Summary
Her beskriver vi et let at implementere, standardiseret, mikrofysiologisk system, der afspejler kompleksiteten af den menneskelige knoglemarvs in vivo-struktur , hvilket giver en relevant model til finstudier af en bred vifte af normale og patologiske hændelser.
Abstract
Den medullære niche er et komplekst økosystem, der er afgørende for at opretholde homeostase for residente celler. Faktisk er knoglemarven, som omfatter en kompleks ekstracellulær matrix og forskellige celletyper, såsom mesenkymale stamceller, osteoblaster og endotelceller, dybt involveret i hæmatopoietisk stamcelleregulering gennem direkte celle-celleinteraktioner samt cytokinproduktion. For nøje at efterligne denne in vivo-struktur og udføre eksperimenter, der afspejler reaktionerne fra den menneskelige knoglemarv, er der skabt flere 3D-modeller baseret på biomaterialer, der primært er afhængige af primære stromale celler. Her beskrives en protokol for at opnå et minimalt og standardiseret system, der er let at konfigurere og giver funktioner i knoglemarvslignende struktur, som kombinerer forskellige cellepopulationer, herunder endotelceller, og afspejler heterogeniteten af in vivo knoglemarvsvæv. Denne 3D-knoglemarvslignende struktur - samlet ved hjælp af calciumphosphatbaserede partikler og humane cellelinjer, der er repræsentative for knoglemarvsmikromiljøet - muliggør overvågning af en lang række biologiske processer ved at kombinere eller erstatte forskellige primære cellepopulationer i systemet. De endelige 3D-strukturer kan derefter enten høstes til billedanalyse efter fiksering, paraffinindlejring og histologisk / immunohistokemisk farvning til cellelokalisering i systemet eller dissocieres for at indsamle hver cellulær komponent til molekylær eller funktionel karakterisering.
Introduction
Knoglemarv (BM) findes i både de centrale hulrum i aksiale og lange knogler og trabekulære flade knogler og indeholder en række forskellige cellulære og ikke-cellulære komponenter. På strukturelt niveau består den af hæmatopoietiske vævsøer (også kaldet "hæmatoner")1,2 og fedtceller omgivet af vaskulære bihuler blandet inden for trabekulær knogle3. I lange og flade knogler er blodtilførslen til knoglen og knoglemarven forbundet gennem et endosteal netværk af fartøjer4. Skjult i dette solide beskyttende netværk er BM vært for meget umodne celler nedsænket i en svampet stroma og udgør stedet for differentiering af hjemmehørende mesenkymale stamceller (MSC'er) og hæmatopoietiske stamceller (HSC'er)5. Bortset fra fornyelse af knoglevæv gennem produktion af osteoblaster ligger en af de vigtigste kendte funktioner i BM i hæmatopoieseudvikling6.
BM hæmatopoietisk væv omfatter en række celletyper, nemlig HSC'er, forstadier og mere differentierede blodlegemer såsom lymfocytter, neutrofiler, erythrocytter, granulocytter, monocytter og trombocytter7. Hæmatopoietiske celler er ikke tilfældigt arrangeret i BM-rummet, men viser en bestemt organisation inden for de hæmatopoietiske nicher, der omfatter mange celletyper af forskellig oprindelse (osteoblaster, osteoklaster, MSC'er, adipocytter, sinusformet endotel og perivaskulære stromale celler, immunceller, nerveceller og forskellige modne hæmatopoietiske celler), der danner en kompleks struktur for at sikre normal hæmatopoiesis8 . De biologiske funktioner i den hæmatopoietiske niche inkluderer regulering af HSC-overlevelse, vedhæftning, hvile, homing og differentiering gennem forskellige mekanismer (celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, produktion af opløselige faktorer, hypoxi) som reaktion på flere fysiologiske eller ikke-fysiologiske belastninger 3,6. Selvom disse hæmatopoietiske nicher oprindeligt blev opfattet som homogene enheder, har teknologiske fremskridt såsom enkeltcelle- og billeddannelsesanalyser gradvist afsløret deres kompleksitet, dynamik og adaptive egenskaber 9,10,11.
