Her beskriver vi et let at implementere, standardiseret, mikrofysiologisk system, der afspejler kompleksiteten af den menneskelige knoglemarvs in vivo-struktur , hvilket giver en relevant model til finstudier af en bred vifte af normale og patologiske hændelser.
Den medullære niche er et komplekst økosystem, der er afgørende for at opretholde homeostase for residente celler. Faktisk er knoglemarven, som omfatter en kompleks ekstracellulær matrix og forskellige celletyper, såsom mesenkymale stamceller, osteoblaster og endotelceller, dybt involveret i hæmatopoietisk stamcelleregulering gennem direkte celle-celleinteraktioner samt cytokinproduktion. For nøje at efterligne denne in vivo-struktur og udføre eksperimenter, der afspejler reaktionerne fra den menneskelige knoglemarv, er der skabt flere 3D-modeller baseret på biomaterialer, der primært er afhængige af primære stromale celler. Her beskrives en protokol for at opnå et minimalt og standardiseret system, der er let at konfigurere og giver funktioner i knoglemarvslignende struktur, som kombinerer forskellige cellepopulationer, herunder endotelceller, og afspejler heterogeniteten af in vivo knoglemarvsvæv. Denne 3D-knoglemarvslignende struktur – samlet ved hjælp af calciumphosphatbaserede partikler og humane cellelinjer, der er repræsentative for knoglemarvsmikromiljøet – muliggør overvågning af en lang række biologiske processer ved at kombinere eller erstatte forskellige primære cellepopulationer i systemet. De endelige 3D-strukturer kan derefter enten høstes til billedanalyse efter fiksering, paraffinindlejring og histologisk / immunohistokemisk farvning til cellelokalisering i systemet eller dissocieres for at indsamle hver cellulær komponent til molekylær eller funktionel karakterisering.
Knoglemarv (BM) findes i både de centrale hulrum i aksiale og lange knogler og trabekulære flade knogler og indeholder en række forskellige cellulære og ikke-cellulære komponenter. På strukturelt niveau består den af hæmatopoietiske vævsøer (også kaldet “hæmatoner”)1,2 og fedtceller omgivet af vaskulære bihuler blandet inden for trabekulær knogle3. I lange og flade knogler er blodtilførslen til knoglen og knoglemarven forbundet gennem et endosteal netværk af fartøjer4. Skjult i dette solide beskyttende netværk er BM vært for meget umodne celler nedsænket i en svampet stroma og udgør stedet for differentiering af hjemmehørende mesenkymale stamceller (MSC’er) og hæmatopoietiske stamceller (HSC’er)5. Bortset fra fornyelse af knoglevæv gennem produktion af osteoblaster ligger en af de vigtigste kendte funktioner i BM i hæmatopoieseudvikling6.
BM hæmatopoietisk væv omfatter en række celletyper, nemlig HSC’er, forstadier og mere differentierede blodlegemer såsom lymfocytter, neutrofiler, erythrocytter, granulocytter, monocytter og trombocytter7. Hæmatopoietiske celler er ikke tilfældigt arrangeret i BM-rummet, men viser en bestemt organisation inden for de hæmatopoietiske nicher, der omfatter mange celletyper af forskellig oprindelse (osteoblaster, osteoklaster, MSC’er, adipocytter, sinusformet endotel og perivaskulære stromale celler, immunceller, nerveceller og forskellige modne hæmatopoietiske celler), der danner en kompleks struktur for at sikre normal hæmatopoiesis8 . De biologiske funktioner i den hæmatopoietiske niche inkluderer regulering af HSC-overlevelse, vedhæftning, hvile, homing og differentiering gennem forskellige mekanismer (celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, produktion af opløselige faktorer, hypoxi) som reaktion på flere fysiologiske eller ikke-fysiologiske belastninger 3,6. Selvom disse hæmatopoietiske nicher oprindeligt blev opfattet som homogene enheder, har teknologiske fremskridt såsom enkeltcelle- og billeddannelsesanalyser gradvist afsløret deres kompleksitet, dynamik og adaptive egenskaber 9,10,11.
Det afgørende behov for at erstatte og reducere brugen af dyr til dechifrering af menneskelige fysiologiske og patologiske processer fører til nye muligheder og udfordringer11,12. Blandt nyligt beskrevne in vitro-værktøjer er tredimensionelle (3D) modeller, der efterligner in vivo human BM bedre end klassiske todimensionale (2D) kulturer 13,14,15,16,17 blevet foreslået. 3D-modellering synes således at være en lovende tilgang til at observere celle-celle- og cellematrixinteraktioner, tættere på dem, der forekommer in vivo. Ved hjælp af en række af disse modeller har nogle hold demonstreret overlevelse og spredning af HSC’er18,19. Flere 3D-modeller er tilgængelige, den mest almindelige tilgang er brugen af stilladsbaserede 3D-biomaterialer såsom hydrogeler, kolloider eller kollagener, der er forbundet med MSC’er, der udnytter deres osteoblastiske afstamningsdifferentieringskapacitet20,21,22. Ikke desto mindre er der ikke opnået noget globalt samtykke til at opfylde alle krav til undersøgelser af humane celler på en brugervenlig og standardiseret måde23, især da disse nuværende 3D-systemer hovedsageligt er afhængige af primære stromale celler og dermed lider under begrænset adgang til primære prøver, vævstilgængelighed og heterogenitet.
