire BM-hematopoietische cellen. De vervanging van HMEC-1-cellen door primaire endotheelcellen is echter nog niet getest. Momenteel kan dit model nog steeds worden verbeterd in termen van vasculatuurrepresentatie, omdat hoewel endotheelcellen aanwezig zijn en correct interageren met andere cellen uit de micro-omgeving (bijv. Hematopoietische cellen), ze geen gestructureerde bloedvaten vormen, waardoor flowperfusie wordt uitgesloten om functionele bloedvaten na te bootsen. Over het algemeen zou dit de complexiteit en representativiteit van het huidige minimale 3D-model geleidelijk kunnen vergroten. De toevoeging van andere celtypen kan studies vergemakkelijken die andere kwesties onderzoeken, zoals het belang van lokale BM-ontsteking of resistentie tegen immunotherapie.
Dit 3D-systeem heeft echter 3 weken nodig voordat cellen van belang, hematologische cellen of epitheelkankercellen als het metastaseproces wordt geëvalueerd, kunnen worden toegevoegd. Steriele omstandigheden moeten worden gehandhaafd, omdat gemiddelde veranderingen tweemaal per week soms kunnen leiden tot gemiddelde besmetting. Verder, aangezien sommige cellen door de poriën van de insert kunnen migreren en in de put beginnen te verspreiden, wat leidt tot een verhoogd mediumverbruik, wordt regelmatige controle aanbevolen.
We beschreven hier een 3D-steiger die osteoblastische differentiatie mogelijk maakt en ontwikkelden een relevante , in vitro, 3D, menselijke BM-achtige micro-omgeving. Dit systeem maakt in situ analyse en het uiteindelijke ophalen van levende cellen mogelijk. Dit systeem biedt een nieuwe en zeer flexibele tool, reproduceerbaar en gebruiksvriendelijk, met een breed scala aan toepassingen om interacties en mechanismen binnen de menselijke BM-micro-omgeving te bestuderen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We danken P. Battiston-Montagne en A. Jambon van het CRCL cytometrie platform en N. Gadot en C. Leneve van het Research Pathology Platform, Department of Translational Research and Innovation, Centre Léon Bérard. De auteurs zijn B. Manship dankbaar voor de Engelse editie. Dit werk werd gefinancierd door Inserm en FI-LMC aan V. M. S., en S. L. K. A. en L. B. werden ondersteund door een subsidie van Société Française d'Hématologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
- Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
- Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
- Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S. Hematopoietic stem cells. Methods in Enzymology. 419, 149-179 (2006).
- Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
- Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
- Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462 (2022).
- Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (5), 345-361 (2021).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
- Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
- Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
- Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77 (2018).
- Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
- Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
- Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002 (2016).
- Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
- Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
- Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
- de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796 (2021).
- Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683 (2021).
- Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).