Det afgørende behov for at erstatte og reducere brugen af dyr til dechifrering af menneskelige fysiologiske og patologiske processer fører til nye muligheder og udfordringer11,12. Blandt nyligt beskrevne in vitro-værktøjer er tredimensionelle (3D) modeller, der efterligner in vivo human BM bedre end klassiske todimensionale (2D) kulturer 13,14,15,16,17 blevet foreslået. 3D-modellering synes således at være en lovende tilgang til at observere celle-celle- og cellematrixinteraktioner, tættere på dem, der forekommer in vivo. Ved hjælp af en række af disse modeller har nogle hold demonstreret overlevelse og spredning af HSC'er18,19. Flere 3D-modeller er tilgængelige, den mest almindelige tilgang er brugen af stilladsbaserede 3D-biomaterialer såsom hydrogeler, kolloider eller kollagener, der er forbundet med MSC'er, der udnytter deres osteoblastiske afstamningsdifferentieringskapacitet20,21,22. Ikke desto mindre er der ikke opnået noget globalt samtykke til at opfylde alle krav til undersøgelser af humane celler på en brugervenlig og standardiseret måde23, især da disse nuværende 3D-systemer hovedsageligt er afhængige af primære stromale celler og dermed lider under begrænset adgang til primære prøver, vævstilgængelighed og heterogenitet.
Derudover bør endotelcellerummet introduceres, da disse celler repræsenterer en vigtig komponent i cellecelleinteraktioner og er involveret i stamcelleskæbne og BM-sygdomsudvikling, både i leukæmi24 og metastase25. Vi har tidligere rapporteret, at tilføjelsen af patologiske elementer i en standardiseret human 3D-knoglemarvsmodel rekapitulerer funktioner observeret i patientprøver såsom ekstracellulære matrixændringer (ECM)26. For bedre at forstå dynamikken og interaktionerne mellem det menneskelige BM-mikromiljø og de residente celler leverer vi en detaljeret protokol til et brugervenligt og standardiseret system til opbygning af en minimal, velorganiseret, BM-lignende struktur. Dette system består af tre humane knoglemarvscelletyper-endotelceller og stromale celler, som repræsenterer mikromiljøet, og HSC'er. Ved at bruge specifikke perler som stillads og et osteoblastisk differentieringsmedium vil den opnåede 3D-struktur efterligne den menneskelige medullarniche, hvilket muliggør en praktisk undersøgelse af menneskelig knoglemarv.
Protocol
BEMÆRK: For at forberede den knoglemarvslignende rygradsstruktur er denne protokol afhængig af at kombinere perler med HMEC-1 endotelceller og HS27A stromale celler på bifasisk calciumphosphat (BCP) perler. BCP-perlerne vil fungere som et stillads, der med et specifikt medium tillader 3D-strukturel formgivning.
1. Forberedelse og sterilisering af perler
- 35-40 mg BCP-perler (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) vejes for hver indsats (lille, cylindrisk plastskål med en polykarbonatmembran i bunden) i et 1,5 ml rør (se Materialetabel). Efter vejning af perlerne bores et lille hul med en ren nål gennem toppen af 1,5 ml røret for at undgå, at låget springer åbent under autoklavecyklussen (121 ° C i 60 minutter), og placer rørene lodret i en lukket steril kasse .
2.3D Indsæt præparatet under en steril hætte
- Sæt sterile polycarbonatcellekulturindsatser i brøndene på en 6-brøndsplade. Hæld sterile BCP-perler fra et 1,5 ml rør i indsatsen. Vask perlerne forsigtigt ved at dryppe 350 μL 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) inde i indsatsen, og tilsæt derefter 4,5 ml 1x PBS til brønden. PBS fjernes og kasseres enten ved hjælp af vakuum eller en 5 ml pipette ved at placere spidsen i et hjørne af brønden. Gentag vasketrinnet to gange.
- Når perlerne er vasket, skal du bruge 1x PBS suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) for at blokere systemet. Der tilsættes forsigtigt 350 μL af blokeringsopløsningen til skæret og 4,5 ml til brønden, og hele pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2 natten over.
BEMÆRK: Trin 2.1 og 2.2 hjælper med at minimere ionfrigivelse fra BCP-perler før cellesåning.
3. Cellelinjehøst og 3D-vedligeholdelse
BEMÆRK: Efter dette inkubationstrin tilføjes mikromiljøceller for at danne 3D-strukturens rygrad. Dette system er baseret på brugen af HMEC-1, humane mikrovaskulære endotelceller udødeliggjort med stort T-antigen fra SV40, og HS27A, humane knoglemarvsstromale celler udødeliggjort med humant papillomavirus på grund af deres evne til at danne en solid BM-lignende struktur og deres kompatibilitet med inkluderingen af endotelceller.
- Før du tilføjer celler til systemet, skal du forberede følgende inkubationsmedier:
- For 50 ml komplet Osteo Differentiation Medium (ODM) blandes 45 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) + 5 ml FBS + 0,5 ml penicillin-streptomycin + 8 × 10-4 mg / L dexamethason + 2,16 g / L beta-glycerophosphat + 44 mg / L ascorbinsyre.
- For 50 ml komplet HMEC-1-medium blandes 45 ml MCDB 131 + 5 ml FBS + 0,5 ml penicillin-streptomycin + 1% glutaminerstatning + 1 mg / l hydrocortison + 10 μg / L EGF.
- Fjern blokeringsløsningen fra systemet. Bland 1 × 10 6 HMEC-1-celler (der repræsenterer det vaskulære rum) og 2 × 106 HS27A-celler (der repræsenterer det mesenkymale stromalcellerum) i et 15 ml rør og centrifuge i 5 minutter ved 1.575 × g ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres og tilsættes 175 μL HMEC-1-medium (specifikt medium for HMEC-1-cellevækst) med 175 μL ODM (specifikt medium for HS27A osteodifferentiering).
- Der hældes 350 μL af denne suspension indeholdende 3 × 10celler i alt 6 inde i hver indsats. Hæld derefter 4,5 ml af det kombinerede medie (2,25 ml HMEC-1 medium + 2,25 ml ODM) uden celler i pladens brønde. Opsæt forsigtigt og dispenser blandingen flere gange med en 1 ml mikropipette for at homogenisere cellerne og BCP-perlerne i indsatsen. Tildel hele blandingen for at sætte sig i bunden af indsatsen.
BEMÆRK: Et blandingspræparat med et dødt volumen anbefales, hvis der dyrkes flere indsatser. For eksempel, hvis fire skær dyrkes, skal du altid forberede det volumen, der kræves til fem indsatser. - Når endotel- og mesenkymale celler er homogeniseret inde i indsatsen, skal du holde 6-brøndspladen inde i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 uger. Skift mediet inde i indsatsen og brønden 2x om ugen ved forsigtigt at fjerne mediet fra indsatsen ved hjælp af en 1 ml mikropipette og placere spidsen ved den indre skærvæg for at undgå at forstyrre hjørnet af indsatsen.
BEMÆRK: Den hentede supernatant kan opbevares ved -80 °C på ethvert trin til senere proteinkvantificering.
4. Tilføjelse af celler af interesse i systemet
BEMÆRK: Efter 3 ugers dyrkning af HMEC-1 og HS27A muliggjorde osteodifferentieringen af HS27A-celler stivgørelse af systemet. På dette trin skal du tilføje hæmatologiske celler af interesse (antallet af tilføjede celler kan variere fra 1 × 104 til 1 × 106) i indsatsen. De tilsatte celler var TF1-celler transficeret med BCR-ABL-onkogen og primære mononukleerede CD34+ celler, der kom enten fra akutte myeloide leukæmipatienter eller raske donorer.
- Skift mediumsammensætningen på dette trin, da ODM-forbindelsen er giftig for hæmatologiske celler, og der er ikke behov for at fortsætte med at tilføje den, når systemstivningen er færdig. For eksempel, for at understøtte hæmatopoietisk vedligeholdelse, erstatte ODM-medium med komplet RPMI til hæmatopoietiske cellelinjer (RPMI suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin) eller IMDM til primære hæmatopoietiske celler. Forbered et parti på 50% komplet HMEC-1 medium og 50% komplet RPMI / IMDM medium til 3D-medium (to gange) ugentlige ændringer.