Derudover bør endotelcellerummet introduceres, da disse celler repræsenterer en vigtig komponent i cellecelleinteraktioner og er involveret i stamcelleskæbne og BM-sygdomsudvikling, både i leukæmi24 og metastase25. Vi har tidligere rapporteret, at tilføjelsen af patologiske elementer i en standardiseret human 3D-knoglemarvsmodel rekapitulerer funktioner observeret i patientprøver såsom ekstracellulære matrixændringer (ECM)26. For bedre at forstå dynamikken og interaktionerne mellem det menneskelige BM-mikromiljø og de residente celler leverer vi en detaljeret protokol til et brugervenligt og standardiseret system til opbygning af en minimal, velorganiseret, BM-lignende struktur. Dette system består af tre humane knoglemarvscelletyper-endotelceller og stromale celler, som repræsenterer mikromiljøet, og HSC’er. Ved at bruge specifikke perler som stillads og et osteoblastisk differentieringsmedium vil den opnåede 3D-struktur efterligne den menneskelige medullarniche, hvilket muliggør en praktisk undersøgelse af menneskelig knoglemarv.
En af de nuværende udfordringer, som undersøgelser af menneskelige fysiologiske og tilknyttede patologiske problemer står over for, er manglen på modeller, der nøjagtigt efterligner de menneskelige organers komplekse funktioner. I tilfælde af menneskelige BM 3D-modeller bruger mange modeller hydrogeler og gengiver delvist BM, hvilket illustrerer kraften i 3D-kulturforhold sammenlignet med klassiske 2D-kulturer for at sikre for eksempel en bedre osteoblastisk differentiering27,28. På trods af god reproducerbarhed og brugervenlighed efterligner disse systemer ikke den menneskelige BM 3D-struktur og arkitektur, hvilket kan påvirke yderligere analyser betydeligt. Teknologiske fremskridt har gjort det muligt for forskere bedre at reproducere det oprindelige menneskelige osteoblastiske nichemiljø ved hjælp af et perfusionsbaseret bioreaktorsystem for at opretholde nogle HSC-egenskaber29. Udviklingen af mikrofluidiske anordninger har ført til nye tilgange til at reproducere en relevant knoglemarvslignende struktur, men har hidtil kun opnået begrænsede træk ved knoglemarven og har derfor begrænset anvendelser30,31,32,33.
Fremskridt inden for materialevidenskab har bidraget til udviklingen af en bred vifte af naturlige eller syntetiske biomaterialer, som kan bruges til at udvikle relevante 3D-knoglekultursystemer. Sådanne systemer er imidlertid undertiden vanskelige at udvikle i standard biologiske laboratorier uden interne færdigheder inden for biofysik. Desuden opnår disse systemer i de fleste tilfælde en begrænset evne til at efterligne 3D-strukturen i den menneskelige knogle, herunder BM-mikromiljøet, og har brugt store mængder cytokiner og vækstfaktorer, hvilket skaber et kunstigt rigt kulturmedium34.
Valget om at inducere osteoblastisk differentiering snarere end adipocytisk differentiering var baseret på det faktum, at preosteoblaster og osteoblaster er blevet beskrevet som en del af endosteal niche35. Dette identificerede osteoblastiske celler som anmodede komponenter i både knogle- og knoglemarv. Blandt de cellulære komponenter i knoglemarven optager endotel- og stromale celler en stor del af mikromiljøet. Derudover producerer disse to celletyper strukturelle ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrix og cytokiner involveret i reguleringen af homeostase og differentiering, der her anmodes om at generere en forkalket struktur. Dette retfærdiggør således brugen af endotel- og stromale celler og vores valg af cellelinjer for at give nem adgang og øge reproducerbarheden mellem laboratorier. Da kulturen i HMEC-1-linjen var mere stabil over tid, blev denne cellelinje bevaret til udvikling af 3D-systemet. For stromale celler sammenlignede vi i 2D-kultur osteoblastdifferentieringskapaciteten for stromalcellelinjerne afledt af normal knoglemarv: HS5 og HS27A. Vi fandt ud af, at HS5-linjen ikke differentierede så meget som HS27A-linjen i 3D-systemet genereret med begge cellelinjer. I denne henseende har forsøg på at erstatte HS27A-celler med HS5-linjen resulteret i produktion af en mindre stiv struktur, hvilket tyder på, at HS27A er mere egnede.