- Resuspender de hæmatologiske celler af interesse i dette kombinationsmedium og tilsæt det i indsatsen. Hvis der kræves en lægemiddelbehandlingsprotokol, skal du vente 24 timer efter tilsætning af cellerne af interesse før behandling, hvilket giver dem tid til at klæbe til den knoglelignende struktur.
- Tilpas perioden med 3D-cellekultur i henhold til kravene. Opdater mediet (50% HMEC-1 komplet medium + 50% RPMI komplet medium) to gange om ugen.
BEMÆRK: I løbet af 3D-cellekulturen kan nogle klæbende celler lække uden for indsatsen i bunden af brøndene, hvilket øger mellemforbruget. Kontroller under mikroskopet for celledispersion ud over indsatsen, og udskift indsatsen i en ny 6-brøndsplade under en steril hætte, hvis det er nødvendigt.
5.3D knoglemarvslignende eksperimentelle resultater
BEMÆRK: Efter 3D-dyrkning kan flere resultater opnås i henhold til eksperimentets mål.
- Protein analyse
BEMÆRK: I løbet af 3D-eksperimentet kan proteinerne udskilles af cellerne i den knoglemarvslignende struktur indsamles til yderligere analyser.- Når dyrkningsmediet skiftes 2x om ugen, opbevares den hentede supernatant fra indersiden af indsatsen ved -80 °C for at evaluere produktionen af proteiner af interesse i systemet.
- Dissociering af celler fra 3D-strukturen (under en steril hætte, hvis celler skal sorteres)
BEMÆRK: Cellerne dyrket i det 3D-knoglemarvslignende system kan hentes, sorteres og analyseres yderligere.- Ved forsøgets afslutning blandes 4,5 ml RPMI med 0,5 ml FBS suppleret med 0,4 mg/ml collagenase i et 15 ml rør og opvarmes ved 37 °C i 10 min.
- Placer indsatsen på hovedet (hvid membranside ovenpå) på et sterilt 6-brønds pladedæksel for at skære membranen ordentligt ud. Brug en steril skalpel til at skære membranen fra siderne og dermed hente en hvid solid skive. Disken anbringes inde i det varme 15 ml rør, der er forberedt i trin 5.2.1.
- Anbring røret i et aktivt hjul i en 37 °C inkubator, og inkuber i 10 minutter for at muliggøre fordøjelsen (i kontakt med collagenase). Anvend den samme inkubationstid for alle membraner for at undgå en skæv analyse.
- Efter 10 minutter centrifugeres 15 ml røret i 5 minutter ved 1.575 × g ved stuetemperatur, supernatanten kasseres, og pelleten genoptages i 5 ml varm 1x PBS. BEMÆRK: På dette trin, da polycarbonatmembranen generelt flyder i supernatantfraktionen, kan den kasseres ved hjælp af en steril pipettespids. Hvis membranen stadig er inkluderet i pelleten, skal du lade den stå og fjerne den i slutningen af næste trin.
- Resuspender pelleten i 300 μL varm trypsin, hvirvel røret i 10 s, og læg det i et 37 ° C vandbad i 1 min.
- Stop den enzymatiske fordøjelse ved at tilføje 1 ml varm ren FBS. Med en 1 ml mikropipette opsuges mekanisk og dispenseres mediet for fuldstændigt at adskille disken.
FORSIGTIG: Aspirations-/dispenseringstrinnet skal være meget hurtigt, ellers vil perlerne sedimentere inde i spidsen. - Centrifuger røret i 5 minutter ved 1.575 × g. Resuspend pellet i 3 ml 1x PBS suppleret med 10% FBS.
- Lad perlerne sedimentere i 5 s, før supernatanten opsamles og filtreres gennem en 35 μm cellesi placeret på et opsamlingsrør. Centrifuge det hentede filtrat i 5 min ved 1.575 × g. Tæl cellerne med trypanblå for at evaluere levedygtigheden og fortsæt med flowcytometrianalyser.
BEMÆRK: Antallet af levedygtige celler hentet efter trypanblå inkubation er ~ 1-2 × 105 celler pr. fordøjet indsats.
- Flowcytometrimærkning af hentede celler
BEMÆRK: Cellerne hentet fra den 3D-knoglemarvslignende struktur kan mærkes og analyseres yderligere ved flowcytometri. Brug en blanding af antistoffer til at detektere de forskellige rum efter 3D-dissociation. Her blev CD45 (pletter de hæmatologiske celler af interesse), CD31 (pletter det vaskulære rum) og CD73 (pletter det osteoblastiske rum) anvendt ved 1 μL i 50 μL PBS + 2% FBS. Hold alle de forberedte celler og antistoffer på is (4 °C) væk fra lys under hele processen.- Resuspender pellets i antistofblandingen og inkuberes i 30-40 minutter på is væk fra lys.
- Tilsæt 1 ml PBS + 2% FBS for at vaske cellerne og centrifugeres i 5 minutter ved 1.575 × g.
- Resuspender den hentede pellet i 200 μL 1x PBS + 10% FBS suppleret med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, fortyndet 1:2.000).
- Analyser rørene i et cytometer ved hjælp af følgende parametre: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; Se hele annoncen 5050 Odense C Boligportal.dk I dag 5.500 kr. 5000 vær. Brug et FSC-H versus FSC-W grafdiagram til at gate singlet populationen. I singlet-fraktionen skal du bruge et DAPI-A versus FSC-A-grafdiagram til at bestemme populationen af levedygtige celler (DAPI-negativ). Da den DAPI-negative population tidligere er gatet, skal du bruge et APC-A versus FSC-A grafdiagram til at bestemme den CD45-positive population.
- Fiksering af den 3D knoglemarvslignende struktur
BEMÆRK: Fiksering af den 3D BM-lignende struktur udføres generelt for immunhistokemi eller immunfluorescens for at visualisere celler in situ og for yderligere specifik farvning.- For at reparere den BM-lignende struktur skal du overføre indsatsen (trin 4.3) fra den gamle plade til en ny 6-brøndsplade fyldt med 1x PBS. Udskift derefter forsigtigt mediet inde i indsatsen med 1x PBS.
BEMÆRK: Skyl ikke den dannede struktur med PBS; væskens tryk kan forringe 3D-strukturen. - Når indsatsen er vasket, skal du placere den i en ny 6-brønds plade og fylde både brønden og indsatsen med nyåbnet paraformaldehyd (PFA) 4% (fortyndet 16% i 1x PBS).
- Lad fikseringsprocessen fortsætte i 4 timer ved stuetemperatur væk fra lys.
- Ved afslutningen af fikseringsprocessen vaskes indsatsen én gang med 1x PBS, og den opbevares 4 °C væk fra lys.
- Skær membranen i bunden af indsatsen som beskrevet i trin 5.2.2 for at hente den faste disk.
- Inkuber disken 4x i 48 timer i EDTA (0,5 M, pH 8) for at afkalke strukturen.
- Integrer strukturen i paraffin og skær 4 μm tykke sektioner.
- Brug en automatiseret immunostainer til at inkubere sektionerne med anti-CD45, anti-CD73 og Ki67 antistoffer. Visualiser farvningen med en anti-kanin eller -mus hest radise peroxidase (HRP) og med 3,3'-diaminobenzidin som et kromogent substrat og modfarve med Gill's-hæmatoxylin.
- For at reparere den BM-lignende struktur skal du overføre indsatsen (trin 4.3) fra den gamle plade til en ny 6-brøndsplade fyldt med 1x PBS. Udskift derefter forsigtigt mediet inde i indsatsen med 1x PBS.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol er det muligt at rekapitulere et minimalt, in vitro, 3D, humant BM-lignende mikromiljø, hvorfra levedygtige celler fra tre forskellige cellerum kan hentes (figur 1). Efter den ønskede eksponering kan 3D BM-lignende strukturer faktisk dissocieres, og MSC'er, endotelceller og hæmatopoietiske celler kan evalueres / karakteriseres ved hjælp af flowcytometri (figur 2A). Indtil videre tyder resultaterne på, at det er muligt at opretholde hæmatologiske celler i mindst 6 uger inden for 3D-modellen, før man henter levedygtige celler (figur 2B). Fremtidige undersøgelser er dog nødvendige for at estimere grænsen for denne 3D-model. Derudover er det om nødvendigt muligt at erstatte HS27A-cellelinjen med primær normal knoglemarv (NBM) MSC eller akut myeloid leukæmi (AML) MSC i denne 3D BM-lignende model (figur 2C) eller erstatte den hæmatopoietiske cellelinje med primære HSC'er (figur 2D). Desuden kan 3D BM-lignende strukturer ved analyse af interaktionerne mellem cellerum eller lokalisering af specifikke markører af interesse fastgøres og viderebehandles med paraffinindlejring og immunkemi. For eksempel blev analysen af CD45 (hæmatologisk) eller CD73 (MSC) indhold udført ved hjælp af disse 3D-modeller (figur 3).
Figur 1: Skematisk diagram over den oprindelige opsætning af det menneskelige 3D BM-lignende system. Efter 3 ugers samkultur kan fast BM-lignende væv opsamles eller podes med hæmatopoietiske celler (som i eksemplet) eller andre celletyper. Hvis det er nødvendigt, når cellerne er vedvarende, kan behandlingen tilføjes, og medium ændringer udføres to gange om ugen. I slutningen af eksperimentet kan BM-lignende strukturer enten rettes og viderebehandles til lokaliseringsundersøgelser eller dissocieres for at evaluere celleindhold. Forkortelser: BCP = bifasisk calciumphosphat; BM = knoglemarv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Genvinding af levedygtige celler fra forskellige rum efter dyrkning i den BM-lignende 3D-model. (A) Typisk mønster for cellegendannelse fra en dissocieret BM-lignende struktur med 9,84% af levedygtige celler (DAPI-). Repræsentative plots af hæmatopoietisk (66,6% CD45+), MSC/osteoblastceller (88,6% CD73+ celler inden for CD45-populationen) og endotelceller (22,1% CD31+ celler inden for CD45-populationen) genvundet efter 3D-dissociation. (B) 3D-systemet tillader vedligeholdelse af levedygtige hæmatopoietiske celler (CD45+) op til 6 uger efter dyrkning. (C) 3D-systemer lavet af primære MSC'er fra NBM eller AML sammen med HMEC-1 (farvet med Kusabira-Orange i dette eksempel) kan opretholde HSC'er (3,88% CD45+ DAPI-celler) in situ (D). Forkortelser: BM = knoglemarv; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; MSC = mesenkymal stamcelle; NBM = normal knoglemarv; AML = akut myeloid leukæmi; HSC'er = hæmatopoietiske stamceller; FSC = fremad spredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Visualisering af celleinteraktioner og spredning inden for den BM-lignende 3D-model. Systemer blev indsamlet efter 3 ugers 3D-samkultur med HS27A og HMEC-1 og tilsætning af hæmatopoietiske celler efter 1 uge. Typisk immunohistokemifarvning (visualiseret i brun) af IHC blev visualiseret ved hjælp af en anti-kanin eller -mus hest radise peroxidase og visualiseret med 3,3′-diaminobenzidin som et kromogent substrat og modfarvet med Gill's-hæmatoxylin og viser tilstedeværelsen af enten hæmatopoietiske celler med CD45 (venstre panel), stromale celler med CD73 (midterpanel) eller proliferation af alle celler med KI67 (højre panel). Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: BM = knoglemarv; IHC = immunhistokemi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
En af de nuværende udfordringer, som undersøgelser af menneskelige fysiologiske og tilknyttede patologiske problemer står over for, er manglen på modeller, der nøjagtigt efterligner de menneskelige organers komplekse funktioner. I tilfælde af menneskelige BM 3D-modeller bruger mange modeller hydrogeler og gengiver delvist BM, hvilket illustrerer kraften i 3D-kulturforhold sammenlignet med klassiske 2D-kulturer for at sikre for eksempel en bedre osteoblastisk differentiering27,28. På trods af god reproducerbarhed og brugervenlighed efterligner disse systemer ikke den menneskelige BM 3D-struktur og arkitektur, hvilket kan påvirke yderligere analyser betydeligt. Teknologiske fremskridt har gjort det muligt for forskere bedre at reproducere det oprindelige menneskelige osteoblastiske nichemiljø ved hjælp af et perfusionsbaseret bioreaktorsystem for at opretholde nogle HSC-egenskaber29. Udviklingen af mikrofluidiske anordninger har ført til nye tilgange til at reproducere en relevant knoglemarvslignende struktur, men har hidtil kun opnået begrænsede træk ved knoglemarven og har derfor begrænset anvendelser30,31,32,33.
Fremskridt inden for materialevidenskab har bidraget til udviklingen af en bred vifte af naturlige eller syntetiske biomaterialer, som kan bruges til at udvikle relevante 3D-knoglekultursystemer. Sådanne systemer er imidlertid undertiden vanskelige at udvikle i standard biologiske laboratorier uden interne færdigheder inden for biofysik. Desuden opnår disse systemer i de fleste tilfælde en begrænset evne til at efterligne 3D-strukturen i den menneskelige knogle, herunder BM-mikromiljøet, og har brugt store mængder cytokiner og vækstfaktorer, hvilket skaber et kunstigt rigt kulturmedium34.
Valget om at inducere osteoblastisk differentiering snarere end adipocytisk differentiering var baseret på det faktum, at preosteoblaster og osteoblaster er blevet beskrevet som en del af endosteal niche35. Dette identificerede osteoblastiske celler som anmodede komponenter i både knogle- og knoglemarv. Blandt de cellulære komponenter i knoglemarven optager endotel- og stromale celler en stor del af mikromiljøet. Derudover producerer disse to celletyper strukturelle ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrix og cytokiner involveret i reguleringen af homeostase og differentiering, der her anmodes om at generere en forkalket struktur. Dette retfærdiggør således brugen af endotel- og stromale celler og vores valg af cellelinjer for at give nem adgang og øge reproducerbarheden mellem laboratorier. Da kulturen i HMEC-1-linjen var mere stabil over tid, blev denne cellelinje bevaret til udvikling af 3D-systemet. For stromale celler sammenlignede vi i 2D-kultur osteoblastdifferentieringskapaciteten for stromalcellelinjerne afledt af normal knoglemarv: HS5 og HS27A. Vi fandt ud af, at HS5-linjen ikke differentierede så meget som HS27A-linjen i 3D-systemet genereret med begge cellelinjer. I denne henseende har forsøg på at erstatte HS27A-celler med HS5-linjen resulteret i produktion af en mindre stiv struktur, hvilket tyder på, at HS27A er mere egnede.
Både HS27A- og HMEC-1-cellelinjer blev dyrket i forskellige mediekombinationer, hvor man fremkalder den bedste stive struktur og justeringer af HMEC-1 langs osteoblaststrukturer, således at produktionen af den ekstracellulære matrix bringer en relativ stivhed til den grundlæggende struktur. Analyse af udviklingen af differentiering ved D14 viste, at differentieringen var mere avanceret ved D21 (måling af BSP, sen osteoblastisk markør), med et forhold 1: 2 for HMEC-1: HS27A og med bedre resultater, da 2 × 106 HS27A blev introduceret. Endotelceller har også en vigtig rolle i reguleringen af homeostase og differentiering (blandt andet gennem tilførsel af cytokiner). Det faktum, at HMEC-1-celler opretholdes i dette system, indikerer, at de i det mindste kan opfylde denne rolle, og dette bidrager til legitimiteten af vores model. For HMEC-1 endotellinjen var det vigtigt at introducere det tidligt nok, så det kunne integreres korrekt i strukturen og med håb om, at disse celler kunne danne justeringer eller endda rør i strukturen. Samkulturtest af HS27A og HMEC-1 blev udført ved at introducere sidstnævnte på forskellige stadier: D0, D7, D14; Der blev ikke observeret nogen bemærkelsesværdig forskel, hverken i differentieringen af stromalcellerne eller i vedligeholdelsen eller placeringen af endotelcellerne. Således blev disse celler introduceret i begyndelsen af processen. Hæmatopoietiske celler blev introduceret på et tidspunkt, hvor osteoblastisk differentiering ville være avanceret nok til at favorisere celle-celleinteraktioner. Dette valg var også betinget af, at denne osteoblastiske differentiering er betinget af brugen af et medium, som ifølge vores tests ikke fuldt ud understøtter vedligeholdelsen af de hæmatopoietiske celler. Hæmatologiske celler kan enten være cellelinjer eller primære BM CD45 hæmatopoietiske celler.
Fra denne 3D-model kunne vi forestille os at erstatte hver celletype med primære celler, normale eller patologiske, eller endda at tilføje andre celletyper for at øge biomimetiske egenskaber, såsom immunceller, adipocytter eller fibroblaster26. Faktisk er HS27A-cellelinjen blevet erstattet med primære BM MSC'er med lav passaging. Tilsvarende blev hæmatologiske cellelinjer erstattet med primære BM hæmatopoietiske celler. Udskiftningen af HMEC-1-celler med primære endotelceller er imidlertid endnu ikke blevet testet. I øjeblikket kan denne model stadig forbedres med hensyn til vaskulaturrepræsentation, da selvom endotelceller er til stede og korrekt interagerer med andre celler fra mikromiljøet (f.eks. Hæmatopoietiske celler), danner de ikke strukturerede kar, hvilket udelukker flowperfusion for at efterligne funktionelle blodkar. Samlet set kan dette gradvist øge kompleksiteten og repræsentativiteten af den nuværende minimale 3D-model. Tilføjelsen af andre celletyper kan lette undersøgelser, der undersøger andre problemer, såsom betydningen af lokal BM-betændelse eller resistens over for immunterapi.
Dette 3D-system har dog brug for 3 uger, før celler af interesse, hæmatologiske celler eller epitelcancerceller, hvis metastaseprocessen evalueres, kan tilføjes. Sterile forhold skal opretholdes, da mellemstore ændringer to gange om ugen undertiden kan føre til medium forurening. Da nogle celler kan migrere gennem indsatsens porer og begynde at sprede sig i brønden, hvilket fører til øget medium forbrug, anbefales regelmæssig overvågning.
Vi beskrev her et 3D-stillads, der tillod osteoblastisk differentiering og udviklede et relevant, in vitro, 3D, menneskeligt BM-lignende mikromiljø. Dette system tillader in situ-analyse og ultimativ levende cellehentning. Dette system giver et nyt og meget fleksibelt værktøj, reproducerbart og brugervenligt, med en bred vifte af applikationer til at studere interaktioner og mekanismer inden for det menneskelige BM-mikromiljø.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker P. Battiston-Montagne og A. Jambon fra CRCL-cytometriplatformen og N. Gadot og C. Leneve fra Research Pathology Platform, Institut for Translationel Forskning og Innovation, Center Léon Bérard. Forfatterne er taknemmelige for B. Manship for den engelske udgave. Dette arbejde blev finansieret af Inserm og FI-LMC til V. M. S., og S. L. K. A. og L. B. blev støttet af et tilskud fra Société Française d'Hématologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
| 5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
| Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
| Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
| Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
| BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
| Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
| CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
| CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
| CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
| CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
| CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
| CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
| CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
| Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
| Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
| Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
| Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
| DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
| Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
| EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
| Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
| Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
| FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
| Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
| HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
| HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
| Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
| Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
| KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
| Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
| PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
| PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
| RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
| Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
| Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
| TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |
References
- Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
- Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
- Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S.
- Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
- Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
- Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462 (2022).
- Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A.
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
- Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
- Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
- Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77 (2018).
- Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
- Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
- Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002 (2016).
- Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
- Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
- Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
- de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796 (2021).
- Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683 (2021).
- Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).