Både HS27A- og HMEC-1-cellelinjer blev dyrket i forskellige mediekombinationer, hvor man fremkalder den bedste stive struktur og justeringer af HMEC-1 langs osteoblaststrukturer, således at produktionen af den ekstracellulære matrix bringer en relativ stivhed til den grundlæggende struktur. Analyse af udviklingen af differentiering ved D14 viste, at differentieringen var mere avanceret ved D21 (måling af BSP, sen osteoblastisk markør), med et forhold 1: 2 for HMEC-1: HS27A og med bedre resultater, da 2 × 106 HS27A blev introduceret. Endotelceller har også en vigtig rolle i reguleringen af homeostase og differentiering (blandt andet gennem tilførsel af cytokiner). Det faktum, at HMEC-1-celler opretholdes i dette system, indikerer, at de i det mindste kan opfylde denne rolle, og dette bidrager til legitimiteten af vores model. For HMEC-1 endotellinjen var det vigtigt at introducere det tidligt nok, så det kunne integreres korrekt i strukturen og med håb om, at disse celler kunne danne justeringer eller endda rør i strukturen. Samkulturtest af HS27A og HMEC-1 blev udført ved at introducere sidstnævnte på forskellige stadier: D0, D7, D14; Der blev ikke observeret nogen bemærkelsesværdig forskel, hverken i differentieringen af stromalcellerne eller i vedligeholdelsen eller placeringen af endotelcellerne. Således blev disse celler introduceret i begyndelsen af processen. Hæmatopoietiske celler blev introduceret på et tidspunkt, hvor osteoblastisk differentiering ville være avanceret nok til at favorisere celle-celleinteraktioner. Dette valg var også betinget af, at denne osteoblastiske differentiering er betinget af brugen af et medium, som ifølge vores tests ikke fuldt ud understøtter vedligeholdelsen af de hæmatopoietiske celler. Hæmatologiske celler kan enten være cellelinjer eller primære BM CD45 hæmatopoietiske celler.
Fra denne 3D-model kunne vi forestille os at erstatte hver celletype med primære celler, normale eller patologiske, eller endda at tilføje andre celletyper for at øge biomimetiske egenskaber, såsom immunceller, adipocytter eller fibroblaster26. Faktisk er HS27A-cellelinjen blevet erstattet med primære BM MSC’er med lav passaging. Tilsvarende blev hæmatologiske cellelinjer erstattet med primære BM hæmatopoietiske celler. Udskiftningen af HMEC-1-celler med primære endotelceller er imidlertid endnu ikke blevet testet. I øjeblikket kan denne model stadig forbedres med hensyn til vaskulaturrepræsentation, da selvom endotelceller er til stede og korrekt interagerer med andre celler fra mikromiljøet (f.eks. Hæmatopoietiske celler), danner de ikke strukturerede kar, hvilket udelukker flowperfusion for at efterligne funktionelle blodkar. Samlet set kan dette gradvist øge kompleksiteten og repræsentativiteten af den nuværende minimale 3D-model. Tilføjelsen af andre celletyper kan lette undersøgelser, der undersøger andre problemer, såsom betydningen af lokal BM-betændelse eller resistens over for immunterapi.
Dette 3D-system har dog brug for 3 uger, før celler af interesse, hæmatologiske celler eller epitelcancerceller, hvis metastaseprocessen evalueres, kan tilføjes. Sterile forhold skal opretholdes, da mellemstore ændringer to gange om ugen undertiden kan føre til medium forurening. Da nogle celler kan migrere gennem indsatsens porer og begynde at sprede sig i brønden, hvilket fører til øget medium forbrug, anbefales regelmæssig overvågning.
Vi beskrev her et 3D-stillads, der tillod osteoblastisk differentiering og udviklede et relevant, in vitro, 3D, menneskeligt BM-lignende mikromiljø. Dette system tillader in situ-analyse og ultimativ levende cellehentning. Dette system giver et nyt og meget fleksibelt værktøj, reproducerbart og brugervenligt, med en bred vifte af applikationer til at studere interaktioner og mekanismer inden for det menneskelige BM-mikromiljø.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker P. Battiston-Montagne og A. Jambon fra CRCL-cytometriplatformen og N. Gadot og C. Leneve fra Research Pathology Platform, Institut for Translationel Forskning og Innovation, Center Léon Bérard. Forfatterne er taknemmelige for B. Manship for den engelske udgave. Dette arbejde blev finansieret af Inserm og FI-LMC til V. M. S., og S. L. K. A. og L. B. blev støttet af et tilskud fra Société Française d’Hématologie.
3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |